CN112029839A - 联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器 - Google Patents
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Abstract
在本专利中，我们建立了联合多重PCR及CRISPR‑Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，通过多重PCR对鲍曼不动杆菌的管家基因以及4个β内酰胺类耐药基因同时扩增，利用LbaCas12a不加区分的单链DNase活性对多重PCR产物进行单一荧光信号输出，在2小时内完成鲍曼不动杆菌的基因型AST，检测限达到50CFU/mL。由于Cas12a的随意切割活性的激活是基于沃森克里克的碱基互补配对原则，只有目标DNA存在时，与引导RNA互补配对激活Cas12a，才可检测到信号。这样检测目标之间完全不受彼此干扰，表明该方法具有高通量高特异的多重基因检测的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)是一种革兰阴性、氧化酶阴性、不发酵葡萄糖的条件致病菌，是危重病人医院获得性感染的主要原因，其中肺炎和血液感染是最常见的感染。鲍曼不动杆菌的易感菌株和抗性菌株的基因组序列揭示了在该生物体中存在大量抗性基因。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药机制较为复杂,产生β-内酰胺类水解酶为其最普遍的机制，相关的耐药基因包括编码水解酶A类超广谱内酰胺酶ESBL的TEM,B类金属内酰胺酶的IMP，C类β内酰胺酶的AmpC，D类苯唑西林酶的OXA-23、OXA-51等。多重耐药鲍曼不动杆菌被认为是最难控制和治疗的耐药性革兰氏阴性细菌之一。传统方法至少需要48小时才能获得菌株及表型药物敏感信息，一定程度上延误了患者的及时抗感染。因此，一种能够快速鉴定耐药基因的现场诊断工具是非常可取的，以便能够更有效地进行抗生素治疗，减少发病率并防止耐药细菌的迅速蔓延。
近年来多种分子生物学方法在临床微生物实验室广泛应用，不仅可以缩短细菌及耐药情况的检测时间，还可以有效提高检测的特异性与敏感性。对上述耐药基因的检测主要方法为PCR分别扩增对应耐药基因，然后对扩增产物进行鉴定，效率较低。近年来兴起的多重PCR因其高通量、简便性等优点发展迅速，已成功用于地中海贫血、病毒、细菌鉴定及耐药基因等检测。通过在单一PCR反应体系中加入2对以上PCR引物，同时扩增出多个目标产物，扩增效率较高，对扩增产物的后续检测通常使用琼脂糖凝胶电泳，较为耗时耗力，限制了该方法的检测效率。多重实时荧光定量PCR则由于荧光光谱的重叠性，限制了多重PCR的检测数量，因此亟需开发新型联合检测技术提高实用性。
在细菌和古细菌基因组中，作为针对入侵性遗传元件的自适应防御系统，观察到了成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)基因座及其相关(Cas)基因，统称为CRISPR-Cas系统。CRISPR酶与可编程引导RNA(gRNA)结合可以靶向DNA或RNA中的互补序列，已在体内基因组编辑、DNA体外组装、医学诊断得到应用，其应用彻底改变了生物学领域。首次在医学诊断方面的应用是张峰实验室提出的基于CRISPR-Cas的核酸检测方法即SHERLOCK，该方法利用Cas13a识别目标RNA后，所获得的对随机RNA的切割活性，结合重组酶聚合酶(RPA)对目标RNA的扩增，显示出aM的敏感性和单碱基错配特异性。在升级版SHERLOCKv2中，通过将Cas13与Csm6结合使用，信号灵敏度提高了3.5倍，更重要的是，使用正交CRISPR酶可以实现4通道单反应多路复用。Doudna实验室和王金报道了对单链DNA的不区分的切割活性，导致分别命名为DETECTR和HOLMES的两个等温DNA检测平台，这消除了SHERLOCK对DNA序列检测所需的DNA到RNA转化的需要。由于Cas酶的随意切割活性的激活是基于沃森克里克的碱基互补配对原则,只有目标DNA存在时与引导RNA互补配对激活Cas，才可检测到信号。这样检测目标之间完全不受彼此干扰，具备高特异性及多重性。因此，我们在此构建联合多重PCR及CRISPR-Cas12a的荧光生物传感器，利用多重PCR对病原菌进行管家基因gltA、耐药基因OXA-23、IMP、OXA-51、AmpC的同时扩增，接着只需要将产物做简单的分离便可利用Cas的随机切割活性进行荧光信号的输出。
发明内容
本发明的目的是开发出一种快速、特异检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器。具体技术方案如下：
一种联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
(1)鲍曼不动杆菌基因组DNA提取
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工，上海)对经PBS稀释的鲍曼不动杆菌进行基因组DNA的提取，将提取的DNA置于-20℃保存备用。
(2)多重PCR扩增
用Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(Takara，大连)试剂盒进行扩增，反应总体系为50μL,具体为25μL的Multiplex Master Mix,5μL的模板DNA，5对引物浓度均为2μM，加入体积均为2μL。反应循环参数为94℃ 1min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
(3)crRNA合成与纯化
首先是转录模板的制备，即25μM的T7-crRNA-F和T7-crRNA-R各3μL在95℃反应5min之后以1℃/min的速度降到20℃，接着使用T7 High Yield Transcription Kit(ThermoFisher Scientific，美国)，按说明书要求分别添加2μL的A、U、C、G碱基以及2μL的酶、4μL的反应缓冲液，总体系为20μL，然后在37℃反应6h，之后再加入4μL Dnase 37℃反应15min。最后用Clean&Concentrator TM-5(QIAGEN，德国)根据说明书要求进行RNA的纯化。
(4)耐药基因检测
CRISPR-Cas12a反应体系总体积为100μL，其中包括10μL多重PCR产物，1.5mM的DTT，10×NEB buffer 2.1，200nM的荧光报告基团，20nM的Cas12a，相对应的crRNA，最后DEPC水补充至100μL。反应条件为避光37℃孵育20min，65℃孵育10min。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。
所述步骤(2)中5对引物浓度均为2μM，加入体积均为2μL，多重PCR反应循环参数为94℃ 1min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。
所述步骤(3)中转录模板的起始浓度均为25μM，反应条件为37℃孵育6h。
所述步骤(4)中CRISPR-Cas12a反应体系总体积为100μL，其中包括10μL多重PCR产物，1.5mM的DTT，10×NEB buffer 2.1，200nM的荧光报告基团，20nM的Cas12a，另外针对管家基因gltA的crRNA浓度为200nM，耐药基因OXA-23的crRNA浓度为500nM，IMP的crRNA浓度为250nM，OXA-51的crRNA浓度为300nM，AmpC的crRNA浓度为200nM。反应条件为避光37℃孵育20min，65℃孵育10min。
本发明由两部分组成：1、对鲍曼不动杆菌基因组DNA的5个靶基因进行多重PCR的核酸扩增系统，2、预先组装好的CRISPR-Cas12a与crRNA以及两端分别标记有荧光基团和猝灭剂的单链DNA荧光报告分子的信号输出系统。当该细菌存在某一耐药基因时，由于PCR扩增的产物片段存在与crRNA互补的DNA序列以及T-rich的PAM序列，将会激活CRISPR-Cas12a对荧光报告分子的随机切割活性。在这种情况下，荧光团与猝灭剂分离，最终该通道就会产生明显的荧光信号。而在没有目标物的情况下，Cas12a的随机切割活性无法被激活，荧光报告分子保持完整，由于猝灭剂靠近荧光团，荧光报告分子的荧光增加可以忽略。由于荧光信号的强度与激活的Cas12a数量成比例，进而与靶标分子的浓度成比例，因此通过分别测量5个通道中荧光信号的变化，可以定性或定量地分析靶标基因。使用这个方法，可以实现多重耐药菌的多个耐药基因同时快速高特异检测。
多重PCR反应体系的成功构建对此传感器的制备起着至关重要的作用，本发明采用琼脂糖凝胶电泳对多重PCR产物进行了验证。如附图1所示，所选菌株即多重耐药鲍曼不动杆菌存在所选靶标的5种基因，且5种产物的条带位置与单一PCR产物的条带位置完全匹配。对PCR产物的进一步测序表明，扩增的序列与NCBI的序列一致。随后，我们证明了多重PCR产物激活CRISPR-Cas12a检测体系的可行性。如附图2所示，Cas12a与crRNA或PCR产物的混合物都不能启动DNA酶活性，只能显示荧光报告分子的背景荧光。相比而言，Cas12a、crRNA和多重PCR产物混合后，37℃孵育20min内可产生显著的荧光信号，这证实了OXA-23靶基因的成功扩增以及高效率的对荧光报告分子的切割。
检测条件是影响生物传感器分析性能的重要因素。在扩增体系中，多重PCR的退火温度影响5个目标基因的同时扩增，因此我们选择了52℃到60℃每隔1℃做一个扩增反应，通过琼脂糖凝胶电泳条带判断最佳退火温度为53℃。
在信号输出体系中，荧光报告分子的浓度，crRNA的浓度，反应时间及温度都对CRISPR-Cas12a检测体系的分析性能产生重大影响。首先是荧光报告分子的浓度优化，在酶促反应动力学中，当酶浓度不变时，反应速度随着底物浓度的增加而增长，在底物浓度增加到一定量时，反应速度不再增加，趋于稳定。如附图3所示，荧光报告分子浓度在100～500nM范围内，荧光生成率经历了先升高后下降的变化，由于使用相对高浓度的荧光报告分子时，分子内和分子间的荧光都会发生猝灭。因此，荧光报告分子浓度的增加不仅会导致荧光团的裂解，还会导致荧光报告分子荧光的自猝灭。为尽量减小初始荧光报告分子浓度的影响，采用标准化的荧光信号强度来优化荧光报告分子的浓度。附图3显示，无论荧光报告分子的浓度如何，最终荧光信号的标准化强度都为22左右，说明荧光报告分子的信噪比接近22。当荧光报告分子浓度在200nM时，标准化强度在45分钟左右就趋于平衡，因此在后续实验中使用200nM的荧光报告分子。
