CN104745678B

CN104745678B - 一种体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒

Info

Publication number: CN104745678B
Application number: CN201310754426.1A
Authority: CN
Inventors: 张辰宇; 张栋; 刘丹青; 管丹萍
Original assignee: Jiangsu Micromedmark Biotech Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Micromedmark Biotech Co Ltd
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2018-06-19
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: WO2015101342A1; CN104745678A

Abstract

本发明属于生物诊断检测领域，涉及一种体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒。人血清miR‐25作为检测靶标可在制备胰腺癌诊断试剂中应用。一种用于体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒，包含人血清miR‐25的逆转录引物、实时荧光定量PCR检测人血清miR‐25的引物和探针。本发明通过大量实验研究发现人血清中的miR‐25与胰腺癌发生具有相关性，基于此发现提出了血清miR‐25可以作为一个新的胰腺癌检测靶标，在制备胰腺癌诊断试剂中应用。进而通过设计miR‐25的逆转录体系、以及定性/或定量检测体系，制备得到一种用于体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒，该试剂盒具有良好的敏感度和特异度。

Description

一种体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒

技术领域

本发明属于生物诊断检测领域，涉及一种体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒。

背景技术

胰腺癌（pancreatic carcinoma）主要指胰外分泌腺腺癌，是胰腺恶性肿瘤中最常见的一种，占常见肿瘤的1%-2%，占消化道肿瘤的8%-10%。全球胰腺癌发病率约为9/10万，死亡率也接近9/10万。据美国临床肿瘤协会的统计，2005年，全美胰腺癌新发病例为32180例，病死数为31800例，在恶性肿瘤死亡率中居第四位。在胰腺癌的发病率和死亡率上，我国的情况与美国相似，目前，我国胰腺癌发病率估计为10/10万，且有逐年增加的趋势，患者的总体生存率为0.5%～1%。

由于胰腺癌早期症状隐匿，故早期诊断十分困难，当出现典型症状时多已属晚期，治疗效果也不理想，病死率很高，5年生存率仅为4%，因此胰腺癌是恶性程度高，进展迅速、严重危害人类健康的肿瘤之一。

目前，胰腺癌的诊断方法包括内镜、影像学检查和肿瘤标志物检测。内镜及影像学检查方法包括B超检查、电子计算机X线断层扫描(CT)、磁共振(MRI)、磁共振胰胆管成像(MRCP)、正电子发射断层扫描(PET)、正电子发射断层扫描(PET)以及超声内镜检查(EUS)、经口胰管镜(POPS)、胰管内超声检查(PIDUS)等。但由于胰腺位置隐匿，内镜及影像学技术的诊断效果有限。目前，用于胰腺癌诊断和随访的肿瘤标记物有10余种，但迄今为止尚未找到一种对胰腺癌诊断灵敏性和特异性都十分满意的肿瘤标志物。因此各指标单独使用对胰腺癌早期诊断价值不大，可用于判断胰腺癌切除后是否有残余病灶以及复发的监测。常用的肿瘤标志物包括CA19-9、CEA（癌胚抗原）。但是，上述肿瘤标记物的灵敏度和特异性相对较低，它们的检测结果还不能作为胰腺癌确诊的指标。胰腺癌的早期诊断率是提高胰腺癌病人生存率最关键的因素，然而上述任何一种肿瘤标记物还难以满足胰腺癌早期诊断的这种需求。一些传统医学手段，如组织细胞检测存在着其固有的缺陷，取材位置不当、组织细胞标本材料不足或人为经验不足等都将导致误诊。同时，某些有创的检测方法如逆行胰胆管造影（ERCP）甚至可以造成出血、继发胰腺炎、胆汁漏、休克等严重并发症。影像学虽然已被广泛应用于癌症的检查和诊断，但其在疾病程度的定性上仍存在着很大的局限性。因此，目前非常有必要寻找能够弥补现有诊断方法的新型、灵敏并且应用方便的疾病检测标记物。

