CN106868146B - 用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒、方法及应用 - Google Patents

用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒、方法及应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明首次通过试验证实SEQ ID NO:1所示miRNA序列与长春新碱的耐药性相关，miRNA在长春新碱耐药细胞中高表达、敏感细胞中低表达，因此可以作为肿瘤细胞长春新碱耐药的标志物。根据该标志物设计的引物、试剂盒及检测方法可用于临床判断肿瘤细胞对长春新碱的耐药性，进一步指导临床用药并实现精准治疗，提高疗效，降低副作用。本发明为设计肿瘤细胞长春新碱耐药药物提供了新的靶点，可用于直接开发拮抗肿瘤细胞长春新碱耐药性的药物。

Description

用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、 试剂盒、方法及应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物，同时还涉及包含该引物的试剂盒和检测方法，以及该miRNA在制备拮抗肿瘤耐长春新碱的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病及多发病，而结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤之一，在发达国家高居癌症发病率第1位、死亡率第2位，高居我国癌症死亡率第4位，同时其发病年龄趋向老龄化。近年的流行病学资料显示，全世界CRC新发病例数占全部恶性肿瘤新发病例数的9.4％。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变，CRC的发病率还将呈不断上升的趋势。目前CRC的治疗是以手术为主，辅以放、化疗治疗，其中药物治疗包括化学药物治疗和靶向药物治疗。但是，由于肿瘤细胞群体具有内在的、高度有序发展的抗药能力，无论是细胞毒类药物还是靶向药物，均未能克服耐药问题。肿瘤细胞一旦产生耐药性，化疗药物就不能发挥完全的抗癌作用杀死癌细胞，即使大多数的肿瘤被杀死，而这一小部分具有抗药性的癌细胞依然会继续生长，造成癌症复发。因此肿瘤的耐药性是影响化疗疗效和肿瘤根治的主要原因，肿瘤耐药是肿瘤治疗急需解决的关键问题之一。
微小RNA(microRNA，miRNA)是长度约22个核苷酸(nucleotide，nt)的单链小RNA分子，其中21nt～23nt长度的miRNA占大多数，约为84％，属于非编码RNA(non-protein-coding RNAs，ncRNAs)的一种。miRNA通过在转录后调控基因表达水平而参与调控生命活动，包括细胞增殖、凋亡、脂肪代谢、神经元发育、激素分泌、肿瘤血管生成、干细胞分化、肿瘤细胞浸润及转移等多种生理和病理过程。最近的研究表明，miRNA对多基因表达的调控具有高效性和特异性，对靶基因的异常调控可能构成肿瘤耐药机制，是肿瘤耐药复杂性调控的重要构成部分。近些年来，microRNAs不仅参与肿瘤的发生和发展，而且在化疗多药耐药性的不同机制和信号通路中也发挥了至关重要的作用。它们可能成为逆转肿瘤化疗药物耐药性、改善化学治疗效果、提高患者生存率的一种有效基因治疗策略。
长春新碱(vincristine，VCR)是一种长春花生物碱，被广泛用于急性白血病和实体瘤的治疗。但是在使用过程中肿瘤细胞会逐渐产生对VCR的耐药性。
研究表明，miRNA与肿瘤细胞的耐药性密切相关，在MCF-7/VP-16乳腺癌耐药细胞中miR-326表达下降，而在多药耐药(包括依托泊苷、顺铂、阿霉素等)的小细胞肺癌中miR-134表达下降。寻找耐药相关的miRNA作为长春新碱耐药性诊断的标志物，并通过将miRNA模拟物或抑制剂与长春新碱联合用药来逆转肿瘤细胞的耐药性，对肿瘤的个性化诊断和治疗具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物。
其次，本发明提供一种包含上述引物的试剂盒。
次之，本发明提供一种用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的方法。
再次，本发明提供一种上述引物、试剂盒在判断肿瘤细胞对长春新碱耐药性或者筛选拮抗肿瘤细胞对长春新碱耐药性药物中的应用。
最后，本发明提供一种miRNA在制备拮抗肿瘤细胞耐药性药物中的应用。
