WO2012177089A2 - 클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커 - Google Patents
클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2012177089A2 WO2012177089A2 PCT/KR2012/004970 KR2012004970W WO2012177089A2 WO 2012177089 A2 WO2012177089 A2 WO 2012177089A2 KR 2012004970 W KR2012004970 W KR 2012004970W WO 2012177089 A2 WO2012177089 A2 WO 2012177089A2
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- chlorella
- seq
- microsatellite
- nos
- marker
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Definitions
- the present invention relates to a novel microsatellite molecular marker that can be distinguished between strains of microalga Chlorella and strain levels within a species, and primers for amplifying the same.
- the core of the biofuel production technology through the production of biomass of such microalgae is to secure excellent microalgae strains, and thus, studies on securing and improving strains worldwide are being actively conducted.
- Chlorella a single-cell green alga, is one of the representative microalgae sold commercially as a dietary supplement containing pharmaceuticals, proteins and antioxidants. Chlorella is a species that attracts much attention as a strain for biofuel production as well as food and medicine because it is a microalgae having a very good growth rate. Chlorella is commonly found in a wide variety of habitats in nature, and its size, shape, and type have been widely reported, making it difficult to accurately isolate and identify these strains, even in expert groups. Therefore, when a better trait of the various chlorella strains is secured, more accurate fractionation is a very important factor in terms of protection of property rights. Therefore, the need for easy genetic analysis and high discrimination of genetic markers is very high. .
- RFLP restriction fragment length polymorphism
- RAPD randomly amplified polymorphic DNA
- AFLP amplified fragment length polymorphism
- ISSR inter-simple sequence repeat
- SSR simple sequence repeat
- microsatellite is widely distributed throughout the genome, and is a polymorphic locus consisting of specific repeating structures with short bases of 2-8 bp. It is known as a very powerful identification marker. Because microsatellite is genetically diverse and contains a lot of information, it has been actively studied internationally for use in genetic breeding of plants, isolation of new functional genes and differentiation between related species. Microsatellite research on rice, which is already very important for food matters, is being conducted in-depth at national rice institutes and universities in China, and in Japan, quantitative features for the regulation of genes with specific functions of rice. A microsatellite chromosome map was also created for the purpose of identifying loci with.
- Microsatellite molecular markers use primers made from conserved specific sequences near repeats, enabling clear genotyping even for genetically hybridized species, high discrimination, ease of analysis, and genetic analysis. It has many advantages over other molecular markers such as high reproducibility.
- the present invention has developed a new microsatellite molecular marker in the genome of microalga Chlorella, and at a strain level that is difficult to distinguish by morphological classification method and molecular classification method such as 18S rDNA sequence or ITS sequence analysis. Discernment of
- the present inventors have used morphological classification and 18S rDNA sequencing or ITS sequencing, which have been used as a microalgae classification method for differentiation of microalgae chlorella strains as food and biofuel materials.
- the present invention has been completed for more reliable and faster classification of chlorella strains that are difficult to distinguish even by the proper classification method.
- an object of the present invention is Chlorella related species consisting of one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 to enable PCR amplification so that the DNA of chlorella as a template to confirm the difference between the polymorphism of the allele type
- Chlorella related species consisting of one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 to enable PCR amplification so that the DNA of chlorella as a template to confirm the difference between the polymorphism of the allele type
- microsatellite markers of chlorella comprising one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 26.
- the present invention provides a chlorella microsatellite specific molecular marker comprising one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16.
- the marker is characterized in that it is used for differentiation at the species or strain level of chlorella.
- the present invention provides a primer for classification identification of chlorella comprising one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 26.
- the invention also includes a primer consisting of one base sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17 and 18, SEQ ID NO: 19 and 20, SEQ ID NO: 21 and 22, SEQ ID NO: 23 and 24, and SEQ ID NO: 25 and 26 It provides a composition for classifying chlorella.
- the present invention provides a chlorella classification kit comprising the composition.
- the present invention also provides a method for measuring the fragment length polymorphism of a chlorella microsatellite-specific molecular marker comprising one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 Provide a kit for classification.
- the present invention is a) one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17 and 18, SEQ ID NO: 19 and 20, SEQ ID NO: 21 and 22, SEQ ID NO: 23 and 24, and SEQ ID NO: 25 and 26 in Chlorella chromosome Amplifying a microsatellite molecule of chlorella by polymerase chain reaction (PCR) using a paired primer; And b) classifying the amplified DNA through fragment length polymorphism of the amplified DNA (Deoxyribonucleic acid).
- a novel microsaclite molecular marker derived from chlorella presented in the present invention enables the identification of several species of chlorella that are genetically flexible by analyzing the polymorphic genotype of the allele according to the number of repetitions of short sequences present in the chlorella gene
- Chlorella vulgaris -UTEX 265, Chlorella vulgaris -NIES 2170 and commercially available commercial Chlorella strains from domestic D company it is also possible to clearly distinguish several chlorella strains. It can be used as a species marker or as a marker at strain level within a species.
- microsatellite markers presented in the present invention can be separated at the species and strain level of chlorella, more important than the chlorella, a very important microalgae gene source used in a wide variety of fields such as food, medicine and energy resources, etc. It is expected that certain strain lines can be obtained. In addition, this may fundamentally block ownership disputes, which may be the protection and controversy of intellectual property rights for chlorella strains of superior varieties developed and improved by researchers. According to the recent international situation, the impact of biological resources on national competitiveness is so great that they cannot be free from the acquisition, management, and ownership disputes resulting from the 10th Convention on Biological Diversity in Nagoya, Japan, in October 2010.
- the Nagoya Protocol is the second protocol following the Cartagena Biostability Protocol adopted by the Conference of the Parties to the Convention on Biological Diversity in 2000.
- benefits derived from the genetic resources including monetary and non-monetary gains
- the core of this technology is a molecular marker that can be identified when a high performance algae ( Chlorella ) strain is obtained, and it is easy to distinguish homologous strains that are not easily distinguished by a group of experts on classification of microalgae. It is an excellent technology.
- Chlorella vulgaris is the most widely used species in the Chlorella Genus group, which is widely used both domestically and internationally.These species are widely distributed by 18s rDNA or ITS sequences. It is impossible to do. In other words, if these species can be distinguished at the strain level, this could be a powerful device for claiming genetic resources both nationally and internationally. It can also be useful in basic biological research such as chromosome mapping of chlorella, identification of new useful genes and genetic breeding, and the search for disease.
- FIG. 1 is a diagram confirming 18S rDNA partial sequencing of 3 strains of Chlorella vulgaris identified as the same species, and performing multi-alignment analysis to confirm that there was no difference in 18S rDNA sequencing of 3 strains.
- Figure 2 is a genomic DNA of three different strains ( Chlorella vulgaris -UTEX 265, Chlorella vulgaris -NIES 2170 and Chlorella vulgaris for food D of Korea ) of the same Chlorella vulgaris species having the same 18S rDNA sequence of the present invention as a template Three markers (mChl-001, 005, 012) of the target microsatellite markers were used to confirm the polymorphism of the genotype.
- Figure 3 shows the results of analyzing the allele type after PCR amplification using three markers (mChl-001, 005, 012) among microsatellite markers of the present invention using genomic DNA of different chlorella species as a template. It is a diagram showing that three different chlorella and two different strains of the same species can be clearly distinguished by the difference in polymorphism.
