KR20150129484A - 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도 - Google Patents

치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20150129484A
KR20150129484A KR1020140056506A KR20140056506A KR20150129484A KR 20150129484 A KR20150129484 A KR 20150129484A KR 1020140056506 A KR1020140056506 A KR 1020140056506A KR 20140056506 A KR20140056506 A KR 20140056506A KR 20150129484 A KR20150129484 A KR 20150129484A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
detecting
periodontal disease
disease causing
primer
causing bacteria
Prior art date
Application number
KR1020140056506A
Other languages
English (en)
Inventor
송강희
신은심
Original Assignee
휴스텝스 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 휴스텝스 주식회사 filed Critical 휴스텝스 주식회사
Priority to KR1020140056506A priority Critical patent/KR20150129484A/ko
Publication of KR20150129484A publication Critical patent/KR20150129484A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 아아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아 (Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola ), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens) 또는 유박테리움 노다툼(ubacterium nodat)의 게놈 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는, 서열번호 1 내지 30의 염기서열을 가지는 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도 {Primers and Probes for detecting bacteria related to periodontal desease and method of detecting the same and use thereof}
본 발명은 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간의 구강 내에는 약 700여 세균 종이 있다고 알려져 있으며, 수많은 세균이 덩어리를 이룬 채로 서식하여 치면 세균막을 이루고 있다.
치주 질환(Periodontal Disease)은 상기 치면 세균막에 존재하는 세균에 의해 치아의 지지 조직에 염증이 발생하는 질환이다.
현재까지의 연구 결과에 의하면, 흡연 여부, 당뇨병 등의 전신 질환 및 면역 결핍을 동반하는 질병 등이 치주 질환으로의 발병에 영향을 주지만, 치은 연하 치면 세균막에 존재하는 그람-음성 세균 종들이 치주질환을 일으키는 주요한 병인으로 알려져 있다.
상기 치주질환의 주요한 원인균종으로 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis), 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus) 등이라고 알려져 있지만, 아직까지 정확한 원인균종은 밝혀져 있지 않은 실정이다.
그러나, 지금까지 치주질환과 관련하여 그 원인균에 의한 감염 여부 또는 원인균의 감염 정도를 조기에 탐지 및 검색하기에는 한계점이 있엇다.
그나마 치주질환에 관련된 병원성 세균종을 찾기 위한 분자역학적 연구는 주로 16S ribosomal RNA 유전자를 표적으로 하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)법을 이용하여 염기서열분석법으로 정성 분석한 것이 대부분이었다.
그러나, 상기 기존 방법으로는 수많은 치주질환 병원성 세균 종을 종-특이적으로 검출하고, 치주질환 원인균의 분자역학적 연구를 위한 정성 및 정량 데이터를 동시에 얻을 수 있는 연구도 전무한 실정이었다.
따라서, 치주질환 병원성 원인균에 대한 종-특이적 PCR 프라이머 및 프로브의 연구 및 상기 원인균에 대한 정성 및 정량을 동시에 검출할 수 있는 연구는 여전히 필요한 실정이다.
본 발명은 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아 (Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola ), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens) 또는 유박테리움 노다툼(ubacterium nodat)의 게놈 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는, 서열번호 1 내지 30의 염기서열을 가지는 치주질환 원인균 검출용 프라이머를 제공한다.
상기 게놈 유전자는 16S ribosomal RNA 유전자일 수 있다.
상기 프로브의 5' 말단에는 바이오틴(biotin)이 부착될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면 상기 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 치주질환 원인균 검출용 조성물과 치주질환 원인균 검출용 키트 및 치주질환 원인균 검출용 마이크로 플레이트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면 생물학적 검체로부터 기원한 핵산을 치주질환 원인균 검출용 프라이머를 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계;를 포함하는 치주질환 원인균 검출 방법을 제공한다.
상기 생물학적 검체로부터 기원한 핵산은 16S ribosomal RNA 유전자일 수 있다.
상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계는 상기 증폭 산물을 마이크로 플레이트 웰 내에 부착된 프로브와 혼성화(Hybridization)하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합될 수 있다.
상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계는 상기 증폭 산물과 상기 프로브가 혼성화(Hybridization)된 반응물을 효소가 표지된 항체와 결합시키는 과정을 포함할 수 있다.