同时，本发明提供一种用于治疗结直肠癌的药物组合物。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物，根据该miRNA序列(如SEQ ID NO:1所示)设计合成，包括逆转录引物和荧光定量PCR引物。
所述逆转录引物如SEQ ID NO:2、3或4所示。
所述荧光定量PCR引物的正向引物如SEQ ID NO:5或6所示，反向引物如SEQ IDNO:7所示。
用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的试剂盒，除包含上述引物外，还可以包含通用的miRNA逆转录试剂和荧光定量聚合酶链反应试剂。
所述miRNA逆转录试剂包括逆转录酶、dNTPmix、buffer缓冲液等。
所述荧光定量聚合酶链反应试剂包括荧光染料、Taq DNA聚合酶、dNTPmix和buffer缓冲液等。
所述试剂盒还可以包含DNA消化试剂以及内参的逆转录引物和荧光定量PCR引物。
所述DNA消化试剂包括DNase I(RNase-free)、EDPC等。
所述内参可采用U6snRNA管家基因，内参的逆转录引物如SEQ ID NO:8所示，荧光定量PCR的正、反向引物分别如SEQ ID NO:9、10所示。
用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的方法，包括以下步骤：
1)以结直肠癌细胞的总RNA为模板，逆转录得到cDNA；
2)以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，检测miRNA的表达量；
步骤1)中逆转录的引物包括miRNA的逆转录引物和内参的逆转录引物；
步骤2)中荧光定量PCR扩增的引物包括miRNA的荧光定量PCR引物和内参的荧光定量PCR引物；
miRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
步骤1)中逆转录的反应体系为：5×RT buffer(250mM Tris-HCl(pH 8.3)、375mMKCl、15mM MgCl2、50mM DTT)4μL，200U/μL逆转录酶1μL，10μM miRNA的逆转录引物0.5μL，dNTP(2.5mM each)2.5μL，10μM内参的逆转录引物0.5μL，1.0μg/μL RNA 1μL，无RNA酶水补足至20μL。
步骤1)中逆转录的反应条件为：16℃30min，42℃30min，85℃灭活逆转录酶5min。反应结束后将产物放在冰上待用或-20℃保存。
步骤2)中荧光定量PCR扩增的反应体系为：dNTP(2.5mM each)2.5μL，2×SYBRGreen PCR Master Mix(购自ABI公司)10μL，1.0μg/μL cDNA1μL，10μM miRNA的荧光定量PCR引物(正、反向引物各0.5μL)1μL，10μM内参的荧光定量PCR引物(正、反向引物各0.5μL)1μL，双蒸水补足至20μL。
步骤2)中荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃变性5min，40个循环(95℃15s，60℃15s，72℃20s，78℃20s，95℃15s)。
具体的，步骤1)中miRNA的逆转录引物如SEQ ID NO:2、3或4所示。步骤2)中miRNA的荧光定量PCR引物的正向引物如SEQ ID NO:5或6所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示。
步骤2)中检测miRNA的表达量以U6snRNA管家基因作为内参，采用相对定量法。
所述内参U6snRNA的逆转录引物如SEQ ID NO:8所示。
所述内参U6snRNA的荧光定量PCR的正、反向引物分别如SEQ ID NO:9、10所示。
上述用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒在判断结直肠癌细胞对长春新碱耐药性方面的应用。
或者上述引物、试剂盒在筛选拮抗肿瘤细胞对长春新碱耐药性药物中的应用。
miRNA在制备拮抗肿瘤细胞耐长春新碱的药物中的应用，或者在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，miRNA序列如SEQ ID NO:1所示。具体为：根据miRNA序列设计合成miRNA抑制物，例如采用miRNA的反义寡核苷酸序列作为抑制物(如SEQ ID NO:11所示)，以治疗有效量的miRNA抑制物为药效成分制备拮抗肿瘤细胞耐长春新碱的药物，或者以治疗有效量的miRNA抑制物和治疗有效量的长春新碱为药效成分制备治疗结直肠癌的药物。
用于拮抗肿瘤细胞耐长春新碱的药物组合物，除包含治疗有效量的miRNA抑制物外，还可以包含常规的药用辅料。
用于治疗结直肠癌的药物组合物，除包含治疗有效量的miRNA抑制物和治疗有效量的长春新碱外，还可以包含常规的药用辅料。
本发明的有益效果：
本发明首次通过试验证实SEQ ID NO:1所示miRNA序列与长春新碱的耐药性相关，miRNA在长春新碱耐药细胞中高表达、敏感细胞中低表达，因此可以作为肿瘤细胞长春新碱耐药的标志物。根据该标志物设计的引物、试剂盒及检测方法可用于临床判断肿瘤细胞对长春新碱的耐药性，进一步指导临床用药并实现精准治疗，提高疗效，降低副作用。本发明为设计肿瘤细胞长春新碱耐药药物提供了新的靶点，可用于直接开发拮抗肿瘤细胞长春新碱耐药性的药物。又由于miRNA抑制物具有降低肿瘤细胞耐药的生物学功能，将其与治疗有效量的长春新碱联合使用，可以提高癌症的化疗效果，为有效逆转肿瘤细胞长春新碱耐药以及提高肿瘤细胞的临床化疗效果提供有效途径。
附图说明
图1为结肠癌细胞原代消化后在VCR下的细胞存活率；
图2为结肠癌细胞HCT-8及HCT-8/VCR在不同VCR浓度下的相对存活率；
图3为HCT-8、HCT-8/VCR细胞中miRNA的表达水平；
图4为HCT-8细胞转染miRNA模拟物(minics)后对长春新碱的耐药能力；
图5为HCT-8/VCR细胞转染miRNA抑制物(inhibitor)后对长春新碱的耐药能力。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物，根据该miRNA序列(如SEQ ID NO:1所示)设计合成，包括逆转录引物和荧光定量PCR引物，逆转录引物如SEQID NO:2、3或4所示，荧光定量PCR引物的正向引物如SEQ ID NO:5或6所示，反向引物如SEQID NO:7所示。
实施例2
用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的试剂盒，包含实施例1中引物、miRNA逆转录试剂和荧光定量聚合酶链反应试剂。
实施例3
用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的试剂盒，包含实施例1中引物、内参U6snRNA的逆转录引物和荧光定量PCR引物，以及DNA消化试剂(DNase I(RNase-free)、EDPC等)、miRNA逆转录试剂(逆转录酶、RT buffer、dNTPmix等)和荧光定量聚合酶链反应试剂(dNTPmix、SYBR Green PCR Master Mix等)。
内参U6snRNA的逆转录引物如SEQ ID NO:8所示，荧光定量PCR的正、反向引物分别如SEQ ID NO:9、10所示。
实施例4
检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的方法，包括以下步骤：
1)引物设计
根据miRNA序列设计合成如下引物：
miRNA序列：5′-CACGUGAAACCCUGUCUG-3′；
逆转录引物：
逆转录引物1：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACAGG-3′；
逆转录引物2：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACAG-3′；
逆转录引物3：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACA-3′；
荧光定量PCR引物：
正向引物1：5′-ACACTCCAGCTGGGCACGTGAAACCCT-3′；
正向引物2：5′-ACACTCCAGCTGGGCACGTGAAACCC-3′；
反向引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′。
根据NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中U6snRNA管家基因(Genbank:NR_004394.1)设计如下引物：
U6snRNA的逆转录引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；
U6snRNA的荧光定量PCR引物：
U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；
U6反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。
2)结肠癌组织细胞的制备