- Figure 4 shows the genotyping of allele genotypes of the respective markers as a result of genotyping of 9 different strains in the same Chlorella vulgaris species distributed in the US and Japan strain distribution centers using the microsatellite markers of the present invention. The combination shows that all strain lines are clearly distinguished.
- the present invention provides a microsatellite of chlorella comprising one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16, which enables discrimination at the species and strain levels of chlorella, a single-cell microalgae producing food and biofuels.
- a primer for amplifying a microsatellite marker of the chlorella comprising a light marker and one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17 to 26.
- the present invention (1) searching for a simple sequence repeat (SSR) motif from the full nucleotide sequence of Chlorella vulgaris provided in the existing database, and based on this design a specific primer; (2) culturing 10 homologous Chlorella vulgaris (including commercially available Chlorella products) and 2 heterologous chlorella in BG11 medium, and then purifying the genomic DNA; And (3) performing specific PCR amplification using the prepared primers, and checking the obtained amplification products through polymorphic amide polyacrylamide gel electrophoresis to confirm polymorphism of allele types, and analyze and identify the structure of each allele type. This step allows the different genotypes of the five microsatellite markers to differentiate between chlorella species and at the strain level.
- SSR simple sequence repeat
- the present invention relates to the development of microsatellite markers that can identify genetic variations between different chlorella species and within other strains within the same species.
- microsatellite markers for the purpose of developing microsatellite markers, two strains in the same species of two different chlorella genus were distributed and cultured at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, and then used as a strain.
- a commercial chlorella producer D purchased a commercially available product, and nine different chlorella strains of the same genus were obtained from microalgal distribution centers in the United States and Japan, respectively, and extracted genomic DNA.
- Chlorella's Chloroplasm complete sequence information (Accession number.NC_001865) can be downloaded from the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and GRAMENE Ssrtool (http: // www. gramene.org/db/markers/ssrtool) was used to search for loci containing microsatellites.
- a primer was designed to specifically amplify the locus, based on the nucleotide sequence of the locus containing the retrieved microsatellite.
- the length of the primer was between 20 and 26 bp
- the temperature at which the primer was attached (Tm) was 50 to 65 °C
- the size of the PCR final amplification product was prepared to be within the range of 100 ⁇ 300bp.
- PCR amplification was performed using purified DNA as a template, and the optimal PCR conditions were 95 ° C-5 minutes, after preliminary denaturation, 95 ° C-30 seconds, 50-65 ° C-30 seconds, 72 ° C. -The conditions of 30 seconds were implemented by 35 cycles, and it was carried out by extending reaction for the last 72 degreeC-7 minutes.
- 5% modified polyacrylamide gel electrophoresis was carried out to confirm the polymorphism of the product amplified by each marker, and the nitric acid was confirmed to be polymorphic in the form of a band through dyeing (FIGS. 2 and 3). , 4).
- polymorphic bands were cut out and DNA sequence in the gel was analyzed to identify the structures and name each allele type.
- the present invention comprises a primer consisting of one base sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17 and 18, SEQ ID NO: 19 and 20, SEQ ID NO: 21 and 22, SEQ ID NO: 23 and 24, and SEQ ID NO: 25 and 26. It provides a classification identification composition of chlorella and a chlorella classification identification kit comprising the same. Also provided is a chlorella classification kit, characterized by using a method for measuring the length polymorphism of a chlorella microsatellite specific molecular marker comprising one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 .
- the "Chlorella classification identification composition” is a probe for measuring the length polymorphism of the Chlorella classification identification primer set and / or Chlorella microsatellite molecular markers and a PCR reaction buffer, DNA polymerization necessary to perform the polymerase chain reaction Enzymes, dNTPs or buffers for performing the hybridization reaction of the probe with the molecular markers may include, but are not limited thereto.
- the “kit” is a container comprising a partitioned carrier means for holding a sample, a chlorella sorting primer set and / or a probe capable of measuring the length polymorphism of the chlorella microsatellite molecular marker of the present invention, a buffer for PCR reaction, and It may include one or more containers including a container containing a DNA polymerase, the primer set may include one or more primers comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 26.
- the carrier means is suitable for containing one or more containers, such as bottles, tubes, each container comprising independent components used in the methods of the present invention, one of ordinary skill in the art will appreciate Easy to distribute
- the heterologous chlorella used in this experiment was sold by the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, and was used as a commercial chlorella vulgaris of domestic D company (see Table 1).
- the different strains of Chlorella vulgaris are the American Strain Distribution Center UTEX (At The University of Texas at Austin; UTEX The Culture collection of Algae) and the Japanese Microalgal Strain Distribution Center NIES (At National Institute for Environmental Studies; Microbial culture collection). ) And was used (see Table 2).
- the culture conditions of chlorella were shaken in a light incubator for 24 hours at 120 ⁇ 5 ⁇ mol / photons / m2 / s, temperature 25 ⁇ 2 °C conditions for 2 hours with light.
- the cultured samples were harvested by centrifugation, the medium was removed, glass beads were added, the bead beating was pulverized, and then purified using a DNA purification kit.
- the food chlorella was finely crushed into a mortar and then DNA in the same manner. Was purified.
- Table 1 Species name Culture collection Medium One Chlorella regularis UTEX 1807 BG11 2 Chlorella regularis NIES 2170 BG11 3 Chlorella regularis UTEX 265 BG11 4 Chlorella regularis CCAP 211/14 BG11 5 Chlorella regularis Company D commercial product (for food)
- Chlorella's chloroplast complete sequencing information (Accession number.NC_001865) was retrieved from NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) to search for loci containing microsatellites in the chlorella genome. Only the locus containing the microsatellite was downloaded using the program GRAMENE Ssrtool (http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool), which was downloaded from the database provided and provided publicly on the Internet. Search.
- a primer was prepared to specifically amplify the locus. Sequences of the prepared primers are shown in Table 3. As shown in Table 3, the length of the primer was 20 ⁇ 26 bp, the temperature of the primer (Tm) was 50 to 60 °C, the size of the PCR final amplification product was designed to be within the range of 150 ⁇ 300bp.
- PCR amplification of the purified DNA template was carried out, and the optimal PCR conditions to stably amplify 95 °C-5 minutes, after preliminary denaturation, 95 °C-30 seconds, 50 ⁇ 65 °C-30 seconds , 72 °C-30 seconds conditions were carried out in 35 repetition cycles, and the final 72 °C-7 minutes extension reaction was carried out by finding the conditions and modifying according to the situation.
- Silver nitrate is a promega DNA silver dye kit, and the electrophoretic gel is fixed in 10% ethanol for 20 minutes, reacted with 1% nitric acid solution for 10 minutes, dyed for 30 minutes in silver nitrate solution, and treated with sodium carbonate. The reaction was performed until the band developed black. The development reaction was treated with 10% glacial acetic acid solution to induce the reaction to stop. In addition, in order to analyze the structure of each allele, a polymorphic band was cut out, DNA was extracted from the gel, and DNA sequencing was performed to identify the structure and name each allele type as shown in Table 4.
- the allele genotype of each marker detected from the four chlorella 3 genome DNAs of Table 1 is shown in Table 5, respectively.
- Chlorella regularis Chlorella vulgaris (NIES 2170) Chlorella vulgaris (UTEX 265) Chlorella zofingiensis mChl-001 5,3 5,5 7,7 3,3 mChl-005 2,2 5.5,5.5 2,2 5,5 mChl-012 1,1 1,1 2,2 1,1 genotype from [FIG. 3]
- C. regularis can be expressed as a combined genotype of 5,3-2,1-1,1 by three markers, and thus, 5,5-5.5,5.5-1,1 (C. vulgaris NIES 2170 ), 7,7-2,2-2,2 (C. vulgaris UTEX 265), 3,3-5,5-1,1 (C. zofingiensis) You can check it. Using the marker of the present invention, it can be confirmed that genus levels of chlorella, ie, species identification, are possible.
