KR101420495B1 - 클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커 - Google Patents

클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클로렐라의 마이크로새틀라이트 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 미세조류 클로렐라(Chlorella)의 종간 및 종 내의 균주 수준에서 구분이 가능한 새로운 마이크로새틀라이트 분자적 마커(microsatellite molrcular marker) 및 이를 증폭하기 위한 프라이머에 관한 것이다. 본 발명에서 제시한 클로렐라 유래의 새로운 마이크로새클라이트 분자적 마커를 통해 클로렐라 유전자에 존재하는 짧은 염기서열의 반복수에 따른 대립유전자의 다형성 유전자형을 분석함으로써 유전적으로 유연관계가 깊은 클로렐라 몇몇 종간 구분을 가능하게 할 뿐만 아니라 동일 종 내의 클로렐라 균주를 명확히 구분할 수 있어 클로렐라의 종간 구분 마커 또는 종 내의 균주 수준에서의 구분 마커로써 활용할 수 있다.

Description

클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커{Microsatellite molecular marker for specific distinction in Chlorella inter-species and strain level}
본 발명은 미세조류 클로렐라(Chlorella)의 종간 및 종 내의 균주 수준에서 구분이 가능한 새로운 마이크로새틀라이트 분자적 마커(microsatellite molecular marker) 및 이를 증폭하기 위한 프라이머(primer) 등에 관한 것이다.
최근 급변하는 사회 속에서 산업이 발전하고, 도시화 및 자동화가 진행되면서 에너지 자원의 소모가 급격히 증가하고 있다. 이러한 제한적 화석연료의 고갈은 수요의 증가와 더불어 가격 상승의 원인이 되며, 전 세계적으로 매립된 원유의 양이 급속도로 소비되어감에 따라서, 이를 대체할 수 있는 대체에너지의 개발에 대한 관심과 요구가 크게 증가되고 있다. 이처럼 한정된 에너지 자원의 고갈로 인해 야기될 수 있는 여러 가지 에너지 문제에 대한 가장 효과적인 해결책으로 미세조류를 이용한 지속 가능한 바이오연료 생산 기술 개발이 제시되고 있다. 미세조류는 빠르게 성장하며, 세포내 함유하고 있는 지질체 중에서 20~ 50% 가까이를 중성지질로 합성, 축적하여 저장하고 있기 때문에 미세조류의 바이오매스로부터 바이오디젤의 생산이 가능할 뿐만 아니라, 태양에너지와 대기 중의 이산화탄소를 이용하여 광합성을 하기 때문에 지구온난화의 주요 원인이 되는 대기 중 이산화탄소 및 온실가스의 저감효과를 동시에 해결할 수 있는 대안으로 떠오르고 있다. 이와 같은 미세조류의 바이오매스 생산을 통한 바이오연료의 생산 기술에 있어 핵심은 우수한 미세조류 균주를 확보하는 것이기 때문에 전 세계적으로 균주의 확보 및 개량에 관한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다.
단세포 녹조류인 클로렐라는 의약품, 단백질 및 항산화물질을 함유하는 건강보조식품으로써 상업적으로 판매되고 있는 대표적인 미세조류 중 하나이다. 클로렐라는 생장률이 매우 우수한 특징을 가지는 미세조류이기 때문에 식품, 의약품 뿐만 아니라 바이오연료 생산을 위한 균주로써도 많은 주목을 받는 종이다. 클로렐라는 자연계에서 매우 다양한 서식환경에서 흔히 존재하며, 그 크기, 형태 및 종류가 매우 다양하게 보고되고 있기 때문에 전문가 그룹에서 조차 이들 균주를 정확하게 분리, 동정하는 것이 쉽지 않다. 따라서 이처럼 다양한 클로렐라 균주들 중 보다 우수한 형질의 균주를 확보하였을 때, 이를 보다 정확하게 분별하는 것은 재산권의 보호 차원에서도 매우 중요한 요소가 되므로 분석이 쉽고, 분별력이 높은 유전적 분자마커의 필요성이 매우 높아지고 있다.