接着是crRNA的浓度优化，理论上，CRISPR-Cas12a与crRNA以1:1的比例结合，考虑到crRNA的稳定性和Cas12a/crRNA复合物的组装效率，在以往的研究中，经常使用稍微多一点的crRNA(如1:1.15)来饱和CRISPR-Cas12a。当使用体外转录试剂盒合成crRNA时，很难直接量化合成的crRNA的准确浓度，因此我们利用滴定法通过终点荧光值对合成的crRNA在100μL标准反应体系里进行优化。如附图4显示，耐药基因OXA-23的荧光强度随着crRNA浓度的增加而增加，在500nM处达到一个平台，表明crRNA对CRISPR-Cas12a的饱和。以同样的方法研究gltA、IMP、OXA-51和AmpC基因的最佳crRNA浓度，如附图5-8显示，crRNA的最佳浓度分别为200nM、250nM、300nM和200nM。
另外，在附图9中可以看到，孵育20min之后就可以获得最佳的切割率，因此后续实验只需要反应20min。最后，是反应温度的优化，众所周知，在不同生物体中酶的最适温度差异较大，只有在最适温度范围内，酶的活性才最强。我们通过终点荧光值来比较三种孵育温度下酶的切割效率，如附图10所示，构建的检测系统在37℃时荧光信号最大，因此，选择37℃作为后续检测系统的孵育温度。
在优化实验条件的基础上构建多重检测的方法，评估其对目标菌多个耐药基因的同时定量分析性能。首先我们用一系列不同浓度的鲍曼不动杆菌对本策略进行了研究，根据10CFU/mL到105CFU/mL不同浓度的鲍曼不动杆菌检测到的结果，如附图11所示，随着靶鲍曼不动杆菌浓度的增加，耐药基因OXA-23的荧光信号也跟着增加，当靶细菌在102-105CFU/mL范围时，信号的增加与DNA浓度的对数有比较好的线性关系，相关系数为0.98，检测限为50CFU/mL，并且运转时间少于2小时。
其次，通过靶向β-内酰胺酶相关的四个耐药基因以及一个管家基因，我们进一步评估了CRISPR-Cas12a阵列的多重检测能力。如附图12所示，在实际样本检测中，鲍曼不动杆菌ATCC19606与临床分离的10株鲍曼不动杆菌具有不同组合的耐药基因。在这11株样本中，均检测到管家基因gltA以及耐药基因IMP，显示了这两个基因的普遍性。同时，这5个基因在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中均未检测到。如附图13所示，琼脂糖凝胶电泳验证了同样的结果，表明该方法具有良好的选择性。
综上所述，我们证明了联合多重PCR及CRISPR-Cas12a可以在2小时内对临床鲍曼不动杆菌进行低至50CFU/mL的检测，在管家基因gltA的指导下具有良好的选择性性能够与其他细菌区分开。在临床中，β-内酰胺类抗菌药物是最常使用的一类抗菌药物，本研究建立简便、快速的方法能同时检测鲍曼不动杆菌的β-内酰胺类耐药基因，快速了解基因情况，从而可监测并推断鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及多重耐药性，有助于尽早、有效地指导临床使用抗生素，治疗感染。因此传感器在鲍曼不动杆菌检测方面具有较好的实用性。
附图说明
图1是多重PCR以及单一PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图
图2是多重PCR产物激活CRISPR-Cas12a可行性分析的荧光分光光度计图谱(扫描)
图3是荧光报告分子浓度优化的荧光分光光度计图谱(动力学)
图4是针对耐药基因OXA-23的crRNA的浓度优化
图5是针对管家基因gltA的crRNA的浓度优化
图6是针对耐药基因IMP的crRNA的浓度优化
图7是针对耐药基因OXA-51的crRNA的浓度优化
图8是针对耐药基因AmpC的crRNA的浓度优化
图9是CRISPR-Cas12a反应时间的优化
图10是CRISPR-Cas12a反应温度的优化
图11是不同浓度的鲍曼不动杆菌与荧光信号的线性关系
图12是传感策咯对临床样本菌多个基因的检出热图
图13是多重PCR扩增临床样本菌多个基因的琼脂糖凝胶电泳图
具体实施方式
制备联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，按以下步骤操作：
(1)鲍曼不动杆菌基因组DNA提取
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工，上海)对经PBS稀释的鲍曼不动杆菌进行基因组DNA的提取，将提取的DNA置于-20℃保存备用。
(2)多重PCR扩增
用Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(Takara，大连)试剂盒进行扩增，反应总体系为50μL,具体为25μL的Multiplex Master Mix,5μL的模板DNA，5对引物浓度均为2μM，加入体积均为2μL。反应循环参数为94℃ 1min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
(3)crRNA合成与纯化
首先是转录模板的制备，即25μM的T7-crRNA-F和T7-crRNA-R各3μL在95℃反应5min之后以1℃/min的速度降到20℃，接着使用T7 High Yield Transcription Kit(ThermoFisher Scientific，美国)，按说明书要求分别添加2μL的A、U、C、G碱基以及2μL的酶、4μL的反应缓冲液，总体系为20μL，然后在37℃反应6h，之后再加入4μL Dnase 37℃反应15min。最后用Clean&Concentrator TM-5(QIAGEN，德国)根据说明书要求进行RNA的纯化。
