KR102242634B1 - 바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법 - Google Patents

바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 (1) Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계; (2) 상기 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계; (3) 상기 단계 (1)에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계; (4) 상기 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 상기 단계 (2)에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계; (5) 상기 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도와 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지하는 단계; (6) 상기 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계; (7) 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구(internal control)로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계; 및 (8) 상기 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계를 포함하는 것을 극 구성상의 특징으로 한다.
본 발명에서 제안하고 있는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 따르면, 구조적으로 안정적인 플라스미드 DNA 벡터에 표준화된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열과 목적 질병 검출을 위한 염기서열을 동시에 포함하는 합성유전자를 클로닝하여 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하고, 이를 이용해 실시한 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 비교함으로써, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도의 유효성을 검증하고, 이를 조정하여 짧은 시간 내에 높은 민감도의 목적 질병에 대한 유전자 검출법을 확립할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제안하고 있는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 따르면, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부 및 증폭 수준을 비교해, 양성대조구로 사용하는 합성 재조합 플라스미드 DNA의 오염 여부를 판단할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에서 제안하고 있는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 따르면, 18s rRNA 유전자의 검출 여부를 비교해, 실험실에서의 곰팡이나 실험자의 부주의로 발생할 수 있는 오염에 대해 판별할 수 있으며, 목적 질병의 진단 시료에 대한 거짓양성, 거짓음성 반응을 종합적으로 제어할 수 있다.

Description

바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법{METHOD FOR DETERMINING FALSE NEGATIVE AND FALSE POSITIVE REACTIONS FOR TARGET PATHOGEN GENE DETECTION BASED ON INTERNATIONAL STANDARD REAL-TIME RT-PCR OF VIRAL HAEMORRHAGIC SEPTICAEMIA}
본 발명은 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 관한 것이다.
바이러스성출혈성패혈증(Viral Haemorrhagic Septicaemia, VHS)에 대한 국제적으로 통용되고 있는 진단 매뉴얼은 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)에서 제시하고 있으며, 세포배양법, 면역항체검출법, 분자생물학적 진단법 등 여러 가지 진단법이 제시되어 있다. 이 중 세포배양법은 감염력 있는 VHS 바이러스(VHS Virus, VHSV)에 대해 최고 민감도를 나타내고 있으나 배양 기간이 2주 정도 소요되므로 질병 전파를 방지하기 위해 빠르게 대처할 수 있는 검사 방법으로는 적절하지 않다. 이렇게 장시간이 소요되는 세포배양법의 단점을 극복하기 위해 분자생물학적 진단법인 실시간 RT-PCR 법은 덴마크 VHS OIE 표준실험실에서 개발한 방법(Jonstrup et al., 2013, 이하 Jonstrup VHS rRT-PCR 법)과 캐나다 OIE 표준실험실에서 개발한 방법(Garver et al., 2011)이 OIE(세계동물보건기구)에 등재되어 있다(OIE, 2019). Warg et al. (2014)는 VHS 진단을 위해 출판된 여러 가지 실시간 RT-PCR 법 관련 논문 중 Jonstrup VHS rRT-PCR 법이 가장 좋은 검출 민감도를 나타낸다고 보고했다(Warg et al. 2014). 최근 Kim et al. (2018)은 모든 VHSV 유전자형 (I, II, III, IVa, IVb)을 사용하여 Jonstrup VHS rRT-PCR 법이, 세포배양법, Kim et al. (2018)이 새롭게 개발한 conventional RT-PCR 법과 검출 민감도가 같음을 과학적으로 증명하였다. 따라서 Jonstrup VHS rRT-PCR 법은 검출 민감도가 가장 좋은 세포배양법과 같은 검출 민감도를 가지는 것이 증명되어, 세포배양에서 장시간 배양이 소요되는 단점을 극복할 수 있다. 이와 같이, Jonstrup VHS rRT-PCR 법은 여러 테스트를 통해 가장 우수한 실시간 RT-PCR 법으로 확인되었는바, 유전자 검출 민감도를 판명하기 위해 우수한 표준 모델이 될 수 있다.
한편, 진단에 사용할 병원체를 확보하기 어려운 상황이거나 병원체가 고위험으로 분류되어 해당 실험실에서 보유 또는 다루기 어려운 상황이라면 진단법 개발에 많은 제한이 따를 수밖에 없고, 각 검체마다 병원체의 양적 차이가 있으므로 검출 민감도에 대한 유효성 평가가 제대로 수행되기에는 한계가 있었다. 또한, 확보된 시료의 상태와 점액질 농도에 따라 자동 핵산 추출기에서 추출하는 과정 중 샘플이 필터에 막히는 현상 등으로 제대로 된 핵산 추출이 어려운 경우일 때, 실제 병원체를 검출하는데 사용될 핵산 농도 부족 및 핵산추출물 내 PCR inhibitor의 유입으로 이어져 제대로 된 진단이 어려울 수 있다. 더욱이, 같은 목적의 진단 제품을 생산한다고 하더라도 유전자 검출 부위가 각각 다르므로 그 검출 감도 또한 달라진다. 이와 같은 한계로 인하여, PCR의 검출한계에 대해 정확한 표준 모델이 없는 실정이다.
또한, 분자생물학적 진단을 위한 실험실은 DNA 오염, 눈에 잘 보이지 않는 타 생물체나 실험자로부터의 오염 등이 없는 환경이 되어야만 거짓양성 및 거짓음성 반응이 예방될 수 있다. 그 중 가장 대표적인 오염은 실험을 할 때마다 증폭시킬 수밖에 없는 양성대조구 핵산 오염이며, 공기 중 곰팡이, 실험자의 비말 등의 환경적인 진단오류인자에 의해 거짓음성 및 거짓양성이 발생할 수 있다. 하지만 실험실에서 지속적인 환경 오염 측정을 할 수 있는 도구는 매우 한정적이며, 주기적으로 확인한다고 해도 실험할 때 항상 정확히 확인할 수 없는 한계가 있다. 그리고 지금까지의 모든 분자생물학적 실험은 진단하고자 하는 시료 각각에 대해 반응이 제대로 수행되었는지를 보는 것보다, 실험 전체에 대해 대조구만으로 세팅되어 왔다. 따라서 실험할 때마다 각각의 시료 하나하나에 대해 유전자 검출 유효성과 오염 여부를 확인하여 귀중하고 소중한 시료의 진단 결과를 정확하게 산출할 수 있는 거짓양성 반응 판별 도구의 개발이 대두된다.