유전적 분자마커는 최근 생명공학기술의 급속한 성장에 힘입어 DNA 수준에서의 활발한 연구와 개발이 이루어져 왔다. 이는 농업 기술에 적용되면서 중요한 가치를 지닌 주요 작물들의 유전적 근연관계를 규명하고, 고유의 유전자원으로써 위치를 판단 가능하도록 함으로써 유전자원의 가치를 향상시키는데 커다란 기여를 하였다. DNA 수준에서의 분자적 마커의 종류에는 대표적으로 restriction fragment length polymorphism(RFLP), randomly amplified polymorphic DNA(RAPD), amplified fragment length polymorphism(AFLP), inter-simple sequence repeat(ISSR), simple sequence repeat(SSR)으로 알려진 마이크로새틀라이트, single nucleotide polymorphism(SNP) 등이 있다. 이들 DNA 기반의 분자적 마커 중 마이크로새틀라이트는 유전체 전체에 널리 분포하고, 2-8 bp의 짧은 염기가 특이적인 반복구조로 이루어진 다형성 좌위로써 개체마다 고유의 반복횟수 다형성을 보이므로 이러한 다형성의 차이를 이용한 매우 강력한 개체식별 마커로 알려져 있다. 마이크로새틀라이트는 유전적으로 매우 다양하고 많은 정보를 함유하고 있기 때문에 식물체의 유전육종, 신규 기능성 유전자 분리 및 근연종간 구분에 이용하기 위해 국제적으로 매우 활발하게 연구되고 있다. 이미 식량문제에 있어 매우 중요한 위치에 있는 벼에 대한 마이크로새틀라이트 연구는 중국의 국립 벼 연구소와 대학을 중심으로 심도 있게 진행되고 있으며, 일본에서는 벼의 특이적인 기능을 갖는 유전자의 조절을 위한 정량적 특징을 갖는 좌위를 동정하기 위한 목적으로 마이크로새틀라이트 염색체 지도를 작성하기도 했다. 또한 국내에서도 형질전환 벼의 유전자가 야생의 유사 종으로 옮겨지는 유전자 유동(gene flow) 빈도를 확인하기 위한 마이크로새틀라이트 마커를 개발 이용한 사례가 있으며, 밀, 쌀, 보리, 콩, 사탕수수, 옥수수 등과 같은 주요 농작물과 참깨, 들깨 등과 같이 유전적 거리가 가까운 작물들의 진화적 거리를 분석하는 등 매우 다양하고 광범위한 연구에 유용하게 사용되고 있다.
마이크로새틀라이트 분자적 마커는 반복서열 근처의 보존된 특이적인 염기서열로부터 만든 시발체를 이용하므로 유전적으로 교잡된 종일 지라도 명확한 유전자형 분석이 가능하며, 높은 변별력과 분석 작업의 편리성, 유전적 분석에 있어 높은 재현성 등 다른 분자적 마커들에 비해 많은 장점을 갖고 있다.
이에, 본 발명은 미세조류 클로렐라의 유전체 내에 존재하는 새로운 마이크로새틀라이트 분자마커를 개발함으로써 형태적 분류방법 및 18S rDNA 염기서열 또는 ITS 염기서열 분석과 같은 분자적 분류 방법으로도 분별하기 어려운 균주 수준에서의 분별을 가능하도록 하였다.
본 발명자들은 식품 및 바이오연료의 재료가 되는 미세조류 클로렐라 균주의 유전자원으로써의 차별화를 위해 기존에 미세조류의 분류 방법으로 사용되어온 형태적 분류방법 및 18S rDNA 염기서열 또는 ITS 염기서열 분석과 같은 분자적 분류 방법으로도 분별하기 어려운 클로렐라 균주의 보다 확실하고 빠른 분별을 위해 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 목적은 클로렐라의 DNA를 주형으로 대립유전자형의 다형성 차이를 확인할 수 있도록 PCR 증폭을 가능하게 하는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열로 이루어지는 클로렐라 근연종 및 각기 다른 균주들의 마이크로새틀라이트 마커, 및 서열번호 17 내지 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라의 마이크로새틀라이트 마커를 증폭하기 위한 프라이머를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는, 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 마커는 클로렐라의 종 간 또는 균주 수준에서의 구분 용도로 사용되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 서열번호 17 내지 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라의 분류식별용 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 포함하는 클로렐라의 분류식별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 클로렐라 분류식별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 측정하는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 클로렐라 분류식별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 a)클로렐라의 염색체에서 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 클로렐라의 마이크로새틀라이트 분자를 증폭하는 단계; 및 b)상기 증폭된 DNA(Deoxyribonucleic acid)의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 통해 분류하는 단계로 구성되는 클로렐라의 분류 식별방법을 제공한다.
본 발명에서 제시한 클로렐라 유래의 새로운 마이크로새클라이트 분자적 마커를 통해 클로렐라 유전자에 존재하는 짧은 염기서열의 반복 수에 따른 대립유전자의 다형성 유전자형을 분석함으로써 유전적으로 유연관계가 깊은 클로렐라 몇몇 종간 구분을 가능하게 할 뿐만 아니라 동일 종 내의 Chlorella vulgaris - UTEX 265, Chlorella vulgaris - NIES 2170 및 상용화되어 시판되고 있는 국내 D사의 식품용 클로렐라 균주를 명확히 구분할 수 있을 뿐만 아니라 여러 종류의 클로렐라 균주를 명확하게 구분 가능하기 때문에 종간 구분 마커 또는 종 내의 균주 수준에서의 구분 마커로써 활용할 수 있다.