(4)耐药基因检测
CRISPR-Cas12a反应体系总体积为100μL，其中包括10μL多重PCR产物，1.5mM的DTT，10×NEB buffer 2.1，200nM的荧光报告基团，20nM的Cas12a，相对应的crRNA，最后DEPC水补充至100μL。反应条件为避光37℃孵育20min，65℃孵育10min。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。
Claims (6)
1.一种联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
(1)鲍曼不动杆菌基因组DNA提取
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工，上海)对经PBS稀释的鲍曼不动杆菌进行基因组DNA的提取，将提取的DNA置于-20℃保存备用。
(2)多重PCR扩增
用Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(Takara，大连)试剂盒进行扩增，反应总体系为50μL,具体为25μL的Multiplex Master Mix,5μL的模板DNA，5对引物浓度均为2μM，加入体积均为2μL，反应循环参数为94℃ 1min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
(3)crRNA合成与纯化
首先是转录模板的制备，即25μM的T7-crRNA-F和T7-crRNA-R各3μL在95℃反应5min之后以1℃/min的速度降到20℃，接着使用T7 High Yield Transcription Kit(ThermoFisher Scientific，美国)，按说明书要求分别添加2μL的A、U、C、G碱基以及2μL的酶、4μL的反应缓冲液，总体系为20μL，然后在37℃反应6h，之后再加入4μL Dnase 37℃反应15min，最后用Clean&Concentrator TM-5(QIAGEN，德国)根据说明书要求进行RNA的纯化。(4)耐药基因检测
CRISPR-Cas12a反应体系总体积为100μL，其中包括10μL多重PCR产物，1.5mM的DTT，10×NEB buffer 2.1，200nM的荧光报告基团，20nM的Cas12a，相对应的crRNA，最后DEPC水补充至100μL，反应条件为避光37℃孵育20min，65℃孵育10min。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。
2.如权利要求1所述的联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，其制备方法步骤(2)中5对引物浓度均为2μM，加入体积均为2μL。
3.如权利要求1所述的联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，其制备方法步骤(2)中多重PCR多重PCR反应循环参数为94℃ 1min；94℃30s，53℃ 30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
4.如权利要求1所述的联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，其制备方法步骤(3)中T7-crRNA-F和T7-crRNA-R的起始均为25μM 3μL，反应条件为37℃孵育6h。
5.如权利要求1所述的联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，其制备方法步骤(4)中CRISPR-Cas12a反应体系总体积为100μL，其中包括10μL多重PCR产物，1.5mM的DTT，10×NEB buffer 2.1，200nM的荧光报告基团，20nM的Cas12a。
6.如权利要求1所述的联合多重PCR及CRISPR-Cas的快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的生物传感器，其制备方法步骤(4)中针对管家基因gltA的crRNA浓度为200nM，耐药基因OXA-23的crRNA浓度为500nM，IMP的crRNA浓度为250nM，OXA-51的crRNA浓度为300nM，AmpC的crRNA浓度为200nM。反应条件为避光37℃孵育20min，65℃孵育10min。
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| CN113373170A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-09-10 | 江西农业大学 | 一种pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统及其应用 |
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