- chromosome of Chlorella of the present invention as one base sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 19 and 20, SEQ ID NOs: 21 and 22, SEQ ID NOs: 23 and 24, and SEQ ID NOs: 25 and 26 Amplify the microsatellite molecules of chlorella by polymerase chain reaction (PCR) using the primers formed, and amplify the length of the amplified DNA (Deoxyribonucleic acid), that is, the chlorella microsatellite specific molecular marker. polymorphism can be used to classify chlorella.
- PCR polymerase chain reaction
- microsatellite markers presented in the present invention can be separated at the species and strain level of chlorella, more important than the chlorella, a very important microalgae gene source used in a wide variety of fields such as food, medicine and energy resources, etc. It is expected that certain strain lines can be obtained. It is also expected to play an important role in the protection of intellectual property rights for chlorella strains of superior varieties developed and improved by researchers in the future.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 클로렐라의 마이크로새틀라이트 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 미세조류 클로렐라(Chlorella)의 종간 및 종 내의 균주 수준에서 구분이 가능한 새로운 마이크로새틀라이트 분자적 마커(microsatellite molrcular marker) 및 이를 증폭하기 위한 프라이머에 관한 것이다. 본 발명에서 제시한 클로렐라 유래의 새로운 마이크로새클라이트 분자적 마커를 통해 클로렐라 유전자에 존재하는 짧은 염기서열의 반복수에 따른 대립유전자의 다형성 유전자형을 분석함으로써 유전적으로 유연관계가 깊은 클로렐라 몇몇 종간 구분을 가능하게 할 뿐만 아니라 동일 종 내의 클로렐라 균주를 명확히 구분할 수 있어 클로렐라의 종간 구분 마커 또는 종 내의 균주 수준에서의 구분 마커로써 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 미세조류 클로렐라(Chlorella)의 종간 및 종 내의 균주 수준에서 구분이 가능한 새로운 마이크로새틀라이트 분자적 마커(microsatellite molecular marker) 및 이를 증폭하기 위한 프라이머(primer) 등에 관한 것이다.
최근 급변하는 사회 속에서 산업이 발전하고, 도시화 및 자동화가 진행되면서 에너지 자원의 소모가 급격히 증가하고 있다. 이러한 제한적 화석연료의 고갈은 수요의 증가와 더불어 가격 상승의 원인이 되며, 전 세계적으로 매립된 원유의 양이 급속도로 소비되어감에 따라서, 이를 대체할 수 있는 대체에너지의 개발에 대한 관심과 요구가 크게 증가되고 있다. 이처럼 한정된 에너지 자원의 고갈로 인해 야기될 수 있는 여러 가지 에너지 문제에 대한 가장 효과적인 해결책으로 미세조류를 이용한 지속 가능한 바이오연료 생산 기술 개발이 제시되고 있다. 미세조류는 빠르게 성장하며, 세포내 함유하고 있는 지질체 중에서 20~ 50% 가까이를 중성지질로 합성, 축적하여 저장하고 있기 때문에 미세조류의 바이오매스로부터 바이오디젤의 생산이 가능할 뿐만 아니라, 태양에너지와 대기 중의 이산화탄소를 이용하여 광합성을 하기 때문에 지구온난화의 주요 원인이 되는 대기 중 이산화탄소 및 온실가스의 저감효과를 동시에 해결할 수 있는 대안으로 떠오르고 있다. 이와 같은 미세조류의 바이오매스 생산을 통한 바이오연료의 생산 기술에 있어 핵심은 우수한 미세조류 균주를 확보하는 것이기 때문에 전 세계적으로 균주의 확보 및 개량에 관한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다.
단세포 녹조류인 클로렐라는 의약품, 단백질 및 항산화물질을 함유하는 건강보조식품으로써 상업적으로 판매되고 있는 대표적인 미세조류 중 하나이다. 클로렐라는 생장률이 매우 우수한 특징을 가지는 미세조류이기 때문에 식품, 의약품 뿐만 아니라 바이오연료 생산을 위한 균주로써도 많은 주목을 받는 종이다. 클로렐라는 자연계에서 매우 다양한 서식환경에서 흔히 존재하며, 그 크기, 형태 및 종류가 매우 다양하게 보고되고 있기 때문에 전문가 그룹에서 조차 이들 균주를 정확하게 분리, 동정하는 것이 쉽지 않다. 따라서 이처럼 다양한 클로렐라 균주들 중 보다 우수한 형질의 균주를 확보하였을 때, 이를 보다 정확하게 분별하는 것은 재산권의 보호 차원에서도 매우 중요한 요소가 되므로 분석이 쉽고, 분별력이 높은 유전적 분자마커의 필요성이 매우 높아지고 있다.
유전적 분자마커는 최근 생명공학기술의 급속한 성장에 힘입어 DNA 수준에서의 활발한 연구와 개발이 이루어져 왔다. 이는 농업 기술에 적용되면서 중요한 가치를 지닌 주요 작물들의 유전적 근연관계를 규명하고, 고유의 유전자원으로써 위치를 판단 가능하도록 함으로써 유전자원의 가치를 향상시키는데 커다란 기여를 하였다. DNA 수준에서의 분자적 마커의 종류에는 대표적으로 restriction fragment length polymorphism(RFLP), randomly amplified polymorphic DNA(RAPD), amplified fragment length polymorphism(AFLP), inter-simple sequence repeat(ISSR), simple sequence repeat(SSR)으로 알려진 마이크로새틀라이트, single nucleotide polymorphism(SNP) 등이 있다. 이들 DNA 기반의 분자적 마커 중 마이크로새틀라이트는 유전체 전체에 널리 분포하고, 2-8 bp의 짧은 염기가 특이적인 반복구조로 이루어진 다형성 좌위로써 개체마다 고유의 반복횟수 다형성을 보이므로 이러한 다형성의 차이를 이용한 매우 강력한 개체식별 마커로 알려져 있다. 마이크로새틀라이트는 유전적으로 매우 다양하고 많은 정보를 함유하고 있기 때문에 식물체의 유전육종, 신규 기능성 유전자 분리 및 근연종간 구분에 이용하기 위해 국제적으로 매우 활발하게 연구되고 있다. 이미 식량문제에 있어 매우 중요한 위치에 있는 벼에 대한 마이크로새틀라이트 연구는 중국의 국립 벼 연구소와 대학을 중심으로 심도 있게 진행되고 있으며, 일본에서는 벼의 특이적인 기능을 갖는 유전자의 조절을 위한 정량적 특징을 갖는 좌위를 동정하기 위한 목적으로 마이크로새틀라이트 염색체 지도를 작성하기도 했다. 또한 국내에서도 형질전환 벼의 유전자가 야생의 유사 종으로 옮겨지는 유전자 유동(gene flow) 빈도를 확인하기 위한 마이크로새틀라이트 마커를 개발 이용한 사례가 있으며, 밀, 쌀, 보리, 콩, 사탕수수, 옥수수 등과 같은 주요 농작물과 참깨, 들깨 등과 같이 유전적 거리가 가까운 작물들의 진화적 거리를 분석하는 등 매우 다양하고 광범위한 연구에 유용하게 사용되고 있다.