한편, 본 발명과 관련된 선행기술로서, 등록특허 제10-1763607호(발명의 명칭: A형 간염바이러스 표준양성대조군 유전자 및 이로부터 전사되는 RNA 전사체, 등록일자: 2017년 07월 26일) 등이 개시된 바 있다.
본 발명은 기존에 제안된 방법들의 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 구조적으로 안정적인 플라스미드 DNA 벡터에 표준화된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열과 목적 질병의 유전자 검출을 위한 염기서열을 동시에 포함하는 합성 유전자를 클로닝하여 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하고, 이를 이용해 실시한 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 비교함으로써, 목적 질병의 거짓음성 반응을 판별하고 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하여 목적 질병 유발 병원체가 없는 상황과 고위험 병원체를 다룰 수 없는 상황에서도 짧은 시간 내에 목적 질병의 병원체 유전자 검출 감도 유효성 검증 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 표준으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 유전자 검출, 목적 질병의 병원체 유전자 검출, 그리고 벡터 유전자의 검출 여부 및 증폭 수준을 비교해, 벡터 유전자 검출을 통해 양성대조구로 사용하는 합성 재조합 플라스미드 DNA의 오염 여부를 판단할 수 있는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그리고, 본 발명은, 목적 질병의 병원체 유전자 검출에 일반적으로 사용하는 1개의 프라이머 세트와 1개의 프로브가 아닌 동일 프라이머 세트에 2개의 프로브를 디자인하여 목적 질병의 병원체 유전자 검출 반응 이외에 타 프로브 검출 반응 확인을 통해 목적 질병의 병원체 유전자 증폭 산물의 DNA 오염 여부를 판단할 수 있는 방법으로서 증폭된 DNA 산물이 검체에 오염되었는지 여부를 알 수 있는 판별 기법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
뿐만 아니라, 본 발명은, 18s rRNA 유전자의 검출 여부를 비교해, 샘플링된 시료가 PCR 반응에 적절한 RNA 농도였는지를 판별하여 이에 대한 표준을 제공함과 동시에 PCR 음성 대조구에서 실험실에서의 곰팡이나 실험자의 부주의로 발생할 수 있는 비말 오염에 대해 판별할 수 있으며, 목적 질병의 진단 시료에 대한 거짓양성, 거짓음성 반응을 종합적으로 제어할 수 있는 것을 또 다른 목적으로 한다.
특히, 본 발명은, 비말 오염 중 감염력 RNA 바이러스가 실제 침 등 타액에 포함되어있다고 가정하고 인체 비병원성 바이러스인 VHS 바이러스와 IHN 바이러스(IHNV)를 핵산 추출 없이 One-step 실시간 RT-PCR 법을 진행하여 핵산추출 없이도 바이러스가 검출되는 것을 확인한바, COVID-19 등과 같은 호흡기 질환 환자가 유전자 검출 진단법을 수행할 때 발생할 수 있는 오염을 18s rRNA 유전자 검출로 오진 예방을 할 수 있는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법은,
(1) Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계;
(2) 상기 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계;
(3) 상기 단계 (1)에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계;
(4) 상기 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 상기 단계 (2)에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계;
(5) 상기 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도와 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지하는 단계;
(6) 상기 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계;
(7) 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구(internal control)로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계; 및
(8) 상기 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계를 포함하는 것을 그 구성상의 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 목적 질병의 병원체는,
세균, 바이러스 및 곰팡이를 포함하는 핵산 유전체를 지닌 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다.
더욱 바람직하게는,
상기 목적 질병의 병원체는,
DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 포함하는 감염성 바이러스 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (1)에서,
상기 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자 합성은, 상기 목적 질병의 진단 시 검체 내의 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프라이머 세트가 위치한 서열 내부에 검출용 프로브 외에 다른 형광 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열인 서열번호 7에 기재된 염기서열에 따른 유전자를 합성할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (7)에서는,
상기 내부대조구 RNA 검출에 사용하는 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며,
실시간 PCR 칵테일 제조물 상에 RNA 주형을 주입하고 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 반응 후, 해당 형광 곡선의 Ct value가 10 이상 20 이하를 형성하는지 여부를 확인하여 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 단계 (7)에서는,
상기 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 목적 질병의 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입한 후 반응 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 플라스미드 벡터 유전자의 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 목적 질병 진단 시, 검체 내에 PCR을 통해 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브와 목적 질병 병원체 유전자 검출용 프로브 및 프라이머를 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 두 가지 프로브에 의해 두 가지 형광 반응이 동시에 일어나는지 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브로서, 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브와 목적 질병 병원체를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 혼입하여 상기 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 목적 질병 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 VHS가 아닌 목적 질병의 병원체 유전자 검출법에서 사용되는 프라이머 및 프로브와 함께 표준 Jonstrup VHS rRT-PCR 프라이머 및 프로브를 혼입하여 실시간 PCR 수행 후 두 검출법에 따른 형광 반응의 동시 발생 유무를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 목적 질병 진단 시, 공기 중 곰팡이, 실험자로부터 발생한 비말, 또는 목적 질병에 감염된 실험자로부터 발생한 병원체가 포함된 비말을 포함하는 실험실 환경 유래 진단오류인자 오염에 의한 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 주형 미포함 음성대조구(Non template control)에서의 형광 반응의 유무를 확인하여, 곰팡이 또는 비말오염 여부 확인을 통해 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 단계 (8)에서는,
상기 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며,
상기 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행할 수 있다.