상기 혼성화(Hybridization)된 반응물과 상기 항체가 결합 후 효소 작용에 의해 나타난 흡광도를 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) reader로 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
표준 시약으로 상기 단계를 수행하여 나온 결과와 상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출한 결과와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 생물학적 검체로부터 치주질환 원인균의 검출을 위해 각각의 원인균에 특이적으로 고안된 프라이머를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 치주질환 원인균의 검출을 위해 PCR (Polymerase Chain Reaction)과 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)기법을 접목함으로써, 기존 PCR (Polymerase Chain Reaction) 기법에 비해 치주질환 원인균의 정성적 분석 및 정량적 분석이 동시에 가능하다.
또한, 상기 치주질환 원인균의 검출을 위해 PCR (Polymerase Chain Reaction)과 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)기법을 접목함으로써, 기존 PCR (Polymerase Chain Reaction) 기법에 비해 검출 민감도와 특이성이 매우 우수한 효과가 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명한다. 다만, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있으며, 도면상의 동일한 부호로 표시되는 요소는 동일한 요소이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 또는 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus) 등의 게놈 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는, 서열번호 1 내지 30의 염기서열을 가지는 치주질환 원인균 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 치주질환의 원인균의 감염여부를 확인하여 치주질환을 조기에 진단하기 위하여, PCR (Polymerase Chain Reaction)과 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)기법을 접목하는 방법을 적용할 수 있으며, 이에 이용되는 치주질환 원인균 검출용 프라이머를 제공한다.
상기와 같이, PCR (Polymerase Chain Reaction)과 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)기법을 접목하여 치주질환의 원인균을 정성 및 정량 분석이 동시에 가능하도록 하기 위하여 치주질환의 원인균 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 염기쌍과 프로브를 하기와 같이 설계하였다.
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)
Aa포워드(forward)프라이머: 5'-ACA CGT GCT ACA ATG GCG TA-3'(서열번호 1)
Aa리버스(reverse)프라이머: 5'-TCA TAC CGT GGT AAA CGC CC-3'(서열번호 2)
Aa프로브: 5'-ACC AAC CAG CGA TGG GGA GTG AA-3'(서열번호 3)
포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis)
Pg포워드(forward)프라이머: 5'-GTG AAA ACC GTC TTC CCT TCG-3'(서열번호 4)
Pg리버스(reverse)프라이머: 5'-GGA TGT AAG GGC CGT GTT GAA-3'(서열번호 5)
Pg프로브: 5'-TGT AGG TGC TGC ATG GTT GTC GT-3'(서열번호 6)
타네렐라 포시티아 (Tannerella forsythia)
Tf포워드(forward)프라이머: 5'-AAG CTC TAC AGC GAA AGC GT-3'(서열번호 7)
Tf리버스(reverse)프라이머: 5'-ACA ACC ATG CAG CAC CTA CA-3'(서열번호 8)
Tf프로브: 5'-CGG CAA CGG TGA AAC TCA AAG GA-3'(서열번호 9)
트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola )
Td포워드(forward)프라이머: 5'-TGT TGG GTT AAG TCC CGC AA-3'(서열번호 10)
Td리버스(reverse)프라이머: 5'-TTG CGT TTT GCT TGA CCT CG-3'(서열번호 11)
Td프로브: 5'-TGG CGG AAC TGC CGA TGA CAA AT-3'(서열번호 12)
푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)
Fn포워드(forward)프라이머: 5'-CCA CAA GGG GAC TGA GAC AC-3'(서열번호 13)
Fn리버스(reverse)프라이머: 5'-GCT GCT GGC ACG TAT TTA GC-3'(서열번호 14)
Fn프로브: 5'-TCC AGC AAT TCT GTG TGC ACG A-3'(서열번호 15)
프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)
Pi포워드(forward)프라이머: 5'-TGA CGA ACT CCG ATT GCG AA-3'(서열번호 16)
Pi리버스(reverse)프라이머: 5'-AAC CAC ATG TTC CTC CGC TT-3'(서열번호 17)
Pi프로브: 5'-AAA CGA TGG ATG CCC GCT GTT-3'(서열번호 18)
캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus)
Cr포워드(forward)프라이머: 5'-CGC AAC CCA CGT CAT TAG TT-3'(서열번호 19)
Cr리버스(reverse)프라이머: 5'-TGC AGA CTC CAA TCC GAA CT-3'(서열번호 20)
Cr프로브: 5'-CGC AAC CCA CGT CAT TAG TT-3'(서열번호 21)
펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros)
Pm포워드(forward)프라이머: 5'-TTC GAA GCA ACG CGA AGA AC-3'(서열번호 22)
Pm리버스(reverse)프라이머: 5'-AGA TAA GGG TTG CGC TCG TT-3'(서열번호 23)
Pm프로브: 5'-AGC TCG TGT CGT GAG ATG TT-3'(서열번호 24)
에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens)
Ec포워드(forward)프라이머: 5'-ATG AGA CTG CCG GTG ACA AA-3'(서열번호 25)
Ec리버스(reverse)프라이머: 5'-ACA AGA CCC GGG AAC GTA TT-3'(서열번호 26)
Ec프로브: 5'-TTG CAC TCT GCA ACT CGA GTG CA-3'(서열번호 27)
유박테리움 노다툼(ubacterium nodat)
En포워드(forward)프라이머: 5'-TCG CAT GGA TGA ACT GCC AA-3'(서열번호 28)
En리버스(reverse)프라이머: 5'-GCT TCG CCC ATT GTG CAA TA-3'(서열번호 29)
En프로브: 5'-TTA CCA AGG CGA CGA TCA GT-3'(서열번호 30)
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 게놈 유전자는 16S ribosomal RNA 유전자일 수 있다.
