CN103074431A

CN103074431A - 检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN103074431A
Application number: CN2013100121961A
Authority: CN
Inventors: 王传新; 张欣; 王海燕
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2013-01-14
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2033-01-14
Also published as: CN103074431B

Abstract

本发明公开了一种检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，包括miR-128的逆转录引物和检测引物、U6的逆转录引物和检测引物、miRNA-16的逆转录引物和检测引物，如SEQ IDNO：1～9所示。一种检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，包括上述引物，以及RNA分离液。一种检测结直肠癌血清miR-128表达量的方法，步骤如下：（1）将待检测的血清标本与等体积RNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清液；（2）RT-PCR扩增；（3）制作标准曲线（4）计算：得出基因的校正起始拷贝数Q；将miR-128的Q值与内参基因U6、miR-16的Q值的几何平均数相比，得到miR-128的相对表达量。本发明的检测方法，为结直肠癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。

Description

检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒，以及检测结直肠癌血清miRNA-128表达量的方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，随着人民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。结直肠癌在早期阶段相对容易治愈，而到晚期阶段往往预后较差。据统计，无侵袭转移的结直肠患者的5年生存率可高达90%，有局部转移者的5年生存率有68%，而带有远处转移者的5年生存率则仅有11%。因此早期发现是改善结直肠癌预后的关键。CT和MRI等对于小于1cm的病灶无法早期诊断，不能用于结直肠癌的早期筛查和诊断。电子肠镜检查虽可早期诊断结直肠癌，但却是有创检查，一定程度上增加了病人的痛苦。肿瘤标志物以其简便、经济、非侵入性等特点日益受到关注。但是，目前临床上推荐用于结直肠癌诊断和预后判断的肿瘤标志物只有CEA，而CEA作为肿瘤标志物其特异性以及在结直肠癌诊断方面的应用也备受质疑。因此目前的结直肠癌肿瘤标志物远远不能满足临床需求，寻找理想的用于早期诊断结直肠癌肿瘤标志物具有重要的临床意义。

miRNAs是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的单链小分子RNAs，其通过对mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后对靶标基因的表达水平进行调节，参与细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。近年来，肿瘤相关miRNAs陆续在肿瘤患者的血清中被发现，为肿瘤的无创性早期诊断提供了一条新的途径。作为潜在的生物标志物，miRNAs具有蛋白标志物无法比拟的优势。miRNAs稳定性非常好，有研究显示体液样本中的miRNAs的稳定性源于其在血液中以核酸-蛋白复合物形式存在或包被于外排颗粒当中，使miRNAs耐受包括核糖核酸酶、反复冻融、pH变化、长期保存等情况，不易被降解。miR-128最早作为一种抑癌基因在神经母细胞瘤中被发现，其有128-1和128-2两种前体形式，基因分别定位在第2和3染色体。Zhu等研究发现，miR-128通过靶向癌基因Bmi-1和ABCC5导致对化疗的耐受，并且miR-128在乳腺癌组织中的表达与患者的预后呈明显负相关。最新研究发现，miR-128的上调表达可以抑制肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡、迁移和血管生成等，与人类多种肿瘤的发生、发展相关，提示对miR-128的表达检测可以成为肿瘤检测的指标之一。

血清miRNAs主要的检测方法有克隆测序、RNA印迹杂交、基因芯片、逆转录-聚合酶链反应，其中基于SYBR Green的逆转录-实时荧光定量PCR方法是分析血清中miRNAs最常用的方法，其具有操作简便、敏感性高、重复性好，目前已在核苷酸检测领域得到广泛应用。采用该方法通常情况下需先对血清样本中的miRNAs进行分离提取，然后再对分离得到的miRNAs进行逆转录、PCR扩增检测，但目前关于miRNAs的提取步骤繁琐、试剂昂贵，并且在提取过程中不可避免的造成miRNAs分子的丢失，给实验造成了误差。因此，如果建立一种对血清中miRNAs直接进行检测的方法，无疑会给研究带来方便。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种快速、简便、准确的检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒，以及检测结直肠癌血清miRNA-128表达量的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，包括：