MicroRNA为一类长约19-23个核苷酸的单链小核糖核酸（RNA）分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可以通过抑制靶基因的翻译（Translation）过程对基因表达进行调节。微小核糖核酸参与正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等，也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。发明人率先发现血清中microRNA在各种环境中表达非常稳定，并且与多种疾病的发生、发展具有极强的相关性；再加上其取材便利，使得血清microRNA具备了成为优异生物标志物的潜质，具有良好的开发应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的胰腺癌血清标记物人血清miR-25作为检测靶标在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。

本发明的另一目的是提供定性或定量检测人血清miR-25的引物和/或探针在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。

本发明的又一目的是提供一种体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

人血清miR-25作为检测靶标在制备胰腺癌诊断试剂中的应用，其中miR-25的序列为：AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG。

定性或定量检测人血清miR-25的引物和/或探针在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。

优选实时荧光定量PCR检测人血清miR-25的引物和探针在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。

进一步优选含有人血清miR-25的逆转录引物、实时荧光定量PCR检测人血清miR-25的引物和探针的组合物在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。

一种用于体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒，包含人血清miR-25的逆转录引物、实时荧光定量PCR检测人血清miR-25的引物和探针。

一种用于体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒，优选包含人血清miR-25的逆转录引物、实时荧光定量PCR检测人血清miR-25的引物和探针。

所述的试剂盒还含有let7d、let7g或let7i作为内对照。

所述的试剂盒还含有针对内对照的逆转录引物，以及实时荧光定量PCR检测内对照的引物和探针。

所述的试剂盒还含有不同拷贝数的miR-25的非人源RNA溶液作为标准品，含有特定拷贝数的miR-25及内对照的人工合成品混合液作为阳性质控品，含有特定拷贝数的miR-25及内对照的人工合成品混合液作为阴性质控品，含有不含miR-25及内对照的RNA溶液作为空白对照。阳性质控品、阴性质控品及空白对照中miR-25拷贝数范围见表1。

表1

质控品	参考范围
		阳性质控品	10⁵拷贝/μl≤miR-25的相对拷贝数≤10⁶拷贝/μl
阴性质控品	10³拷贝/μl≤miR-25的相对拷贝数≤10⁴拷贝/μl
		空白对照	miR-25的相对拷贝数≤10³拷贝/μl

所述的试剂盒还含有逆转录酶、dNTPs、RT缓冲液、DEPC水、DNA聚合酶的缓冲液、MgCl2、DNA聚合酶及参比荧光染料。

本试剂盒的组成最优选包括表2中所示组分：

表2

序号	标签	成份	规格	数量
					1	标准品S4	含miR-2510⁶拷贝/μl的非人源RNA溶液	100μl/支	1支
2	标准品S3	含miR-2510⁵拷贝/μl的非人源RNA溶液	100μl/支	1支
					3	标准品S2	含miR-2510⁴拷贝/μl的非人源RNA溶液	100μl/支	1支
4	标准品S1	含miR-2510³拷贝/μl的非人源RNA溶液	100μl/支	1支
					5	阳性质控品	miR-25及内对照的人工合成品混合液	350μl/支	1支
6	阴性质控品	miR-25及内对照的人工合成品混合液	350μl/支	1支
					7	空白对照	不含miR-25及内对照的RNA溶液	50μl/支	1支
8	逆转录酶	逆转录酶	44μl/支	1支
					9	dNTPs	dATP、dTTP、dCTP、dGTP混合液	85μl/支	1支
10	RT缓冲液	逆转录酶的缓冲液	200μl/支	1支
					11	RP-miR-25	miR-25的逆转录引物	25μl/支	1支
12	RP-内对照	内对照的逆转录引物	19μl/支	1支

13	DEPC水	无RNA酶的超纯水	360μl/支	1支
					14	qPCR缓冲液	DNA聚合酶的缓冲液	200μl/支	1支
15	MgCl₂	MgCl₂溶液	150μl/支	1支
					16	dNTPs	dATP、dTTP、dCTP、dGTP混合液	35μl/支	1支
17	DNA聚合酶	DNA聚合酶	27μl/支	1支
					18	ROX	参比荧光染料	19μl/支	1支
19	PP-miR-25	miR-25的正、反向引物及探针	25μl/支	1支
					20	PP-内对照	内参照的正、反向引物及探针	19μl/支	1支
21	DEPC水	无RNA酶的超纯水	900μl/支	1支

