KR101510666B1 - 병원체 유전자를 사용하지 않는 피시알용 양성대조구 플라스미드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 바이러스 병원체 유전자가 삽입된 기존의 PCR용 양성대조구 플라스미드에서, 바이러스 병원체 유전자를 바이러스 병원체 유전자와 동일한 PCR 산물 크기를 갖는 외부 유전자로 치환된 것을 그 구성상의 특징으로 한다.
본 발명에서 제안하고 있는 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드에 따르면, 바이러스 병원체 유전자와 동일한 PCR 산물 크기를 가지면서 상이한 염기서열을 갖는 외부 유전자로 치환함으로써 거짓양성반응인지 여부에 대한 구분을 명확히 할 수 있어 PCR을 이용한 감염성 질병의 진단 시, 진단의 정확성과 신뢰성이 보장될 수 있다.

Description

병원체 유전자를 사용하지 않는 피시알용 양성대조구 플라스미드{PLASMID FOR PCR POSITIVE CONTROL WITHOUT USING PATHOGENE}

본 발명은 PCR용 양성대조구 플라스미드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드에 관한 것이다.

일반적으로, DNA 증폭기술은 생명과학, 유전공학 및 의학 분야 등의 연구개발 및 진단 목적으로 광범위하게 활용되고 있으며, 특히 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)에 의한 DNA 증폭기술이 널리 활용되고 있다. 중합효소 연쇄반응(PCR)은 유전체에 있는 특정 DNA서열을 필요한 만큼 증폭시킬 수 있는 간단하고 편리한 방법으로서, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하여 고온에서도 안정한 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 변성(denaturation), 결합(annealing), 신장(extension)의 과정을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭시키게 된다. 이러한 PCR을 이용한 감염성 질병의 진단은 목적 병원체의 특이 유전자를 인식하는 프라이머를 이용하여 특정 DNA를 증폭하여 확인하는 것이며, 이를 통해 샘플 중에 미량으로 존재하는 병원체를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

한편, PCR을 이용하여 감염성 질병을 진단하는 과정에서, 진단의 정확성 및 신뢰성을 확보하기 위하여 양성대조구를 사용하게 된다. 일반적으로, 양성대조구는 확인하고자 하는 병원체의 유전자가 삽입된 플라스미드(plasmid) DNA를 양성대조구로 사용하게 되는데, 이때 눈에 보이지 않는 양성대조구가 PCR 반응을 수행하는 과정에서 소량이라도 오염되면 정작 알고자 하는 샘플이 병원체에 감염되었는지 아닌지 확인이 불가능한 거짓 양성반응이 나타날 수 있는 문제점이 있다. 더욱이, 유전자 염기서열 분석을 수행하면 병원체 유전자와 100% 일치하는바, 거짓 양성반응인지 또는 정말 감염되었는지 여부의 구분이 불가능하여 진단의 정확성과 신뢰성에 큰 지장을 주는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드의 제공이 중요한 과제로 되고 있으나, 이에 대한 개발이 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 기존에 제안된 방법들의 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 바이러스 병원체 유전자와 동일한 PCR 산물 크기를 가지면서 상이한 염기서열을 갖는 외부 유전자로 치환함으로써 거짓양성반응인지 여부에 대한 구분을 명확히 할 수 있어 PCR을 이용한 감염성 질병의 진단 시, 진단의 정확성과 신뢰성이 보장되는, 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드는,

바이러스 병원체 유전자가 삽입된 기존의 PCR용 양성대조구 플라스미드에서,

상기 바이러스 병원체 유전자를 상기 바이러스 병원체 유전자와 동일한 PCR 산물 크기를 갖는 외부 유전자로 치환된 것을 그 구성상의 특징으로 한다.

바람직하게는,

상기 외부 유전자의 염기서열은 상기 바이러스 병원체 유전자의 염기서열과 상이할 수 있다.

바람직하게는, 상기 바이러스 병원체 유전자는,

흰반점바이러스 유전자(white spot syndrome virus gene)일 수 있다.

바람직하게는, 상기 외부 유전자는,

1447bp 크기의 pGEM-T easy vector DNA 단편일 수 있다.

바람직하게는, 상기 외부 유전자는,

941bp 크기의 pGEM-T easy vector DNA 단편일 수 있다.

본 발명에서 제안하고 있는 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드에 따르면, 바이러스 병원체 유전자와 동일한 PCR 산물 크기를 가지면서 상이한 염기서열을 갖는 외부 유전자로 치환함으로써 거짓양성반응인지 여부에 대한 구분을 명확히 할 수 있어 PCR을 이용한 감염성 질병의 진단 시, 진단의 정확성과 신뢰성이 보장될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드에서, 제조된 1차 및 2차 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 도면.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드에서, 실시예 1-2 및 1-3의 전기영동 결과를 나타낸 도면.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드에서, pGEM-T Easy vector의 외래유전자 클로닝 부분의 일부 염기서열을 도시한 도면이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.

덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 ‘연결’ 되어 있다고 할 때, 이는 ‘직접적으로 연결’ 되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 ‘간접적으로 연결’ 되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성요소를 ‘포함’ 한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 “양성대조구”란, 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested polymerase chain reaction)과 같은 분자생물학적 방법을 이용하여 감염성 질병을 진단하는데 있어서, 검출하고자 하는 병원체 유전자와 동일한 PCR 산물의 크기를 가짐으로써 샘플에 대한 진단의 신뢰성을 확보하기 위하여 사용되는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

PCR을 이용하여 감염성 질병을 진단하는 과정에서, 진단의 정확성 및 신뢰성을 확보하기 위하여 양성대조구를 사용하게 되며, 일반적으로, 확인하고자 하는 병원체의 유전자가 삽입된 플라스미드(plasmid) DNA를 양성대조구로 사용하게 된다. 이러한 경우, 눈에 보이지 않는 양성대조구가 PCR 반응을 수행하는 과정에서 소량이라도 오염되면 정작 알고자 하는 샘플이 병원체에 감염되었는지 아닌지 확인이 불가능한 거짓 양성반응이 나타날 수 있는 문제점이 있다. 더욱이, 유전자 염기서열 분석을 수행하면 병원체 유전자와 100% 일치하는바, 거짓 양성반응인지 또는 정말 감염되었는지 여부의 구분이 불가능하여 진단의 정확성과 신뢰성에 큰 지장을 주는 문제점이 있다.

본 발명자 등은 바이러스 병원체 유전자가 아닌 외부 유전자를 사용하여, 상기 외부 유전자가 바이러스 병원체 유전자와 동일한 PCR 산물을 가지면서 바이러스 병원체 유전자의 염기서열과 상이함을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명에 따른 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드는, 정해진 매뉴얼에 따른 PCR 방법을 그대로 사용하되, 바이러스 병원체 유전자가 삽입된 기존의 PCR용 양성대조구 플라스미드에서, 병원체 유전자를 제거하고 외부 유전자를 삽입함으로써 제조된 키메릭 플라스미드(chimeric plasmid)인바, 기존의 양성대조구로부터 발생할 수 있는 거짓 양성반응을 정확히 구분할 수 있다. 보다 구체적으로, PCR 과정을 수행하기 위하여 검출하고자 하는 바이러스 병원체 특이 프라이머를 사용하는 경우, 해당 바이러스 병원체 유전자 크기(bp)와 동일한 크기의 PCR 산물을 증폭하는 반면(실시예 1), 바이러스 병원체 유전자와 상이한 염기서열을 가지는바(실시예 2), 거짓양성반응 여부를 정확히 구분할 수 있다.

본 발명은 이하의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이하의 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

바이러스 병원체와의 PCR 산물 비교 실험

[1-1] 프라이머 세트 제작

암피실린 내성 유전자(ampicillin resistance gene) 및 파지 f1 영역 유전자(phage f1 region gene)를 포함하는 pGEM-T easy vector DNA를 주형으로 네스티드 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 1차 및 2차 프라이머 세트를 제작하였고, 제작한 프라이머 세트의 염기서열을 도 1에 나타내었다.

즉, 도 1에 도시된 바와 같이, 1차 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 WSSV 146F1(OIE)의 염기서열과 pGEM-T Easy vector 내의 암피실린 내성 유전자의 뉴클레오티드 1351번째 내지 1371번째에 해당하는 염기서열을 이용하여 합성하였고, 역방향 프라이머는 WSSV 146R1(OIE)의 염기서열과 암피실린 내성 유전자의 뉴클레오티드 2730번째 내지 2749번째에 해당하는 염기서열을 이용하여 합성하였다. WSSV 146F1(OIE)의 염기서열과 WSSV 146R1(OIE)의 염기서열은 하기와 같다.

WSSV 146F1: 5'-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3'

WSSV 146R1: 5'-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3'

또한, 2차 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 WSSV 146F2(OIE)의 염기서열과 pGEM-T Easy vector 내의 암피실린 내성 유전자의 뉴클레오티드 1351번째 내지 1371번째에 해당하는 염기서열을 이용하여 합성하였고, 역방향 프라이머는 WSSV 146R2(OIE)의 염기서열과 pGEM-T Easy vector 내의 암피실린 내성 유전자와 파지 f1 영역 유전자 사이의 뉴클레오티드 2223번째 내지 2247번째에 해당하는 염기서열을 이용하여 합성하였다. WSSV 146F2(OIE)의 염기서열과 WSSV 146R2(OIE)의 염기서열은 하기와 같다.