본 발명에서 제시한 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 클로렐라의 종 간 및 균주 수준에서의 분리가 가능해짐에 따라서 식품, 의학, 에너지 자원 분야 등 매우 다양한 분야에서 활용되는 매우 중요한 미세조류 유전자원인 클로렐라의 보다 확실한 균주 라인을 확보할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 이는 추후 연구자들에 의해 개발 및 개량된 우수 품종의 클로렐라 균주에 대한 지적 재산권의 보호 및 논쟁이 될 수 있는 소유권 분쟁을 원천적으로 봉쇄할 수 있다. 최근 국제 정세에 의하면, 생물자원이 국가경쟁력에 미치는 영향력이 매우 큰 바 생물자원의 확보와 관리, 그리고 이에 따른 소유권 분쟁에서 자유로울 수 없게 되었다.2010년 10월 일본 나고야에서 열린 제 10차 생물다양성협약 당사국 총회에서는 생물자원을 활용하여 생기는 이익을 누구와 어떻게 공유할 것인지에 대한 논의가 이루어졌고, 나고야의정서라는 국제협약을 발의하였다. 나고야의정서는 2000년 생물다양성 협약 당사국 총회에서 채택된 카르타헤나 바이오안정성의정서에 이은 2번째 의정서로써, 동물, 식물 및 미생물 포함한 모든 생물 유전자원을 이용하는 나라는 유전자원 제공 국가에 미리 통보해 승인을 받아야 하며, 해당 유전자원을 이용해서 얻은 이익(금전적, 비금전적 이익 포함)은 상호 합의된 계약조건에 따라 배분해야 한다고 명시하고 있다. 이는 각종 생물 유전자원에 대해 국제적으로 인정받는 지역 및 국가가 지식자산으로서의 소유권을 행사할 수 있게 된 것을 의미하므로, 이에 대비한 유전자원 발굴과 정보 획득 및 자료 정립이 매우 중요해졌다.
이에 따라, 국내에서도 토착 생물 유전자원의 정보 획득 및 자료 정립이 꼭 필요한 상황이며 특히 최근 국제적으로 많은 연구가 이루어지고 있는 미세조류에 대한 유전자원 확보 노력은 반드시 필요한 사항이 되었다. 본 기술의 핵심은 우수한 성능을 갖는 미세조류 (Chlorella) 주가 확보되었을 때, 이를 식별할 수 있는 분자 마커로써, 미세조류의 분류식별에 관한 전문가 그룹에서도 구분하기 쉽지 않은 동종의 strain을 쉽게 구분할 수 있는 뛰어난 기술이라 할 수 있다.
현재 국내 및 국제적으로 널리 이용되고 있는 Chlorella Genus 그룹 가운데 가장 많은 분야에서 이용되는 종이 Chlorella vulgaris 이며, 다양하게 분포하고 있는 이들 종들은 기존에 알려진 균주식별 마커인 18s rDNA 염기서열 또는 ITS 염기서열로는 구분하는 것이 불가능하다. 즉, 이들 종들을 균주 수준에서도 구분할 수 있다면, 이로 인해 국내 및 국제적으로 유전자원의 소유권을 주장하기 위한 강력한 장치가 될 수 있을 것이다. 또한 클로렐라의 염색체 지도 작성, 새로운 유용 유전자의 동정 및 유전 육종, 질병의 탐색과 같은 기초 생물학적 연구에서도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 동일한 종(species)으로 동정된 클로렐라 불가리스 3 균주의 18S rDNA partial 염기서열을 분석하고, multi-alignment 분석을 수행하여 3 균주의 18S rDNA 염기서열에서의 차이가 없었음을 확인한 도이다.
도 2는 동일한 18S rDNA 염기서열을 갖는 같은 클로렐라 불가리스 종 중, 서로 다른 3 균주(Chlorella vulgaris - UTEX 265, Chlorella vulgaris - NIES 2170 및 국내 D사의 식품용 Chlorella vulgaris)의 genomic DNA를 주형으로 본 발명의 대상인 마이크로새틀라이트 마커 중 3개의 마커(mChl-001, 005, 012)를 이용하여 유전자형의 다형성을 확인함으로써 세 가지 균주를 대상으로 균주 수준의 확실한 분별력이 있음을 보여주는 도이다.
도 3은 서로 다른 클로렐라 종들의 genomic DNA를 주형으로 하여 본 발명의 대상인 마이크로새틀라이트 마커 중 3개의 마커(mChl-001, 005, 012)를 이용한 PCR 증폭 후 대립유전자형을 분석한 결과로써 대립유전자형의 다형성의 차이에 의해 서로 다른 클로렐라 3종 및 동종의 다른 두 가지 균주를 확실하게 구분할 수 있음을 나타낸 도이다.
도 4는 미국과 일본의 균주분양센터에서 분양받은 동일한 클로렐라 불가리스 종내의 서로 다른 9개의 균주를 대상으로 본 발명의 대상인 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 genotyping을 실시한 결과로써 각각의 마커의 대립유전자 유전자형의 조합을 통해 모든 균주라인이 명확히 구분됨을 보여주는 도이다.
