KR101275246B1 - 구강질환 유발 미생물 동시 검출 방법 및 이의 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스, 타네렐라 포르시서스, 캄필로박터 렉터스, 포르피로모나스 긴기발리스, 프레보텔라 인터미디아 및 트레포네마 덴티콜라와 같은 최대 6종의 주요 구강질환 유발 미생물을 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법 및 이를 이용하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 저렴한 비용 및 간단한 방법으로 최대 6종의 각기 다른 구강질환 유발 미생물을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명에 따르면 저렴한 비용 및 간단한 방법으로 최대 6종의 각기 다른 구강질환 유발 미생물을 동시에 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 구강질환 유발 미생물 동시 검출 방법 및 이의 키트에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스, 타네렐라 포르시서스, 캄필로박터 렉터스, 포르피로모나스 긴기발리스, 프레보텔라 인터미디아 및 트레포네마 덴티콜라와 같은 최대 6종의 주요 구강질환 유발 미생물을 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법 및 이를 이용하는 키트에 관한 것이다.
치주염은 치아를 지탱하는 치아주위 조직과 치조골 등의 부위에 염증이 발생하여 치아 연결 조직과 치조골이 손실되고 종국에는 치아가 상실되는 감염성 질환이다.
치주염은 구강 내에 서식하는 다양한 구강질환 유발 미생물(putative periodontopathic bacteria)들이 복합적으로 군집을 형성함으로써 이루어지는 것으로 추정되고 있다. 이러한 박테리아들은 구강질환 환부에서 동시에 서식하는 것이 확인되었으며, 다양한 균종들이 동시에 서식하는 상황이 치주염 등의 질환을 더욱 증대시키는 것으로 추정되고 있다. 이와 같은 이유로 구강 및 치주낭(periodontal pockets)에 서식하고 있는 미생물의 분포가 질환의 진단과 치료에 매우 중요한 의미를 지닌다.
이에 따라, 구강질환 유발 미생물의 신속한 동정을 위한 기술의 개발이 지속적으로 이루어져 왔으나 낮은 민감도, 과정의 복잡성으로 인하여 일반화되지 못하였다. 이와 같은 문제를 극복하기 위하여 다종의 미생물을 동시에 분석, 동정하기 위한 기술의 개발이 시도되고 있기는 하지만 3종 이내의 균종에 대해서만 이루어지고 있다. 최근 DNA chip 기법을 이용하여 구강 미생물의 분포를 확인하는 제품(Greiner, germany)이 개발되어 판매되고 있다. 그러나 본 제품 및 기법의 경우 매우 높은 비용이 요구되며 분석 과정도 복잡한 단점을 갖고 있다. 아울러 정량이 가능한 real time PCR을 이용한 구강 미생물의 정량적 분석이 시도되고 있으나 분석 장비의 개발과 분석 Dye의 기술적인 문제로 인하여 다종의 미생물을 동시에 분석하는 데에는 어려움을 나타내며 높은 비용이 요구되는 단점을 나타낸다.