본 발명에서 제안하고 있는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 따르면, 국제적으로 유효성이 검증되고 표준화된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에서 사용되는 염기서열과 목적 질병 병원체 유전자 검출을 위한 염기서열을 동시에 포함하는 유전자를 합성하여 구조적으로 안정적인 플라스미드 DNA 벡터에 유전자 클로닝 및 합성 재조합 플라스미드 DNA 추출을 수행하고, 추출한 고농도의 주형을 이용해 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 최종 비교함으로써, 보다 효율적으로 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도의 유효성을 검증하고, 이를 조정하여 짧은 시간 내에 목적 질병의 병원체 없이도 높은 민감도의 목적 질병에 대한 유전자 검출법을 확립할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부 또는 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 의한 유전자 검출과 동시에 목적 질병의 유전자 검출 여부, 그리고 목적 질병을 검출하는 PCR 산물 내 두 가지 프로브의 검출 여부에 따라 양성대조구 오염 또는 양성대조구 유래 PCR 증폭 산물 오염으로부터의 거짓 양성 반응을 판별하여 예방할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따르면, 실험실에서의 곰팡이나 실험자의 부주의로 발생할 수 있는 비말 오염에 대해 판별할 수 있으며, 그로 인한 오염으로 목적 질병의 진단 시료에 대한 검출 민감도를 저하시켜 발생될 수 있는 거짓음성과 호흡기 바이러스에 감염된 실험자에 의해 노출될 수 있는 거짓 양성반응도 종합적으로 제어할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 흐름을 도시한 도면.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 목적 질병의 실제 진단 시 수행되는 과정의 세부적인 흐름을 도시한 도면.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, Jonstrup VHS rRT-PCR 반응의 유전자 검출민감도를 결정하는 것이 RNA 상태에서가 아닌 DNA 상태에서 유전자 증폭 반응에 영향을 준다는 결과를 도시한 도면.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 합성 재조합 플라스미드 DNA 추출 및 다중 실시간 RT-PCR을 설명하기 위해 도시한 도면.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 플라스미드 벡터 유전자 검출을 포함하는 각 유전자의 단일 실시간 RT-PCR 실시 결과를 도시한 도면.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, VHSV, IHNV, 플라스미드 벡터 유전자 및 18s rRNA 유전자 검출을 모두 포함하는 다중 실시간 RT-PCR 실시 결과를 도시한 도면.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, VHSV 및 IHNV에 각각 감염 및 감염되지 않은 넙치 및 무지개 송어를 대상으로 다중 실시간 RT-PCR 한 실험 결과를 도시한 도면.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 목적 질병의 병원체로 사용된 IHNV 검출 PCR 과정에서 하나의 프라이머 세트 내에 두 개의 프로브가 동일하게 검출되는 결과를 도시한 도면.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 곰팡이에 오염된 에어컨의 공기 노출 여부에 따른 PCR 실험 결과를 도시한 도면.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 18s rRNA 유전자 검출을 통해 PCR 반응액 내 사람의 침액과 침액을 필터한 것을 PCR 반응하여 유전자를 검출한 실험 결과를 도시한 도면.
도 11은 VHSV와 IHNV 같은 RNA 바이러스가 RNA 추출 없이 실시간 PCR 반응하였을 때는 바이러스 유전자가 검출되지 않으나, 역전사 반응이 포함된 실시간 RT-PCR 반응에서는 RNA 추출 없이 살아있는 바이러스 액만 PCR 반응액에 넣었을 때 바이러스 유전자가 검출되는 실험 결과를 도시한 도면.
도 12는 18s rRNA 유전자의 프라이머와 프로브 부분의 염기서열을 유전자은행(NCBI GenBank)에 검색한 결과를 도시한 도면.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.
덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 ‘연결’ 되어 있다고 할 때, 이는 ‘직접적으로 연결’ 되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 ‘간접적으로 연결’ 되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성요소를 ‘포함’ 한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 흐름을 도시한 도면이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법은, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계(S100), 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계(S200), 단계 S100에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계(S300), 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 단계 S200에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계(S400), 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지하는 단계(S500)를 포함하여 구현될 수 있다.
여기서, 거짓음성은 검체 내의 미량의 병원체 존재 등으로 인한 것으로, VHS의 검출 민감도와 IHN과 같은 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교해, 검출한계가 유효하게 설정되었는지를 확인하여, 거짓음성 반응을 판별할 수 있다. 거짓양성은 검체 오염, 양성대조구로 사용된 플라스미드 DNA의 오염, PCR 산물 오염 등으로 인한 것일 수 있다.
즉, 본 발명은, 신뢰도가 높은 OIE 국제진단매뉴얼의 VHS 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하여, 양성대조구로 사용할 수 있는 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하고, 이를 이용해 VHS의 검출 민감도와 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도의 유효성을 검증할 수 있다. 이하에서는 도 1을 참조하여 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 각 단계에 대해 상세히 설명하도록 한다.
단계 S100에서는, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성할 수 있다. 여기서, 목적 질병의 병원체는, 세균, 바이러스 및 곰팡이를 포함하는 핵산 유전체를 지닌 모든 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있으며, 보다 구체적으로, 목적 질병의 병원체는, DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 포함하는 모든 감염성 바이러스 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다.
실시예에 따라서는, 목적 질병은 전염성조혈기괴사증(Infectious Haematopoietic Necrosis, IHN)일 수 있으며, 합성된 유전자의 염기서열은 다음과 같다.
VHSV 유전자 (VHSV gene, 서열번호 8): 5'-AAACTCGCAGGATGTGTGCGTCCcgggCAGAAGATCACCAAGGCCCTCTAtgcgTTCATCCTGACTGAGATCGCAGAgggccc-3'
IHNV 유전자: 5'-AGAGCCAAGGCACTGTGCGccaTGAGACTGAGCGGGACAGGAATGACAATGGTGGGACTGTTCAACCAAGCCGCAAAGAA-3’
한편, 단계 S100에서, 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자 합성은, 목적 질병의 진단 시 검체 내의 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프라이머 세트가 위치한 서열 내부에 검출용 프로브 외에 다른 형광 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열인 서열번호 7에 기재된 염기서열에 따른 유전자를 합성할 수 있다. 특정염기서열은 다음과 같다.