마이크로새틀라이트 분자적 마커는 반복서열 근처의 보존된 특이적인 염기서열로부터 만든 시발체를 이용하므로 유전적으로 교잡된 종일 지라도 명확한 유전자형 분석이 가능하며, 높은 변별력과 분석 작업의 편리성, 유전적 분석에 있어 높은 재현성 등 다른 분자적 마커들에 비해 많은 장점을 갖고 있다.
이에, 본 발명은 미세조류 클로렐라의 유전체 내에 존재하는 새로운 마이크로새틀라이트 분자마커를 개발함으로써 형태적 분류방법 및 18S rDNA 염기서열 또는 ITS 염기서열 분석과 같은 분자적 분류 방법으로도 분별하기 어려운 균주 수준에서의 분별을 가능하도록 하였다.
본 발명자들은 식품 및 바이오연료의 재료가 되는 미세조류 클로렐라 균주의 유전자원으로써의 차별화를 위해 기존에 미세조류의 분류 방법으로 사용되어온 형태적 분류방법 및 18S rDNA 염기서열 또는 ITS 염기서열 분석과 같은 분자적 분류 방법으로도 분별하기 어려운 클로렐라 균주의 보다 확실하고 빠른 분별을 위해 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 목적은 클로렐라의 DNA를 주형으로 대립유전자형의 다형성 차이를 확인할 수 있도록 PCR 증폭을 가능하게 하는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열로 이루어지는 클로렐라 근연종 및 각기 다른 균주들의 마이크로새틀라이트 마커, 및 서열번호 17 내지 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라의 마이크로새틀라이트 마커를 증폭하기 위한 프라이머를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는, 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 마커는 클로렐라의 종 간 또는 균주 수준에서의 구분 용도로 사용되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 서열번호 17 내지 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라의 분류식별용 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 포함하는 클로렐라의 분류식별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 클로렐라 분류식별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 측정하는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 클로렐라 분류식별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 a)클로렐라의 염색체에서 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 클로렐라의 마이크로새틀라이트 분자를 증폭하는 단계; 및 b)상기 증폭된 DNA(Deoxyribonucleic acid)의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 통해 분류하는 단계로 구성되는 클로렐라의 분류 식별방법을 제공한다.
본 발명에서 제시한 클로렐라 유래의 새로운 마이크로새클라이트 분자적 마커를 통해 클로렐라 유전자에 존재하는 짧은 염기서열의 반복 수에 따른 대립유전자의 다형성 유전자형을 분석함으로써 유전적으로 유연관계가 깊은 클로렐라 몇몇 종간 구분을 가능하게 할 뿐만 아니라 동일 종 내의 Chlorella vulgaris - UTEX 265, Chlorella vulgaris - NIES 2170 및 상용화되어 시판되고 있는 국내 D사의 식품용 클로렐라 균주를 명확히 구분할 수 있을 뿐만 아니라 여러 종류의 클로렐라 균주를 명확하게 구분 가능하기 때문에 종간 구분 마커 또는 종 내의 균주 수준에서의 구분 마커로써 활용할 수 있다.
본 발명에서 제시한 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 클로렐라의 종 간 및 균주 수준에서의 분리가 가능해짐에 따라서 식품, 의학, 에너지 자원 분야 등 매우 다양한 분야에서 활용되는 매우 중요한 미세조류 유전자원인 클로렐라의 보다 확실한 균주 라인을 확보할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 이는 추후 연구자들에 의해 개발 및 개량된 우수 품종의 클로렐라 균주에 대한 지적 재산권의 보호 및 논쟁이 될 수 있는 소유권 분쟁을 원천적으로 봉쇄할 수 있다. 최근 국제 정세에 의하면, 생물자원이 국가경쟁력에 미치는 영향력이 매우 큰 바 생물자원의 확보와 관리, 그리고 이에 따른 소유권 분쟁에서 자유로울 수 없게 되었다.2010년 10월 일본 나고야에서 열린 제 10차 생물다양성협약 당사국 총회에서는 생물자원을 활용하여 생기는 이익을 누구와 어떻게 공유할 것인지에 대한 논의가 이루어졌고, 나고야의정서라는 국제협약을 발의하였다. 나고야의정서는 2000년 생물다양성 협약 당사국 총회에서 채택된 카르타헤나 바이오안정성의정서에 이은 2번째 의정서로써, 동물, 식물 및 미생물 포함한 모든 생물 유전자원을 이용하는 나라는 유전자원 제공 국가에 미리 통보해 승인을 받아야 하며, 해당 유전자원을 이용해서 얻은 이익(금전적, 비금전적 이익 포함)은 상호 합의된 계약조건에 따라 배분해야 한다고 명시하고 있다. 이는 각종 생물 유전자원에 대해 국제적으로 인정받는 지역 및 국가가 지식자산으로서의 소유권을 행사할 수 있게 된 것을 의미하므로, 이에 대비한 유전자원 발굴과 정보 획득 및 자료 정립이 매우 중요해졌다.
이에 따라, 국내에서도 토착 생물 유전자원의 정보 획득 및 자료 정립이 꼭 필요한 상황이며 특히 최근 국제적으로 많은 연구가 이루어지고 있는 미세조류에 대한 유전자원 확보 노력은 반드시 필요한 사항이 되었다. 본 기술의 핵심은 우수한 성능을 갖는 미세조류 (Chlorella) 주가 확보되었을 때, 이를 식별할 수 있는 분자 마커로써, 미세조류의 분류식별에 관한 전문가 그룹에서도 구분하기 쉽지 않은 동종의 strain을 쉽게 구분할 수 있는 뛰어난 기술이라 할 수 있다.
현재 국내 및 국제적으로 널리 이용되고 있는 Chlorella Genus 그룹 가운데 가장 많은 분야에서 이용되는 종이 Chlorella vulgaris 이며, 다양하게 분포하고 있는 이들 종들은 기존에 알려진 균주식별 마커인 18s rDNA 염기서열 또는 ITS 염기서열로는 구분하는 것이 불가능하다. 즉, 이들 종들을 균주 수준에서도 구분할 수 있다면, 이로 인해 국내 및 국제적으로 유전자원의 소유권을 주장하기 위한 강력한 장치가 될 수 있을 것이다. 또한 클로렐라의 염색체 지도 작성, 새로운 유용 유전자의 동정 및 유전 육종, 질병의 탐색과 같은 기초 생물학적 연구에서도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 동일한 종(species)으로 동정된 클로렐라 불가리스 3 균주의 18S rDNA partial 염기서열을 분석하고, multi-alignment 분석을 수행하여 3 균주의 18S rDNA 염기서열에서의 차이가 없었음을 확인한 도이다.
도 2는 동일한 18S rDNA 염기서열을 갖는 같은 클로렐라 불가리스 종 중, 서로 다른 3 균주(Chlorella vulgaris - UTEX 265, Chlorella vulgaris - NIES 2170 및 국내 D사의 식품용 Chlorella vulgaris)의 genomic DNA를 주형으로 본 발명의 대상인 마이크로새틀라이트 마커 중 3개의 마커(mChl-001, 005, 012)를 이용하여 유전자형의 다형성을 확인함으로써 세 가지 균주를 대상으로 균주 수준의 확실한 분별력이 있음을 보여주는 도이다.