WSSV 146F2: 5'-GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA-3'

WSSV 146R2: 5'-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3'

[1-2] 네스티드 중합효소 연쇄반응(Nested-PCR)에 의한 pGEM-T easy vector DNA 증폭

pGEM-T easy vector DNA를 주형으로 하여 네스티드 중합효소 연쇄반응을 수행하였고, 보다 구체적으로 각각의 1차 및 2차 프라이머 세트 10pmol, TE(Tris-EDTA) buffer 및 1.25 U Ex-Taq DNA 중합효소(TaKaRa, Tokyo, Japan)를 함유한 25-μL PCR 반응 혼합물에서 수행되었다.

반응은 95℃에서 10분 동안 초기 변성(initial denaturation)시킨 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 과정을 35회 반복하며, 72℃ 10분 동안 최종 신장(final extension) 시켰으며, iCycler thermal cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하였다.

[1-3] 네스티드 중합효소 연쇄반응(nesetd PCR)에 의한 WSSV 유전자의 증폭

흰반점바이러스(WSSV)로 감염된 새우 조직을 분리한 후, 게놈 DNA 추출 키트(Qiagen, Germantown, MD, USA)를 사용하여 질병에 걸린 새우 두 마리의 아가미 및 각피상피(cuticular epithelia)로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다.

추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여 WSSV 유전자를 코딩하는(encoding) 서열에 대응(reflect)하는 초기 프라이머 세트(WSSV 146F1 및 146R1)를 사용하여 PCR 산물을 증폭하였고, 이때 상기 반응은 각각의 프라이머 10 pmol, TX(Tris-EDTA) buffer 및 1.25 U Ex-Taq DNA 중합효소(TaKaRa, Tokyo, Japan)를 함유한 25-μL PCR 반응 혼합물에서 수행되었다. 또한 상기 PCR 반응은 94℃에서 4분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 한 사이클 진행 후, 이어서 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 39 사이클을 진행하였고, 최종 신장 단계(extension step)는 72℃에서 5분 동안 지속시켰다.

이 후, 증폭된 PCR 산물과 WSSV 146F2 및 146R2 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 수행하였다. 보다 구체적으로, PCR 산물(1 μL)은 각각의 프라이머 10 pmol, TE buffer 및 1.25 U Ex-Taq DNA 중합효소를 함유한 50-μL PCR 반응 혼합물에 첨가되어 수행되었고, 첫 번째 PCR과 동일한 PCR 증폭 프로토콜이 사용되었다.

[1-4] 전기영동

실시예 [1-2] 및 [1-3]에 따라 수득된 PCR 산물을 EtBr(ethidium bromide)(0.5μg mL-1; Sigma, St.Louis, MO, USA)을 함유한 1.5% 아가로오스겔(agarose gel)에서 전기영동 하였고, Gel Doc UV trans-illuminator(Bio-rad)를 사용하여 가시화하여 PCR 산물 크기를 비교하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 [1-2]에서, pGEM-T Easy vector DNA로 구성된 주형을 가지고, 첫 번째 단계의 PCR 반응은 1차 프라이머 세트에 의해 pGEM-T Easy vector DNA으로부터 1447bp 단편을 증폭하였음을 확인하였고(도 2a, Lane 2), 네스티드 PCR 반응은 2차 프라이머 세트에 의해 941-bp 단편을 증폭하였음을 확인하였다(도 2b, Lane 5).

또한, 실시예 [1-3]에서, 주형으로서 WSSV-감염된 조직으로부터 추출된 게놈 DNA를 사용하여, 첫 번째 단계의 PCR 반응은 WSSV 146F1 및 R1 프라이머 세트에 의해 WSSV 유전자의 1447bp를 증폭하였음을 확인하였고(도 2a, Lane 1), 네스티드 PCR 반응은 WSSV 146F2 및 R2 프라이머 세트에 의해 WSSV 유전자의 941bp를 증폭하였음을 확인하였다(도 2b, Lane 4).

이러한 결과를 통해, 바이러스 병원체 유전자가 아닌 pGEM-T Easy vector DNA로부터 증폭된 PCR 산물은 바이러스 병원체 유전자로부터 증폭된 PCR 산물과 동일한 크기를 가지는 것을 확인하였다. 한편, Lane 3 및 6은 음성 대조구이며, M은 DNA 마커이다.