특정염기서열 (specific sequence, 서열번호 7): 5'-GGAATGACAATGGTGGGACTGT-3'
단계 S200에서는, 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 S200에서는, 단계 S100에서 합성된 2개의 유전자를 각각 10배씩 단계 희석하고 각 희석액을 주형으로 사용하되, 표준 Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 동시에 실시해, 두 반응에 의해 생성된 각 형광 곡선을 비교하여 목적 질병 병원체 유전자 검출법의 최종 검출 희석배수가 표준 VHSV 검출법의 것과 동일 수준임이 확인된 방법의 선별을 통해, 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택할 수 있다.
예를 들어, VHS의 검출 민감도와 IHN과 같은 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교해, 목적 질병의 병원체 유전자 검출한계가 VHSV 유전자의 검출한계와 유사하게 나타나도록 프라이머와 프로브 등을 조절해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택할 수 있다. 특히, 단계 S200에서는 국제적으로 유효성이 검증된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법의 검출 민감도를 표준으로 하므로, 신속하게 최적의 합성 염기서열을 선택할 수 있다.
단계 S300에서는, 단계 S100에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 S300에서는, 단계 S100에서 합성된 유전자 중 단계 S200에서 선별 완료된 것을 플라스미드 DNA 벡터에 삽입하고 대장균에 클로닝하여, 합성 DNA 재조합 플라스미드 DNA를 추출하고 정량할 수 있다. 즉, 단계 S200에서 Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 검출 민감도가 같은 것으로 확인된 목적 질병의 병원체 유전자를 클로닝할 수 있다. 따라서 합성 재조합 플라스미드 DNA는, VHSV 검출 유전자, 목적 질병의 병원체 유전자 및 플라스미드 벡터 자체의 유전자를 모두 포함하며, 합성 재조합 플라스미드 DNA 1 copy에 각각 동일 양의 유전자를 포함하게 된다. 이때, 플라스미드 벡터는 상업용 플라스미드 DNA이며 더욱 바람직하게는 Promega사의 pGEM T-easy vector일 수 있다.
단계 S400에서는, 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 단계 S200에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 S400에서는, VHSV 검출용 프라이머 및 프로브로서, 다음 표 1과 같은 VHSV 포워드 프라이머(VHSV F), 리버스 프라이머(VHSV R) 및 프로브(VHSV probe)를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR을 실시할 수 있다. 즉, VHSV 검출용 Forward, Reverse, Probe (FAM), 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 Forward, Reverse, Probe (HEX), 플라스미드 벡터 검출용 Forward, Reverse, Probe (Texas Red)를 혼입해 사용할 수 있다. 플라스미드 벡터 검출용 프라이머 및 프로브는 다음 표 2와 같다.
Figure 112020088290867-pat00001
Figure 112020088290867-pat00002
실시예에 따라서는, 목적 질병은 전염성조혈기괴사증(Infectious Haematopoietic Necrosis, IHN)이며, 단계 S400에서는, IHNV 검출용 프라이머 및 프로브로서, Hoferer et al., 2019의 염기서열을 참조하여, 다음 표 3과 같은 포워드 프라이머(IHN F), 프로브(IHN probe), 및 리버스 프라이머(IHN R)를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR을 실시할 수 있다.
Figure 112020088290867-pat00003
단계 S500에서는, 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도와 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지할 수 있다. 특히, 국제적으로 유효성이 검증된 VHS Jonstrup 진단법의 검출 민감도를 표준으로 하므로, 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 유효성을 측정할 수 있다. 또한, 병원체 미보유 상황이나 COVID-19와 같이 고위험 병원체를 직접 실험자가 다루기 어려운 상황이더라도, 단계 S500의 검출 민감도를 검증을 통해 짧은 시간 내에 높은 민감도의 목적 질병에 대한 유전자 검출법을 확립하고, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법의 목적 질병의 실제 진단 시 수행되는 과정의 세부적인 흐름을 도시한 도면이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법은, 단계 S500 이후에, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계(S600), 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계(S700), 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계(S800)를 더 포함하여 구현될 수 있다.
단계 S600에서는, 추출한 정량된 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 실제 질병 진단 시 양성대조구를 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인할 수 있다.
단계 S700에서는, 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구(internal control)로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증할 수 있다.
보다 구체적으로는, 단계 S700에서는, 내부대조구 RNA 검출에 사용하는 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며, 실시간 PCR 칵테일 제조물 상에 RNA 주형을 1 ㎍/㎕의 농도가 되도록 주입하고 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 반응 후 해당 형광 곡선의 Ct value가 10 이상 20 이하를 형성하는지 여부를 확인하여 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증할 수 있다.
RT-PCR 과정 중 합성 플라스미드를 양성대조구로 사용하게 되면, RNA가 cDNA화되는 과정에 대한 대조구가 없다. 따라서 시료로부터 RNA 추출 후 RNA에 대한 유효성 확인 대조구의 역할을 하도록, 18s rRNA 유전자를 같이 반응하여 검사하고자 하는 시료의 RNA -> cDNA의 유효성을 검증할 수 있다. 다만, VHS, IHN 또는 COVID-19의 원인 바이러스는 모두 RNA 바이러스이지만 DNA 바이러스 등에 적용한다면, 18s rRNA 유전자와 같은 내부대조구가 필요 없어 더욱 간편하게 사용할 수 있다.
여기서, 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브로서, 다음 표 4와 같이, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행할 수 있다.