도 3은 서로 다른 클로렐라 종들의 genomic DNA를 주형으로 하여 본 발명의 대상인 마이크로새틀라이트 마커 중 3개의 마커(mChl-001, 005, 012)를 이용한 PCR 증폭 후 대립유전자형을 분석한 결과로써 대립유전자형의 다형성의 차이에 의해 서로 다른 클로렐라 3종 및 동종의 다른 두 가지 균주를 확실하게 구분할 수 있음을 나타낸 도이다.
도 4는 미국과 일본의 균주분양센터에서 분양받은 동일한 클로렐라 불가리스 종내의 서로 다른 9개의 균주를 대상으로 본 발명의 대상인 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 genotyping을 실시한 결과로써 각각의 마커의 대립유전자 유전자형의 조합을 통해 모든 균주라인이 명확히 구분됨을 보여주는 도이다.
본 발명은 식품 및 바이오연료를 생산하는 단세포 미세조류인 클로렐라의 종간 및 균주 수준에서의 분별을 가능하게 하는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라의 마이크로새틀라이트 마커 및 서열번호 17 내지 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 상기 클로렐라의 마이크로새틀라이트 마커를 증폭하기 위한 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 기존의 데이터베이스에서 제공하는 클로렐라 불가리스의 클로로플라스트 전체 염기서열로부터 Simple sequence repeat(SSR) motif를 검색하고, 이를 기본으로 특이적인 프라이머를 디자인하는 단계; (2) 동종의 클로렐라 불가리스 10 균주(상용화된 클로렐라 제품 포함)및 이종의 클로렐라 2종을 BG11 배지에서 배양 한 후, genomic DNA를 정제하는 단계; 및 (3) 제작된 프라이머를 이용하여 특이적 PCR 증폭을 수행하고, 얻어진 증폭산물을 5% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 대립유전자형의 다형성을 확인하고, 각각의 대립유전자형의 구조 분석 및 동정하는 단계를 통해 5 가지 마이크로새틀라이트 마커의 복합 유전자형의 차이로 클로렐라 종간 및 균주 수준에서의 구별을 가능하게 한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서로 다른 클로렐라 종 간 및 같은 종 내의 다른 균주의 유전적 변이를 확인할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커의 개발에 관한 것이다. 본 발명에서는 마이크로새틀라이트 마커를 개발하기 위한 목적으로, 서로 다른 클로렐라 속 2종과 같은 종 내 2 균주를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에서 분양받아 배양 후 사용하였고, 식품으로 판매되는 1 균주는 국내 식품용 클로렐라 생산업체 D사의 상용 판매되는 제품을 구입하였으며, 같은 속의 서로 다른 클로렐라 9개 균주는 미국과 일본의 미세조류 분양센터에서 분양받아 각각 genomic DNA를 추출하였다. 클로렐라의 클로로플라스트 전체 염기서열 정보(Accession number. NC_001865)는 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 데이터베이스를 다운로드하여, GRAMENE Ssrtool(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool) 프로그램을 사용하여 마이크로새틀라이트를 포함하는 좌위를 검색하였다.
검색된 마이크로새틀라이트를 포함하는 좌위의 염기서열을 기초로 이 좌위를 특이적으로 증폭할 수 있도록 하는 프라이머를 디자인 하였다. 프라이머의 길이는 20 ~ 26 bp 사이로 하였고, 프라이머가 붙는 온도(Tm)는 50 ~ 65℃가 되도록 하였으며, PCR 최종 증폭 산물의 크기는 100 ~ 300bp 범위 내에 있도록 제작하였다.
제작된 프라이머를 사용하여, 정제된 DNA를 주형으로하여 PCR 증폭을 실시하였고, 최적 PCR 조건은 95℃ - 5분 동안 예비 변성 후, 95℃ - 30초, 50~65℃ - 30초, 72℃ - 30초의 조건을 35 주기로 실시하고, 최종 72℃ - 7분간 연장 반응하여 실시하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 각 마커에 의해 증폭된 산물의 다형성을 확인하기 위하여 5% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하고, 질산은 염색을 통하여 밴드의 형태로 다형성을 확인하였다(도 2, 3, 4 참조). 또한 각각의 대립유전자형의 구조를 분석하기 위하여 다형성 밴드를 오려 겔 내의 DNA 추출 후 염기서열 분석을 함으로써 구조를 파악하여 각각의 대립유전자형을 명명하였다.
상기 결과를 통하여 본 발명의 마커 및/또는 프라이머를 이용하여 클로렐라의 속(genus) 및 종(species)을 분류할 수 있다는 것을 확인하였다. 이에 본 발명은 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 포함하는, 클로렐라의 분류식별용 조성물과 이를 포함하는, 클로렐라 분류식별용 키트를 제공한다. 또한 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커의 길이 다형성을 측정하는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 분류식별용 키트를 제공한다.
상기 "클로렐라의 분류식별용 조성물"은 클로렐라 분류식별용 프라이머 세트 및/또는 클로렐라 마이크로새틀라이트 분자마커의 길이다형성을 측정할 수 있는 프로브와 중합효소 연쇄반응을 수행하는데 필요한 PCR 반응용 버퍼, DNA 중합효소, dNTP 또는 상기 프로브와 분자마커의 결합(hybridization) 반응을 수행하는데 필요한 버퍼 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
상기 "키트"는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 클로렐라 분류식별용 프라이머 세트 및/또는 본 발명의 클로렐라 마이크로새틀라이트 분자마커의 길이다형성을 측정할 수 있는 프로브를 포함하는 용기, PCR 반응용 버퍼 및 DNA 중합효소를 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 내지 서열번호 26에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머를 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 클로렐라 5 균주의 확보 및 DNA 추출
본 실험에 사용한 이종의 클로렐라는 한국생명공학연구원 미생물자원센터에서 분양받아 사용하였으며, 국내 D사의 식품용 클로렐라 불가리스는 시중에서 판매되는 상품을 구입하여 사용하였다(표 1 참조). 그리고 클로렐라 불가리스의 각기 다른 균주들은 미국의 균주 분양센터 UTEX(At The University of Texas at Austin; UTEX The Culture collection of Algae)와 일본의 미세조류 균주분양센터 NIES(At National Institute for Environmental Studies; Microbial culture collection)에서 분양받아 사용하였다(표 2 참조). 클로렐라의 배양 조건으로는 광배양기에서 광도 120 ± 5 μmol/photons/㎡/s, 온도 25 ± 2℃ 조건에서 빛을 24시간 조사하며 2주간 진탕배양하였다. 배양된 시료는 원심분리기로 수확하여 배지를 제거하고 글라스비드를 넣고 비드 비팅 분쇄 후 DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였고, 식품용 클로렐라는 정 형태의 제품을 막자사발로 곱게 분쇄한 후 동일한 방법으로 DNA를 정제하였다.
표 1
| Species name | Culture collection | Medium | |
| 1 | Chlorella regularis | UTEX 1807 | BG11 |
| 2 | Chlorella regularis | NIES 2170 | BG11 |
| 3 | Chlorella regularis | UTEX 265 | BG11 |
| 4 | Chlorella regularis | CCAP 211/14 | BG11 |
| 5 | Chlorella regularis | D사 상용 제품 (식품용) | |
표 2
| Species name | Culture collection(Strain number) | Medium | |
| 1 | Chlorella vulgaris | UTEX 265 | BG11 |
| 2 | Chlorella vulgaris | UTEX 396 | BG11 |
| 3 | Chlorella vulgaris | UTEX B1803 | BG11 |
| 4 | Chlorella vulgaris | UTEX 1809 | BG11 |
| 5 | Chlorella vulgaris | NIES 641 | BG11 |
| 6 | Chlorella vulgaris | NIES 642 | BG11 |
| 7 | Chlorella vulgaris | NIES 686 | BG11 |
| 8 | Chlorella vulgaris | NIES 1269 | BG11 |
| 9 | Chlorella vulgaris | NIES 1270 | BG11 |
실시예 2. 마이크로새틀라이트 특이적 프라이머 제작 및 PCR 증폭
클로렐라의 유전체 내의 마이크로새틀라이트가 포함되어있는 좌위를 검색하기 위해서 클로렐라의 클로로플라스트 전체 염기서열 정보(Accession number. NC_001865)를 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 데이터베이스로부터 다운로드하였고, 얻어진 염기서열 정보를 인터넷에서 공개 제공하는 프로그램인 GRAMENE Ssrtool(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool) 프로그램을 사용하여 마이크로새틀라이트를 포함하는 좌위만을 검색하였다.