바이러스 병원체와의 염기서열 비교 실험

[2-1] 클로닝 및 염기서열 분석

실시예 [1-2] 및 [1-3]에 의해 획득된 총 4개의 PCR 산물(1447bp 및 941bp)을 스핀-컬럼(spin-column) PCR 정제 키트(Promega)를 사용하여 정제한 후, 도 3에 도시된 바와 같은 염기서열을 가지는 pGEM-T Easy vector에 클로닝하여 각각의 PCR 산물을 클론화하였다. 플라스미드 DNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 형질전환 세균으로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후, 이를 주형으로 한 PCR 반응을 통해 정확한 클론을 선택하고, T7 및 SP6 프라이머를 가진 ABI377 시퀀서(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과, [1-3]에 따른 WSSV를 기반으로 한 플라스미드의 염기서열은 WSSV 유전자와 100% 일치하는 반면, [1-2]에 따른 PCR 산물에 기반하여 제조된 플라스미드(키메릭 플라스미드) 주형의 염기서열은 WSSV 유전자와 동일하지 않고, pGEM-T Easy vector 유전자와 100% 동일한 것을 확인할 수 있었다.

추가로, WSSV 146 F1 & 146 R1 및 WSSV 146 F2 & 146 R2 프라이머 세트를 이용하여 키메릭 플라스미드의 PCR 과정을 수행하였다. 즉, 실시예 [1-2]에 따른 1차 프라이머 세트를 이용하여 수득된 1447bp의 PCR 산물을 클로닝하여 제조된 플라스미드(키메릭 플라스미드-1)는 WSSV 146F1 및 146R1 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 하였고, 2차 프라이머 세트를 이용하여 수득된 941bp의 PCR 산물을 클로닝하여 제조된 플라스미드(키메릭 플라스미드-2)는 WSSV 146F2 및 146R2 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 하였으며, 이때 상기 반응은 각각의 프라이머 10 pmol, TE buffer 및 1.25 U Ex-Taq DNA 중합효소를 함유한 25-μL PCR 반응 혼합물에서 수행되었다.

그 결과, 941-bp PCR 산물은 WSSV 146F2-R2 프라이머 세트를 사용하여 키메릭 플라스미드-2로부터 증폭되었지만, 키메릭 플라스미드-1을 사용해서는 증폭되지 않음을 확인하였다.

이상 설명한 본 발명은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 다양한 변형이나 응용이 가능하며, 본 발명에 따른 기술적 사상의 범위는 아래의 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 바이러스 병원체 유전자가 삽입된 PCR용 양성대조구 플라스미드에서,
   상기 바이러스 병원체 유전자가, 상기 바이러스 병원체 유전자와 염기서열은 다르나 PCR 산물 크기는 동일한 유전자로 치환되되,
   상기 바이러스 병원체는, 흰반점바이러스(white spot syndrome virus)이고,
   상기 바이러스 병원체 유전자와 염기서열은 다르나 PCR 산물 크기는 동일한 유전자는, 암피실린 내성 유전자(ampicillin resistance gene) 및 파지 f1 영역 유전자(phage f1 region gene)를 포함하는 pGEM-T easy vector DNA로서,
   흰반점바이러스 검출에 사용되는 PCR 프라이머의 염기서열과 pGEM-T Easy vector 내의 암피실린 내성 유전자의 뉴클레오티드 1351번째 내지 1371번째에 해당하는 염기서열을 이용하여 합성한 정방향 프라이머, 및
   상기 흰반점바이러스 검출에 사용되는 PCR 프라이머의 염기서열과 암피실린 내성 유전자의 뉴클레오티드 2730번째 내지 2749번째에 해당하는 염기서열을 이용하여 합성한 역방향 프라이머를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR) 시 수득되는 PCR 산물의 크기가 1447bp인 것을 특징으로 하는, 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드.
   
4. 바이러스 병원체 유전자가 삽입된 PCR용 양성대조구 플라스미드에서,
   상기 바이러스 병원체 유전자가, 상기 바이러스 병원체 유전자와 염기서열은 다르나 PCR 산물 크기는 동일한 유전자로 치환되되,
   상기 바이러스 병원체는, 흰반점바이러스(white spot syndrome virus)이고,
   상기 바이러스 병원체 유전자와 염기서열은 다르나 PCR 산물 크기는 동일한 유전자는 암피실린 내성 유전자(ampicillin resistance gene) 및 파지 f1 영역 유전자(phage f1 region gene)를 포함하는 pGEM-T easy vector DNA로서,
   흰반점바이러스 검출에 사용되는 PCR 프라이머의 염기서열과 pGEM-T Easy vector 내의 암피실린 내성 유전자의 뉴클레오티드 1351번째 내지 1371번째에 해당하는 염기서열을 이용하여 합성한 정방향 프라이머, 및
   상기 흰반점바이러스 검출에 사용되는 PCR 프라이머의 염기서열과 pGEM-T Easy vector 내의 암피실린 내성 유전자와 파지 f1 영역 유전자 사이의 뉴클레오티드 2223번째 내지 2247번째에 해당하는 염기서열을 이용하여 합성한 역방향 프라이머를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR) 시 수득되는 PCR 산물의 크기가 941bp인 것을 특징으로 하는, 병원체 유전자를 사용하지 않는 PCR용 양성대조구 플라스미드.
5. 삭제

Images