이에 본 발명자들은, 여러 구강질환 유발 미생물을 동시에 그리고 정확하게 분석 및 동정할 수 있고, 이를 보다 저렴한 비용으로 달성할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 구강질환을 유발하는 것으로 추정되는 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 타네렐라 포르시서스(Tannerella forsythus), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia) 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)를 검출하기 위한 프라이머를 발명할 수 있었고, 이 프라이머들을 사용하여 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하게 되면, 비교적 간단한 방법 및 저렴한 비용으로 최대 6종의 구강질환 유발 미생물을 동시에 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 저렴하고 간단한 방법으로 여러 구강질환 유발 미생물을 동시에 검출할 수 있는 구강질환 유발 미생물 검출 방법과 이의 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 구강에서 채취한 생물학적 샘플로부터 얻어진 DNA를 대상으로 하여, 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)의 fimA(I) 유전자와 fimA(Ⅱ) 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제1프라이머), 타네렐라 포르시서스(Tannerella forsythus)의 16S rRNA 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제2프라이머), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus)의 csxA 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제3프라이머), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)의 OpdB 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제4프라이머), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)의 pin0048 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제5프라이머) 및 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)의 LtC 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제6프라이머)로 이루어진 군 중에서 선택된 2종 이상의 프라이머로 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 증폭된 DNA를 분석하는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 미생물 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 구강질환 유발 미생물 검출 방법에 있어서, 상기 제1프라이머로는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제2프라이머로는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제3프라이머로는 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제4프라이머로는 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제5프라이머로는 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제6프라이머로는 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)의 fimA(I) 유전자와 fimA(Ⅱ) 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제1프라이머), 타네렐라 포르시서스(Tannerella forsythus)의 16S rRNA 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제2프라이머), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus)의 csxA 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제3프라이머), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)의 OpdB 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제4프라이머), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)의 pin0048 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제5프라이머) 및 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)의 LtC 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제6프라이머)로 이루어진 군 중에서 선택된 2종 이상의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 미생물 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 구강질환 유발 미생물 검출 키트에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제2프라이머는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제3프라이머는 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제4프라이머는 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제5프라이머는 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머, 상기 제6프라이머는 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 비교적 저렴한 비용으로 간단하게 수행할 수 있는 multiplex PCR(Polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)을 이용하기로 하였다.
우선 구강질환 유발 미생물로 추정되는 6종의 균주 즉, 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 타네렐라 포르시서스(Tannerella forsythus), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia) 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)를 선별하였고, 이들 각각 및 다른 미생물과 구분할 수 있는 특이적인 유전자를 선별하였으며, 이에 대한 특이적인 프라이머를 제작하였다(표 1 참조).
프라이머의 제작을 위하여, P. gingivalis는 fimA(I)와 fimA(Ⅱ)(GenBank accession no. AB261608)의 공통적인 염기서열을 이용하였고, T. forsythia는 16S rRNA 유전자(GenBank accession no. DQ344918), C. rectus는 csxA 유전자(GenBank accession no. AF035193), T. denticola는 OpdB 유전자(GenBank accession no. AF355459), P. intermedia는 pin0048 유전자(GenBank accession no. AM920311), A. actinomycetemcomitans는 LtC 유전자(GenBank accession no. M27399)의 염기서열을 각각 이용하였다.
제작된 프라이머에 따른 각 균주들에 대한 증폭을 확인하고, 타 균주 및 음성 대조군에 대한 증폭 및 간섭 저해 등을 확인하였다.
PCR 반응의 조건은 챔버레인(Chamberlain)의 논문 및 챔버레인(Chamberlain)과 헤네가리우 등(Henegariu et al.)의 논문에 서술된 내용을 참조하여 6종의 구강 미생물을 동시 확인할 수 있는 조건으로 최적화 하였다. Taq polymerase는 AmpliTaq Gold(PE Biosystems, Foster City, Calif.)를 사용하였으며, 0.5U(Unit, 유닛) 내지 10U 사이에서 적절한 반응 농도를 확인하기 위한 실험을 수행하였고, 3U/test의 농도가 최적의 반응 결과를 나타내었다.
본 발명의 구강질환 유발 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 구강질환 유발 미생물 검출 방법의 유효성을 분석하기 위하여 PCR 반응의 특이도 분석을 시행하였다. 이를 위하여 분양받은 6종의 미생물로부터 각각 DNA를 추출하였고, 이들 추출된 각 DNA를 단독 PCR template로 사용하여 비 특이 반응 결과물의 생성을 확인하였다. 또한, 이와 함께 다른 종의 구강 미생물 6종 및 일반 미생물 10종의 DNA를 2종씩 섞어서 template로 사용하여 비 특이 PCR 반응 발생 여부를 확인하였다.