상기 검색된 마이크로새틀라이트를 포함하는 좌위의 염기서열을 토대로 하여 그 좌위만을 특이적으로 증폭할 수 있도록 하는 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 서열은 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타난 바와 같이, 프라이머의 길이는 20 ~ 26 bp 사이로 하였고, 프라이머가 붙는 온도(Tm)는 50 ~ 60℃가 되도록 하였으며, PCR 최종 증폭 산물의 크기는 150 ~ 300bp 범위 내에 있도록 제작하였다.
제작된 프라이머를 사용하여, 정제된 DNA를 주형으로 PCR 증폭을 수행하였으며, 안정적으로 증폭되는 최적 PCR 조건은 95℃ - 5분 동안 예비 변성 후, 95℃ - 30초, 50 ~ 65℃ - 30초, 72℃ - 30초의 조건을 35 반복주기로 실시하고, 최종 72℃ - 7분간 연장 반응은 조건을 찾아서 상황에 맞게 변형하여 실시하였다.
표 3
| No. | Marker | Primer (5 - 3) | TM(℃) | Size (bp) |
| 1 | mChl-001_F | cct att gct cta tgt taa cat atg (서열번호17) | 55 | 154-166 |
| mChl-001_R | gtt ttg aat ttt tcc cca ttg ctg (서열번호18) | 55 | ||
| 2 | mChl-002_F | aca ggc cag tca att tat tt (서열번호19) | 55 | 159-183 |
| mChl-002_R | cac tac atc gtc tat ttg aca ttg ag (서열번호20) | 55 | ||
| 3 | mChl-005_F | caa gcc aat ttt att taa aat c (서열번호21) | 55 | 164-200 |
| mChl-005_R | agg ttc acc tct tcg cct aa (서열번호22) | 55 | ||
| 4 | mChl-011_F | cag tat aga gta cac gat ttt cc (서열번호23) | 55 | 175 |
| mChl-011_R | gag cgt gta att gtt ata act tc (서열번호24) | 55 | ||
| 5 | mChl-012_F | cgc tat agt cat agc gtg acg (서열번호25) | 55 | 233-257 |
| mChl-012_R | ctt gaa agc ttc atg agg agt gcc (서열번호26) | 55 |
실시예 3. 마이크로새틀라이트 유전자형 다형성 분석
마이크로새틀라이트 마커에 의해 증폭된 산물의 다형성을 분석하기 위하여 5% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하였다. 전기영동은 1 X TBE 완충용액 중 우레아를 7M의 농도로 함유하는 5% 폴리아크릴아마이드(acrylamide : bis - acrylamide = 19:1) 겔을 사용하였으며, 겔의 두께는 T: 0.4mm x L: 40cm을 이용하여 1600V 이상의 전압으로 2~4시간 동안 실시하였다. DNA 길이 다형성을 가시화하기 위하여 다음과 같은 과정으로 질산은 염색을 수행하였다. 질산은 염색은 프로메가 DNA 은염색 키트로, 전기영동이 완료된 겔을 10% 에탄올에 20분간 고정하고, 1% 질산용액에 10분간 반응한 후, 질산은 염색용액에 30분간 염색하고, 탄산나트륨을 처리하여 밴드가 검게 현상될 때까지 반응시켰다. 현상 반응은 10% 빙초산 용액을 처리하여 반응 중단을 유도하였다. 또한 각각의 대립유전자형의 구조를 분석하기 위하여, 다형성 밴드를 오려 겔 내의 DNA를 추출한 후 염기서열 분석(DNA sequencing)을 함으로써 구조를 파악하여 표 4에 도시된 바와 같이 각각의 대립유전자형을 명명하였다.
표 4
| No. | Marker | Allele | Structure | Size(bp) | |
| 1 | mChl-001 | a | 3 | P24-N25-(T)-N69-(TTA)3-AG-P24 (서열번호1) | 154 |
| b | 5 | P24-N25-(C)-N69-(TTA)5-AG-P24 (서열번호2) | 160 | ||
| c | 7 | P24-N25-(C)-N69-(TTA)7-AG-P24 (서열번호3) | 166 | ||
| 2 | mChl-002 | a | 4-09 | P20-N22-(GAA)4-N22-(A)9-N48-P26 (서열번호4) | 159 |
| b | 5-10 | P20-N22-(GAA)5-N22-(A)10-N48-P26 (서열번호5) | 163 | ||
| c | 5-11 | P20-N22-(GAA)5-N22-(A)11-N48-P26 (서열번호6) | 164 | ||
| d | 6-12 | P20-N22-(GAA)6-N22-(A)12-N48-P26 (서열번호7) | 168 | ||
| e | 10-12 | P20-N22-(GAA)7-(AAAGAC)-(GAA)2-N22-(A)12-N48-P26 (서열번호8) | 183 | ||
| 3 | mChl-005 | a | 2 | P22-N54 - (AAAAAAAAAG)2-N48 - P20 (서열번호9) | 164 |
| b | 5.5 | P22-N80 -(AAAAAAAAAG)3 -N48 -P20 (서열번호10) | 200 | ||
| 4 | mChl-011 | a | G | P23-N23-(G)-N105-P23 (서열번호11) | 175 |
| b | T | P23-N23-(T)-N105-P23 (서열번호12) | 175 | ||
| c | A | P23-N23-(A)-N105-P23 (서열번호13) | 175 | ||
| 5 | mChl-012 | a | 1 | P21-N73-(AAG)3-N106-P24 (서열번호14) | 233 |
| b | 2 | P21-N73-N28-(AAG)2-N106-P24 (서열번호15) | 258 | ||
| c | 3 | P21-N73-N70-(AAG)2-N106-P24 (서열번호16) | 300 | ||
표 1의 클로렐라 3속 4종의 DNA로부터 검출된 각 마커의 대립유전자 유전자형(allele type)은 각각 표 5와 같다.
표 5
| Chlorella regularis | Chlorella vulgaris(NIES 2170) | Chlorella vulgaris(UTEX 265) | Chlorella zofingiensis | |
| mChl-001 | 5,3 | 5,5 | 7,7 | 3,3 |
| mChl-005 | 2,2 | 5.5,5.5 | 2,2 | 5,5 |
| mChl-012 | 1,1 | 1,1 | 2,2 | 1,1 |
| genotype from [도 3] | ||||
즉, C. regularis는 3개의 마커에 의해 5,3-2,1-1,1의 combined genotype으로 표시될 수 있으며, 따라서, 5,5-5.5,5.5-1,1 (C. vulgaris NIES 2170), 7,7-2,2-2,2 (C. vulgaris UTEX 265), 3,3-5,5-1,1 (C. zofingiensis)의 유전자 형을 갖는 다른 세 종과 명확하게 구분됨을 확인할 수 있다. 본 발명의 마커를 이용하여 이를 통해 클로렐라의 속(genus) 수준, 즉 종간 식별이 가능하다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 표 2의 클로렐라 9종의 DNA로부터 검출된 각 마커의 대립유전자 유전자형(allele type)은 각각 표 6과 같다.