본 발명은 식품 및 바이오연료를 생산하는 단세포 미세조류인 클로렐라의 종간 및 균주 수준에서의 분별을 가능하게 하는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라의 마이크로새틀라이트 마커 및 서열번호 17 내지 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 상기 클로렐라의 마이크로새틀라이트 마커를 증폭하기 위한 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 기존의 데이터베이스에서 제공하는 클로렐라 불가리스의 클로로플라스트 전체 염기서열로부터 Simple sequence repeat(SSR) motif를 검색하고, 이를 기본으로 특이적인 프라이머를 디자인하는 단계; (2) 동종의 클로렐라 불가리스 10 균주(상용화된 클로렐라 제품 포함)및 이종의 클로렐라 2종을 BG11 배지에서 배양 한 후, genomic DNA를 정제하는 단계; 및 (3) 제작된 프라이머를 이용하여 특이적 PCR 증폭을 수행하고, 얻어진 증폭산물을 5% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 대립유전자형의 다형성을 확인하고, 각각의 대립유전자형의 구조 분석 및 동정하는 단계를 통해 5 가지 마이크로새틀라이트 마커의 복합 유전자형의 차이로 클로렐라 종간 및 균주 수준에서의 구별을 가능하게 한다.
즉, 본 발명은 단세포 미세조류 클로렐라를 종(species) 및 균주(strain) 수준에서 구별할 수 있는 새로운 마이크로새틀라이트 마커(microsatellite marker)에 대한 것으로서, 동일종의 클로렐라 세 균주(Chlorella vulgaris - UTEX 265, Chlorella vulgaris - NIES 2170 및 D사의 식품용 클로렐라)와 몇몇 다른 클로렐라 종(Chlorella regularis , Chlorella zofingiensis)의 genomic DNA를 주형으로 마이크로새틀라이트 좌위를 특이적으로 증폭할 수 있을 뿐만 아니라 동일한 종내의 서로다른 9개의 균주(표 2 참조)의 특정 좌위를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 개발하였으며, PCR 증폭 및 genotyping을 통해 대립유전자형의 차이를 규명함으로써 종간 또는 종 내의 균주 수준에서 분자적 분별을 가능하게 할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서로 다른 클로렐라 종 간 및 같은 종 내의 다른 균주의 유전적 변이를 확인할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커의 개발에 관한 것이다. 본 발명에서는 마이크로새틀라이트 마커를 개발하기 위한 목적으로, 서로 다른 클로렐라 속 2종과 같은 종 내 2 균주를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에서 분양받아 배양 후 사용하였고, 식품으로 판매되는 1 균주는 국내 식품용 클로렐라 생산업체 D사의 상용 판매되는 제품을 구입하였으며, 같은 속의 서로 다른 클로렐라 9개 균주는 미국과 일본의 미세조류 분양센터에서 분양받아 각각 genomic DNA를 추출하였다. 클로렐라의 클로로플라스트 전체 염기서열 정보(Accession number. NC_001865)는 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 데이터베이스를 다운로드하여, GRAMENE Ssrtool(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool) 프로그램을 사용하여 마이크로새틀라이트를 포함하는 좌위를 검색하였다.
검색된 마이크로새틀라이트를 포함하는 좌위의 염기서열을 기초로 이 좌위를 특이적으로 증폭할 수 있도록 하는 프라이머를 디자인 하였다. 프라이머의 길이는 20 ~ 26 bp 사이로 하였고, 프라이머가 붙는 온도(Tm)는 50 ~ 65℃가 되도록 하였으며, PCR 최종 증폭 산물의 크기는 100 ~ 300bp 범위 내에 있도록 제작하였다.
제작된 프라이머를 사용하여, 정제된 DNA를 주형으로하여 PCR 증폭을 실시하였고, 최적 PCR 조건은 95℃ - 5분 동안 예비 변성 후, 95℃ - 30초, 50~65℃ - 30초, 72℃ - 30초의 조건을 35 주기로 실시하고, 최종 72℃ - 7분간 연장 반응하여 실시하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 각 마커에 의해 증폭된 산물의 다형성을 확인하기 위하여 5% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하고, 질산은 염색을 통하여 밴드의 형태로 다형성을 확인하였다(도 2, 3, 4 참조). 또한 각각의 대립유전자형의 구조를 분석하기 위하여 다형성 밴드를 오려 겔 내의 DNA 추출 후 염기서열 분석을 함으로써 구조를 파악하여 각각의 대립유전자형을 명명하였다.
상기 결과를 통하여 본 발명의 마커 및/또는 프라이머를 이용하여 클로렐라의 속(genus) 및 종(species)을 분류할 수 있다는 것을 확인하였다. 이에 본 발명은 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 포함하는, 클로렐라의 분류식별용 조성물과 이를 포함하는, 클로렐라 분류식별용 키트를 제공한다. 또한 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커의 길이 다형성을 측정하는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 분류식별용 키트를 제공한다.