本试剂盒的操作包括以下步骤：

1.检测样本准备：采集血液，分离、收集血清，提取血清中RNA；

2.逆转录：使用逆转录酶及其他原料，在特定的反应条件下，将血清中的RNA逆转录成cDNA；

3.PCR扩增：使用DNA聚合酶及其他原料，在特定的反应条件下，使逆转录产物（cDNA)进行聚合酶链式反应（PCR）。通过设定阈值得miR-25以及标准品各个浓度的Ct值；

4.对检测结果进行统计分析和解释。

本试剂盒的保存条件为：试剂于-18℃以下避光保存，自包装之日起可稳定保存12个月；4℃-8℃中避光保存8天，质量稳定；经干冰运输3天，质量稳定；经3次冻融后，质量稳定，建议开封后应立即使用，避免反复冻融。

本试剂盒适用于ABI-7500、ABI-7300、罗氏等荧光定量PCR仪等。

本试剂盒的检测原理为：定性检测试剂盒，采用实时荧光定量PCR系统，检测人血清中miR-25的含量，用于胰腺癌的辅助诊断。不推荐作为恶性肿瘤诊断或确诊的依据，不适宜于普通人群的肿瘤筛查。所谓的辅助诊断，指本发明的适应症人群为胰腺癌的高危人群，具体可包括但不限于：1）年龄大于40岁，有上腹部非特异症状患者，伴有乏力和进行性消瘦；2）上腹不适的部位较深，范围较广，患者常不易用用手指出腹部不适的位置，不适的性质多数患者不能清楚的描述，不适与饮食的关系不密切；3）有胰腺癌家族史者；4）慢性胰腺炎患者；5）家族性腺瘤息肉病患者；6）突发糖尿病；7）上腹痛或背痛伴多发性静脉血栓形成或血栓性静脉炎；8）长期吸烟、酗酒及长期接触有害化学物质者。

测定人血清中miR-25的含量为本领域的常规技术，本发明的发明点在于发现人血清中的miR-25与胰腺癌发生具有相关性，基于此发现提出了血清miR-25可以作为一个新的胰腺癌检测靶标，而不在于具体的引物和探针序列。针对miR-25设计的用于扩增miR-25cDNA的逆转录引物、荧光定量PCR引物和探针均可以适用于本发明，这些引物和探针可以遵循业内公知方法通过现有的计算机软件自行设计，并化学合成，也可以向厂家订购。表3为发明人自己设计的三组引物组合物，但是以下的引物组合物仅是举例说明本发明的技术方案，并不能够作为对本发明保护范围的限制。

表3

有益效果：

本发明通过大量实验研究发现人血清中的miR-25与胰腺癌发生具有相关性，基于此发现提出了血清miR-25可以作为一个新的胰腺癌检测靶标，在制备胰腺癌诊断试剂中应用。进而通过设计miR-25的逆转录体系、以及定性/或定量检测体系，制备得到一种用于体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒，该试剂盒具有良好的敏感度和特异度。与同主题在先申请相比，本申请的探针库得到最大程度简化，极大降低了制造和使用成本，而同时仍保证较高的检测准确度和特异性。本发明试剂盒填补胰腺癌标记物方面的空白；检测准确率不低于现有技术，操作简便、样本保存方便、不受取样位置和手法的影响，故总体效果优于现有技术；3.检测样本为血清，非侵入，减少病人痛苦。

附图说明

图1样本类型比例示意图

图2对照组、试验组及干扰组中根据miR-25表达量的高低进行的频数统计，其中纵坐标代表检测值满足特定浓度区间的样本数量（单位：例），横坐标为浓度区间（单位：拷贝/μl）。频数统计的结果可以直观看出样本分布情况和样本中弱阳性、医学决定水平附近及强阳性的样本比例。