표 6
| mChl-001 | mChl-002 | mChl-005 | mChl-011 | mChl-012 | |
| UTEX 265 | 7,7 | 6-12,6-12 | 2,2 | T | 2,2 |
| UTEX 396 | 5,5 | 10-12,10-12 | 5.5,4.5 | A | 0,0 |
| UTEX B1803 | 5,5 | 10-12,10-12 | 5.5,4.5 | T | 0,0 |
| UTEX 1809 | 7,7 | 6-12,6-12 | 2,2 | T | 2,2 |
| NIES 641 | 5,5 | 5-11,5-11 | 3,3 | A | 3,3 |
| NIES 642 | 5,5 | 5-10,5-10 | 3.5,3.5 | A | 3,3 |
| NIES 686 | 3,3 | 4-09,4-09 | 3.5,3.5 | G | 2,2 |
| NIES 1269 | 5,5 | 5-11,5-11 | 3,3 | T | 3,3 |
| NIES 1270 | 5,5 | 6-12,6-12 | 5.5,5.5 | T | 1,1 |
| genotype from [도 4] | |||||
즉, 실험에 사용된 C. vulgaris 9종은 본 발명인 5개의 마커에 의해 상기와 같은 유전자형으로 명명되었으며, combined genotype이 7,7-6-12,6-12-2,2-T-2,2로 같은 UTEX 265와 UTEX 1809를 제외하고는 모든 strain이 식별됨을 확인 할 수 있었다. 또한 UTEX 265와 UTEX 1809는 현재까지 개발된 어떠한 마커로도 두 strain은 구별할 수 없으나, 본 마커를 포함하여 추가적으로 개발되는 마커를 통해 식별 가능할 수 있거나, 또는 두 strain이 본래 동일한 strain일 가능성도 배제할 수 없다고 결론 내릴 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 마커를 이용하여 클로렐라의 종(species) 수준, 즉 종내 식별이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명의 클로렐라의 염색체에서 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 클로렐라의 마이크로새틀라이트 분자를 증폭하고, 증폭된 DNA(Deoxyribonucleic acid), 즉 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 통해 클로렐라를 분류 식별할 수 있다는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에서 제시한 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 클로렐라의 종 간 및 균주 수준에서의 분리가 가능해짐에 따라서 식품, 의학, 에너지 자원 분야 등 매우 다양한 분야에서 활용되는 매우 중요한 미세조류 유전자원인 클로렐라의 보다 확실한 균주 라인을 확보할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 이는 추후 연구자들에 의해 개발 및 개량된 우수 품종의 클로렐라 균주에 대한 지적 재산권의 보호에 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Microsatellite molecular marker for specific distinction in
Chlorella inter-species and strain level
<130> PCT01482
<150> 10-2011-0061945
<151> 2011-06-24
<150> KR 10-2012-0067578
<151> 2012-06-22
<160> 26
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 154
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 1
cctattgctc tatgttaaca tatgttgaaa ggattaaggc ttgtaaattt taaacttttt 60
ttatcttgtt tctttttata aattaatttt tttactttca aacccgtata tttttgtttt 120
tattattaag cagcaatggg gaaaaattca aaac 154
<210> 2
<211> 160
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 2
cctattgctc tatgttaaca tatgttgaaa ggattaaggc ttgtaagttc taaacttttt 60
ttatcttgtt tctttttata aattaatttt tttactttca aacccgtata tttttgtttt 120
tattattatt attaagcagc aatggggaaa aattcaaaac 160
<210> 3
<211> 166
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 3
cctattgctc tatgttaaca tatgttgaaa ggattaaggc ttgtaagttc taaacttttt 60
ttatcttgtt tctttttata aattaatttt tttactttca aacccgtata tttttgtttt 120
tattattatt attattatta agcagcaatg gggaaaaatt caaaac 166
<210> 4
<211> 159
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 4
acaggcccgc caatttattt gacgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagactgg 60
tttttctcct ttaaagaaaa aaaaatagaa aaaatttcta ttttagatag tactatttgt 120
tttattgttt atactcaatg tcaaatagac gatgtagtg 159
<210> 5
<211> 163
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 5
acaggcccgc caatttattt gacgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagaagac 60
tggtttttct cctttaaaga aaaaaaaaat agaaaaaatt tctattttag atagtactat 120
ttgttttatt gtttatactc aatgtcaaat agacgatgta gtg 163
<210> 6
<211> 164
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 6
acaggcccgc caatttattt gacgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagaagac 60
tggtttttct cctttaaaga aaaaaaaaaa tagaaaaaat ttctatttta gatagtacta 120
tttgttttat tgtttatact caatgtcaaa tagacgatgt agtg 164
<210> 7
<211> 168
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 7
acaggcccgc caatttattt gacgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagaagaa 60
gactggtttt tttcctttaa agaaaaaaaa aaaatagaaa aaatttctat tttagatagt 120
actatttgtt ttattgttta tactcaatgt caaatagacg atgtagtg 168
<210> 8
<211> 183
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 8
acaggcccgc caatttattt gatgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagaagaa 60
gaaaaagacg aagaagactg gtttttctct tttaaagaaa aaaaaaaaat agaaaaaatt 120
tctattttag atagtactat ttgttttatt gtttatactc aatgtcaaat agacgatgta 180
gtg 183
<210> 9
<211> 164
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 9
caagccaatt ttatttaaaa tctttttttt aattaaaaaa aatttctttt ctattctttt 60
ttatgttttt ttttgtaaaa aaaaagaaaa aaaaagagca taaaaatgaa aagagaaaaa 120
actcaatttt gtgattccgt ttttttaggc gaagaggtga acct 164
<210> 10
<211> 200
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 10
caagccaatt ttatttaaaa tctttctttt aattaaaaaa aatttctttt ctattctttt 60
ttatgttttt gatctttttt tttttgaaaa aaaaaaagaa gtaaaaaaaa agaaaaaaaa 120
agaaaaaaaa agagcataaa attgaaaaga gaaaaaactc aattttgtga ttccgttttt 180
ttaggcgaag aggtgaacct 200
<210> 11
<211> 175
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 11
cagtatagag tacacgattt tccaatccta ataataaatc taaattgcgt aatcctatat 60
ctgcatcaat aagagcaaca cgataaccaa gccgagcaat tgacattcct aaatttgctg 120
ttgttgttgt tttcccaacc ccacctttgc ctgaagttat aacaattaca cgctc 175
<210> 12
<211> 175
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 12
cagtatagag tacacgattt tccaatccta ataataaatc taaatttcgt aatcctatat 60
ctgcatcaat aagagcaaca cgataaccaa gccgagcaat tgacattcct aaatttgctg 120
ttgttgttgt tttcccaacc ccacctttgc ctgaagttat aacaattaca cgctc 175
<210> 13
<211> 175
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 13
cagtatagag tacacgattt tccaatccta ataataaatc taaattacgt aatcctatat 60
ctgcatcaat aagagcaaca cgataaccaa gccgagcaat tgacattcct aaatttgctg 120
ttgttgttgt tttcccaacc ccacctttgc ctgaagttat aacaattaca cgctc 175
<210> 14
<211> 233
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 14
cgctatagtc atagcgtgac gatctccttt acaatgtatt caaaacttga accaaaaaaa 60
aatcttaagg ccttgtcttt cctttctgat tctaaagaag aagagaaaga gagtaacaaa 120
aattgaattt tgtgatggta tctgattctt tttttcaaaa agaaaaagat aaatcacttt 180
ttttgtttgt ttgtacaaaa atagtatatg gcactcctca tgaagctttc aag 233
<210> 15
<211> 258
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 15
cgctatagtc atagcgtgac gatctccttt acaatgtatt caaaacttga accaaaaaaa 60
aatcttaagg tcttgtcttt cctttctgat tctttgcttt ttttttagaa aaaaaaagca 120
tcaagaagag aaagagaatc acaaaaattg aattttgtga tggtatctga ttcttttttt 180
ctaaaagaaa aagataaatc actttttttg tttgtttgta caaaaatagt atatggcact 240
cctcatgaag ctttcaag 258
<210> 16
<211> 300
<212> DNA
<213> Chlorella sp.