상기 "클로렐라의 분류식별용 조성물"은 클로렐라 분류식별용 프라이머 세트 및/또는 클로렐라 마이크로새틀라이트 분자마커의 길이다형성을 측정할 수 있는 프로브와 중합효소 연쇄반응을 수행하는데 필요한 PCR 반응용 버퍼, DNA 중합효소, dNTP 또는 상기 프로브와 분자마커의 결합(hybridization) 반응을 수행하는데 필요한 버퍼 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
상기 “키트”는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 클로렐라 분류식별용 프라이머 세트 및/또는 본 발명의 클로렐라 마이크로새틀라이트 분자마커의 길이다형성을 측정할 수 있는 프로브를 포함하는 용기, PCR 반응용 버퍼 및 DNA 중합효소를 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 내지 서열번호 26에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머를 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 클로렐라 5 균주의 확보 및 DNA 추출
본 실험에 사용한 이종의 클로렐라는 한국생명공학연구원 미생물자원센터에서 분양받아 사용하였으며, 국내 D사의 식품용 클로렐라 불가리스는 시중에서 판매되는 상품을 구입하여 사용하였다(표 1 참조). 그리고 클로렐라 불가리스의 각기 다른 균주들은 미국의 균주 분양센터 UTEX(At The University of Texas at Austin; UTEX The Culture collection of Algae)와 일본의 미세조류 균주분양센터 NIES(At National Institute for Environmental Studies; Microbial culture collection)에서 분양받아 사용하였다(표 2 참조). 클로렐라의 배양 조건으로는 광배양기에서 광도 120 ± 5 μmol/photons/㎡/s, 온도 25 ± 2℃ 조건에서 빛을 24시간 조사하며 2주간 진탕배양하였다. 배양된 시료는 원심분리기로 수확하여 배지를 제거하고 글라스비드를 넣고 비드 비팅 분쇄 후 DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였고, 식품용 클로렐라는 정 형태의 제품을 막자사발로 곱게 분쇄한 후 동일한 방법으로 DNA를 정제하였다.
Species name Culture collection Medium
1 Chlorella regularis UTEX 1807 BG11
2 Chlorella vulgaris NIES 2170 BG11
3 Chlorella vulgaris UTEX 265 BG11
4 Chlorella zofingiensis CCAP 211/14 BG11
5 Chlorella vulgaris D사 상용 제품 (식품용)
Species name Culture collection
(Strain number) 		Medium
1 Chlorella vulgaris UTEX 265 BG11
2 Chlorella vulgaris UTEX 396 BG11
3 Chlorella vulgaris UTEX B1803 BG11
4 Chlorella vulgaris UTEX 1809 BG11
5 Chlorella vulgaris NIES 641 BG11
6 Chlorella vulgaris NIES 642 BG11
7 Chlorella vulgaris NIES 686 BG11
8 Chlorella vulgaris NIES 1269 BG11
9 Chlorella vulgaris NIES 1270 BG11
실시예 2. 마이크로새틀라이트 특이적 프라이머 제작 및 PCR 증폭
클로렐라의 유전체 내의 마이크로새틀라이트가 포함되어있는 좌위를 검색하기 위해서 클로렐라의 클로로플라스트 전체 염기서열 정보(Accession number. NC_001865)를 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 데이터베이스로부터 다운로드하였고, 얻어진 염기서열 정보를 인터넷에서 공개 제공하는 프로그램인 GRAMENE Ssrtool(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool) 프로그램을 사용하여 마이크로새틀라이트를 포함하는 좌위만을 검색하였다.
상기 검색된 마이크로새틀라이트를 포함하는 좌위의 염기서열을 토대로 하여 그 좌위만을 특이적으로 증폭할 수 있도록 하는 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 서열은 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타난 바와 같이, 프라이머의 길이는 20 ~ 26 bp 사이로 하였고, 프라이머가 붙는 온도(Tm)는 50 ~ 60℃가 되도록 하였으며, PCR 최종 증폭 산물의 크기는 150 ~ 300bp 범위 내에 있도록 제작하였다.
제작된 프라이머를 사용하여, 정제된 DNA를 주형으로 PCR 증폭을 수행하였으며, 안정적으로 증폭되는 최적 PCR 조건은 95℃ - 5분 동안 예비 변성 후, 95℃ - 30초, 50 ~ 65℃ - 30초, 72℃ - 30초의 조건을 35 반복주기로 실시하고, 최종 72℃ - 7분간 연장 반응은 조건을 찾아서 상황에 맞게 변형하여 실시하였다.