图3受试者工作特征（ROC）曲线

具体实施方式

以下实施例使用的miR‐25以及内对照Let‐7d的逆转录引物以及Q‐PCR引物和探针如表3序列设计1所示。但是所用序列仅为举例说明本发明的技术方案，而不应理解为对本发明保护范围的限制。以表3中其他序列设计组的引物组合物制备试剂和，也能实现与以下实施例相同的功能。

实施例1样本要求及样本处理方法

1.样本要求

1)样本类型：血清。

血清以新鲜采集分离为好。采血6小时内必须分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用无RNA酶的无菌微量离心管中。

2)血清样本置室温可稳定保存24小时，2℃－8℃可稳定保存7天，-18℃以下可稳定保存6个月。

3)血清样本提取出的RNA溶液，室温可稳定保存12小时，2℃－8℃可稳定保存3天，-18℃以下可稳定保存3个月。

2.处理方法：

1)将全血样本处理成血清：采集静脉血2ml，于5ml洁净离心管中，不抗凝。静置30分钟后，5000rpm离心5分钟，取其上清。如果样本不立即使用，需-18℃以下保存。本试剂盒所需血清样本体积为300μl。

2)血清样本的RNA提取：使用QiagenmiRNeasyMini Kit试剂盒，遵守厂商说明进行操作。在提取血清样本的同时，也提取阳性质控品（如表2）及阴性质控品（如表2）。

实施例2逆转录操作过程

1.逆转录体系如表4所示：

表4

名称	体积
		RT缓冲液	2μl
逆转录酶	0.5μl
		dNTPs	1μl
逆转录引物（RP-miR-25、RP-内对照）	0.5μl
		RNA	2μl
DEPC水	4μl
		总体积	10μl

2.实验操作：

1）计算反应体系：按检测样本量计算miR-25、内对照分别进行逆转录反应所需体系量。

2）配制反应混合液：按顺序加入DEPC水、RT缓冲液、dNTPs、逆转录酶、逆转录引物（RP-miR-25、RP-内对照），进行混匀。

3）分布反应混合液：将步骤2）所得混合液8μl/孔分布于相应的96孔PCR板中。

4）加入样品：所有样品miR-25、内对照各检测1份；分别取空白对照、标准品S4-S1、提取后的阴性质控品、阳性质控品及待测标本RNA2ul至步骤3）96孔PCR板中，贴膜。

5）混匀：96孔PCR板置涡旋仪上涡旋约5s，然后置于板式离心机（1500rpm，30s）进行离心。

3.反应程序：

将96孔板放入PCR仪，设定程序，进行逆转录反应。

反应程序：16℃，30min——42℃，30min——85℃，5min——4℃，forever

实施例3PCR操作过程

1.实验体系见表5：

表5

名称	体积
		qPCR缓冲液	2μl
MgCl₂	1.2μl
		dNTPs	0.4μl
DNA聚合酶	0.3μl
		引物探针（PP-miR-25、pp-内对照）	0.5μl
ROX	0.2μl
		cDNA	5μl
DEPC水	10.4μl
		总体积	20μl

2.实验操作：

1）计算反应体系：按实验需求计算每种qRCR引物所需体系量。

2）配制反应混合液：按顺序加入DEPC水、qRCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶、ROX、引物探针（PP-miR-25、PP-内对照），进行混匀。

3）分布反应混合液：将步骤2）所得混合液15μl/孔分布于相应的96孔PCR板中。

4）加入cDNA：将逆转录反应所得的样本cDNA5μl/孔分别加入步骤3）96孔PCR板中，贴膜。

3.反应程序：

将96孔板放入ABI7300或7500荧光定量PCR仪，设定程序，进行qPCR反应。

反应程序：95℃，5min——（95℃，15s——60℃，1min）×40个循环——4℃，forever。

于每个循环的第二步即：60℃1min收集荧光信号。

实施例4产品的质量要求

1.试剂盒内miR-25标准品线性范围为：10⁶～10³拷贝/μl。

线性相关系数：︱r︱≥0.990。

2.准确度：准确度即阳性符合率，用企业质控盘中10份阳性参考品P1～P10（其中miR-25的浓度＞20000copy/微升）对miR-25进行测定，检测结果均应为阳性，即为10/10；对内对照进行测定，检测结果均应符合Ct＜26.5。