Figure 112020088290867-pat00004
단계 S800에서는, 질병 진단 시 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별할 수 있다. 단계 S800에서 판별 가능한 거짓음성 및 거짓양성 반응에는 여러 가지가 있는데, 이하에서는 각각에 대해 상세히 설명하도록 한다.
단계 S800에서는, 목적 질병의 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입한 후 반응 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 S800에서는, 플라스미드 벡터 유전자의 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
즉, VHSV 검출 반응, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 반응, 플라스미드 벡터 유전자 검출 반응이 모두 같은 검출 민감도를 나타내기 때문에, 양성대조구로 사용된 합성 재조합 플라스미드 DNA가 오염되었는지를, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부와 증폭 수준을 비교해 실시간으로 판단할 수 있다. 이때, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부 및 증폭 수준을 비교해 양성대조구로 사용된 합성 재조합 플라스미드 DNA의 오염 여부에 따른 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
한편, 단계 S800에서는, 목적 질병 진단 시, 검체 내에 PCR을 통해 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브와 목적 질병 병원체 유전자 검출용 프로브 및 프라이머를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 두 가지 프로브에 의해 두 가지 형광 반응이 동시에 일어나는지 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다. 즉, 단계 S400의 실시간 PCR 칵테일 제조물에, 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프라이머 세트 내에 두 개의 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR을 실시하며, 두 개의 프로브의 검출 여부를 비교해 실시간 PCR 산물의 오염 여부에 따른 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
보다 구체적으로, 단계 S800에서는, 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브로서, 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브와 목적 질병 병원체를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
한편, 단계 S800에서는, 목적 질병 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 VHS가 아닌 목적 질병의 병원체 유전자 검출법에서 사용되는 프라이머 및 프로브와 함께 표준 Jonstrup VHS rRT-PCR 프라이머 및 프로브를 혼입하여 실시간 PCR 수행 후 두 검출법에 따른 형광 반응의 동시 발생 유무를 확인하여 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
한편, 단계 S800에서는, 목적 질병 진단 시, 공기 중 곰팡이, 실험자로부터 발생한 비말, 또는 목적 질병에 감염된 실험자로부터 발생한 병원체가 포함된 비말을 포함하는 실험실 환경 유래 진단오류인자 오염에 의한 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 주형 미포함 음성대조구(Non template control)에서의 형광 반응의 유무를 확인하여, 곰팡이 또는 비말오염 여부 확인을 통해 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별할 수 있다.
보다 구체적으로, 단계 S800에서는, 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며, 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행할 수 있다. 즉, 18s rRNA 유전자를 이용해 곰팡이 등의 진단오류인자를 검출할 수 있으므로, 18s rRNA 유전자가 검출되면 실험자나 실험실 환경이 곰팡이에 오염된 것으로 판단할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 제안하고 있는 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에 따르면, 표준화된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에서 사용되는 염기서열과 목적 질병 병원체 유전자 검출을 위한 염기서열을 동시에 포함하는 유전자를 합성하여 구조적으로 안정적인 플라스미드 DNA 벡터에 유전자 클로닝 및 합성 재조합 플라스미드 DNA 추출을 수행하고, 이를 이용해 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 최종 비교함으로써, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도의 유효성을 검증하고, 이를 조정하여 짧은 시간 내에 목적 질병의 병원체 없이도 높은 민감도의 목적 질병에 대한 유전자 검출법을 확립할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 플라스미드 벡터 유전자의 검출 여부 또는 Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 의한 유전자 검출과 동시에 목적 질병의 유전자 검출 여부, 그리고 목적 질병을 검출하는 PCR 산물 내 두 가지 프로브의 검출 여부에 따라 양성대조구 오염 또는 양성대조구 유래 PCR 증폭 산물 오염으로부터의 거짓 양성 반응을 판별하여 예방할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따르면, 실험실에서의 곰팡이나 실험자의 부주의로 발생할 수 있는 비말 오염에 대해 판별할 수 있으며, 그로 인한 오염으로 목적 질병의 진단 시료에 대한 검출 민감도를 저하시켜 발생될 수 있는 거짓음성과 호흡기 바이러스에 감염된 실험자에 의해 노출될 수 있는 거짓 양성반응도 종합적으로 제어할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실시간 RT-PCR 법에서 검출 민감도 결정 단계 확인
역전사효소를 이용한 실시간 RT-PCR에서 실제 검출 민감도가 결정되는 단계가, RT 과정인지 cDNA 화 된 후 PCR 과정인지를 확인하기 위해, 여러 테스트를 통해 가장 우수한 실시간 RT-PCR 법으로 파악된 Jonstrup VHS rRT-PCR 법을 이용해 One-step RT-PCR과 Two-step RT-PCR을 각각 실시하였다.
보다 구체적으로, genotype II에 속하는 VHSV와 genotype IVa에 속하는 VHSV의 세포배양 상층액에서 RNA를 추출하고(Qiagen Viral RNA mini Kit), PCR 단계에서 RNA를 10배 희석하기 위해 세포배양액 100 ㎕당 최종 elution을 10 ㎕로 하여 10배 농축하였다. 이를 10배씩 단계 희석하여 10-10까지 희석하였다.
실시간 One-step RT-PCR에서는 Two-step RT-PCR과 사용된 RNA 양을 동일하게 맞추기 위해 10배 희석 후 5 ㎕ 사용하고, 실시간 Two-step RT-PCR에서는, RNA 10 ㎕로 cDNA를 합성하고 PCR에는 cDNA 5 ㎕를 사용하였다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, RNA 바이러스인 VHSV 유전자를 검출하는데 있어 PCR 검출 민감도가 결정되는 단계를 확인하는 실험을 통해 양성대조구로서 플라스미드 DNA를 사용하여 Jonstrup VHS rRT-PCR 법의 표준화 가능성을 실험한 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 3의 위쪽 2개의 그래프는 VHSV 유전자형 II와 IVa를 RNA→cDNA→PCR이 일원화된 One-step RT-PCR 결과이며, 아래쪽 2개의 그래프는 위쪽의 RNA 양과 같게 계산한 RNA를 cDNA 화하고 난 후 PCR 과정을 거친 Two-step RT-PCR 결과이다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상반부와 하반부의 유전자 검출 민감도가 결과가 동일(VHSV II : 10-5 희석액까지 검출, VHSV IVa : 10-6 희석액까지 검출)하다는 것을 통해, PCR 검출 민감도가 결정되는 것은 RNA 상태에서 cDNA화 되는 단계가 아니라 cDNA화 된 시점에서 PCR 반응 단계일 때라는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 양성대조구를 플라스미드 DNA로 사용한다고 해도 PCR 검출 민감도에 대한 유효성 검증의 표준화가 가능하며, 이러한 사실을 기반으로 양성대조구로 사용할 수 있는 합성 재조합 플라스미드 DNA를 구축하였다.