즉, 상기 치주질환 원인균 중 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 또는 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus) 등의 16S ribosomal RNA 유전자를 주형으로 하여, 상기 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 상기 프라이머 염기쌍을 이용함으로써 PCR을 수행할 수 있다.
상기 PCR을 수행하여 수득되는 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)기법을 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출할 수 있다.
이에 대한 보다 자세한 설명은 본 발명의 다른 실시형태인 치주질환 원인균 검출방법에서 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 프로브의 5' 말단에는 바이오틴(biotin)이 부착될 수 있다.
일반적으로, 치주질환에 관련된 병원성 세균종을 찾기 위한 분자역학적 연구는 주로 16S ribosomal RNA 유전자를 표적으로 하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)법을 이용하여 염기서열분석법으로 정성 분석하였다. 그러나, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 표적 유전자의 양쪽에 프라이머를 부착하고, 상기 원인균에 특이한 프로브의 5'말단에 바이오팀(Biotin)을 부착함으로써, 원인균을 정성 및 정량 분석할 수 있으며, 또한 DIG(Digoxigenin)을 표지로서 부착함으로써 검출 민감도를 향상시켜 왔다.
즉, 본 발명의 일 실시형태에 따르면 탐침자인 프로브를 별도로 유전자 주형에 부착하는 것이 아니라, 상기 프라이머의 위치내에 존재하도록 하였으며 상기 프라이머의 5' 말단에 바이오틴(biotin)으로 변형되어 존재하도록 함에 특징이 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브를 이용하여 상기 치주질환 원인균을 정성 및 정량 분석하는 방법에 대한 보다 자세한 사항은 후술하도록 한다.
한편, 본 발명의 다른 실시형태에 따르면 상기 치주질환 원인균 검출용 프라이머를 포함하는 치주질환 원인균 검출용 조성물과 치주질환 원인균 검출용 키트 및 치주질환 원인균 검출용 마이크로 플레이트를 제공한다.
상기 치주질환 원인균 검출용 조성물, 치주질환 원인균 검출용 키트 및 치주질환 원인균 검출용 마이크로 플레이트는 본 발명의 일 실시형태에 따른 치주질환 원인균 검출용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면 생물학적 검체로부터 기원한 핵산을 치주질환 원인균 검출용 프라이머를 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계;를 포함하는 치주질환 원인균 검출 방법을 제공한다.
상기 생물학적 검체로부터 기원한 핵산은 16S ribosomal RNA 유전자일 수 있다.
상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계는 상기 증폭 산물을 마이크로 플레이트 웰 내에 부착된 프로브와 혼성화(Hybridization)하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합될 수 있다.
상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계는 상기 증폭 산물과 상기 프로브가 혼성화(Hybridization)된 반응물을 효소가 표지된 항체와 결합시키는 과정을 포함할 수 있다.
상기 혼성화(Hybridization)된 반응물과 상기 항체가 결합 후 효소 작용에 의해 나타난 흡광도를 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) reader로 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
표준 시약으로 상기 단계를 수행하여 나온 결과와 상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출한 결과와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하도록 한다.
이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: PCR 수행
치주질환 원인균의 게놈 유전자를 증폭하기 위한 조건
(1) 마스터 믹스의 조건
PCR 반응을 위한 반응액의 구성은 다음과 같다.