（1）miR-128的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示：

miR-128-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG-3’；

miR-128-F：5’-GGCTCACAGTGAACCGGT-3’；

miR-128-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

（2）U6的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示：

U6-RT：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3’；

U6-F：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3’；

U6-R：5’-AAATATGGAACGCTTCACGAATT-3’；

（3）miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示：

miRNA-16-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’；

miRNA-16-F：5’-CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’；

miRNA-16-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

所述引物的序列是根据microRNA数据库（http://www.mirbase.org/）上报的核苷酸序列miR-128（MIMAT0000424）、miRNA-16（MIMAT0000069）以及GeneBank数据库中的U6序列（X07425.1）为模板自主设计的。

一种检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，包括上述引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下：吐温20：2.5%（体积百分数）；三羟甲基氨基甲烷：50mmol/L；乙二胺四乙酸：1mmol/L；牛血清白蛋白：1%（质量百分数）。

所述检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由1×Syber GreenⅠ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成，优选的，各物质的浓度如下：DNA聚合酶：100U/ml，dNTPs：0.2mM；氯化镁：6mM；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16.5mM；氯化钾：89.3mM。

上述检测结直肠癌血清miR-128的专用引物、检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒在定性检测血清miR-128或定量检测血清miR-128表达量中的应用。

一种检测结直肠癌血清miR-128表达量的方法，步骤如下：

（1）将待检测的血清标本与等体积RNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清液；

（2）RT-PCR扩增：向上述分离的上清液中加入SEQ ID NO：1所示的miR-128的逆转录引物，进行反转录得cDNA，取cDNA为模板，加入SEQ ID NO：2、3所示的引物以及PCR反应液，进行PCR扩增，检测样本阈值Cq（test sample）；同时，从人结直肠癌细胞株HT29细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心）中提取miRNAs，逆转录成cDNA，10倍梯度稀释，作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参基因U6、miR-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法相同；

（3）制作标准曲线：上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=10^（-1/S）-1，计算扩增效率E；

（4）计算：选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq（T）和校对样本阈值Cq（C），根据公式Q=（E+1）^-△Cq，△Cq=[Cq（T）-Cq（C）]，得出基因的校正起始拷贝数Q；将miR-128的Q值与内参基因U6、miR-16的Q值的几何平均数相比，得到miR-128的相对表达量。

本发明所建立的结直肠癌血清miR-128检测方法，为结直肠癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。

本发明利用RNA分离液对血清样本进行处理，得到的混合液直接用于逆转录反应，省略了对需求样本RNA的提取过程，不仅简化了操作步骤，降低了检测成本，还避免了传统方法提取RNA降解的问题。

本发明根据公式E=10^（-1/S）-1，计算扩增效率（E），根据公式Q=（E+1）^-△Cq计算miR-128基因相对miR-191、miR-16的表达量，避免了传统2^-△△Cq法必须要求PCR扩增效率为100%的限制，使结果分析更加可靠。

附图说明

图1为U6、miR-16和miR-128的标准曲线，其中，A：U6的标准曲线；B：miR-16的标准曲线；C：miR-128的标准曲线。

图2为血清miR-128在38例结直肠癌患者和20例健康对照者中的相对表达水平。

图3为血浆血清miR-128检测对结直肠癌诊断的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

（1）试剂盒的组成及配制：

所述引物的序列是根据microRNA数据库（http://www.mirbase.org/）上报的核苷酸序列miR-128（MIMAT0000424）、miRNA-16（MIMAT0000069）以及GeneBank数据库中的U6序列（X07425.1）为模板自主设计的，其引物序列、Tm值见表1。

表1引物序列、Tm值

所述专用试剂盒还包括RNA分离液，RNA分离液由2.5%吐温20、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、1mmol/L乙二胺四乙酸和1%牛血清白蛋白组成。

所述试剂盒还包括PCR反应液：由1×Syber Green Ⅰ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁组成。