<400> 16
cgctatagtc atagcgtgac gatctccttt tcaatgtatt caaaacttta accaaaagaa 60
aatcttaagg tcttgtcttt cctttctgat tctttgcttt ttgatctttt ttttcttttt 120
ttttctaaaa aaaaaaaaaa aaagaaatag aaaaaaaaag catcaagaag agaaagagaa 180
tcacaaaaat tgaattttgt gatggtatct gattcttttt ttctaaaaga aaaagataaa 240
tcactttttt tgtttgtttg tccaaaaata gtatatggca ctcctcatga agctttcaag 300
300
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-001 Forward primer
<400> 17
cctattgctc tatgttaaca tatg 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-001 Reverse primer
<400> 18
gttttgaatt tttccccatt gctg 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-002 Forward primer
<400> 19
acaggccagt caatttattt 20
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-002 Reverse primer
<400> 20
cactacatcg tctatttgac attgag 26
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-005 Forward primer
<400> 21
caagccaatt ttatttaaaa tc 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-005 Reverse primer
<400> 22
aggttcacct cttcgcctaa 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-011 Forward primer
<400> 23
cagtatagag tacacgattt tcc 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-011 Reverse primer
<400> 24
gagcgtgtaa ttgttataac ttc 23
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-012 Forward primer
<400> 25
cgctatagtc atagcgtgac g 21
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCh1-012 Reverse primer
<400> 26
cttgaaagct tcatgaggag tgcc 24
Claims (7)
- 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는, 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커.
- 제 1항에 있어서,상기 마커는 클로렐라의 종 간 또는 균주 수준에서의 구분 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커.
- 서열번호 17 내지 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는, 클로렐라의 분류식별용 프라이머.
- 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 포함하는, 클로렐라의 분류식별용 조성물.
- 제 4항의 조성물을 포함하는, 클로렐라 분류식별용 키트.
- 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 측정하는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 분류식별용 키트.
- a)클로렐라의 염색체에서 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 클로렐라의 마이크로새틀라이트 분자를 증폭하는 단계; 및b)상기 증폭된 DNA(Deoxyribonucleic acid)의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 통해 분류하는 단계로 구성되는,클로렐라의 분류 식별방법.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2011-0061945 | 2011-06-24 | ||
| KR20110061945 | 2011-06-24 | ||
| KR1020120067578A KR101420495B1 (ko) | 2011-06-24 | 2012-06-22 | 클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커 |
| KR10-2012-0067578 | 2012-06-22 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2012177089A2 true WO2012177089A2 (ko) | 2012-12-27 |
| WO2012177089A3 WO2012177089A3 (ko) | 2013-02-21 |
| WO2012177089A9 WO2012177089A9 (ko) | 2014-01-23 |
Family
ID=47423112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2012/004970 WO2012177089A2 (ko) | 2011-06-24 | 2012-06-22 | 클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2012177089A2 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116426677A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-07-14 | 中国科学院昆明植物研究所 | 高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记及其引物与应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106995853B (zh) * | 2017-05-16 | 2020-08-25 | 浙江海洋大学 | 筛选与少根紫萍叶生长相关的分子标记的方法 |
-
2012
- 2012-06-22 WO PCT/KR2012/004970 patent/WO2012177089A2/ko active Application Filing
Non-Patent Citations (6)
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116426677A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-07-14 | 中国科学院昆明植物研究所 | 高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记及其引物与应用 |
| CN116426677B (zh) * | 2023-03-24 | 2023-12-08 | 中国科学院昆明植物研究所 | 高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记及其引物与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2012177089A3 (ko) | 2013-02-21 |
| WO2012177089A9 (ko) | 2014-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2015068957A1 (en) | Method for the detection of multiple target nucleic acids using clamping probes and detection probes | |
| WO2017188797A1 (ko) | In vivo에서 rna-가이드 뉴클레아제의 활성을 고처리량 방식으로 평가하는 방법 | |
| WO2017188669A2 (ko) | 절단된 상보적인 태그 절편을 이용한 표적 핵산 서열 검출 방법 및 그 조성물 | |
| WO2018139826A1 (ko) | Dna 메틸화를 이용한 연령 예측 방법 | |
| CN101768639A (zh) | 一种甘蓝型油菜品种ssr指纹的快捷检测方法 | |
| WO2011157222A1 (zh) | 淋巴瘤融合基因的联合检测方法及其诊断试剂盒 | |
| WO2012177089A2 (ko) | 클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커 | |
| WO2020105873A1 (ko) | 인간 알파코로나바이러스 전장유전체 증폭을 통한 진단키트 및 전장 유전체 서열 확인 방법 | |
| WO2018208133A1 (ko) | 고순도 뉴클레오타이드 획득 방법 및 장치 | |
| WO2021182881A1 (ko) | 유방암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도 | |
| WO2018080225A2 (ko) | 시식성 파리의 종 구별용 snp 마커 및 이의 용도 | |
| WO2011120398A1 (zh) | 白血病融合基因的联合检测方法及其诊断试剂盒 | |
| WO2012050353A2 (ko) | 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법 | |
| WO2015167087A1 (ko) | Dna 복제수 변이를 이용한 강직성 척추염 발병 위험도 예측 방법 | |
| WO2011139032A2 (ko) | 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물 | |
| WO2023027418A1 (ko) | 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도 | |
| WO2020122679A1 (en) | Method for detecting a target analyte in a sample using an s-shaped function for a slope data set | |
| CN114507743B (zh) | 一种快速检测菲利普孢囊线虫的rpa引物和探针、试剂盒及应用 | |
| WO2011081501A2 (ko) | 핵내유전자적 웅성불임성 유전인자인 엠에스3 판별용 분자마커 및 이를 이용한 검정방법 | |
| WO2019135477A2 (ko) | 다복제유전자를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법 | |
| WO2022055276A1 (ko) | 여성형 탈모증 관련 유전자 다형성 마커 및 이의 용도 | |
| WO2014157825A1 (ko) | 스피드 멀티플렉스 pcr법을 이용한 hla 대립유전자 검사방법 및 검사키트 | |
| WO2019103475A2 (ko) | 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 검사 키트 | |
| WO2010140827A9 (ko) | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 자동검사 키트 | |
| WO2024136591A1 (ko) | 차세대 서열분석을 이용한 결핵균 및 비결핵 항산균 감염의 동정 및 내성 진단 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 12802313 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase in: |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 12802313 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |