WO2022039336A1 - 바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법 - Google Patents

바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2022039336A1
WO2022039336A1 PCT/KR2021/000001 KR2021000001W WO2022039336A1 WO 2022039336 A1 WO2022039336 A1 WO 2022039336A1 KR 2021000001 W KR2021000001 W KR 2021000001W WO 2022039336 A1 WO2022039336 A1 WO 2022039336A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pcr
false
detection
target disease
real
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/000001
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김형준
김영철
김신후
김민지
Original Assignee
대한민국(해양수산부 국립수산과학원장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(해양수산부 국립수산과학원장) filed Critical 대한민국(해양수산부 국립수산과학원장)
Publication of WO2022039336A1 publication Critical patent/WO2022039336A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
    • C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
    • C12Q2545/101—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis with an internal standard/control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a method for discriminating false-negative and false-positive reactions that may appear in the detection of a pathogen gene of a target disease, and more specifically, to a pathogen gene detection of a target disease using the real-time RT-PCR method for viral hemorrhagic sepsis as a standard. It relates to a method for discriminating false negatives and false positives.
  • VHS Viral Haemorrhagic Septicaemia
  • OIE World Organization for Animal Health
  • cell culture method shows the highest sensitivity to the infective VHS virus (VHSV), but it takes about 2 weeks to incubate, so it is not suitable as a test method that can quickly respond to prevent disease transmission.
  • the real-time RT-PCR method a molecular biological diagnostic method, developed by the Danish VHS OIE standard laboratory (Jonstrup et al., 2013, hereafter referred to as Jonstrup VHS rRT-PCR method) and Canada
  • the method developed by the OIE standard laboratory (Garver et al., 2011) is listed in the OIE (World Organization for Animal Health) (OIE, 2019).
  • Warg et al. (2014) reported that the Jonstrup VHS rRT-PCR method showed the best detection sensitivity among several published real-time RT-PCR related papers for VHS diagnosis (Warg et al. 2014). Recently, Kim et al.
  • the Jonstrup VHS rRT-PCR method using all VHSV genotypes (I, II, III, IVa, IVb), cell culture method, Kim et al. (2018) scientifically proved that the detection sensitivity of the newly developed conventional RT-PCR method is the same. Therefore, the Jonstrup VHS rRT-PCR method has been proven to have the same detection sensitivity as the cell culture method, which has the best detection sensitivity, and can overcome the disadvantage of requiring long-term culture in cell culture. As such, the Jonstrup VHS rRT-PCR method has been confirmed as the best real-time RT-PCR method through several tests, and can be an excellent standard model for determining the sensitivity of gene detection.
  • Patent Registration No. 10-1763607 title of the invention: hepatitis A virus standard positive control gene and RNA transcript transcribed therefrom, registration date: July 26, 2017, etc. This has been disclosed.
  • the present invention has been proposed to solve the above problems of the previously proposed methods, and a nucleotide sequence according to the Jonstrup VHS rRT-PCR method standardized on a structurally stable plasmid DNA vector and a nucleotide sequence for gene detection of a target disease
  • a nucleotide sequence according to the Jonstrup VHS rRT-PCR method standardized on a structurally stable plasmid DNA vector and a nucleotide sequence for gene detection of a target disease
  • the present invention compares the standard viral hemorrhagic sepsis gene detection, the pathogen gene detection of the target disease, and the detection and amplification level of the vector gene, and the synthetic recombinant plasmid DNA used as a positive control through vector gene detection. Another purpose is to provide a method for determining whether contamination is present.
  • two probes are designed in the same primer set instead of one primer set and one probe generally used for pathogen gene detection of a target disease, and other probe detection reactions are confirmed in addition to the pathogen gene detection reaction of the target disease.
  • Another purpose is to provide a method for determining whether or not the amplified DNA product is contaminated with the sample as a method for determining whether the DNA amplification product of the target disease is contaminated through the
  • the present invention compares the detection of the 18s rRNA gene to determine whether the sampled sample was an appropriate RNA concentration for the PCR reaction and provides a standard for this, and at the same time as a mold or experimenter's carelessness in the laboratory in the PCR negative control Another purpose is to be able to determine the droplet contamination that may occur, and to comprehensively control false positive and false negative responses to a diagnostic sample of a target disease.
  • the present invention one-step real-time RT-PCR method without nucleic acid extraction of VHS virus and IHN virus (IHNV), which are human non-pathogenic viruses, assuming that the infectious RNA virus is actually contained in saliva such as saliva during droplet contamination.
  • VHS virus and IHN virus IHN virus
  • the virus is detected without nucleic acid extraction, it is another way to prevent contamination that may occur when patients with respiratory diseases such as COVID-19 perform gene detection diagnostics with 18s rRNA gene detection. The purpose.
  • step (3) cloning the gene synthesized in step (1) into a plasmid DNA vector, and extracting the synthetic recombinant plasmid DNA;
  • step (2) Using the extracted synthetic recombinant plasmid DNA as a template, primers and probes according to the synthetic nucleotide sequence for detecting the pathogen gene of the target disease selected in step (2), VHSV detection according to the Jonstrup VHS rRT-PCR method Incorporating primers and probes, primers and probes for detection of plasmid vector DNA into a real-time PCR cocktail preparation, performing multiplex real-time RT-PCR;
  • RNA virus when the pathogen of the target disease is an RNA virus, in order to determine the success of RNA extraction and cDNA synthesis by setting the eukaryotic common gene detection as an internal control, the real-time Incorporating the eukaryotic common gene detection primer and probe into the PCR cocktail preparation, verifying the RNA extraction and cDNA synthesis experimental process by confirming the internal control fluorescence reaction;
  • the pathogen of the target disease is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoe
  • It may be at least one selected from pathogens having a nucleic acid genome including bacteria, viruses and fungi.
  • the pathogen of the target disease is,
  • It may be at least one selected from infectious viral pathogens including DNA viruses and RNA viruses.
  • step (1) Preferably, in step (1),
  • the gene synthesis for the nucleotide sequence for determining the false positive is, in order to determine a false positive reaction due to contamination derived from the DNA product that has been amplified in the sample at the time of diagnosis of the target disease, the primer set for detecting the pathogen gene of the target disease is A gene according to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7, which is a specific nucleotide sequence different from the sequence of the pathogen gene to which other fluorescent probes can be attached in addition to the detection probe, can be synthesized within the located sequence.
  • step (7) Preferably, in step (7),
  • 18s rRNA gene is used as the eukaryotic common gene used to detect the internal control RNA
  • RNA extraction and The cDNA synthesis test process can be verified.
  • step (7) More preferably, in step (7),
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • a probe comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5
  • a reverse primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • step (8) Preferably, in step (8),
  • a primer and probe for detecting plasmid vector DNA are incorporated into the real-time PCR cocktail preparation, and then a reaction is checked to confirm a false positive reaction can be identified.
  • step (8) More preferably, in step (8),
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • a probe comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • a reverse primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • step (8) Preferably, in step (8),
  • a specific nucleotide sequence different from the sequence of the pathogen gene to which the probe for detecting the pathogen gene of the target disease can be attached to discriminate a false positive reaction due to contamination derived from a DNA product amplified through PCR in the sample By mixing a probe for contamination diagnosis targeting there is.
  • step (8) More preferably, in step (8),
  • the multiplex real-time RT-PCR is performed by mixing a probe including the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a primer and a probe for detecting the target disease pathogen.
  • a false-positive reaction can be identified from
  • step (8) Preferably, in step (8),
  • step (8) Preferably, in step (8),
  • step (8) More preferably, in step (8),
  • 18s rRNA gene is used as the eukaryotic common gene
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4
  • a probe comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5
  • a reverse primer comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6
  • the internationally validated and standardized Jonstrup VHS By synthesizing a gene containing the nucleotide sequence used in the rRT-PCR method and the nucleotide sequence for detecting the target disease pathogen gene at the same time, gene cloning and synthetic recombinant plasmid DNA extraction into a structurally stable plasmid DNA vector are performed, and the extracted high-concentration template By finally comparing the detection sensitivity of real-time RT-PCR using can be established
  • mold or droplet contamination that may occur due to the negligence of the experimenter can be determined in the laboratory, and false contamination that can be generated by lowering the detection sensitivity for the diagnostic sample of the target disease due to the contamination Negative and false positive reactions that can be exposed by an experimenter infected with respiratory viruses can also be controlled comprehensively.
  • FIG. 1 is a view showing the flow of a method for determining false negatives and false positives that may appear in the detection of a pathogen gene of a target disease using the viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method as a standard according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a method for determining false-negative and false-positive reactions that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention. Performed at the time of actual diagnosis of the target disease A drawing showing the detailed flow of the process.
  • FIG. 3 is a Jonstrup VHS rRT-PCR reaction in a method for discriminating false negatives and false positives that may appear in pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a method for determining false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method as a standard according to an embodiment of the present invention, synthetic recombinant plasmid DNA extraction and A diagram illustrating multiple real-time RT-PCR.
  • FIG. 5 is a method for discriminating false negatives and false positives that may appear in pathogen gene detection of a target disease using the viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method as a standard according to an embodiment of the present invention, including plasmid vector gene detection
  • FIG. 5 A diagram showing the results of a single real-time RT-PCR of each gene.
  • VHSV a VHSV, IHNV, plasmid vector in a method for discriminating false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method as a standard according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a method for discriminating false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method according to an embodiment of the present invention, each infection with VHSV and IHNV and a diagram showing the results of multiple real-time RT-PCR experiments on uninfected halibut and rainbow trout.
  • FIG. 8 is a method for determining false-negative and false-positive reactions that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention as a pathogen of the target disease
  • the mold-contaminated air conditioner A diagram showing the results of PCR experiments depending on whether or not exposed to air.
  • 10 is a method for discriminating false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease based on the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention, through 18s rRNA gene detection
  • RNA viruses such as VHSV and IHNV were subjected to real-time PCR reaction without RNA extraction, viral genes were not detected, but in real-time RT-PCR reaction including reverse transcription reaction, only live virus fluid without RNA extraction was put into the PCR reaction solution.
  • GenBank 12 is a view showing the results of searching for the nucleotide sequence of the primer and probe portion of the 18s rRNA gene in the GenBank (NCBI GenBank).
  • S100 The step of linking and synthesizing the nucleotide sequence according to Jonstrup VHS rRT-PCR method and the nucleotide sequence for the detection of the pathogen gene of the target disease and the nucleotide sequence for false positive identification
  • step S300 cloning the gene synthesized in step S100 into a plasmid DNA vector, extracting the synthetic recombinant plasmid DNA
  • step S400 using the extracted synthetic recombinant plasmid DNA as a template, primers and probes according to the synthetic nucleotide sequence for detecting the pathogen gene of the target disease selected in step S200, primers and probes for VHSV detection according to the Jonstrup VHS rRT-PCR method, plasmid Incorporating a primer and a probe for detection of vector DNA into a real-time PCR cocktail preparation, performing multiplex real-time RT-PCR
  • S800 Step of discriminating false negatives and false positives by checking multiple fluorescence reaction results when diagnosing a target disease
  • FIG. 1 is a diagram showing the flow of a method for determining false negatives and false positives that may appear in the detection of a pathogen gene of a target disease using the viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method as a standard according to an embodiment of the present invention. As shown in Fig.
  • performing the Jonstrup VHS rRT-PCR method and the rRT-PCR reaction for detecting the pathogen gene of the target disease comparing the detection sensitivities for the two reactions, selecting a synthetic nucleotide sequence for detecting the pathogen gene of the target disease (S200), Cloning the gene synthesized in step S100 into a plasmid DNA vector, extracting the synthetic recombinant
  • False positives may be due to sample contamination, plasmid DNA used as a positive control, or PCR product contamination.
  • the present invention uses the highly reliable VHS real-time RT-PCR method of the OIE International Diagnostic Manual as a standard to extract synthetic recombinant plasmid DNA that can be used as a positive control, and uses this to extract the VHS detection sensitivity and the pathogen of the target disease. By comparing the gene detection sensitivity, it is possible to verify the effectiveness of the pathogen gene detection sensitivity of the target disease.
  • the nucleotide sequence according to the Jonstrup VHS rRT-PCR method and the gene for the nucleotide sequence for the detection of the pathogen gene of the target disease and the false positive discrimination can be linked and synthesized.
  • the pathogen of the target disease may be at least any one selected from all pathogens having a nucleic acid genome including bacteria, viruses and fungi, and more specifically, the pathogen of the target disease includes all pathogens including DNA viruses and RNA viruses. It may be at least one selected from infectious viral pathogens.
  • the target disease may be Infectious Haematopoietic Necrosis (IHN), and the nucleotide sequence of the synthesized gene is as follows.
  • IHN Infectious Haematopoietic Necrosis
  • VHSV gene (SEQ ID NO: 8): 5'-AAACTCGCAGGATGTGTGCGTCCcgggCAGAAGATCACCAAGGCCCTCTAtgcgTTCATCCTGACTGAGATCGCAGAgggccc-3'
  • IHNV gene 5'-AGAGCCAAGGCACTGTGCGccaTGAGACTGAGCGGGACAGGAATGACAATGGTGGGACTGTTCAACCAAGCCGCAAAGAA-3'
  • step S100 the gene synthesis for the nucleotide sequence for determining the false positive is performed to determine the false positive reaction due to contamination derived from the pre-amplified DNA product in the sample at the time of diagnosis of the target disease, for detecting the pathogen gene of the target disease
  • a gene according to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, which is a specific nucleotide sequence different from the sequence of a pathogen gene to which other fluorescent probes can be attached, can be synthesized within the sequence in which the primer set is located.
  • the specific nucleotide sequence is as follows.
  • step S200 the synthesized gene is diluted stepwise and each dilution is used as a template, but the Jonstrup VHS rRT-PCR method and the rRT-PCR reaction for detecting the pathogen gene of the target disease are performed respectively, and the detection sensitivity for the two reactions is compared to the target disease Synthetic nucleotide sequences for detection of pathogen genes can be selected. More specifically, in step S200, the two genes synthesized in step S100 are serially diluted 10-fold each and each dilution is used as a template, but the standard Jonstrup VHS rRT-PCR method and the rRT-PCR reaction for detecting the pathogen gene of the target disease are performed simultaneously. By comparing each fluorescence curve generated by the two reactions, the final detection dilution factor of the target disease pathogen gene detection method is at the same level as that of the standard VHSV detection method. You can select a nucleotide sequence.
  • the primer and probe are adjusted so that the detection limit of the pathogen gene of the target disease appears similar to the detection limit of the VHSV gene.
  • Synthetic nucleotide sequences for pathogen gene detection can be selected.
  • step S200 since the detection sensitivity of the internationally validated Jonstrup VHS rRT-PCR method is used as a standard, an optimal synthetic nucleotide sequence can be selected quickly.
  • step S300 the gene synthesized in step S100 may be cloned into a plasmid DNA vector to extract synthetic recombinant plasmid DNA. More specifically, in step S300, among the genes synthesized in step S100, the selected one in step S200 is inserted into a plasmid DNA vector and cloned into E. coli, and the synthetic DNA recombinant plasmid DNA can be extracted and quantified. That is, the pathogen gene of the target disease confirmed to have the same detection sensitivity as the Jonstrup VHS rRT-PCR method in step S200 can be cloned.
  • the synthetic recombinant plasmid DNA includes all of the VHSV detection gene, the pathogen gene of the target disease, and the gene of the plasmid vector itself, and each copy of the synthetic recombinant plasmid DNA contains the same amount of genes.
  • the plasmid vector may be a commercial plasmid DNA, more preferably, a pGEM T-easy vector from Promega.
  • step S400 the extracted synthetic recombinant plasmid DNA is used as a template, primers and probes according to the synthetic nucleotide sequence for detecting the pathogen gene of the target disease selected in step S200, primers and probes for VHSV detection according to the Jonstrup VHS rRT-PCR method , by incorporating primers and probes for detection of plasmid vector DNA into a real-time PCR cocktail preparation, multiplex real-time RT-PCR can be performed. More specifically, in step S400, multiple real-time RT-PCR is performed by incorporating VHSV forward primer (VHSV F), reverse primer (VHSV R) and probe (VHSV probe) as shown in Table 1 below as primers and probes for VHSV detection.
  • VHSV F VHSV forward primer
  • VHSV R reverse primer
  • VHSV probe VHSV probe
  • FAM Forward, Reverse, Probe
  • HEX Forward, Reverse, Probe
  • Texas Red plasmid vector detection
  • Primers and probes for detecting plasmid vectors are shown in Table 2 below.
  • the target disease is Infectious Haematopoietic Necrosis (IHN), and in step S400, as a primer and a probe for detecting IHNV, with reference to the nucleotide sequence of Hoferer et al., 2019, Table 3 and Multiple real-time RT-PCR can be performed by incorporating the same forward primer (IHN F), probe (IHN probe), and reverse primer (IHN R).
  • IHN F forward primer
  • probe IHN probe
  • IHN R reverse primer
  • step S500 from the results of multiple real-time RT-PCR, the detection sensitivity of VHSV and the detection sensitivity of the pathogen gene of the target disease are compared, the sensitivity of the pathogen gene detection method of the target disease is verified, and false negative reaction by using the low sensitivity detection method can prevent
  • the detection sensitivity of the internationally validated VHS Jonstrup diagnostic method is standardized, the effectiveness of the pathogen gene detection method for the target disease can be measured.
  • step S500 by verifying the detection sensitivity of step S500, a high-sensitivity gene detection method for the target disease is established in a short time, and a low-sensitivity detection method It is possible to prevent false negative reactions due to use.
  • FIG. 2 is a method for determining false-negative and false-positive reactions that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention. Performed at the time of actual diagnosis of the target disease It is a diagram showing the detailed flow of the process. As shown in FIG.
  • the method for determining false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method as a standard is, After S500, by using the synthetic recombinant plasmid DNA as a positive control, when diagnosing the target disease, confirming the success of multiple real-time PCR experiments for detecting the target disease pathogen gene without using the target disease pathogen directly (S600) ,
  • the target disease is diagnosed, if the pathogen of the target disease is an RNA virus, eukaryotic common gene detection in real-time PCR cocktail preparations to determine the success of RNA extraction and cDNA synthesis by using eukaryotic common gene detection as an internal control Incorporating a primer and a probe, verifying the RNA extraction and cDNA synthesis experimental process by confirming the internal control fluorescence reaction (S700) It may be implemented by further including a step (S800) of doing.
  • step S600 by using the extracted quantified synthetic recombinant plasmid DNA as a positive control, the success or failure of the multiplex real-time PCR experiment for detecting the target disease pathogen without directly using the positive control as the target disease pathogen during actual disease diagnosis can be checked. .
  • step S700 when the target disease is diagnosed, if the pathogen of the target disease is an RNA virus, the detection of the eukaryotic common gene is set as an internal control to determine the success of RNA extraction and cDNA synthesis, real-time PCR cocktail
  • RNA extraction and cDNA synthesis experimental procedures can be verified through confirmation of an internal control fluorescence reaction.
  • step S700 the 18s rRNA gene is used as the eukaryotic common gene used for internal control RNA detection, and the RNA template is injected to a concentration of 1 ⁇ g/ ⁇ l on the real-time PCR cocktail preparation, and 18s rRNA is detected.
  • RNA extraction and cDNA synthesis experiments can be verified by checking whether the Ct value of the corresponding fluorescence curve forms between 10 and 20.
  • RNA-to-cDNA When a synthetic plasmid is used as a positive control during the RT-PCR process, there is no control for the RNA-to-cDNA process. Therefore, it is possible to verify the effectiveness of RNA -> cDNA of the sample to be tested by reacting the 18s rRNA gene together to serve as a control for validation of RNA after RNA extraction from the sample.
  • VHS, IHN, or the virus causing COVID-19 are all RNA viruses, if applied to DNA viruses, it can be used more conveniently because there is no need for an internal control such as 18s rRNA gene.
  • a forward primer comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • a probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 5
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 Multiple real-time RT-PCR method can be performed by incorporating a reverse primer comprising a.
  • step S800 false negatives and false positives may be discriminated by checking multiple fluorescence reaction results when diagnosing a disease. There are various false negative and false positive reactions that can be discriminated in step S800, and each of them will be described in detail below.
  • step S800 when the target disease is diagnosed, in order to determine false positives due to DNA contamination derived from the positive control in the sample, a primer and a probe for detecting plasmid vector DNA are incorporated into the real-time PCR cocktail preparation, followed by checking whether a reaction is false. A positive reaction can be identified.
  • step S800 as a primer and a probe for detecting the plasmid vector gene, a forward primer comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a probe comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3
  • a multiplex real-time RT-PCR method may be performed by incorporating a reverse primer including a nucleotide sequence, and a false positive reaction may be discriminated from the result.
  • the VHSV detection reaction, the pathogen gene detection reaction of the target disease, and the plasmid vector gene detection reaction all show the same detection sensitivity, it can be determined whether the synthetic recombinant plasmid DNA used as a positive control is contaminated or not, and whether the plasmid vector gene is detected or not. It can be judged in real time by comparing the amplification level. In this case, by comparing the detection and amplification level of the plasmid vector gene, it is possible to determine a false positive reaction according to the contamination of the synthetic recombinant plasmid DNA used as a positive control.
  • step S800 when diagnosing a target disease, in order to determine a false positive reaction due to contamination derived from a DNA product amplified through PCR in the sample, the sequence of the pathogen gene to which the probe for detecting the pathogen gene of the target disease can be attached;
  • a probe for contamination diagnosis targeting a different specific nucleotide sequence and a probe and primer for detecting the target disease pathogen gene into the real-time PCR cocktail, it is confirmed whether two fluorescence reactions occur simultaneously by the two probes to prevent a false positive reaction. can be discerned.
  • multiplex real-time RT-PCR is performed by incorporating two probes into the primer set for detecting the pathogen gene of the target disease in the real-time PCR cocktail product of step S400, and the detection of the two probes is compared to determine whether the real-time PCR product is contaminated false-positive reactions can be identified.
  • step S800 as a probe for contamination diagnosis targeting a specific nucleotide sequence, a probe including the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a primer and probe for detecting a target disease pathogen are mixed to perform multiplex real-time RT-PCR , and a false-positive reaction can be discriminated from the performance result.
  • step S800 when diagnosing the target disease, in order to determine false positives due to DNA contamination derived from the positive control in the sample, the real-time PCR cocktail is prepared with primers and probes used in the pathogen gene detection method of the target disease, not VHS. After real-time PCR is performed by mixing Jonstrup VHS rRT-PCR primer and probe, it is possible to determine whether a fluorescence reaction occurs at the same time according to the two detection methods to determine a false positive reaction.
  • step S800 when diagnosing a target disease, false negatives and false positives due to contamination of diagnostic error factors derived from laboratory environments including airborne mold, droplets generated from an experimenter, or droplets containing pathogens generated from an experimenter infected with the target disease
  • a primer and a probe for detecting the eukaryotic common gene in the real-time PCR cocktail preparation check the presence or absence of a fluorescence reaction in the non-template control, mold or droplet contamination False negative and false positive reactions can be discriminated.
  • the 18s rRNA gene is used as the eukaryotic common gene, and as a primer and probe for detecting the eukaryotic common gene, a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, the base shown in SEQ ID NO: 5
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the base shown in SEQ ID NO: 5 Multiple real-time RT-PCR method can be performed by incorporating a probe including the sequence and a reverse primer including the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. That is, since a diagnostic error factor such as mold can be detected using the 18s rRNA gene, when the 18s rRNA gene is detected, it can be determined that the experimenter or the laboratory environment is contaminated with mold.
  • the standardized Jonstrup VHS rRT -Genome cloning and synthetic recombinant plasmid DNA extraction are performed on a structurally stable plasmid DNA vector by synthesizing a gene containing the nucleotide sequence used in the PCR method and the nucleotide sequence for detecting the target disease pathogen gene, and using this to perform real-time RT-
  • the detection sensitivities of PCR it is possible to verify the effectiveness of the detection sensitivity of the pathogen gene of the target disease, and by adjusting it, it is possible to establish a gene detection method with high sensitivity for the target disease without the pathogen of the target disease in a short time.
  • mold or droplet contamination that may occur due to the negligence of the experimenter can be determined in the laboratory, and false contamination that can be generated by lowering the detection sensitivity for the diagnostic sample of the target disease due to the contamination Negative and false positive reactions that can be exposed by an experimenter infected with a respiratory virus can also be controlled comprehensively.
  • Jonstrup VHS rRT which was identified as the best real-time RT-PCR method through several tests, to determine whether the step that determines the actual detection sensitivity in real-time RT-PCR using reverse transcriptase is the RT process or the PCR process after cDNA conversion
  • One-step RT-PCR and two-step RT-PCR were performed using the -PCR method, respectively.
  • RNA is extracted from the cell culture supernatant of VHSV belonging to genotype II and VHSV belonging to genotype IVa (Qiagen Viral RNA mini Kit), and the final elution per 100 ⁇ l of the cell culture medium to dilute the RNA 10-fold in the PCR step. was concentrated 10 times to 10 ⁇ l. This was serially diluted 10-fold and diluted to 10 -10 .
  • RNA is synthesized with 10 ⁇ l of RNA and 5 ⁇ l of cDNA was used for PCR.
  • RNA virus VHSV gene It is a diagram showing the experimental results of testing the possibility of standardization of the Jonstrup VHS rRT-PCR method using plasmid DNA as a positive control through an experiment confirming the step at which the PCR detection sensitivity is determined.
  • RNA ⁇ cDNA ⁇ PCR is unified for VHSV genotypes II and IVa
  • the lower two graphs are after cDNA conversion of RNA calculated to be the same as the amount of RNA above.
  • Two-step RT-PCR result after PCR process.
  • the PCR detection sensitivity is determined through the fact that the gene detection sensitivities of the upper and lower halves are the same (VHSV II: detection up to 10 -5 dilution, VHSV IVa: detection up to 10 -6 dilution) It can be confirmed that it is not the stage of cDNA formation in the RNA state, but the PCR reaction stage at the time of cDNA formation.
  • IHN is a viral disease that causes massive death with bleeding in salmonid fish such as rainbow trout. Its symptoms are similar to VHS, and preliminary diagnosis is important.
  • Using the target disease as IHN a method for discriminating false-negative and false-positive reactions that may appear in the pathogen gene detection of the target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention as a standard was performed.
  • the synthesized gene was cloned into the pGEM T-Easy plasmid vector, and then the plasmid DNA was extracted to synthesize a synthetic recombinant plasmid DNA.
  • Figure 4 is a method for determining false negatives and false positives that can appear in the pathogen gene detection of a target disease using the viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method as a standard according to an embodiment of the present invention, synthetic recombinant plasmid DNA extraction and It is a diagram illustrating multiple real-time RT-PCR. As shown in FIG. 4 , one copy of the extracted synthetic recombinant plasmid DNA may contain the same amount of plasmid vector, VHSV, and IHNV genes, respectively.
  • the synthetic recombinant plasmid DNA extracted in Example 2 was serially diluted 10-fold to 10 -10 , and multiple real-time RT-PCR was performed using BIO-RAD CFX96 equipment and QIAGEN Quantitect probe RT-PCR kit.
  • VHSV F VHSV probe
  • VHSV R VHSV R
  • Vector F Vector probe (Texas Red) shown in Table 2 for plasmid vector detection
  • Vector R IHN F, IHN probe (HEX), and IHN R shown in Table 3 were used for IHNV detection.
  • PCR reaction was performed to detect the 18s rRNA gene, for a control to confirm the RNA validity. That is, multiplex real-time RT-PCR was performed by putting all primers and probes together for VHSV, IHNV, plasmid vectors (using synthetic recombinant plasmid DNA) and 18s rRNA genes. At this time, the composition of the multiple real-time RT-PCR mixture containing the 18s rRNA gene is shown in Table 5 below, and a total of 20 pmol of each primer and probe was used.
  • FIG. 5 is a single real-time RT of each gene in a method for discriminating false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method as a standard according to an embodiment of the present invention; - It is a view showing the results of PCR, and FIG. 6 is a false negative and false positive reaction that may appear in the detection of the pathogen gene of the target disease using the real-time RT-PCR method for viral hemorrhagic sepsis according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 which is the result of a single PCR reaction of each detection primer and probe using DNA diluted 10-10 steps of synthetic recombinant plasmid DNA as a template
  • Fig. 6 which is a result of multiple real-time RT-PCR
  • the three genes (VHSV, IHNV, plasmid vector) to be detected by RT-PCR showed the same detection sensitivity as a single PCR reaction.
  • FIG. 7 is a method for discriminating false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis real-time RT-PCR method according to an embodiment of the present invention, each infection with VHSV and IHNV and a diagram showing the results of multiple real-time RT-PCR experiments on uninfected halibut and rainbow trout.
  • FIG. 7 only the 18s rRNA gene was detected in healthy halibut and rainbow trout, confirming that the RNA-cDNA-PCR process was well progressed, and neither the VHS nor IHN virus genes were detected.
  • the VHSV gene was specifically detected in VHSV-infected halibut, and the IHN virus gene was specifically detected in rainbow trout infected with IHN.
  • FIG. 8 is a method for determining false-negative and false-positive reactions that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention as a pathogen of the target disease It is a diagram showing the result of identically detecting two probes in one primer set in the IHNV detection PCR process. As shown in FIG. 8 , it can be accurately confirmed that the positive control is contaminated from the result of detecting both probes in one primer set.
  • Example 5 Experimenter and/or laboratory environment contamination determination experiment through comparison of detection of 18s rRNA gene
  • the 18s rRNA gene used for multiple real-time RT-PCR of the present invention can detect eukaryotes, so it can be determined whether fungal contamination is present. To confirm this, a mold contamination confirmation experiment was performed from the air conditioner.
  • Example 3-2 In the same manner as in Example 3-2 above, two sets of PCR cocktails were made to perform multiplex real-time RT-PCR, and then one set was subjected to multiplex real-time RT-PCR without air conditioning exposure, and the other set was placed in an air conditioner. Multiple real-time RT-PCR was performed after exposure for 1 min.
  • the mold-contaminated air conditioner It is a diagram showing the PCR test results according to whether or not exposed to air. As shown in FIG. 9 , the 18s rRNA gene was detected in the air conditioning exposure group, and in the negative control group, all of the groups exposed to the air conditioner showed a positive reaction, especially without the template and without nucleic acid extraction.
  • Sample contamination due to environmental diagnostic error factors includes not only mold contamination in the air in laboratories where mold is continuously emitted due to the use of air conditioners, etc. There is a target disease pathogen contamination caused by. Therefore, in order to determine whether or not contamination by the experimenter is contamination by the experimenter, 1 ⁇ l of the saliva stock solution is filtered through a 0.2 ⁇ m filter that can filter out mold, and 1 ⁇ l of the saliva is used as a sample for 18s rRNA gene detection reaction without nucleic acid extraction. did
  • 10 is a method for discriminating false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease based on the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention, through 18s rRNA gene detection It is a diagram showing the experimental results of detecting genes by PCR reaction of human saliva and saliva in the PCR reaction solution. As shown in Figure 10, 18s rRNA gene was detected in both groups.
  • VHSV cell culture medium (genotype II and IV) and IHNV cell culture medium (Wanju09, Wanju15 strains) was subjected to gene detection reaction without nucleic acid extraction.
  • RNA viruses such as VHSV and IHNV, which are used to detect the target pathogen gene in the present invention
  • real-time PCR reaction without RNA extraction
  • viral genes are not detected, but in real-time RT-PCR reaction including reverse transcription reaction without RNA extraction
  • FIG. 11 shows that when RNA viruses such as VHSV and IHNV, which are used to detect the target pathogen gene in the present invention, are subjected to real-time PCR reaction without RNA extraction, viral genes are not detected, but in real-time RT-PCR reaction including reverse transcription reaction without RNA extraction
  • FIG. 11 shows that when RNA viruses such as VHSV and IHNV, which are used to detect the target pathogen gene in the present invention, are subjected to real-time PCR reaction without RNA extraction, viral genes are not detected, but in real-time RT-PCR reaction including reverse transcription reaction without RNA extraction
  • FIG. 11 shows that when RNA viruses such as VHSV and IHNV, which are used to detect the target pathogen gene in the present invention, are
  • FIG. 12 is a view showing the results of searching for the nucleotide sequences of the primer and probe portions of the 18s rRNA gene in NCBI GenBank. As shown in FIG. 11 , it can be confirmed that most of the primers and probes (SEQ ID NOs: 4 to 6) of the 18s rRNA gene developed in the present invention have the same nucleotide sequences as fish, humans, fungi, and the like.
  • the method for discriminating false negatives and false positives that may appear in the pathogen gene detection of a target disease using the real-time viral hemorrhagic sepsis RT-PCR method according to an embodiment of the present invention as a standard is 18s rRNA gene detection You can check the contamination of the experimenter and the laboratory environment in real time by checking the there is. This function makes it possible to discriminate false-positive reactions that can occur by experimenters exposed to pathogens in laboratories that diagnose respiratory pathogens by gene detection, so it is particularly suitable for application to diagnostic laboratories dealing with large-scale infectious respiratory diseases such as COVID-19. may be appropriate.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명에서 제안하고 있는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 따르면, 구조적으로 안정적인 플라스미드 DNA 벡터에 표준화된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열과 목적 질병 검출을 위한 염기서열을 동시에 포함하는 합성유전자를 클로닝하여 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하고, 이를 이용해 실시한 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 비교함으로써, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도의 유효성을 검증하고, 이를 조정하여 짧은 시간 내에 높은 민감도의 목적 질병에 대한 유전자 검출법을 확립할 수 있다.

Description

바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법
본 발명은 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 관한 것이다.
바이러스성출혈성패혈증(Viral Haemorrhagic Septicaemia, VHS)에 대한 국제적으로 통용되고 있는 진단 매뉴얼은 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)에서 제시하고 있으며, 세포배양법, 면역항체검출법, 분자생물학적 진단법 등 여러 가지 진단법이 제시되어 있다. 이 중 세포배양법은 감염력 있는 VHS 바이러스(VHS Virus, VHSV)에 대해 최고 민감도를 나타내고 있으나 배양 기간이 2주 정도 소요되므로 질병 전파를 방지하기 위해 빠르게 대처할 수 있는 검사 방법으로는 적절하지 않다. 이렇게 장시간이 소요되는 세포배양법의 단점을 극복하기 위해 분자생물학적 진단법인 실시간 RT-PCR 법은 덴마크 VHS OIE 표준실험실에서 개발한 방법(Jonstrup et al., 2013, 이하 Jonstrup VHS rRT-PCR 법)과 캐나다 OIE 표준실험실에서 개발한 방법(Garver et al., 2011)이 OIE(세계동물보건기구)에 등재되어 있다(OIE, 2019). Warg et al. (2014)는 VHS 진단을 위해 출판된 여러 가지 실시간 RT-PCR 법 관련 논문 중 Jonstrup VHS rRT-PCR 법이 가장 좋은 검출 민감도를 나타낸다고 보고했다(Warg et al. 2014). 최근 Kim et al. (2018)은 모든 VHSV 유전자형 (I, II, III, IVa, IVb)을 사용하여 Jonstrup VHS rRT-PCR 법이, 세포배양법, Kim et al. (2018)이 새롭게 개발한 conventional RT-PCR 법과 검출 민감도가 같음을 과학적으로 증명하였다. 따라서 Jonstrup VHS rRT-PCR 법은 검출 민감도가 가장 좋은 세포배양법과 같은 검출 민감도를 가지는 것이 증명되어, 세포배양에서 장시간 배양이 소요되는 단점을 극복할 수 있다. 이와 같이, Jonstrup VHS rRT-PCR 법은 여러 테스트를 통해 가장 우수한 실시간 RT-PCR 법으로 확인되었는바, 유전자 검출 민감도를 판명하기 위해 우수한 표준 모델이 될 수 있다.
한편, 진단에 사용할 병원체를 확보하기 어려운 상황이거나 병원체가 고위험으로 분류되어 해당 실험실에서 보유 또는 다루기 어려운 상황이라면 진단법 개발에 많은 제한이 따를 수밖에 없고, 각 검체마다 병원체의 양적 차이가 있으므로 검출 민감도에 대한 유효성 평가가 제대로 수행되기에는 한계가 있었다. 또한, 확보된 시료의 상태와 점액질 농도에 따라 자동 핵산 추출기에서 추출하는 과정 중 샘플이 필터에 막히는 현상 등으로 제대로 된 핵산 추출이 어려운 경우일 때, 실제 병원체를 검출하는데 사용될 핵산 농도 부족 및 핵산추출물 내 PCR inhibitor의 유입으로 이어져 제대로 된 진단이 어려울 수 있다. 더욱이, 같은 목적의 진단 제품을 생산한다고 하더라도 유전자 검출 부위가 각각 다르므로 그 검출 감도 또한 달라진다. 이와 같은 한계로 인하여, PCR의 검출한계에 대해 정확한 표준 모델이 없는 실정이다.
또한, 분자생물학적 진단을 위한 실험실은 DNA 오염, 눈에 잘 보이지 않는 타 생물체나 실험자로부터의 오염 등이 없는 환경이 되어야만 거짓양성 및 거짓음성 반응이 예방될 수 있다. 그 중 가장 대표적인 오염은 실험을 할 때마다 증폭시킬 수밖에 없는 양성대조구 핵산 오염이며, 공기 중 곰팡이, 실험자의 비말 등의 환경적인 진단오류인자에 의해 거짓음성 및 거짓양성이 발생할 수 있다. 하지만 실험실에서 지속적인 환경 오염 측정을 할 수 있는 도구는 매우 한정적이며, 주기적으로 확인한다고 해도 실험할 때 항상 정확히 확인할 수 없는 한계가 있다. 그리고 지금까지의 모든 분자생물학적 실험은 진단하고자 하는 시료 각각에 대해 반응이 제대로 수행되었는지를 보는 것보다, 실험 전체에 대해 대조구만으로 세팅되어 왔다. 따라서 실험할 때마다 각각의 시료 하나하나에 대해 유전자 검출 유효성과 오염 여부를 확인하여 귀중하고 소중한 시료의 진단 결과를 정확하게 산출할 수 있는 거짓양성 반응 판별 도구의 개발이 대두된다.
한편, 본 발명과 관련된 선행기술로서, 등록특허 제10-1763607호(발명의 명칭: A형 간염바이러스 표준양성대조군 유전자 및 이로부터 전사되는 RNA 전사체, 등록일자: 2017년 07월 26일) 등이 개시된 바 있다.
본 발명은 기존에 제안된 방법들의 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 구조적으로 안정적인 플라스미드 DNA 벡터에 표준화된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열과 목적 질병의 유전자 검출을 위한 염기서열을 동시에 포함하는 합성 유전자를 클로닝하여 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하고, 이를 이용해 실시한 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 비교함으로써, 목적 질병의 거짓음성 반응을 판별하고 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하여 목적 질병 유발 병원체가 없는 상황과 고위험 병원체를 다룰 수 없는 상황에서도 짧은 시간 내에 목적 질병의 병원체 유전자 검출 감도 유효성 검증 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 표준으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 유전자 검출, 목적 질병의 병원체 유전자 검출, 그리고 벡터 유전자의 검출 여부 및 증폭 수준을 비교해, 벡터 유전자 검출을 통해 양성대조구로 사용하는 합성 재조합 플라스미드 DNA의 오염 여부를 판단할 수 있는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그리고, 본 발명은, 목적 질병의 병원체 유전자 검출에 일반적으로 사용하는 1개의 프라이머 세트와 1개의 프로브가 아닌 동일 프라이머 세트에 2개의 프로브를 디자인하여 목적 질병의 병원체 유전자 검출 반응 이외에 타 프로브 검출 반응 확인을 통해 목적 질병의 병원체 유전자 증폭 산물의 DNA 오염 여부를 판단할 수 있는 방법으로서 증폭된 DNA 산물이 검체에 오염되었는지 여부를 알 수 있는 판별 기법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
뿐만 아니라, 본 발명은, 18s rRNA 유전자의 검출 여부를 비교해, 샘플링된 시료가 PCR 반응에 적절한 RNA 농도였는지를 판별하여 이에 대한 표준을 제공함과 동시에 PCR 음성 대조구에서 실험실에서의 곰팡이나 실험자의 부주의로 발생할 수 있는 비말 오염에 대해 판별할 수 있으며, 목적 질병의 진단 시료에 대한 거짓양성, 거짓음성 반응을 종합적으로 제어할 수 있는 것을 또 다른 목적으로 한다.
특히, 본 발명은, 비말 오염 중 감염력 RNA 바이러스가 실제 침 등 타액에 포함되어있다고 가정하고 인체 비병원성 바이러스인 VHS 바이러스와 IHN 바이러스(IHNV)를 핵산 추출 없이 One-step 실시간 RT-PCR 법을 진행하여 핵산추출 없이도 바이러스가 검출되는 것을 확인한바, COVID-19 등과 같은 호흡기 질환 환자가 유전자 검출 진단법을 수행할 때 발생할 수 있는 오염을 18s rRNA 유전자 검출로 오진 예방을 할 수 있는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법은,
(1) Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계;
(2) 상기 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계;
(3) 상기 단계 (1)에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계;
(4) 상기 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 상기 단계 (2)에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계;
(5) 상기 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도와 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지하는 단계;
(6) 상기 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계;
(7) 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구(internal control)로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계; 및
(8) 상기 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계를 포함하는 것을 그 구성상의 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 목적 질병의 병원체는,
세균, 바이러스 및 곰팡이를 포함하는 핵산 유전체를 지닌 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다.
더욱 바람직하게는,
상기 목적 질병의 병원체는,
DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 포함하는 감염성 바이러스 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (1)에서,
상기 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자 합성은, 상기 목적 질병의 진단 시 검체 내의 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프라이머 세트가 위치한 서열 내부에 검출용 프로브 외에 다른 형광 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열인 서열번호 7에 기재된 염기서열에 따른 유전자를 합성할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (7)에서는,
상기 내부대조구 RNA 검출에 사용하는 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며,
실시간 PCR 칵테일 제조물 상에 RNA 주형을 주입하고 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 반응 후, 해당 형광 곡선의 Ct value가 10 이상 20 이하를 형성하는지 여부를 확인하여 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 단계 (7)에서는,
상기 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 목적 질병의 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입한 후 반응 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 플라스미드 벡터 유전자의 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 목적 질병 진단 시, 검체 내에 PCR을 통해 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브와 목적 질병 병원체 유전자 검출용 프로브 및 프라이머를 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 두 가지 프로브에 의해 두 가지 형광 반응이 동시에 일어나는지 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브로서, 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브와 목적 질병 병원체를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 혼입하여 상기 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 목적 질병 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 VHS가 아닌 목적 질병의 병원체 유전자 검출법에서 사용되는 프라이머 및 프로브와 함께 표준 Jonstrup VHS rRT-PCR 프라이머 및 프로브를 혼입하여 실시간 PCR 수행 후 두 검출법에 따른 형광 반응의 동시 발생 유무를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 목적 질병 진단 시, 공기 중 곰팡이, 실험자로부터 발생한 비말, 또는 목적 질병에 감염된 실험자로부터 발생한 병원체가 포함된 비말을 포함하는 실험실 환경 유래 진단오류인자 오염에 의한 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 주형 미포함 음성대조구(Non template control)에서의 형광 반응의 유무를 확인하여, 곰팡이 또는 비말오염 여부 확인을 통해 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며,
상기 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행할 수 있다.
본 발명에서 제안하고 있는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 따르면, 국제적으로 유효성이 검증되고 표준화된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에서 사용되는 염기서열과 목적 질병 병원체 유전자 검출을 위한 염기서열을 동시에 포함하는 유전자를 합성하여 구조적으로 안정적인 플라스미드 DNA 벡터에 유전자 클로닝 및 합성 재조합 플라스미드 DNA 추출을 수행하고, 추출한 고농도의 주형을 이용해 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 최종 비교함으로써, 보다 효율적으로 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도의 유효성을 검증하고, 이를 조정하여 짧은 시간 내에 목적 질병의 병원체 없이도 높은 민감도의 목적 질병에 대한 유전자 검출법을 확립할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부 또는 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 의한 유전자 검출과 동시에 목적 질병의 유전자 검출 여부, 그리고 목적 질병을 검출하는 PCR 산물 내 두 가지 프로브의 검출 여부에 따라 양성대조구 오염 또는 양성대조구 유래 PCR 증폭 산물 오염으로부터의 거짓 양성 반응을 판별하여 예방할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따르면, 실험실에서의 곰팡이나 실험자의 부주의로 발생할 수 있는 비말 오염에 대해 판별할 수 있으며, 그로 인한 오염으로 목적 질병의 진단 시료에 대한 검출 민감도를 저하시켜 발생될 수 있는 거짓음성과 호흡기 바이러스에 감염된 실험자에 의해 노출될 수 있는 거짓 양성반응도 종합적으로 제어할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 흐름을 도시한 도면.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 목적 질병의 실제 진단 시 수행되는 과정의 세부적인 흐름을 도시한 도면.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, Jonstrup VHS rRT-PCR 반응의 유전자 검출민감도를 결정하는 것이 RNA 상태에서가 아닌 DNA 상태에서 유전자 증폭 반응에 영향을 준다는 결과를 도시한 도면.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 합성 재조합 플라스미드 DNA 추출 및 다중 실시간 RT-PCR을 설명하기 위해 도시한 도면.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 플라스미드 벡터 유전자 검출을 포함하는 각 유전자의 단일 실시간 RT-PCR 실시 결과를 도시한 도면.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, VHSV, IHNV, 플라스미드 벡터 유전자 및 18s rRNA 유전자 검출을 모두 포함하는 다중 실시간 RT-PCR 실시 결과를 도시한 도면.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, VHSV 및 IHNV에 각각 감염 및 감염되지 않은 넙치 및 무지개 송어를 대상으로 다중 실시간 RT-PCR 한 실험 결과를 도시한 도면.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 목적 질병의 병원체로 사용된 IHNV 검출 PCR 과정에서 하나의 프라이머 세트 내에 두 개의 프로브가 동일하게 검출되는 결과를 도시한 도면.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 곰팡이에 오염된 에어컨의 공기 노출 여부에 따른 PCR 실험 결과를 도시한 도면.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 18s rRNA 유전자 검출을 통해 PCR 반응액 내 사람의 침액과 침액을 필터한 것을 PCR 반응하여 유전자를 검출한 실험 결과를 도시한 도면.
도 11은 VHSV와 IHNV 같은 RNA 바이러스가 RNA 추출 없이 실시간 PCR 반응하였을 때는 바이러스 유전자가 검출되지 않으나, 역전사 반응이 포함된 실시간 RT-PCR 반응에서는 RNA 추출 없이 살아있는 바이러스 액만 PCR 반응액에 넣었을 때 바이러스 유전자가 검출되는 실험 결과를 도시한 도면.
도 12는 18s rRNA 유전자의 프라이머와 프로브 부분의 염기서열을 유전자은행(NCBI GenBank)에 검색한 결과를 도시한 도면.
<부호의 설명>
S100: Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계
S200: 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계
S300: 단계 S100에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계
S400: 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 단계 S200에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계
S500: 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지하는 단계
S600: 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계
S700: 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계
S800: 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.
덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 ‘연결’ 되어 있다고 할 때, 이는 ‘직접적으로 연결’ 되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 ‘간접적으로 연결’ 되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성요소를 ‘포함’ 한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 흐름을 도시한 도면이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법은, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계(S100), 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계(S200), 단계 S100에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계(S300), 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 단계 S200에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계(S400), 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지하는 단계(S500)를 포함하여 구현될 수 있다.
여기서, 거짓음성은 검체 내의 미량의 병원체 존재 등으로 인한 것으로, VHS의 검출 민감도와 IHN과 같은 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교해, 검출한계가 유효하게 설정되었는지를 확인하여, 거짓음성 반응을 판별할 수 있다. 거짓양성은 검체 오염, 양성대조구로 사용된 플라스미드 DNA의 오염, PCR 산물 오염 등으로 인한 것일 수 있다.
즉, 본 발명은, 신뢰도가 높은 OIE 국제진단매뉴얼의 VHS 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하여, 양성대조구로 사용할 수 있는 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하고, 이를 이용해 VHS의 검출 민감도와 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도의 유효성을 검증할 수 있다. 이하에서는 도 1을 참조하여 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 각 단계에 대해 상세히 설명하도록 한다.
단계 S100에서는, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성할 수 있다. 여기서, 목적 질병의 병원체는, 세균, 바이러스 및 곰팡이를 포함하는 핵산 유전체를 지닌 모든 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있으며, 보다 구체적으로, 목적 질병의 병원체는, DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 포함하는 모든 감염성 바이러스 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다.
실시예에 따라서는, 목적 질병은 전염성조혈기괴사증(Infectious Haematopoietic Necrosis, IHN)일 수 있으며, 합성된 유전자의 염기서열은 다음과 같다.
VHSV 유전자 (VHSV gene, 서열번호 8): 5'-AAACTCGCAGGATGTGTGCGTCCcgggCAGAAGATCACCAAGGCCCTCTAtgcgTTCATCCTGACTGAGATCGCAGAgggccc-3'
IHNV 유전자: 5'-AGAGCCAAGGCACTGTGCGccaTGAGACTGAGCGGGACAGGAATGACAATGGTGGGACTGTTCAACCAAGCCGCAAAGAA-3’
한편, 단계 S100에서, 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자 합성은, 목적 질병의 진단 시 검체 내의 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프라이머 세트가 위치한 서열 내부에 검출용 프로브 외에 다른 형광 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열인 서열번호 7에 기재된 염기서열에 따른 유전자를 합성할 수 있다. 특정염기서열은 다음과 같다.
특정염기서열 (specific sequence, 서열번호 7): 5'-GGAATGACAATGGTGGGACTGT-3'
단계 S200에서는, 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 S200에서는, 단계 S100에서 합성된 2개의 유전자를 각각 10배씩 단계 희석하고 각 희석액을 주형으로 사용하되, 표준 Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 동시에 실시해, 두 반응에 의해 생성된 각 형광 곡선을 비교하여 목적 질병 병원체 유전자 검출법의 최종 검출 희석배수가 표준 VHSV 검출법의 것과 동일 수준임이 확인된 방법의 선별을 통해, 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택할 수 있다.
예를 들어, VHS의 검출 민감도와 IHN과 같은 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교해, 목적 질병의 병원체 유전자 검출한계가 VHSV 유전자의 검출한계와 유사하게 나타나도록 프라이머와 프로브 등을 조절해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택할 수 있다. 특히, 단계 S200에서는 국제적으로 유효성이 검증된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법의 검출 민감도를 표준으로 하므로, 신속하게 최적의 합성 염기서열을 선택할 수 있다.
단계 S300에서는, 단계 S100에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 S300에서는, 단계 S100에서 합성된 유전자 중 단계 S200에서 선별 완료된 것을 플라스미드 DNA 벡터에 삽입하고 대장균에 클로닝하여, 합성 DNA 재조합 플라스미드 DNA를 추출하고 정량할 수 있다. 즉, 단계 S200에서 Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 검출 민감도가 같은 것으로 확인된 목적 질병의 병원체 유전자를 클로닝할 수 있다. 따라서 합성 재조합 플라스미드 DNA는, VHSV 검출 유전자, 목적 질병의 병원체 유전자 및 플라스미드 벡터 자체의 유전자를 모두 포함하며, 합성 재조합 플라스미드 DNA 1 copy에 각각 동일 양의 유전자를 포함하게 된다. 이때, 플라스미드 벡터는 상업용 플라스미드 DNA이며 더욱 바람직하게는 Promega사의 pGEM T-easy vector일 수 있다.
단계 S400에서는, 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 단계 S200에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 S400에서는, VHSV 검출용 프라이머 및 프로브로서, 다음 표 1과 같은 VHSV 포워드 프라이머(VHSV F), 리버스 프라이머(VHSV R) 및 프로브(VHSV probe)를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR을 실시할 수 있다. 즉, VHSV 검출용 Forward, Reverse, Probe (FAM), 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 Forward, Reverse, Probe (HEX), 플라스미드 벡터 검출용 Forward, Reverse, Probe (Texas Red)를 혼입해 사용할 수 있다. 플라스미드 벡터 검출용 프라이머 및 프로브는 다음 표 2와 같다.
Figure PCTKR2021000001-appb-img-000001
Figure PCTKR2021000001-appb-img-000002
실시예에 따라서는, 목적 질병은 전염성조혈기괴사증(Infectious Haematopoietic Necrosis, IHN)이며, 단계 S400에서는, IHNV 검출용 프라이머 및 프로브로서, Hoferer et al., 2019의 염기서열을 참조하여, 다음 표 3과 같은 포워드 프라이머(IHN F), 프로브(IHN probe), 및 리버스 프라이머(IHN R)를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR을 실시할 수 있다.
Figure PCTKR2021000001-appb-img-000003
단계 S500에서는, 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도와 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지할 수 있다. 특히, 국제적으로 유효성이 검증된 VHS Jonstrup 진단법의 검출 민감도를 표준으로 하므로, 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 유효성을 측정할 수 있다. 또한, 병원체 미보유 상황이나 COVID-19와 같이 고위험 병원체를 직접 실험자가 다루기 어려운 상황이더라도, 단계 S500의 검출 민감도를 검증을 통해 짧은 시간 내에 높은 민감도의 목적 질병에 대한 유전자 검출법을 확립하고, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 목적 질병의 실제 진단 시 수행되는 과정의 세부적인 흐름을 도시한 도면이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법은, 단계 S500 이후에, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계(S600), 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계(S700), 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계(S800)를 더 포함하여 구현될 수 있다.
단계 S600에서는, 추출한 정량된 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 실제 질병 진단 시 양성대조구를 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인할 수 있다.
단계 S700에서는, 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구(internal control)로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증할 수 있다.
보다 구체적으로는, 단계 S700에서는, 내부대조구 RNA 검출에 사용하는 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며, 실시간 PCR 칵테일 제조물 상에 RNA 주형을 1 ㎍/㎕의 농도가 되도록 주입하고 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 반응 후 해당 형광 곡선의 Ct value가 10 이상 20 이하를 형성하는지 여부를 확인하여 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증할 수 있다.
RT-PCR 과정 중 합성 플라스미드를 양성대조구로 사용하게 되면, RNA가 cDNA화되는 과정에 대한 대조구가 없다. 따라서 시료로부터 RNA 추출 후 RNA에 대한 유효성 확인 대조구의 역할을 하도록, 18s rRNA 유전자를 같이 반응하여 검사하고자 하는 시료의 RNA -> cDNA의 유효성을 검증할 수 있다. 다만, VHS, IHN 또는 COVID-19의 원인 바이러스는 모두 RNA 바이러스이지만 DNA 바이러스 등에 적용한다면, 18s rRNA 유전자와 같은 내부대조구가 필요 없어 더욱 간편하게 사용할 수 있다.
여기서, 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브로서, 다음 표 4와 같이, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행할 수 있다.
Figure PCTKR2021000001-appb-img-000004
단계 S800에서는, 질병 진단 시 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별할 수 있다. 단계 S800에서 판별 가능한 거짓음성 및 거짓양성 반응에는 여러 가지가 있는데, 이하에서는 각각에 대해 상세히 설명하도록 한다.
단계 S800에서는, 목적 질병의 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입한 후 반응 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 S800에서는, 플라스미드 벡터 유전자의 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
즉, VHSV 검출 반응, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 반응, 플라스미드 벡터 유전자 검출 반응이 모두 같은 검출 민감도를 나타내기 때문에, 양성대조구로 사용된 합성 재조합 플라스미드 DNA가 오염되었는지를, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부와 증폭 수준을 비교해 실시간으로 판단할 수 있다. 이때, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부 및 증폭 수준을 비교해 양성대조구로 사용된 합성 재조합 플라스미드 DNA의 오염 여부에 따른 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
한편, 단계 S800에서는, 목적 질병 진단 시, 검체 내에 PCR을 통해 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브와 목적 질병 병원체 유전자 검출용 프로브 및 프라이머를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 두 가지 프로브에 의해 두 가지 형광 반응이 동시에 일어나는지 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다. 즉, 단계 S400의 실시간 PCR 칵테일 제조물에, 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프라이머 세트 내에 두 개의 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR을 실시하며, 두 개의 프로브의 검출 여부를 비교해 실시간 PCR 산물의 오염 여부에 따른 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
보다 구체적으로, 단계 S800에서는, 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브로서, 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브와 목적 질병 병원체를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
한편, 단계 S800에서는, 목적 질병 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 VHS가 아닌 목적 질병의 병원체 유전자 검출법에서 사용되는 프라이머 및 프로브와 함께 표준 Jonstrup VHS rRT-PCR 프라이머 및 프로브를 혼입하여 실시간 PCR 수행 후 두 검출법에 따른 형광 반응의 동시 발생 유무를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
한편, 단계 S800에서는, 목적 질병 진단 시, 공기 중 곰팡이, 실험자로부터 발생한 비말, 또는 목적 질병에 감염된 실험자로부터 발생한 병원체가 포함된 비말을 포함하는 실험실 환경 유래 진단오류인자 오염에 의한 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 주형 미포함 음성대조구(Non template control)에서의 형광 반응의 유무를 확인하여, 곰팡이 또는 비말오염 여부 확인을 통해 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
보다 구체적으로, 단계 S800에서는, 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며, 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행할 수 있다. 즉, 18s rRNA 유전자를 이용해 곰팡이 등의 진단오류인자를 검출할 수 있으므로, 18s rRNA 유전자가 검출되면 실험자나 실험실 환경이 곰팡이에 오염된 것으로 판단할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 제안하고 있는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 따르면, 표준화된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에서 사용되는 염기서열과 목적 질병 병원체 유전자 검출을 위한 염기서열을 동시에 포함하는 유전자를 합성하여 구조적으로 안정적인 플라스미드 DNA 벡터에 유전자 클로닝 및 합성 재조합 플라스미드 DNA 추출을 수행하고, 이를 이용해 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 최종 비교함으로써, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도의 유효성을 검증하고, 이를 조정하여 짧은 시간 내에 목적 질병의 병원체 없이도 높은 민감도의 목적 질병에 대한 유전자 검출법을 확립할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부 또는 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 의한 유전자 검출과 동시에 목적 질병의 유전자 검출 여부, 그리고 목적 질병을 검출하는 PCR 산물 내 두 가지 프로브의 검출 여부에 따라 양성대조구 오염 또는 양성대조구 유래 PCR 증폭 산물 오염으로부터의 거짓 양성 반응을 판별하여 예방할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따르면, 실험실에서의 곰팡이나 실험자의 부주의로 발생할 수 있는 비말 오염에 대해 판별할 수 있으며, 그로 인한 오염으로 목적 질병의 진단 시료에 대한 검출 민감도를 저하시켜 발생될 수 있는 거짓음성과 호흡기 바이러스에 감염된 실험자에 의해 노출될 수 있는 거짓 양성반응도 종합적으로 제어할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실시간 RT-PCR 법에서 검출 민감도 결정 단계 확인
역전사효소를 이용한 실시간 RT-PCR에서 실제 검출 민감도가 결정되는 단계가, RT 과정인지 cDNA 화 된 후 PCR 과정인지를 확인하기 위해, 여러 테스트를 통해 가장 우수한 실시간 RT-PCR 법으로 파악된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법을 이용해 One-step RT-PCR과 Two-step RT-PCR을 각각 실시하였다.
보다 구체적으로, genotype II에 속하는 VHSV와 genotype IVa에 속하는 VHSV의 세포배양 상층액에서 RNA를 추출하고(Qiagen Viral RNA mini Kit), PCR 단계에서 RNA를 10배 희석하기 위해 세포배양액 100 ㎕당 최종 elution을 10 ㎕로 하여 10배 농축하였다. 이를 10배씩 단계 희석하여 10 -10까지 희석하였다.
실시간 One-step RT-PCR에서는 Two-step RT-PCR과 사용된 RNA 양을 동일하게 맞추기 위해 10배 희석 후 5 ㎕ 사용하고, 실시간 Two-step RT-PCR에서는, RNA 10 ㎕로 cDNA를 합성하고 PCR에는 cDNA 5 ㎕를 사용하였다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, RNA 바이러스인 VHSV 유전자를 검출하는데 있어 PCR 검출 민감도가 결정되는 단계를 확인하는 실험을 통해 양성대조구로서 플라스미드 DNA를 사용하여 Jonstrup VHS rRT-PCR 법의 표준화 가능성을 실험한 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 3의 위쪽 2개의 그래프는 VHSV 유전자형 II와 IVa를 RNA→cDNA→PCR이 일원화된 One-step RT-PCR 결과이며, 아래쪽 2개의 그래프는 위쪽의 RNA 양과 같게 계산한 RNA를 cDNA 화하고 난 후 PCR 과정을 거친 Two-step RT-PCR 결과이다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상반부와 하반부의 유전자 검출 민감도가 결과가 동일(VHSV II : 10 -5 희석액까지 검출, VHSV IVa : 10 -6 희석액까지 검출)하다는 것을 통해, PCR 검출 민감도가 결정되는 것은 RNA 상태에서 cDNA화 되는 단계가 아니라 cDNA화 된 시점에서 PCR 반응 단계일 때라는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 양성대조구를 플라스미드 DNA로 사용한다고 해도 PCR 검출 민감도에 대한 유효성 검증의 표준화가 가능하며, 이러한 사실을 기반으로 양성대조구로 사용할 수 있는 합성 재조합 플라스미드 DNA를 구축하였다.
실시예 2. 목적 질병을 전염성조혈기괴사증(Infectious Haematopoietic Necrosis, IHN)으로 하는 합성 재조합 플라스미드 DNA의 구축
IHN은 무지개송어 등 연어과 어류에서 출혈을 동반하여 대량 폐사를 일으키는 바이러스성 질병으로 VHS와 증상이 비슷하며, 사전적 진단이 중요한 질병이다. 목적 질병을 IHN으로 하여 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법을 수행하였다.
먼저, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 IHNV의 검출을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하였다(VHSV Jonstrup 유전자 및 IHN 유전자 염기서열 참조).
그다음, 합성된 유전자를 pGEM T-Easy 플라스미드 벡터에 클로닝한 후 플라스미드 DNA를 추출하여 합성 재조합 플라스미드 DNA를 합성하였다.
실시예 3. 목적 질병을 전염성조혈기괴사증(IHN)으로 하여 다중 실시간 RT-PCR 실시
3-1. 단일 실시간 RT-PCR와 다중 실시간 RT-PCR 결과 비교
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 합성 재조합 플라스미드 DNA 추출 및 다중 실시간 RT-PCR을 설명하기 위해 도시한 도면이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA 하나의 copy에는 플라스미드 벡터, VHSV, IHNV 유전자가 각각 같은 양 포함될 수 있다. 실시예 2에서 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 10배씩 단계 희석하여 10 -10까지 희석하고, BIO-RAD CFX96 장비와 QIAGEN Quantitect probe RT-PCR kit를 사용하여 다중 실시간 RT-PCR을 실시하였다.
이때, 검출용 프라이머와 프로브는 VHSV 검출용으로 표 1에 표시된 VHSV F, VHSV probe(FAM), VHSV R이 사용되었고, 플라스미드 벡터 검출용으로 표 2에 표시된 Vector F, Vector probe(Texas Red), Vector R, IHNV 검출용으로 표 3에 표시된 IHN F, IHN probe(HEX), IHN R가 사용되었다.
한편, 어류 시료의 RNA 추출 후 RNA에 대한 유효성 확인 대조구를 위해, 18s rRNA 유전자 검출을 위해 PCR 반응하였다. 즉, VHSV, IHNV, 플라스미드 벡터(합성 재조합 플라스미드 DNA 사용) 및 18s rRNA 유전자에 대해 모든 프라이머와 프로브를 함께 넣어 다중 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 이때, 18s rRNA 유전자를 포함하는 다중 실시간 RT-PCR 혼합물의 구성은 다음 표 5와 같으며, 각각의 프라이머 및 프로브 총 20 pmol을 사용하였다.
Figure PCTKR2021000001-appb-img-000005
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 각 유전자의 단일 실시간 RT-PCR 실시 결과를 도시한 도면이고, 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, VHSV, IHNV, 플라스미드 벡터 유전자 및 18s rRNA 유전자 검출을 모두 포함하는 다중 실시간 RT-PCR 실시 결과를 도시한 도면이다. 즉, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 10 -10 단계 희석한 DNA를 주형으로 각각의 검출용 프라이머와 프로브를 단일 PCR 반응한 결과인 도 5와, 다중 실시간 RT-PCR 결과인 도 6을 비교해 보면, 다중 실시간 RT-PCR에서 검출하고자 하는 3가지 (VHSV, IHNV, 플라스미드 벡터) 유전자가 단일 PCR 반응과 같은 검출 민감도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이때, 어류에서 VHSV와 IHNV는 동반 감염 사례가 없으므로, 만약 어류의 검체에서 VHSV와 IHNV의 2개 형광을 모두 보일 경우, 양성대조구 플라스미드가 진단하고자 하는 시료에 오염된 것으로 판단할 수 있다.
3-2. 넙치 및 무지개 송어를 대상으로 다중 실시간 RT-PCR 적용
VHSV 감염 넙치 1마리, IHNV 감염 무지개송어 1마리, 건강 넙치 3마리, 건강 무지개송어 3마리)를 대상으로, 본 발명의 다중 실시간 RT-PCR 법을 적용하여 PCR을 실시하였다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, VHSV 및 IHNV에 각각 감염 및 감염되지 않은 넙치 및 무지개 송어를 대상으로 다중 실시간 RT-PCR 한 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 건강한 넙치와 무지개송어에서는 18s rRNA 유전자만 검출되어 RNA-cDNA-PCR 과정이 잘 진행된 것을 확인하였으며, 해당 질병인 VHS 및 IHN 바이러스 유전자가 모두 검출되지 않았다. 그러나, VHSV 감염 넙치는 VHSV 유전자가 특이적으로 검출되었고, IHN 역시 감염 무지개송어는 IHN 바이러스 유전자가 특이적으로 검출된 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. 목적 질병 병원체로 사용된 IHNV 검출 PCR 과정에서 하나의 프라이머 세트 내에서 두 개의 프로브를 혼입한 거짓양성 판별 실험
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 목적 질병의 병원체로 사용된 IHNV 검출 PCR 과정에서 하나의 프라이머 세트 내에 두 개의 프로브가 동일하게 검출되는 결과를 도시한 도면이다. 도 8에 도시된 바와 같이, 하나의 프라이머 세트 내에서 두 개의 프로브가 모두 검출되는 결과로부터, 양성대조구가 오염되었다는 것을 정확하게 확인할 수 있다.
실시예 5. 18s rRNA 유전자의 검출 여부 비교를 통한 실험자 및/또는 실험실 환경 오염 여부 판단 실험
5-1. 에어컨 노출 실험
본 발명의 다중 실시간 RT-PCR을 위해 사용되는 18s rRNA 유전자는 진핵생물을 검출할 수 있으므로, 이를 통해 곰팡이 오염 여부를 판단할 수 있다. 이를 확인하기 위해, 에어컨으로부터 곰팡이 오염 확인 실험을 수행하였다.
위의 실시예 3-2와 같은 방법으로, 다중 실시간 RT-PCR을 수행하기 위해 PCR 칵테일 두 세트를 만든 다음, 한 세트는 에어컨 노출 없이 다중 실시간 RT-PCR을 수행하고, 나머지 한 세트는 에어컨에 1분간 노출한 후 다중 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 곰팡이에 오염된 에어컨의 공기 노출 여부에 따른 PCR 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 9에 도시된 바와 같이, 에어컨 노출 그룹에서는 18s rRNA 유전자가 검출되었으며, 특히 template를 넣지 않고, 핵산 추출 없는 상황에도 음성대조구에서는 모두 에어컨에 노출한 그룹에서 모두 양성 반응이 나타났다.
5-2. 침(비말)에 의한 오염 실험
환경적 진단오류인자에 의한 샘플 오염으로는 에어컨 사용 등에 의해 곰팡이가 지속해서 배출되는 실험실에서의 공기 중 곰팡이 오염 외에도 실험자의 호흡에 의한 인간 유전자가 포함된 비말 오염 또는 목적 질병에 감염된 실험자의 비말에 의한 목적 질병 병원체 오염이 있다. 따라서 실험자에 의한 오염 여부 판단을 위해 실험자의 침을 샘플로 하여, 하나는 침 원액 1 ㎕, 곰팡이도 거를 수 있는 0.2 ㎛ 필터를 통해 필터한 후 침 1 ㎕를 핵산 추출 없이 18s rRNA 유전자 검출 반응을 하였다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 18s rRNA 유전자 검출을 통해 PCR 반응액 내 사람의 침액과 침액을 필터한 것을 PCR 반응하여 유전자를 검출한 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 10에 도시된 바와 같이, 두 그룹 모두 18s rRNA 유전자가 검출되었다.
또한, 병원체 오염 판단을 위해 VHSV 세포배양액 (유전형 II와 IV) 및 IHNV 세포배양액 (Wanju09, Wanju15 strains) 원액 1 ㎕를 핵산 추출 없이 유전자 검출 반응을 하였다.
도 11은 본 발명에서 목적 병원체 유전자를 검출하는데 사용하는 VHSV와 IHNV 같은 RNA 바이러스가 RNA 추출 없이 실시간 PCR 반응하였을 때는 바이러스 유전자가 검출되지 않으나, 역전사 반응이 포함된 실시간 RT-PCR 반응에서는 RNA 추출 없이 살아있는 바이러스 액만 PCR 반응액에 넣었을 때 바이러스 유전자가 검출되는 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 11에 도시된 바와 같이, 목적 병원체인 VHSV와 IHNV 유전자가 RNA 추출을 하지 않은 바이러스 액만으로도 유전자가 검출되었다.
도 12는 18s rRNA 유전자의 프라이머와 프로브 부분의 염기서열을 유전자은행(NCBI GenBank)에 검색한 결과를 도시한 도면이다. 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명에서 개발된 18s rRNA 유전자의 프라이머와 프로브(서열번호 4 내지 6)는, 어류, 사람, 곰팡이 등과 대부분 염기서열이 일치하는 것을 확인할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법은, 18s rRNA 유전자 검출을 확인하여 실험자 및 실험실 환경 오염에 대해 실시간으로 확인할 수 있으며, 이는 실험실 내에서 발생하는 곰팡이나 실험자가 실험 시 대화하는 것으로 인해 비말 오염되어 PCR 반응을 저해했을 가능성이 있다는 것을 확인하는 도구로 사용될 수 있다. 이러한 기능은 호흡기 병원체를 유전자 검출로 진단하는 실험실에서 병원체에 노출된 실험자에 의해 발생할 수 있는 거짓양성 반응도 판별이 가능하므로, 특히 COVID-19 등과 같은 대규모 감염 호흡기 질환을 다루는 진단 실험실에 적용하기에 더욱 적절할 수 있다.
이상 설명한 본 발명은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 다양한 변형이나 응용이 가능하며, 본 발명에 따른 기술적 사상의 범위는 아래의 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법으로서,
    (1) Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 서열번호 8에 기재된 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계;
    (2) 상기 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계;
    (3) 상기 단계 (1)에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계;
    (4) 상기 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 상기 단계 (2)에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계;
    (5) 상기 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도와 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지하는 단계;
    (6) 상기 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계;
    (7) 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구(internal control)로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계; 및
    (8) 상기 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목적 질병의 병원체는,
    세균, 바이러스 및 곰팡이를 포함하는 핵산 유전체를 지닌 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 목적 질병의 병원체는,
    DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 포함하는 감염성 바이러스 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서,
    상기 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자 합성은, 상기 목적 질병의 진단 시 검체 내의 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프라이머 세트가 위치한 서열 내부에 검출용 프로브 외에 다른 형광 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열인 서열번호 7에 기재된 염기서열에 따른 유전자를 합성하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (7)에서는,
    상기 내부대조구 RNA 검출에 사용하는 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며,
    실시간 PCR 칵테일 제조물 상에 RNA 주형을 주입하고 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 반응 후, 해당 형광 곡선의 Ct value가 10 이상 20 이하를 형성하는지 여부를 확인하여 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단계 (7)에서는,
    상기 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 목적 질병의 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입한 후 반응 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별하는 것 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 플라스미드 벡터 유전자의 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 목적 질병 진단 시, 검체 내에 PCR을 통해 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브와 목적 질병 병원체 유전자 검출용 프로브 및 프라이머를 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 두 가지 프로브에 의해 두 가지 형광 반응이 동시에 일어나는지 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브로서, 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브와 목적 질병 병원체를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 혼입하여 상기 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 목적 질병 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 VHS가 아닌 목적 질병의 병원체 유전자 검출법에서 사용되는 프라이머 및 프로브와 함께 표준 Jonstrup VHS rRT-PCR 프라이머 및 프로브를 혼입하여 실시간 PCR 수행 후 두 검출법에 따른 형광 반응의 동시 발생 유무를 확인하여 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 목적 질병 진단 시, 공기 중 곰팡이, 실험자로부터 발생한 비말, 또는 목적 질병에 감염된 실험자로부터 발생한 병원체가 포함된 비말을 포함하는 실험실 환경 유래 진단오류인자 오염에 의한 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 주형 미포함 음성대조구(Non template control)에서의 형광 반응의 유무를 확인하여, 곰팡이 또는 비말오염 여부 확인을 통해 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며,
    상기 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
PCT/KR2021/000001 2020-08-21 2021-01-01 바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법 WO2022039336A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200105670A KR102242634B1 (ko) 2020-08-21 2020-08-21 바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법
KR10-2020-0105670 2020-08-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022039336A1 true WO2022039336A1 (ko) 2022-02-24

Family

ID=75731179

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/000001 WO2022039336A1 (ko) 2020-08-21 2021-01-01 바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102242634B1 (ko)
WO (1) WO2022039336A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100942388B1 (ko) * 2009-05-11 2010-02-17 대한민국 일본뇌염바이러스 검출을 위한 프라이머 세트, 내부컨트롤 리보핵산, 이를 포함하는 역전사 중합효소 연쇄반응 키트 및 이를 이용한 중합효소 연쇄반응 방법
KR20140048496A (ko) * 2012-10-16 2014-04-24 선문대학교 산학협력단 병원체 유전자를 사용하지 않는 피시알용 양성대조구 플라스미드
KR101782489B1 (ko) * 2016-04-06 2017-09-28 주식회사 시선바이오머티리얼스 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 검출용 pna 프로브 및 그 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100942388B1 (ko) * 2009-05-11 2010-02-17 대한민국 일본뇌염바이러스 검출을 위한 프라이머 세트, 내부컨트롤 리보핵산, 이를 포함하는 역전사 중합효소 연쇄반응 키트 및 이를 이용한 중합효소 연쇄반응 방법
KR20140048496A (ko) * 2012-10-16 2014-04-24 선문대학교 산학협력단 병원체 유전자를 사용하지 않는 피시알용 양성대조구 플라스미드
KR101782489B1 (ko) * 2016-04-06 2017-09-28 주식회사 시선바이오머티리얼스 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 검출용 pna 프로브 및 그 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WARG JV, CLEMENT T, CORNWELL ER, CRUZ A, GETCHELL RG, GIRAY C, GOODWIN AE, GROOCOCK GH, FAISAL M, KIM R, MERRY GE, PHELPS NBD, REI: "Detection and surveillance of viral hemorrhagic septicemia virus using real-time RT-PCR. I. Initial comparison of four protocols", DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS, vol. 111, no. 1, 21 August 2014 (2014-08-21), DE , pages 1 - 13, XP055901839, ISSN: 0177-5103, DOI: 10.3354/dao02753 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102242634B1 (ko) 2021-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2010147372A2 (ko) 말라리아 원충 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 검출방법
WO2013119049A1 (ko) 생물학적 시료의 자동 분석 장치 및 방법
WO2017188669A2 (ko) 절단된 상보적인 태그 절편을 이용한 표적 핵산 서열 검출 방법 및 그 조성물
WO2018139826A1 (ko) Dna 메틸화를 이용한 연령 예측 방법
WO2022039336A1 (ko) 바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법
WO2020105873A1 (ko) 인간 알파코로나바이러스 전장유전체 증폭을 통한 진단키트 및 전장 유전체 서열 확인 방법
US20230346912A1 (en) Restrictive epitope peptide of major histocompatibility complex b2 of h9n2 subtype avian influenza virus and application thereof
WO2022114920A1 (ko) 혈액 유래 엑소좀에서 발굴한 신규의 알츠하이머 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머 진단방법
WO2023234659A1 (ko) 퇴행성 턱관절염의 진단 또는 예후 예측용 유전자 마커 및 이의 용도
WO2011139032A2 (ko) 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물
WO2013105801A1 (ko) 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프로브, 프라이머 및 이의 이용방법
WO2022163967A1 (ko) 라임병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트
WO2015105336A1 (ko) 5&#39;-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제된 dna 폴리머레이즈를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법
WO2022124839A1 (ko) 온-타겟 활성이 유지되고 오프-타겟 활성이 감소된 가이드 rna 및 이의 용도
WO2020149719A2 (ko) 과민성대장증후군 특이적 미생물 바이오마커와 이를 이용하여 과민성대장증후군의 위험도를 예측하는 방법
WO2019135477A2 (ko) 다복제유전자를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법
EP3895170A1 (en) Method for detecting a target analyte in a sample using an s-shaped function for a slope data set
CN109486960B (zh) 一种应用rpa技术检测杉并根结线虫的方法、rpa引物及试剂盒
WO2021261924A1 (en) Computer-implemented method for providing coverage of oligonucleotide set for plurality of nucleic acid sequences
WO2023177221A1 (en) Device for determining presence/absence of target nucleic acid, method for determining presence/absence of target by the device, server for distributing update information, and method for distributing update information by the server
WO2024085731A1 (ko) 타겟 핵산 분자 검출용 시약 개발에 필요한 복수 개의 세부 성능 실험 가이딩 및 실험 결과 기록서 정리 방법
WO2023003082A1 (ko) 코로나바이러스 검출용 랩온 페이퍼 및 이를 이용한 코로나바이러스 진단 시스템
WO2014157825A1 (ko) 스피드 멀티플렉스 pcr법을 이용한 hla 대립유전자 검사방법 및 검사키트
WO2013147352A1 (ko) 제한효소 절편 질량다형성법을 이용하여 ｈｉｖ에 대한 약제 내성 유전자 돌연변이 검출방법
CN109355396B (zh) 杉并根结线虫的pcr检测特异性引物及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21858424

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21858424

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1