No. Marker Primer (5’ - 3’) TM(℃) Size (bp)
1
 mChl-001_F cct att gct cta tgt taa cat atg (서열번호17) 55 154-166
mChl-001_R gtt ttg aat ttt tcc cca ttg ctg (서열번호18)
2
 mChl-002_F aca ggc cag tca att tat tt (서열번호19) 55 159-183
mChl-002_R cac tac atc gtc tat ttg aca ttg ag (서열번호20)
3
 mChl-005_F caa gcc aat ttt att taa aat c (서열번호21) 55 164-200
mChl-005_R agg ttc acc tct tcg cct aa (서열번호22)
4
 mChl-011_F cag tat aga gta cac gat ttt cc (서열번호23) 55 175
mChl-011_R gag cgt gta att gtt ata act tc (서열번호24)
5
 mChl-012_F cgc tat agt cat agc gtg acg (서열번호25) 55 233-257
mChl-012_R ctt gaa agc ttc atg agg agt gcc (서열번호26)
실시예 3. 마이크로새틀라이트 유전자형 다형성 분석
마이크로새틀라이트 마커에 의해 증폭된 산물의 다형성을 분석하기 위하여 5% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하였다. 전기영동은 1 X TBE 완충용액 중 우레아를 7M의 농도로 함유하는 5% 폴리아크릴아마이드(acrylamide : bis - acrylamide = 19:1) 겔을 사용하였으며, 겔의 두께는 T: 0.4mm x L: 40cm을 이용하여 1600V 이상의 전압으로 2~4시간 동안 실시하였다. DNA 길이 다형성을 가시화하기 위하여 다음과 같은 과정으로 질산은 염색을 수행하였다. 질산은 염색은 프로메가 DNA 은염색 키트로, 전기영동이 완료된 겔을 10% 에탄올에 20분간 고정하고, 1% 질산용액에 10분간 반응한 후, 질산은 염색용액에 30분간 염색하고, 탄산나트륨을 처리하여 밴드가 검게 현상될 때까지 반응시켰다. 현상 반응은 10% 빙초산 용액을 처리하여 반응 중단을 유도하였다. 또한 각각의 대립유전자형의 구조를 분석하기 위하여, 다형성 밴드를 오려 겔 내의 DNA를 추출한 후 염기서열 분석(DNA sequencing)을 함으로써 구조를 파악하여 표 4에 도시된 바와 같이 각각의 대립유전자형을 명명하였다.
No. Marker Allele Structure Size(bp)
1 mChl-001 a 3 P24-N25-(T)-N69-(TTA)3-AG-P24 (서열번호1) 154
b 5 P24-N25-(C)-N69-(TTA)5-AG-P24 (서열번호2) 160
c 7 P24-N25-(C)-N69-(TTA)7-AG-P24 (서열번호3) 166
2 mChl-002 a 4-09 P20-N22-(GAA)4-N22-(A)9-N48-P26 (서열번호4) 159
b 5-10 P20-N22-(GAA)5-N22-(A)10-N48-P26 (서열번호5) 163
c 5-11 P20-N22-(GAA)5-N22-(A)11-N48-P26 (서열번호6) 164
d 6-12 P20-N22-(GAA)6-N22-(A)12-N48-P26 (서열번호7) 168
e 10-12 P20-N22-(GAA)7-(AAAGAC)-(GAA)2-N22-(A)12-N48-P26 (서열번호8) 183
3 mChl-005 a 2 P22-N54 - (AAAAAAAAAG)2-N48 - P20 (서열번호9) 164
b 5.5 P22-N80 -(AAAAAAAAAG)3 -N48 -P20 (서열번호10) 200
4 mChl-011 a G P23-N23-(G)-N105-P23 (서열번호11) 175
b T P23-N23-(T)-N105-P23 (서열번호12) 175
c A P23-N23-(A)-N105-P23 (서열번호13) 175
5 mChl-012 a 1 P21-N73-(AAG)3-N106-P24 (서열번호14) 233
b 2 P21-N73-N28-(AAG)2-N106-P24 (서열번호15) 258
c 3 P21-N73-N70-(AAG)2-N106-P24 (서열번호16) 300
표 1의 클로렐라 3속 4종의 DNA로부터 검출된 각 마커의 대립유전자 유전자형(allele type)은 각각 표 5와 같다.
Chlorella regularis Chlorella vulgaris
(NIES 2170)		 Chlorella vulgaris
(UTEX 265)		 Chlorella zofingiensis
mChl-001 5,3 5,5 7,7 3,3
mChl-005 2,2 5.5,5.5 2,2 5,5
mChl-012 1,1 1,1 2,2 1,1
genotype from [도 3]
즉, C. regularis는 3개의 마커에 의해 5,3-2,1-1,1의 combined genotype으로 표시될 수 있으며, 따라서, 5,5-5.5,5.5-1,1 (C. vulgaris NIES 2170), 7,7-2,2-2,2 (C. vulgaris UTEX 265), 3,3-5,5-1,1 (C. zofingiensis)의 유전자 형을 갖는 다른 세 종과 명확하게 구분됨을 확인할 수 있다. 본 발명의 마커를 이용하여 이를 통해 클로렐라의 속(genus) 수준, 즉 종간 식별이 가능하다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 표 2의 클로렐라 9종의 DNA로부터 검출된 각 마커의 대립유전자 유전자형(allele type)은 각각 표 6과 같다.