프라이머 용량은 2 ㎕가 되도록 하였고, Dig-labeled dUTP를 포함하는 PCR 완충액은 2 ㎕로 하였으며, 증류수는 9.5 ㎕가 되도록 하였고, 시료 DNA는 2 ㎕가 되도록 하여 총 20 ㎕의 마스터 믹스를 사용하였다.
(2)온도의 조건
PCR 장비 (Applied Biosystems사)에서 PCR을 수행하여, 치주질환 원인균의 해당 유전자를 증폭한다.
다음과 같은 온도 조건으로 실험을 시행하였다.
94 ℃에서 초기 변성과정을 2분 동안 진행한 다음, 94 ℃에서 30초, 58 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 1분간 진행하는 과정을 30회 반복하여, 치주질환 원인균의 게놈 유전자를 변성하고 상기 치주질환 원인균의 게놈 유전자와 프라이머쌍을 결합하여 상기 치주질환 원인균의 게놈 유전자의 합성이 진행되도록 하여 최종적으로 마지막 합성 반응을 72 ℃에서 5분간 추가적으로 시행하여 치주질환 원인균의 게놈 유전자의 증폭이 충분하도록 하였다.
상기 치주질환 원인균의 게놈 유전자를 증폭하여 얻은 증폭 산물의 크기는 사이즈 마커(100bp DNA Ladder Marker)를 이용하여 전기영도으로 확인하였다.
사이즈 마커의 밴드는 100, 200, 3OO, 400, 500, 600, 700, 794, 900, 1,000 및 1,500 bp의 11개 밴드를 이용하여 치주질환 원인균을 확인하였다.
각 치주질환 원인균의 증폭된 산물은 Aa의 경우 250bp의 밴드로 표시되고, Pg의 경우 207bp의 밴드로 표시되며, Cr은 210bp의 밴드로 표시됨을 확인하였다.
실시예 2: ELISA 수행
상기 PCR 방법으로 증폭된 치주질환 원인균의 증폭 산물을 검출하고 정량화하는 조건
(1) 프로브의 마이크로웰 플레이트에 부착
마이크로웰 플레이트를 워시 버퍼(wash buffer) 200 ㎕로 세 번 세척한 뒤, 바이오틴(biotin)이 결합된 프로브 100 ㎕를 해당하는 마이크로웰 플레이트에 넣고, 실온에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 마이크로웰 플레이트를 워시 버퍼(wash buffer) 200 ㎕로 세 번 세척하여 ELISA 방법을 준비한다.
상기 바이오틴(biotin)이 결합된 프로브와 혼성화 버퍼(hybridization buffer)를 1:100 (v/v) 비율로 혼합한다.
(2) ELISA 조건
1.5 ㎖ 반응 튜브에 증폭된 PCR 산물 10 ㎕와 40 ㎕의 변성(denaturing) 용액을 혼합하여 상온 (15 ℃ ~ 25 ℃)에서 10분간 반응시킨다.
상기 (1)에서 준비한 프로브 450 ㎕를 반응 튜브에 넣고, 잘 혼합한다.
반응 튜브에서 200 ㎕의 혼합물을 마이크로웰 플레이트에 넣은 뒤, 커버 호일로 상기 마이크로웰 플레이트를 막고, 37 ℃의 온도 조건에서 300 rpm으로 진탕하며 3시간 동안 반응시킨다.
마이크로웰 플레이트를 뒤집어서 반응액을 제거한 후 각 웰 당 250 ㎕의 워시 버퍼(wash buffer)를 이용하여 3회 세척하였다.
200 ㎕의 anti-Dig peroxidase conjugated solution을 각 웰에 넣고 상온의 온도 조건에서 300 rpm으로 진탕하며 30분간 암반응 시킨다.
마이크로웰 플레이트를 뒤집어서 반응액을 제거한 후 각 웰 당 250 ㎕의 워시 버퍼(wash buffer)를 이용하여 5회 세척하였다.
다음으로, 200 ㎕의 ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 기질 용액(substrate solution)을 각 웰에 넣고 상온의 온도 조건에서 300 rpm으로 진탕하며 30분간 암반응 시킨 후 stop solution(sulfuric acid (H2SO4)) 100 ㎕를 넣고 ELISA reader를 이용하여 OD 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 3: 표준 시약의 흡광도 측정
표준 시약에 대하여 상기 실시예 1과 실시예 2의 방법에 따라 PCR 및 ELISA법을 적용하여 흡광도를 측정하였다.