3.分析特异性：分析特异性即阴性符合率，用企业质控盘中10份阴性参考品N1～N10（其中miR-25的浓度≤20000copy/微升）对miR-25进行测定，检测结果均应为阴性，即为10/10；对内对照进行测定，检测结果均应符合Ct＜26.5。

4.检测限：本试剂盒miR-25的最低检测限应不高于10³拷贝/μl，检测miR-25的10³拷贝/μl（标准品S1）20次，至少17次检测结果高于最低检测限判读值。

5.试剂盒组份阳性质控品、阴性质控品和空白对照有效性要求

5.1用试剂盒检测经抽提后的阳性质控品应满足：10⁵拷贝/μl≤miR-25的相对拷贝数≤10⁶拷贝/μl、内对照Ct＜26.5；

5.2用试剂盒检测经抽提后的阴性质控品应满足：10³拷贝/μl≤miR-25的相对拷贝数≤10⁴拷贝/μl、内对照Ct＜26.5；

5.3用试剂盒检测空白对照应满足：miR-25的相对拷贝数＜103拷贝/μl、内对照的Ct≥26.5。

6.精密度：批内精密度的测定方法：用阳性质控品、阴性质控品各平行检测10次，miR-25检测应符合相对拷贝数对数值的变异系数（CV,%）≤5%，内对照检测应符合Ct变异系数（CV,%）≤5%。

7.经过对临床常见高浓度甘油三脂、胆红素、血红蛋白血清样本的系统研究，此类样本不影响本试剂盒的定性检测结果。

实施例5.检测结果的分析和判读

本实施例公开如何分析检测结果，并判读得出样本来源是否患病的结论；

1.结果分析条件设定：

在判定扩增曲线正常即呈现S型后，进行基线及阈值的设定。基线（baseline）设定，取auto模式，即3-15的荧光信号；阈值（threshold）设定，应以超过3-15循环内噪音线最高点为准。

2.质控标准：

按以下质控指标进行逐条判断，所有指标均合格后，质控合格。

1)标准曲线的相关系数︱r︱应≥0.990，否则实验无效。

2)阳性质控品应满足：105拷贝/μl≤miR-25的相对拷贝数≤10⁶拷贝/μl、内对照Ct＜26.5，否则实验无效。

3)阴性质控品应满足：103拷贝/μl≤miR-25的相对拷贝数≤10⁴拷贝/μl、内对照Ct＜26.5，否则实验无效。

4)空白对照应满足：miR-25的相对拷贝数≤10³拷贝/μl、内对照Ct≥26.5，否则实验无效。

5)样本内对照应满足：Ct＜26.5，否则实验无效。

3.根据标准品的Ct值及对应拷贝数绘制miR-25的标准曲线，将样本检测获得的Ct值代入标准曲线，计算样本miR-25的相对拷贝数

本试剂盒检测结果的解释方法为：

2)检测样本miR-25相对拷贝数≥50000拷贝/μl，可直接报告诊断结果为阳性。

3)检测样本20000拷贝/μl＜miR-25相对拷贝数＜50000拷贝/μl，可直接报告诊断结果为阳性，并建议对此份标本谨慎跟踪。

4)检测样本miR-25相对拷贝数≤20000拷贝/μl，可直接报告诊断结果为阴性。

实施例6.检测结果有效性的验证

本实施例将本发明与金标准（即病理学诊断为胰腺癌）对比。本发明通过检测血清中miR-25的含量，对胰腺癌进行辅助诊断。通过独立在三家医疗机构，进行1,063例临床样本的检测，灵敏度和特异度分别达到75.58%和93.03%，初步结果证明该发明对胰腺癌具有一定的辅助诊断价值。