所述DNA聚合酶在PCR反应液中的终浓度为100U/ml。

所述dNTPs在PCR反应液中的终浓度为0.2mM。

所述氯化镁在PCR反应液中的终浓度为6mM。

所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在PCR反应液中的终浓度为16.5mM。

所述氯化钾在PCR反应液中的终浓度为89.3mM。

（2）标本采集

采集38例结直肠患者和20例健康对照者血清3ml，1600g离心5分钟，进一步16000g离心10分钟，分离上清，保存于-80℃待测。所有样本均在取得受试者同意的情况下进行。将分离上清液3μl与RNA分离液3μl混合，16000g离心10分钟，分离上清，将上清1:10稀释用于逆转录模板。

（3）RT-PCR扩增

采用Takara公司的One Step

miRNA cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒、逆转录引物对上述mRNA进行反转录成cDNA，取5μl cDNA为模板，进行PCR反应。

PCR反应体系如下：

模板DNA：5ul；

PCR反应液：12.5μl；

上游引物（10μM）：1μl；

下游引物（10μM）：1μl；

无菌水：5.5μl；

反应条件为：37℃→20分钟，95℃→10分钟；（95℃15秒，60℃1分钟）→40个循环。

内参基因U6、miR-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法同上；

（4）标准曲线制作

将从人结直肠癌H29细胞中提取的miRNA，逆转录成cDNA，然后10倍梯度稀释成5个浓度，作为标准品，同待测样本一同进行RT-PCR扩增，制作标准曲线。

（5）结果判断

①拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=10^（-1/S）-1，计算扩增效率E；

②选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq（T）和校对样本阈值Cq（C），根据公式Q=（E+1）^-△Cq，△Cq=[Cq（T）-Cq（C）]，得出基因的校正起始拷贝数Q；将miR-128的Q值与内参基因U6、miR-16的Q值的几何平均数相比，得到miR-128的相对表达量。

（7）检测结果

①标准曲线见图1。

②38例结直肠癌患者和20例健康对照者血清miR-128检测结果见图2。结直肠癌患者和健康对照者血清miR-128中位水平分别为-1.779（-3.019～-1.032）和-0.422（-1.422～1.00443）。结直肠癌患者血清miR-128水平明显低于于健康对照者，差异具有统计学意义（P<0.05）。

③结直肠癌血清miR-128检测方法对结直肠癌的诊断价值分析

以38例结直肠癌患者作为结直肠癌组，20例健康对照者作为非结直肠癌组，采用SPSS13.0统计学软件中的受试者工作曲线分析，得出血清miR-128检测结直肠癌的临界值为-0.893，敏感性为86.84%，特异性为80.00%，诊断效能为-0.878（见图3），说明血清miR-128对结直肠癌具有较大的诊断价值。

Claims

1.一种检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，其特征在于：包括：

miR-128-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG-3’；

miR-128-F：5’-GGCTCACAGTGAACCGGT-3’；

miR-128-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

U6-RT：GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC；

U6-F：GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC；

U6-R：AAATATGGAACGCTTCACGAATT；

miRNA-16-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’；

miRNA-16-F：5’-CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’；

miRNA-16-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

2.一种检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下：吐温20：2.5%；三羟甲基氨基甲烷：50mmol/L；乙二胺四乙酸：1mmol/L；牛血清白蛋白：1%。

3.根据权利要求2所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，其特征在于：所述检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由Syber Green Ⅰ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。

4.根据权利要求3所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，其特征在于：所述反应液中各物质的浓度如下：DNA聚合酶：100U/ml，dNTPs：0.2mM；氯化镁：6mM；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16.5mM；氯化钾：89.3mM。

5.权利要求1所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用引物在定性检测血清miR-128或定量检测血清miR-128表达量中的应用。

6.权利要求2或3或4所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒在定性检测血清miR-128或定量检测血清miR-128表达量中的应用。

7.一种检测结直肠癌血清miR-128表达量的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）将待检测的血清标本与等体积RNA分离液混合，离心，分离上清液；

（2）RT-PCR扩增：向上述分离的上清液中加入SEQ ID NO：1所示的miR-128的逆转录引物，进行反转录得cDNA，取cDNA为模板，加入SEQ ID NO：2、3所示的引物以及PCR反应液，进行PCR扩增，检测样本阈值Cq；同时，从人结直肠癌细胞株HT29细胞中提取miRNAs，逆转录成cDNA，10倍梯度稀释，作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参基因U6、miR-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法相同；