실시예 2. 목적 질병을 전염성조혈기괴사증(Infectious Haematopoietic Necrosis, IHN)으로 하는 합성 재조합 플라스미드 DNA의 구축
IHN은 무지개송어 등 연어과 어류에서 출혈을 동반하여 대량 폐사를 일으키는 바이러스성 질병으로 VHS와 증상이 비슷하며, 사전적 진단이 중요한 질병이다. 목적 질병을 IHN으로 하여 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법을 수행하였다.
먼저, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 IHNV의 검출을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하였다(VHSV Jonstrup 유전자 및 IHN 유전자 염기서열 참조).
그다음, 합성된 유전자를 pGEM T-Easy 플라스미드 벡터에 클로닝한 후 플라스미드 DNA를 추출하여 합성 재조합 플라스미드 DNA를 합성하였다.
실시예 3. 목적 질병을 전염성조혈기괴사증(IHN)으로 하여 다중 실시간 RT-PCR 실시
3-1. 단일 실시간 RT-PCR와 다중 실시간 RT-PCR 결과 비교
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 합성 재조합 플라스미드 DNA 추출 및 다중 실시간 RT-PCR을 설명하기 위해 도시한 도면이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA 하나의 copy에는 플라스미드 벡터, VHSV, IHNV 유전자가 각각 같은 양 포함될 수 있다. 실시예 2에서 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 10배씩 단계 희석하여 10-10까지 희석하고, BIO-RAD CFX96 장비와 QIAGEN Quantitect probe RT-PCR kit를 사용하여 다중 실시간 RT-PCR을 실시하였다.
이때, 검출용 프라이머와 프로브는 VHSV 검출용으로 표 1에 표시된 VHSV F, VHSV probe(FAM), VHSV R이 사용되었고, 플라스미드 벡터 검출용으로 표 2에 표시된 Vector F, Vector probe(Texas Red), Vector R, IHNV 검출용으로 표 3에 표시된 IHN F, IHN probe(HEX), IHN R가 사용되었다.
한편, 어류 시료의 RNA 추출 후 RNA에 대한 유효성 확인 대조구를 위해, 18s rRNA 유전자 검출을 위해 PCR 반응하였다. 즉, VHSV, IHNV, 플라스미드 벡터(합성 재조합 플라스미드 DNA 사용) 및 18s rRNA 유전자에 대해 모든 프라이머와 프로브를 함께 넣어 다중 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 이때, 18s rRNA 유전자를 포함하는 다중 실시간 RT-PCR 혼합물의 구성은 다음 표 5와 같으며, 각각의 프라이머 및 프로브 총 20 pmol을 사용하였다.
Figure 112020088290867-pat00005
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 각 유전자의 단일 실시간 RT-PCR 실시 결과를 도시한 도면이고, 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, VHSV, IHNV, 플라스미드 벡터 유전자 및 18s rRNA 유전자 검출을 모두 포함하는 다중 실시간 RT-PCR 실시 결과를 도시한 도면이다. 즉, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 10-10 단계 희석한 DNA를 주형으로 각각의 검출용 프라이머와 프로브를 단일 PCR 반응한 결과인 도 5와, 다중 실시간 RT-PCR 결과인 도 6을 비교해 보면, 다중 실시간 RT-PCR에서 검출하고자 하는 3가지 (VHSV, IHNV, 플라스미드 벡터) 유전자가 단일 PCR 반응과 같은 검출 민감도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이때, 어류에서 VHSV와 IHNV는 동반 감염 사례가 없으므로, 만약 어류의 검체에서 VHSV와 IHNV의 2개 형광을 모두 보일 경우, 양성대조구 플라스미드가 진단하고자 하는 시료에 오염된 것으로 판단할 수 있다.
3-2. 넙치 및 무지개 송어를 대상으로 다중 실시간 RT-PCR 적용
VHSV 감염 넙치 1마리, IHNV 감염 무지개송어 1마리, 건강 넙치 3마리, 건강 무지개송어 3마리)를 대상으로, 본 발명의 다중 실시간 RT-PCR 법을 적용하여 PCR을 실시하였다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, VHSV 및 IHNV에 각각 감염 및 감염되지 않은 넙치 및 무지개 송어를 대상으로 다중 실시간 RT-PCR 한 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 건강한 넙치와 무지개송어에서는 18s rRNA 유전자만 검출되어 RNA-cDNA-PCR 과정이 잘 진행된 것을 확인하였으며, 해당 질병인 VHS 및 IHN 바이러스 유전자가 모두 검출되지 않았다. 그러나, VHSV 감염 넙치는 VHSV 유전자가 특이적으로 검출되었고, IHN 역시 감염 무지개송어는 IHN 바이러스 유전자가 특이적으로 검출된 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. 목적 질병 병원체로 사용된 IHNV 검출 PCR 과정에서 하나의 프라이머 세트 내에서 두 개의 프로브를 혼입한 거짓양성 판별 실험
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 목적 질병의 병원체로 사용된 IHNV 검출 PCR 과정에서 하나의 프라이머 세트 내에 두 개의 프로브가 동일하게 검출되는 결과를 도시한 도면이다. 도 8에 도시된 바와 같이, 하나의 프라이머 세트 내에서 두 개의 프로브가 모두 검출되는 결과로부터, 양성대조구가 오염되었다는 것을 정확하게 확인할 수 있다.