이의 결과 6종의 각 병원성 구강 미생물들의 DNA에 대하여서 매우 특이적인 PCR 결과를 나타내었으며, 비 특이적인 반응을 양산시키지 않았음을 확인할 수 있었다. 아울러 다른 6종의 구강미생물들과 일반 미생물들의 DNA들에 대하여서도 비 특이 반응을 나타내지 않았음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 방법을 사용하여 일반인과 환자의 시료를 분석하여 봄으로써 실제 진단검사에의 활용 가능성을 확인하는 실험을 수행하였다. 일반인 시료는 건강한 성인 64명의 시료(시료 No. 1 ~ No. 64)를 채취하였으며 환자 시료의 경우 아산병원 치과에 내원한 환자 10명을 대상으로 시료(시료 No. 65 ~ No. 74)를 채취하여 분석을 수행하였다.
전체 분석 대상 시료 중 음성은 26명(35.13%) 이었으며, 일반인 중에서는 5명이 음성이었고, 환자 시료 중에서는 5명이 음성 결과를 나타내었다.
각 대상별 보균율은 T. forsythus가 58.10%로 가장 높은 보균율을 보였으며, 환자들의 경우 90.00%로 높은 보균율을 나타내었다. 그 다음으로 P. gingivalis가 43.24%로 높은 보균율을 나타내었고, T. denticola와 P. intermedia는 각각 33.78%로 동일한 보균율을 나타내었다. C. rectus의 경우 25.67%를 나타내었고, A. actinomycetemcomitans의 경우 13개의 시료에서 양성 결과를 나타내었다. 환자 시료 중에서 3종 이상의 구강 질환 유발 미생물이 검출된 것은 모두 9건으로 전체 환자 시료 10건에 대비하여 90.00%를 나타내었고 일반인 시료의 경우 24명의 경우에만 유사한 결과를 보여 32.43%를 나타내었다. 실험에 사용된 일반인 시료(시료 No. 9 ~ No. 18)의 결과를 보면(도 2 참조) 특이도 검증을 위한 실험 결과에서와 마찬가지로 임상 시료에서 추출한 DNA에서도 비 특이적인 반응 결과를 나타내지 않았다.
본 발명의 구강질환 유발 미생물 검출 방법은 A. actinomycetemcomitans, T. forsythus, P. gingivalis, T. denticola, C. rectus, P. intermedia 등과 같은 주요 구강질환 유발 미생물들을 동시에 검출할 수 있는 진단 방법으로 기존의 방법들보다 최고 3종의 추가 균종을 동시에 확인할 수 있다는 장점을 나타낸다. 아울러 PCR 장비 이외에 추가적인 고가 장비를 사용하지 않고도 낮은 비용과 짧고 간편한 분석 과정을 통해 실험을 수행할 수 있다는 장점도 함께 나타낸다.
실험에 사용된 시료들 중 일부는 치간솔로 그리고 일부는 페이퍼 포인트(Paper point)로 채취되어졌다. 분석 결과 페이퍼 포인트의 경우 대체로 음성 결과를 나타낸 경우가 많았으나, 단일 종 혹은 2종 이내의 균종 검출이 많았다. 이에 비하여 치간솔의 경우 양성율이 매우 높았으며 다종 검출예가 많았다. 이는 페이퍼 포인트를 이용한 시료 채취에 비해 치간솔을 이용한 시료 채취가 다종 균종 분석에 효율적일 수 있다는 것을 나타낸다. 다만 페이퍼 포인트의 경우 적절한 시료 채취가 이루어진다면 구강 포켓(poket)의 물리적 특성으로 인하여 서식이 용이한 혐기성 세균들의 확인을 위하여 치간솔에 의한 시료 채취의 보조적인 수단으로 활용될 수 있을 것으로 보인다.
구강 내에 서식하는 치주질환 유발 미생물들은 대부분 혐기성 세균으로 시료 채취이후 보관 및 운송 과정에서 사멸되어 소실되는 경우가 많아 정확한 분석 어려운 문제점을 안고 있다. 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 기존의 보관 용액으로 주로 사용되던 PBS buffer를 사용하지 않고 구아니딘 이소티오시아네이트(Guanidine isothiocyanate)를 주성분으로 하는 Lysis buffer를 사용하였다. 이러한 Lysis buffer의 경우 채취된 시료를 보관용액이 담겨있는 보관 용기에 넣는 즉시 세포막이 파괴되어 세포를 사멸시킴과 동시에 시료내의 DNase 등의 DNA 파괴 효소를 파괴하여 DNA를 안전하게 보관할 수 있도록 하여준다.