mChl-001 mChl-002 mChl-005 mChl-011 mChl-012
UTEX 265 7,7 6-12,6-12 2,2 T 2,2
UTEX 396 5,5 10-12,10-12 5.5,4.5 A 0,0
UTEX B1803 5,5 10-12,10-12 5.5,4.5 T 0,0
UTEX 1809 7,7 6-12,6-12 2,2 T 2,2
NIES 641 5,5 5-11,5-11 3,3 A 3,3
NIES 642 5,5 5-10,5-10 3.5,3.5 A 3,3
NIES 686 3,3 4-09,4-09 3.5,3.5 G 2,2
NIES 1269 5,5 5-11,5-11 3,3 T 3,3
NIES 1270 5,5 6-12,6-12 5.5,5.5 T 1,1
genotype from [도 4]
즉, 실험에 사용된 C. vulgaris 9종은 본 발명인 5개의 마커에 의해 상기와 같은 유전자형으로 명명되었으며, combined genotype이 7,7-6-12,6-12-2,2-T-2,2로 같은 UTEX 265와 UTEX 1809를 제외하고는 모든 strain이 식별됨을 확인 할 수 있었다. 또한 UTEX 265와 UTEX 1809는 현재까지 개발된 어떠한 마커로도 두 strain은 구별할 수 없으나, 본 마커를 포함하여 추가적으로 개발되는 마커를 통해 식별 가능할 수 있거나, 또는 두 strain이 본래 동일한 strain일 가능성도 배제할 수 없다고 결론 내릴 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 마커를 이용하여 클로렐라의 종(species) 수준, 즉 종내 식별이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명의 클로렐라의 염색체에서 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 클로렐라의 마이크로새틀라이트 분자를 증폭하고, 증폭된 DNA(Deoxyribonucleic acid), 즉 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 통해 클로렐라를 분류 식별할 수 있다는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Microsatellite molecular marker for specific distinction in Chlorella inter-species and strain level <130> PB12-10731 <150> 10-2011-0061945 <151> 2011-06-24 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 154 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 1 cctattgctc tatgttaaca tatgttgaaa ggattaaggc ttgtaaattt taaacttttt 60 ttatcttgtt tctttttata aattaatttt tttactttca aacccgtata tttttgtttt 120 tattattaag cagcaatggg gaaaaattca aaac 154 <210> 2 <211> 160 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 2 cctattgctc tatgttaaca tatgttgaaa ggattaaggc ttgtaagttc taaacttttt 60 ttatcttgtt tctttttata aattaatttt tttactttca aacccgtata tttttgtttt 120 tattattatt attaagcagc aatggggaaa aattcaaaac 160 <210> 3 <211> 166 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 3 cctattgctc tatgttaaca tatgttgaaa ggattaaggc ttgtaagttc taaacttttt 60 ttatcttgtt tctttttata aattaatttt tttactttca aacccgtata tttttgtttt 120 tattattatt attattatta agcagcaatg gggaaaaatt caaaac 166 <210> 4 <211> 159 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 4 acaggcccgc caatttattt gacgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagactgg 60 tttttctcct ttaaagaaaa aaaaatagaa aaaatttcta ttttagatag tactatttgt 120 tttattgttt atactcaatg tcaaatagac gatgtagtg 159 <210> 5 <211> 163 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 5 acaggcccgc caatttattt gacgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagaagac 60 tggtttttct cctttaaaga aaaaaaaaat agaaaaaatt tctattttag atagtactat 120 ttgttttatt gtttatactc aatgtcaaat agacgatgta gtg 163 <210> 6 <211> 164 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 6 acaggcccgc caatttattt gacgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagaagac 60 tggtttttct cctttaaaga aaaaaaaaaa tagaaaaaat ttctatttta gatagtacta 120 tttgttttat tgtttatact caatgtcaaa tagacgatgt agtg 164 <210> 7 <211> 168 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 7 acaggcccgc caatttattt gacgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagaagaa 60 gactggtttt tttcctttaa agaaaaaaaa aaaatagaaa aaatttctat tttagatagt 120 actatttgtt ttattgttta tactcaatgt caaatagacg atgtagtg 168 <210> 8 <211> 183 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 8 acaggcccgc caatttattt gatgatcgta gaccaagaac tggaagaaga agaagaagaa 60 gaaaaagacg aagaagactg gtttttctct tttaaagaaa aaaaaaaaat agaaaaaatt 120 tctattttag atagtactat ttgttttatt gtttatactc aatgtcaaat agacgatgta 180 gtg 183 <210> 9 <211> 164 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 9 caagccaatt ttatttaaaa tctttttttt aattaaaaaa aatttctttt ctattctttt 60 ttatgttttt ttttgtaaaa aaaaagaaaa aaaaagagca taaaaatgaa aagagaaaaa 120 actcaatttt gtgattccgt ttttttaggc gaagaggtga acct 164 <210> 10 <211> 200 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 10 caagccaatt ttatttaaaa tctttctttt aattaaaaaa aatttctttt ctattctttt 60 ttatgttttt gatctttttt tttttgaaaa aaaaaaagaa gtaaaaaaaa agaaaaaaaa 120 agaaaaaaaa agagcataaa attgaaaaga gaaaaaactc aattttgtga