실시예 5. 18s rRNA 유전자의 검출 여부 비교를 통한 실험자 및/또는 실험실 환경 오염 여부 판단 실험
5-1. 에어컨 노출 실험
본 발명의 다중 실시간 RT-PCR을 위해 사용되는 18s rRNA 유전자는 진핵생물을 검출할 수 있으므로, 이를 통해 곰팡이 오염 여부를 판단할 수 있다. 이를 확인하기 위해, 에어컨으로부터 곰팡이 오염 확인 실험을 수행하였다.
위의 실시예 3-2와 같은 방법으로, 다중 실시간 RT-PCR을 수행하기 위해 PCR 칵테일 두 세트를 만든 다음, 한 세트는 에어컨 노출 없이 다중 실시간 RT-PCR을 수행하고, 나머지 한 세트는 에어컨에 1분간 노출한 후 다중 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 곰팡이에 오염된 에어컨의 공기 노출 여부에 따른 PCR 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 9에 도시된 바와 같이, 에어컨 노출 그룹에서는 18s rRNA 유전자가 검출되었으며, 특히 template를 넣지 않고, 핵산 추출 없는 상황에도 음성대조구에서는 모두 에어컨에 노출한 그룹에서 모두 양성 반응이 나타났다.
5-2. 침(비말)에 의한 오염 실험
환경적 진단오류인자에 의한 샘플 오염으로는 에어컨 사용 등에 의해 곰팡이가 지속해서 배출되는 실험실에서의 공기 중 곰팡이 오염 외에도 실험자의 호흡에 의한 인간 유전자가 포함된 비말 오염 또는 목적 질병에 감염된 실험자의 비말에 의한 목적 질병 병원체 오염이 있다. 따라서 실험자에 의한 오염 여부 판단을 위해 실험자의 침을 샘플로 하여, 하나는 침 원액 1 ㎕, 곰팡이도 거를 수 있는 0.2 ㎛ 필터를 통해 필터한 후 침 1 ㎕를 핵산 추출 없이 18s rRNA 유전자 검출 반응을 하였다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법에서, 18s rRNA 유전자 검출을 통해 PCR 반응액 내 사람의 침액과 침액을 필터한 것을 PCR 반응하여 유전자를 검출한 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 10에 도시된 바와 같이, 두 그룹 모두 18s rRNA 유전자가 검출되었다.
또한, 병원체 오염 판단을 위해 VHSV 세포배양액 (유전형 II와 IV) 및 IHNV 세포배양액 (Wanju09, Wanju15 strains) 원액 1 ㎕를 핵산 추출 없이 유전자 검출 반응을 하였다.
도 11은 본 발명에서 목적 병원체 유전자를 검출하는데 사용하는 VHSV와 IHNV 같은 RNA 바이러스가 RNA 추출 없이 실시간 PCR 반응하였을 때는 바이러스 유전자가 검출되지 않으나, 역전사 반응이 포함된 실시간 RT-PCR 반응에서는 RNA 추출 없이 살아있는 바이러스 액만 PCR 반응액에 넣었을 때 바이러스 유전자가 검출되는 실험 결과를 도시한 도면이다. 도 11에 도시된 바와 같이, 목적 병원체인 VHSV와 IHNV 유전자가 RNA 추출을 하지 않은 바이러스 액만으로도 유전자가 검출되었다.
도 12는 18s rRNA 유전자의 프라이머와 프로브 부분의 염기서열을 유전자은행(NCBI GenBank)에 검색한 결과를 도시한 도면이다. 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명에서 개발된 18s rRNA 유전자의 프라이머와 프로브(서열번호 4 내지 6)는, 어류, 사람, 곰팡이 등과 대부분 염기서열이 일치하는 것을 확인할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법은, 18s rRNA 유전자 검출을 확인하여 실험자 및 실험실 환경 오염에 대해 실시간으로 확인할 수 있으며, 이는 실험실 내에서 발생하는 곰팡이나 실험자가 실험 시 대화하는 것으로 인해 비말 오염되어 PCR 반응을 저해했을 가능성이 있다는 것을 확인하는 도구로 사용될 수 있다. 이러한 기능은 호흡기 병원체를 유전자 검출로 진단하는 실험실에서 병원체에 노출된 실험자에 의해 발생할 수 있는 거짓양성 반응도 판별이 가능하므로, 특히 COVID-19 등과 같은 대규모 감염 호흡기 질환을 다루는 진단 실험실에 적용하기에 더욱 적절할 수 있다.
이상 설명한 본 발명은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 다양한 변형이나 응용이 가능하며, 본 발명에 따른 기술적 사상의 범위는 아래의 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.