상기 실시예 1과 실시예 2에 따라 생물학적 검체로부터 얻어진 치주질환 원인균의 흡광도 결과와 상기 실시예 3에서 검출된 표준 시약의 흡광도 결과를 비교하여 치주질환 원인균의 검출 결과를 경증, 중증 치주질환으로 판정하였다.
상기 치주질환 원인균의 검출 결과를 경증, 중증 치주질환으로 판정하는 방법은 상기 표준 시약의 흡광도 결과를 나타내는 선형 그래프에 상기 실시예 1과 실시예 2에 따른 검체의 흡광도 결과를 표시하여 그 정도에 따라 판정하였다.
상기 실시예 1과 실시예 2에 따라 생물학적 검체로부터 얻어진 치주질환 원인균의 흡광도 결과가 0.1 이상인 경우를 양성으로 판정하였다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 생물학적 검체로부터 치주질환 원인균의 검출을 위해 각각의 원인균에 특이적으로 고안된 프라이머 및 프로브를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 치주질환 원인균의 검출을 위해 PCR (Polymerase Chain Reaction)과 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)기법을 접목함으로써, 기존 PCR (Polymerase Chain Reaction) 기법에 비해 치주질환 원인균의 정성적 분석 및 정량적 분석이 동시에 가능하다.
또한, 상기 치주질환 원인균의 검출을 위해 PCR (Polymerase Chain Reaction)과 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)기법을 접목함으로써, 기존 PCR (Polymerase Chain Reaction) 기법에 비해 검출 민감도와 특이성이 매우 우수한 효과가 있다.
본 발명은 상술한 실시 형태 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니며, 첨부된 청구범위에 의해 한정하고자 한다. 따라서, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아 (Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola ), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens) 또는 유박테리움 노다툼(ubacterium nodat)의 게놈 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는, 서열번호 1 내지 30의 염기서열을 가지는 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 게놈 유전자는 16S ribosomal RNA 유전자인 치주질환 원인균 검출용 프라이머.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머의 5' 말단에는 바이오틴(biotin)이 부착된 치주질환 원인균 검출용 프로브.
  4. 제1항에 따른 프라이머를 포함하는 치주질환 원인균 검출용 조성물.
  5. 제1항에 따른 프라이머를 포함하는 치주질환 원인균 검출용 키트.
  6. 제1항에 따른 프라이머를 포함하는 치주질환 원인균 검출용 마이크로 플레이트.
  7. 생물학적 검체로부터 기원한 핵산을 치주질환 원인균 검출용 프라이머를 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계;를 포함하는 치주질환 원인균 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 검체로부터 기원한 핵산은 16S ribosomal RNA 유전자인 것을 특징으로 하는 치주질환 원인균 검출 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계는 상기 증폭 산물을 마이크로 플레이트 웰 내에 부착된 프로브와 혼성화(Hybridization)하는 과정을 포함하는 치주질환 원인균 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 치주질환 원인균 검출 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계는 상기 증폭 산물과 상기 프로브가 혼성화(Hybridization)된 반응물을 효소가 표지된 항체와 결합시키는 과정을 포함하는 치주질환 원인균 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 혼성화(Hybridization)된 반응물과 상기 항체가 결합 후 효소 작용에 의해 나타난 흡광도를 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) reader로 측정하는 단계를 더 포함하는 치주질환 원인균 검출 방법.
  13. 제7항에 있어서,
    표준 시약으로 상기 단계를 수행하여 나온 결과와 상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출한 결과와 비교하는 단계를 더 포함하는 치주질환 원인균 검출 방법.