본 발명자들의 실험 결과 P. gingivalis와 T. forsythia가 함께 출현하는 비율은 37.83%였으며, T. forsythia와 T. denticola가 함께 출현하는 경우는 29.72%, P. gingivalis와 T. denticola가 함께 출현하는 경우는 29.72%, red complex로 분류되는 세 종류의 세균이 모두 출현한 경우가 27.02%로 나타났으며, 6종의 분석 대상 균종 중 3종 이상의 보균을 보인 시료는 24개로 32.43%를 나타내어 치주질환 원인균들이 서로 공존하는 양상을 보였다.
64개의 전체 일반인 시료 중 음성은 26개로 40.62%를 나타내었으나 환자군의 경우 모두 양성 결과를 나타내었다. 아울러 일반인들의 경우 4종 이상의 분석 대상 균종에 감염된 경우는 14개의 샘플로 18.91%를 나타내었으나 환자 시료에서는 6개로 60%의 높은 동시 감염율을 나타내었다. 이와 같은 결과로 미루어볼 때 치주염 환자 혹은 치주 질환 가능성이 높은 일반인의 경우 다종의 치주 질환 유발 미생물에 감염되어 있는 것으로 판단되어진다.
상기와 같이 주요 치주질환 유발 미생물들의 동시 감염 여부의 확인은 이후의 치주 질환 및 구강 미생물 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 아울러 본 발명에서와 같은 분석은 건강한 일반인의 경우 치주 질환 발병 가능성의 예측 및 관리가 가능하며 환자의 경우 치료 과정에서의 예후 관찰의 지표로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
결론적으로 본 발명의 결과물인 구강질환 유발 미생물 검출 방법 및 이를 이용한 검출 키트는 치주질환 주요 6종 미생물을 동시에 검출, 분석할 수 있음에도 불구하고 높은 특이도와 민감도를 나타내고 있어, 기존의 단독 PCR 혹은 real time PCR 등에 비교하여 매우 효율적이면서 경제적인 장점을 제공할 것으로 예상된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 저렴한 비용 및 간단한 방법으로 6종의 각기 다른 구강질환 유발 미생물을 동시에 검출할 수 있다.
도 1은 구강질환 유발 미생물, 기타 구강 미생물 및 일반 미생물을 대상으로 하고, 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다. 전기영동은 위에서 아래의 방향으로 진행하였으며, 도 1의 1번부터 6번까지 순서대로 A. actinomycetemcomitans(Aa), P. intermedia(Pi), T. denticola(Td), C. rectus(Cr), T. forsythus(Tf), P. gingivalis(Pg)의 DNA를 주형으로 한 것이며, 7번은 100 base pair DNA size standard이고, 8번부터 15번까지 순서대로 Fusobacterium nucleatum + Peptostreptococcus sp., Eikenella corrodens + Actinomyces viscosus, Veillonella parvula + Capnocytophaga ochracea, Streptococcus crista + Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis + Streptococcus gordonii, Campylobacter concisus + Prevotella nigrescens, Actinomyces odontolyticus +, Chryseobacterium meningosepticum, Escherichia coli + Pseudomonas aeruginosa 각 두 종의 DNA를 주형으로 한 것이다.
도 2는 일반인의 구강으로부터 채취한 시료를 대상으로 하고, 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다. 전기영동은 위에서 아래의 방향으로 진행하였으며, 도 2의 1번부터 10번까지는 각각 일반인 시료 No. 9 ~ No. 18의 DNA를 주형으로 한 것이며, 11번은 음성대조군, 12번은 100 base pair DNA size standard이다.
도 2는 일반인의 구강으로부터 채취한 시료를 대상으로 하고, 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다. 전기영동은 위에서 아래의 방향으로 진행하였으며, 도 2의 1번부터 10번까지는 각각 일반인 시료 No. 9 ~ No. 18의 DNA를 주형으로 한 것이며, 11번은 음성대조군, 12번은 100 base pair DNA size standard이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1.