S100: Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계
S200: 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계
S300: 단계 S100에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계
S400: 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 단계 S200에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계
S500: 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도, 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 저감도 검출법 사용에 의한 거짓음성 반응을 방지하는 단계
S600: 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계
S700: 목적 질병의 진단 시, 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계
S800: 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계
<110> National Fishery Products Quality Management Service <120> METHOD FOR DETERMINING FALSE NEGATIVE AND FALSE POSITIVE REACTIONS FOR TARGET PATHOGEN GENE DETECTION BASED ON INTERNATIONAL STANDARD REAL-TIME RT-PCR OF VIRAL HAEMORRHAGIC SEPTICAEMIA <130> 2020-P-0097 <140> 10-2020-0105670 <141> 2020-08-21 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector F <400> 1 cctgtgtgaa attgttatcc gctcac 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector probe <400> 2 atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtg 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector R <400> 3 gagttagctc actcattagg cac 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s F <400> 4 gatagctctt tctcgattct gtgg 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s probe <400> 5 ggtggtgcat ggccgttctt agttg 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s R <400> 6 cggagtctcg ttcgttatcg gaat 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific sequence <400> 7 ggaatgacaa tggtgggact gt 22 <210> 8 <211> 83 <212> DNA <213> Viral hemorrhagic septicemia virus <400> 8 aaactcgcag gatgtgtgcg tcccgggcag aagatcacca aggccctcta tgcgttcatc 60 ctgactgaga tcgcagaggg ccc 83

Claims (13)

  1. 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법으로서,
    (1) Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 서열번호 8에 기재된 염기서열 및 목적 질병의 병원체 유전자 검출과 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자를 연결하여 합성하는 단계;
    (2) 상기 합성된 유전자를 단계 희석하여 각 희석액을 주형으로 사용하되, Jonstrup VHS rRT-PCR 법과 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 rRT-PCR 반응을 각각 실시하고, 두 반응에 대한 검출 민감도를 비교해 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열을 선택하는 단계;
    (3) 상기 단계 (1)에서 합성된 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 클로닝하여, 합성 재조합 플라스미드 DNA를 추출하는 단계;
    (4) 상기 추출한 합성 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하며, 상기 단계 (2)에서 선택된 목적 질병의 병원체 유전자 검출을 위한 합성 염기서열에 따른 프라이머 및 프로브, Jonstrup VHS rRT-PCR 법에 따른 VHSV 검출용 프라이머 및 프로브, 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 다중 실시간 RT-PCR을 실시하는 단계;
    (5) 상기 다중 실시간 RT-PCR의 결과로부터, VHSV의 검출 민감도와 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출 민감도를 비교하여, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출법의 민감도를 검증하여, 거짓음성 반응을 방지하는 단계;
    (6) 상기 합성 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조구로 사용하여, 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체 직접 사용 없이 목적 질병 병원체 유전자의 검출을 위한 다중 실시간 PCR 실험의 성공 여부를 확인하는 단계;
    (7) 상기 목적 질병의 진단 시, 상기 목적 질병의 병원체가 RNA 바이러스일 경우, 진핵생물 공통유전자 검출을 내부대조구(internal control)로 두어 RNA 추출 및 cDNA 합성의 성공 여부를 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출 프라이머 및 프로브를 혼입하여, 내부대조구 형광 반응의 확인을 통해 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 단계; 및
    (8) 상기 목적 질병의 진단 시, 다중 형광 반응 결과 확인으로 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목적 질병의 병원체는,
    세균, 바이러스 및 곰팡이를 포함하는 핵산 유전체를 지닌 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 목적 질병의 병원체는,
    DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 포함하는 감염성 바이러스 병원체 중에서 선택된 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서,
    상기 거짓양성 판별을 위한 염기서열에 대한 유전자 합성은, 상기 목적 질병의 진단 시 검체 내의 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프라이머 세트가 위치한 서열 내부에 검출용 프로브 외에 다른 형광 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열인 서열번호 7에 기재된 염기서열에 따른 유전자를 합성하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (7)에서는,
    상기 내부대조구 RNA 검출에 사용하는 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며,
    실시간 PCR 칵테일 제조물 상에 RNA 주형을 주입하고 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 반응 후, 해당 형광 곡선의 Ct value가 10 이상 20 이하를 형성하는지 여부를 확인하여 RNA 추출 및 cDNA 합성 실험 과정을 검증하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단계 (7)에서는,
    상기 18s rRNA 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열의 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열의 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열의 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 목적 질병의 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 플라스미드 벡터 DNA의 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입한 후 반응 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별하는 것 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 플라스미드 벡터 유전자의 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 1에 기재된 염기서열의 포워드 프라이머, 서열번호 2에 기재된 염기서열의 프로브, 및 서열번호 3에 기재된 염기서열의 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 목적 질병 진단 시, 검체 내에 PCR을 통해 기 증폭된 DNA 산물 유래 오염에 의한 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 목적 질병의 병원체 유전자 검출용 프로브가 붙을 수 있는 병원체 유전자의 서열과 다른 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브와 목적 질병 병원체 유전자 검출용 프로브 및 프라이머를 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 혼입하여, 두 가지 프로브에 의해 두 가지 형광 반응이 동시에 일어나는지 여부를 확인하여 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 특정염기서열을 표적으로 하는 오염진단용 프로브로서, 서열번호 7에 기재된 염기서열의 프로브와 목적 질병 병원체를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 혼입하여 상기 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여, 수행 결과로부터 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 목적 질병 진단 시, 검체 내 양성대조구 유래 DNA 오염에 의한 거짓양성을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 VHS가 아닌 목적 질병의 병원체 유전자 검출법에서 사용되는 프라이머 및 프로브와 함께 표준 Jonstrup VHS rRT-PCR 프라이머 및 프로브를 혼입하여 실시간 PCR 수행 후 두 검출법에 따른 형광 반응의 동시 발생 유무를 확인하여 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 목적 질병 진단 시, 공기 중 곰팡이, 실험자로부터 발생한 비말, 또는 목적 질병에 감염된 실험자로부터 발생한 병원체가 포함된 비말을 포함하는 실험실 환경 유래 진단오류인자 오염에 의한 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하기 위해, 상기 실시간 PCR 칵테일 제조물에 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 혼입하여 주형 미포함 음성대조구(Non template control)에서의 형광 반응의 유무를 확인하여, 곰팡이 또는 비말오염 여부 확인을 통해 거짓음성 및 거짓양성 반응을 판별하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단계 (8)에서는,
    상기 진핵생물 공통유전자로서 18s rRNA 유전자를 이용하며,
    상기 진핵생물 공통유전자 검출용 프라이머 및 프로브로서, 서열번호 4에 기재된 염기서열의 포워드 프라이머, 서열번호 5에 기재된 염기서열의 프로브, 및 서열번호 6에 기재된 염기서열의 리버스 프라이머를 혼입하여 다중 실시간 RT-PCR 법을 수행하는 것을 특징으로 하는, 바이러스성출혈성패혈증 실시간 RT-PCR법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법.
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