ttccgttttt 180 ttaggcgaag aggtgaacct 200 <210> 11 <211> 175 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 11 cagtatagag tacacgattt tccaatccta ataataaatc taaattgcgt aatcctatat 60 ctgcatcaat aagagcaaca cgataaccaa gccgagcaat tgacattcct aaatttgctg 120 ttgttgttgt tttcccaacc ccacctttgc ctgaagttat aacaattaca cgctc 175 <210> 12 <211> 175 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 12 cagtatagag tacacgattt tccaatccta ataataaatc taaatttcgt aatcctatat 60 ctgcatcaat aagagcaaca cgataaccaa gccgagcaat tgacattcct aaatttgctg 120 ttgttgttgt tttcccaacc ccacctttgc ctgaagttat aacaattaca cgctc 175 <210> 13 <211> 175 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 13 cagtatagag tacacgattt tccaatccta ataataaatc taaattacgt aatcctatat 60 ctgcatcaat aagagcaaca cgataaccaa gccgagcaat tgacattcct aaatttgctg 120 ttgttgttgt tttcccaacc ccacctttgc ctgaagttat aacaattaca cgctc 175 <210> 14 <211> 233 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 14 cgctatagtc atagcgtgac gatctccttt acaatgtatt caaaacttga accaaaaaaa 60 aatcttaagg ccttgtcttt cctttctgat tctaaagaag aagagaaaga gagtaacaaa 120 aattgaattt tgtgatggta tctgattctt tttttcaaaa agaaaaagat aaatcacttt 180 ttttgtttgt ttgtacaaaa atagtatatg gcactcctca tgaagctttc aag 233 <210> 15 <211> 258 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 15 cgctatagtc atagcgtgac gatctccttt acaatgtatt caaaacttga accaaaaaaa 60 aatcttaagg tcttgtcttt cctttctgat tctttgcttt ttttttagaa aaaaaaagca 120 tcaagaagag aaagagaatc acaaaaattg aattttgtga tggtatctga ttcttttttt 180 ctaaaagaaa aagataaatc actttttttg tttgtttgta caaaaatagt atatggcact 240 cctcatgaag ctttcaag 258 <210> 16 <211> 300 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 16 cgctatagtc atagcgtgac gatctccttt tcaatgtatt caaaacttta accaaaagaa 60 aatcttaagg tcttgtcttt cctttctgat tctttgcttt ttgatctttt ttttcttttt 120 ttttctaaaa aaaaaaaaaa aaagaaatag aaaaaaaaag catcaagaag agaaagagaa 180 tcacaaaaat tgaattttgt gatggtatct gattcttttt ttctaaaaga aaaagataaa 240 tcactttttt tgtttgtttg tccaaaaata gtatatggca ctcctcatga agctttcaag 300 300 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-001 Forward primer <400> 17 cctattgctc tatgttaaca tatg 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-001 Reverse primer <400> 18 gttttgaatt tttccccatt gctg 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-002 Forward primer <400> 19 acaggccagt caatttattt 20 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-002 Reverse primer <400> 20 cactacatcg tctatttgac attgag 26 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-005 Forward primer <400> 21 caagccaatt ttatttaaaa tc 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-005 Reverse primer <400> 22 aggttcacct cttcgcctaa 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-011 Forward primer <400> 23 cagtatagag tacacgattt tcc 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-011 Reverse primer <400> 24 gagcgtgtaa ttgttataac ttc 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-012 Forward primer <400> 25 cgctatagtc atagcgtgac g 21 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCh1-012 Reverse primer <400> 26 cttgaaagct tcatgaggag tgcc 24

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 클로렐라의 종 간 또는 균주 수준에서의 구분 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 서열번호 2 내지 12, 및 서열번호 14 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 마이크로새틀라이트 특이적 분자 마커 조성물.
  4. 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 포함하는, 클로렐라의 분류식별용 조성물.
  5. 제 4항의 조성물을 포함하는, 클로렐라 분류식별용 키트.
  6. 삭제
  7. a)클로렐라의 염색체에서 서열 번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21및 22, 서열번호 23 및 24, 및 서열번호 25 및 26 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기 서열 쌍으로 이루어지는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 클로렐라의 마이크로새틀라이트 분자를 증폭하는 단계; 및
    b)상기 증폭된 DNA(Deoxyribonucleic acid)의 길이 다형성(fragment length polymorphism)을 통해 분류하는 단계로 구성되는,
    클로렐라의 분류 식별방법.
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NCBI database. Chlorella vulgaris C-27 chloroplast DNA. GenBank: AB001684.1 (2004.01.30.). *

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