생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 및 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)로부터 Porphyromonas gingivalis(ATCC 49417), Tannerella forsythia(ATCC 43037), Campylobacter rectus(DSM 3260), Treponema denticola(ATCC 35404), Prevotella intermedia(ATCC 25611), Actinobacillus actinomycetemcomitans(ATCC 29522) 균주를 동결건조 되어있는 상태로 분양받았다.
동결건조 되어있는 균주를 멸균된 증류수로 현탁한 다음, Genomic DNA Extraction Kit(Intron, Korea)를 사용하여 각 균주의 genomic DNA를 추출하였다.
상기 추출한 각 genomic DNA를 대상으로하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때 PCR 반응을 위한 혼합물의 총 부피를 30㎕로 하였으며, 상기 추출한 각 genomic DNA는 5㎕를 사용하였고, 4 유닛(unit)의 AmpliTaq Gold(PE Biosystems, Foster City, Calif.) taq polymerase를 사용하였다. Tris-HCl, KCl, MgCl2의 농도가 각각 10.3mM, 51.3mM, 2.9mM이 되도록 첨가하였고, 표 1의 프라이머를 각각 0.5mM이 되도록 첨가하였다. 오염을 방지하기 위하여 UDG(uracil-DNA glycosylase)를 1 유닛 첨가하였고, dNTP 중 dATP, dCTP, dGTP는 200mM 그리고 dUTP는 600mM(Solgent, Korea)의 농도가 되도록 첨가하였다.
| 프라이머명 | 염기서열 | 서열번호 | 증폭산물 크기 (bp) |
| PGF PGR |
5'-ctgacggctgatctcgtcga-3' 5'-catggttcgaatgcaaggtc -3' |
1 2 |
736 |
| TFF TFR |
5'-actggtactgagacacggacca-3' 5'-tgatacccacgctttcgtgc-3' |
3 4 |
461 |
| CRF CRR |
5'-caaccgacggataacgcagac-3' 5'-catagatgttgtcgtctccttcg-3' |
5 6 |
355 |
| TDF TDR |
5'-ctgcgttcaagcaaggtcttc-3' 5'-ggataaacggagtattcggtatcc-3' |
7 8 |
239 |
| PIF PIR |
5'-cggaaacaccacctacgactg-3' 5'-gaaataggttcgcaagcctgc-3' |
9 10 |
190 |
| AAF AAR |
5'-cttggtcttaccgaacgaggt-3' 5'-acgtaccaagaacactctgaacct-3' |
11 12 |
145 |
PCR 반응을 수행하기 위한 PCR 장치로는 GenePro(Bioer, Japan)를 사용하였으며, 오염방지 단계와 PCR 증폭 단계로 나누어 수행하였다. 오염방지 단계의 UDG 반응을 위해 50℃에서 10분간 유지하였으며, 이후 UDG의 불활성화를 위해 95℃에서 10분간 유지하였다. PCR 증폭 단계는 94℃에서 40초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초로 40회 반복하여 수행하였고, PCR 증폭 반응 이후 72℃에서 5분간 유지하여 post elongation 반응이 이루어지도록 하였다.
PCR을 수행한 이후, Et-Br(Ethidium Bromide)이 포함된 2.5% agarose gel(Bioshop, USA)과 TAE buffer를 사용하여 200V에서 30분간 PCR 반응 결과물을 전기영동하였고, i-MAX MC2000 Gel Image Analysis System(Biocore, Korea)을 사용하여 분석하였다. 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 2.
상기 실시예 1에서 사용한 균주 이외에 구강 내에 존재하는 미생물인 Fusobacterium nucleatum(ATCC 25586), Peptostreptococcus sp.(ATCC 14963), Eikenella corrodens(ATCC 51724), Actinomyces viscosus(ATCC 15987), Veillonella parvula(ATCC 10790), Capnocytophaga ochracea(ATCC 33596) 및 이 외에도 Streptococcus crista(ATCC 51110), Streptococcus sanguis(ATCC 10556), Streptococcus mitis(ATCC 49456), Streptococcus gordonii(ATCC 10558), Campylobacter concisus(ATCC 33237), Prevotella nigrescens(ATCC 33563), Actinomyces odontolyticus(ATCC 17929), Chryseobacterium meningosepticum(ATCC 13253), Sphingomonas paucimobilis(ATCC 29837), Pseudomonas aeruginosa(15442), Escherichia coli(ATCC 23736) 균주를 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 및 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)로부터 분양받아 상기 실시예 1과 동일하게 각 균주의 genomic DNA를 추출하였다.