KR1020140056506A 2014-05-12 2014-05-12 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도 KR20150129484A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140056506A KR20150129484A (ko) 2014-05-12 2014-05-12 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140056506A KR20150129484A (ko) 2014-05-12 2014-05-12 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150129484A true KR20150129484A (ko) 2015-11-20

Family

ID=54844170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140056506A KR20150129484A (ko) 2014-05-12 2014-05-12 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20150129484A (ko)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190031395A (ko) * 2017-09-15 2019-03-26 주식회사 마이크로이즈 구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 리얼타임 pcr 방법
KR102215852B1 (ko) * 2020-07-09 2021-02-15 부산대학교 산학협력단 치주 질환 원인균의 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102337293B1 (ko) * 2020-07-23 2021-12-08 주식회사 천랩 푸소박테리움 뉴클레아툼 아종 뉴클레아툼의 검출
KR102337292B1 (ko) * 2020-07-23 2021-12-08 주식회사 천랩 푸소박테리움 뉴클레아툼 아종 애니말리스의 검출
WO2022114491A1 (ko) * 2020-11-30 2022-06-02 주식회사 힐릭스코 한국인의 치주질환 진단을 위한 정보제공 방법 및 키트
WO2022244923A1 (ko) * 2021-05-17 2022-11-24 주식회사 힐릭스코 한국인의 치주질환 진단을 위한 정보제공 방법 및 키트
WO2023139137A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Uea Enterprises Limited Tumour microbiome analysis as a prognostic indicator of prostate cancer

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190031395A (ko) * 2017-09-15 2019-03-26 주식회사 마이크로이즈 구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 리얼타임 pcr 방법
KR102215852B1 (ko) * 2020-07-09 2021-02-15 부산대학교 산학협력단 치주 질환 원인균의 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102337293B1 (ko) * 2020-07-23 2021-12-08 주식회사 천랩 푸소박테리움 뉴클레아툼 아종 뉴클레아툼의 검출
KR102337292B1 (ko) * 2020-07-23 2021-12-08 주식회사 천랩 푸소박테리움 뉴클레아툼 아종 애니말리스의 검출
WO2022114491A1 (ko) * 2020-11-30 2022-06-02 주식회사 힐릭스코 한국인의 치주질환 진단을 위한 정보제공 방법 및 키트
WO2022244923A1 (ko) * 2021-05-17 2022-11-24 주식회사 힐릭스코 한국인의 치주질환 진단을 위한 정보제공 방법 및 키트
KR20220155631A (ko) * 2021-05-17 2022-11-24 주식회사 힐릭스코 한국인의 치주질환 진단을 위한 정보제공 방법 및 키트
WO2023139137A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Uea Enterprises Limited Tumour microbiome analysis as a prognostic indicator of prostate cancer

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150129484A (ko) 치주질환 원인균 검출용 프라이머 및 프로브, 치주질환 원인균 검출 방법 및 이의 용도
Chen et al. Using oligonucleotide-functionalized Au nanoparticles to rapidly detect foodborne pathogens on a piezoelectric biosensor
US8735067B2 (en) Asymmetric PCR amplification, its special primer and application
US10227660B2 (en) Strand-invasion based DNA amplification method
US9845495B2 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
Liu et al. Dual-signal amplification strategy: Universal asymmetric tailing-PCR triggered rolling circle amplification assay for fluorescent detection of Cronobacter spp. in milk
Liu et al. Visual diagnostic of Helicobacter pylori based on a cascade amplification of PCR and G-quadruplex DNAzyme as a color label
JPH08510386A (ja) ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定
US20150093749A1 (en) Real-time pcr detection of streptococcus pyogenes
US20110287965A1 (en) Methods and compositions to detect clostridium difficile
JP2016214101A (ja) 口腔細菌の簡易迅速検査方法
Kitagawa et al. Rapid detection of the Streptococcus mutans cnm gene by loop-mediated isothermal amplification
US9574242B2 (en) Method for detecting a methicillin resistant coagulase positive Staphylococcus aureus strain
Miyachi et al. Application of chimeric RNA–DNA oligonucleotides to the detection of pathogenic microorganisms using surface plasmon resonance
US20140377749A1 (en) Metronidazole resistance in trichomonas vaginalis and single nucleotide polymorphisms
US20230031670A1 (en) Method and kit for detection of polynucleotide
WO2014189398A1 (en) Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by pcr, primers as well as bacteria and fungi detection kit
KR20220026367A (ko) 구강질환 유발 세균 검출용 조성물
RU2420589C1 (ru) НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Prevotella intermedia МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
RU2420591C1 (ru) НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Porphyromonas gingivalis МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
CN112029839A (zh) 联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器
Niu et al. DNA nanoassembly based turn-on amplification probe for sensitive colorimetric CRISPR/Cas12a-mediated detection of pathogen DNA
RU2510856C2 (ru) НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Candida albicans МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
US9297034B2 (en) Detection of Streptococcus pneumoniae through magneto-amperometric genosensors using lytA gene-specific primers and probes
RU2810751C1 (ru) Тест-система и способ обнаружения специфических фрагментов нуклеиновых кислот 16 патогенов с использованием изотермической реакции амплификации

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application