1.样本数、样本类型及样本来源

1)样本数及样本类型

表6样本类型及每种类型样本数量汇总表

本实施例中采用的试验组样本分布均匀，不仅含有强阳性样本，而且含有大量弱阳及医学决定水平附近的样本。采用频数统计的方法可以直观展示样本的分布（图1）。

利用本发明试剂盒进行检测，由统计可见，试验组中大多数样本分布在参考值（20000拷贝/μl）附近，为弱阳性或临界阳性，少数样本为强阳性，具体比例如表7所示：

表7试验组中样本的分布比例

图2为对照组、试验组及干扰组中根据miR-25表达量的高低进行的频数统计。频数统计的结果可以直观看出样本分布情况和样本中弱阳性、医学决定水平附近及强阳性的样本比例。其中纵坐标代表检测值满足特定浓度区间的样本数量（单位：例），横坐标为浓度区间（单位：拷贝/μl）。

表8样本检测结果四格表统计表

灵敏度*（Sensitivity）：Se=P(T+|D+)=a/(a+c)=229/303=75.58%

特异度**（Specificity）：Sp=P(T-|D-)=d/(b+d)=707/760=93.03%

假阴性率（false-negative rate）：FNR=P(T-|D+)=c/(a+c)=74/303=24.42%

假阳性率（false-positive rate）：FPR=P(T+|D-)=b/(b+d)=53/760=6.97%

阳性预测值（positive prediCtive value）：PPV=P(D+|T+)=a/(a+b)=229/282=81.21%

阴性预测值（negative prediCtive value）：NPV=P(D-|T-)=d/(c+d)=707/781=90.52%

总符合率：(a+d)/N=(229+707)/1063=88.05%

约登指数（Youden Index）：YI=Se+Sp-1=75.58%+93.03%-1=0.69

*注：此处灵敏度仅指在当前样本中待考核试剂与金标准对比得出的灵敏度，非大样本情况下获得。

**注：此处特异度仅指在当前样本中待考核试剂与金标准对比得出的特异度，非大样本情况下获得。

a)灵敏度、特异度及总符合率的置信区间

灵敏度的95%置信区间：

特异度的95%置信区间：

总符合率的95%置信区间：

b)一致性检验（Kappa值分析）见表9：

表9一致性检验

a.不假定零假设。

Kappa值=0.701，表明被考核试剂和金标准一致性较好。

c)受试者工作特征（ROC）曲线分析（图3）：

表10曲线下的面积

检验结果变量:miR25

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积=0.5

曲线下面积（AUC）=0.921，95%置信区间为[0.901,0.941]，p值=0.000。

Claims

1.一种用于体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒，其特征在于包含人血清miR-25的逆转录引物，实时荧光定量PCR检测人血清miR-25的引物和探针，let7d、let7g或let7i作为内对照，针对内对照的逆转录引物，实时荧光定量PCR检测内对照的引物和探针，不同拷贝数的miR-25及内对照的非人源RNA溶液作为标准品，含有特定拷贝数的miR-25及内对照的人工合成品混合液作为阳性质控品，含有特定拷贝数的miR-25及内对照的人工合成品混合液作为阴性质控品，含有不含miR-25及内对照的RNA溶液作为空白对照；所述的阳性质控品、阴性质控品及空白对照中miR-25拷贝数范围如下：

表1

质控品参考范围阳性质控品 10⁵拷贝/μl≤miR-25的相对拷贝数≤10⁶拷贝/μl 阴性质控品 10³拷贝/μl≤miR-25的相对拷贝数≤10⁴拷贝/μl 空白对照 miR-25的相对拷贝数≤10³拷贝/μl

所述的实时荧光定量PCR检测人血清miR-25的探针选自以下三条探针中的任意一条或多条的组合:

CGGTCTGA GTGCTAA；

GGTCTGAGTGCTAAC；

GTCTGA GTGCTAACC。

2.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还含有逆转录酶、dNTPs、RT缓冲液、DEPC水、DNA聚合酶的缓冲液、MgCl₂、DNA聚合酶及参比荧光染料。