상기 실시예 1에서, 각 genomic DNA 대신 본 실시예에서 추출한 각 균주의 genomic DNA를 2종씩 첨가한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR을 수행한 다음 전기영동하여 분석하였고, 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 3.
건강한 성인 64명으로부터 구강의 시료(시료 No. 1 ~ No. 64)를 채취하였으며, 환자 시료의 경우 아산병원 치과에 내원한 환자 10명으로부터 시료(시료 No. 65 ~ No. 74)를 채취하여 수득하였다.
구강내 플라그(plaque)를 채취하기 위하여 치간솔과 페이퍼 포인트(paper point)를 사용하였다. 치아 간의 플라그는 치간솔을 사용하여 채취하였고, 치아와 잇몸 사이의 치주 포켓(pocket)이 의심되는 부분은 페이퍼 포인트를 사용하여 균주를 채취하였다.
채취되어진 임상 시료로부터 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA를 추출한 다음 동일한 방법으로 PCR을 수행하고, 전기영동하여 분석하였다.
이의 결과를 표 2에 나타내었고, 전기영동 결과의 일부를 도 2에 나타내었다.
| 균 종 명 | 양성 수량 | 양성율 |
| Tannerella forsythus | 43 | 58.10 |
| Porphyromonas gingivalis | 32 | 43.24 |
| Treponema denticola | 25 | 33.78 |
| Prevotella intermedia | 25 | 33.78 |
| Campylobacter rectus | 19 | 25.67 |
| Actinobacillus actinomycetemcomitans | 13 | 17.56 |
| 음 성 | 26 | 35.13 |
서열목록 전자파일 첨부
Claims (4)
- 구강에서 채취한 생물학적 샘플로부터 얻어진 DNA를 대상으로 하여,
포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)의 fimA(I) 유전자와 fimA(Ⅱ) 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제1프라이머),
타네렐라 포르시서스(Tannerella forsythus)의 16S rRNA 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제2프라이머),
캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus)의 csxA 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제3프라이머),
트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)의 OpdB 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제4프라이머),
프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)의 pin0048 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제5프라이머) 및
엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)의 LtC 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제6프라이머)로 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 증폭된 DNA를 분석하는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 미생물 검출 방법. - 제 1항에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제2프라이머는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제3프라이머는 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제4프라이머는 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제5프라이머는 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제6프라이머는 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 미생물 검출 방법. - 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)의 fimA(I) 유전자와 fimA(Ⅱ) 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제1프라이머),
타네렐라 포르시서스(Tannerella forsythus)의 16S rRNA 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제2프라이머),
캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus)의 csxA 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제3프라이머),
트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)의 OpdB 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제4프라이머),
프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)의 pin0048 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제5프라이머) 및
엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)의 LtC 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머(제6프라이머)를 포함하는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 미생물 검출 키트. - 제 3항에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제2프라이머는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제3프라이머는 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제4프라이머는 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제5프라이머는 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머,
상기 제6프라이머는 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 미생물 검출 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100123454A KR101275246B1 (ko) | 2010-12-06 | 2010-12-06 | 구강질환 유발 미생물 동시 검출 방법 및 이의 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100123454A KR101275246B1 (ko) | 2010-12-06 | 2010-12-06 | 구강질환 유발 미생물 동시 검출 방법 및 이의 키트 |
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-
2010
- 2010-12-06 KR KR1020100123454A patent/KR101275246B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J. Periodontal. Res., Vol. 43, No. 3, pp. 268-274 (2008.06.) * |
| New Microbiol, Vol. 31, No. 3, pp. 383-291 (2008.07.) * |
Also Published As
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