选取新乡某医院收治的19例结肠癌患者的结肠癌组织，病理分型确定，未经任何化疗；选取的结肠癌组织应尽可能避免纤维结缔组织或坏死的瘤组织，并立刻放到液氮中；在超净工作台上去除纤维结缔组织或坏死的瘤组织，用10mL PBS清洗组织3遍，吸弃上清液，将结肠癌组织切成1.5mm3小块(1～2mm3均可)，用10mL PBS轻悬组织块，吸弃上清液；加入10mL预温到37℃的0.1％胶原酶溶液，37℃消化45min(30～60min均可)，直至完全消化；终止消化，用100目筛网过滤，滤液500g离心9min(8～10min均可)，弃上清；用10mL PBS轻轻吹打，悬浮沉淀，滤液500g离心9min(8～10min均可)，弃上清；重复一次；用2.5mL RMPI-1640培养基轻轻吹打(2～3mL均可)，悬起沉淀，调整细胞浓度5×105～1×106/mL。
3)MTT琼脂法体外药敏实验
将5mL预温到37℃的2×RMPI-1640培养基与5mL 1.5％高压灭菌后冷却到50℃的琼脂混匀，混匀后加入到96孔板中(每孔100μL)，室温静置30min备用；按照100μL细胞悬液加入150ng/mL浓度的长春新碱，接种于96孔板中，每种药物浓度三复孔，设立背景对照组(不含细胞的等体积培养液)，空白对照组加入不含VCR的培养液；37℃、5％CO2培养72小时后，MTT测细胞活性；96孔板中，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h；每孔加入100μL含10％SDS的PBS，60℃孵育30min；560nm波长处测定OD值。计算背景组平均值，并以此平均值为零点进行调零，计算各组细胞的存活率。
细胞存活率/％＝(试验组平均OD值-背景组平均OD值)/(空白对照组平均OD值-背景组平均OD值)×100％。
以150ng/mL浓度的长春新碱处理19例原代培养的结肠癌细胞，按照存活率小于40％作为敏感，大于70％作为耐药的判断指标，介于40～70％的不做进一步分析；结果表明，在19例原代培养的结肠癌细胞中，有13例判断为敏感或耐药的样本，其中8例样本是对VCR耐药的，5例是敏感的(见图1)。
4)提取RNA
选取13例上述敏感或耐药的结肠癌原代细胞(5～10×106个/mL，见表1)，离心，弃上清；用移液管加入1mL提前预冷的Trizol试剂，反复吹打裂解细胞至均一透亮；将匀浆样品在冰上放置5分钟，保证细胞充分裂解；加入200μL氯仿，剧烈涡旋30秒后，室温静置5分钟；4℃、12000×g离心15分钟；小心转移上清至1.5mL RNase-free离心管中，加入等体积异丙醇混匀；4℃、12000×g离心15分钟，弃上清；加入750μL 75％乙醇，4℃、12000×g离心5分钟，弃上清；乙醇风干后，加入45μL DEPC处理水，室温静置2分钟溶解RNA；变性电泳检测后测定浓度为1.8μg/μL，待用(或-80℃保存)。
提取过程在冰上操作，以防止RNA降解；全程佩戴一次性手套；采用无RNA酶的非一次性玻璃器皿或塑料器皿，玻璃器皿可在150℃烘箱中烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH溶液中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
5)DNase I处理
配制10μL DNase I处理体系：RNA(1.8μg/μL)1μg，10×Buffer(400mM Tris-HCl(pH7.5)、80mM MgCl2、50mM DTT)1μL，70U/μL(60～80U/μL均可)DNase I(RNase-free)1μL，0.1％DEPC处理水补足至10μL。
处理条件为：37℃水浴30min，65℃水浴10min灭活DNase I。
6)逆转录
配制20μL逆转录反应体系：5×RT buffer(250mM Tris-HCl(pH 8.3)、375mM KCl、15mM MgCl2、50mM DTT)4μL，200U/μL逆转录酶1μL，10μM miRNA的逆转录引物1 0.5μL，10μMU6snRNA的逆转录引物0.5μL，dNTPmix(2.5mM each)2.5μL，RNA(1.0μg/μL)1μL，无RNA酶水补足至20μL。
反应条件为：16℃30min，42℃30min，85℃灭活逆转录酶5min；反应结束后将其放在冰上待用或-20℃保存。
7)Real-time PCR
配制20μL荧光定量PCR反应体系：2×SYBR Green PCR Master Mix(购自ABI公司)10μL，1.0μg/μL cDNA 1μL，10μM miRNA的正向引物1和反向引物各0.5μL，dNTPmix(2.5mMeach)2.5μL，10μM U6snRNA的正、反向引物各0.5μL，双蒸水补足至20μL。
反应条件为：95℃变性5min，40个循环(95℃15s，60℃15s，72℃20s，78℃20s，95℃15s)。
8)miRNA表达量统计分析
采用相对定量法，计算基因的表达量F，公式如下：
F＝2—△Δct；
式中，△Δct＝(待测样本中目的基因的ct的平均值-待测样本中管家基因的ct的平均值)-(对照样本中目的基因的ct的平均值-对照样本中管家基因的ct的平均值)。选取上述2号对VCR敏感的样本miRNA的表达水平作为对照，设置为1，其他各样板相对2号样本的比值作为miRNA表达水平。
结果表明，miRNA在VCR耐药的细胞中的表达上调，表达量比敏感细胞样本明显上调(见下表1)。
表1原代结肠癌细胞耐药性及miRNA的相对表达水平
样本编号 耐药性 miRNA表达水平
1 耐药 2.35
2 敏感 1.0
3 耐药 2.19
6 耐药 2.86
7 敏感 0.90
8 敏感 0.87
10 耐药 3.12
11 敏感 0.91
13 敏感 0.93
14 耐药 2.78
15 耐药 2.73
16 耐药 3.02
18 耐药 2.64
实施例5
miRNA在制备拮抗肿瘤细胞耐长春新碱的药物中的应用，具体为：根据miRNA序列(如SEQ ID NO:1所示)设计合成miRNA的反义寡核苷酸序列作为抑制物(由吉满生物科技上海有限公司合成，序列如SEQ ID NO:11所示)，以治疗有效量的miRNA抑制物和药用辅料为原料制备片剂。
miRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，以治疗有效量的miRNA抑制物(同上)、治疗有效量的长春新碱和药用辅料为原料制备片剂。
实施例6
用于拮抗肿瘤细胞耐长春新碱的药物组合物，由治疗有效量的miRNA抑制物和药用辅料组成。
用于治疗结直肠癌的药物组合物，由治疗有效量的miRNA抑制物、治疗有效量的长春新碱和药用辅料组成。
试验例1
长春新碱在结肠癌的治疗过程中发挥着重要作用，但出现的耐药现象是限制其临床疗效的主要原因。明确SEQ ID NO:1所示miRNA在结肠癌细胞长春新碱耐药中的生物学功能和机制，能够为有效提高结肠癌的临床疗效提供新的生物靶标。
1、miRNA在长春新碱耐药细胞和敏感细胞中的表达
1)构建长春新碱耐药细胞系HCT-8/VCR
采用逐步增加VCR浓度的方法建立结肠癌细胞系HCT-8/VCR：将敏感细胞HCT-8培养于含VCR的培养液中，初始浓度为5ng/mL，此后逐渐增加药物浓度，分别为10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL和4000ng/mL；在每个浓度获得耐药性后，以极限稀释法克隆生长良好的细胞，然后进入下一个浓度的培养，最后HCT-8在2000ng/mL的VCR中持续培养20代以上，于试验前1周停用VCR。
2)细胞对VCR的药敏性测试(MTT法)
分别取对数生长期的耐药株和敏感株细胞，通过培养基稀释法用计数板计数细胞密度为1×105个/mL；以1×104个/孔接种96孔细胞培养板，设立背景对照组(不含细胞的等体积培养液)，空白对照组加入不含VCR的培养液，试验组分别加入含10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL的长春新碱培养液，100μl/孔。
各组细胞于37℃下温育培养48h，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续放入37℃细胞培养箱中温育4h；然后用移液器吸弃培养上清液，每孔加入DMSO 150μL，充分振荡后，将培养板放入酶联免疫检测仪中，设定检测波长为570nm，读取各孔的吸光度值(OD)。计算背景组平均值，并以此平均值为零点进行调零，计算各组细胞的存活率，然后计算50％细胞存活时的药物浓度，即半数抑制浓度IC50。
细胞存活率/％＝(试验组平均OD值-背景组平均OD值)/(空白对照组平均OD值-背景组平均OD值)×100％。
使用不同浓度的VCR处理结肠癌细胞HCT-8及HCT-8/VCR，抑制率见图2。HCT-8细胞和HCT-8/VCR细胞的半抑制浓度IC50分别为143.739和1982.194。
3)检测HCT-8、HCT-8/VCR细胞中miRNA的表达量
操作同实施例4中步骤4)～8)；
结果显示，与HCT-8细胞相比，miRNA在HCT-8/VCR细胞中的表达上调，表达量比HCT-8细胞上调1.925倍，差异具有统计学意义(P<0.01)，如图3所示。
2、细胞增殖-毒性试验检测HCT-8细胞转染miRNA模拟物后的耐药特性
将生长活跃的HCT-8细胞悬液于转染前一天接种到12孔板中；第二天，转染miRNA模拟物(25nM，由吉满生物科技上海有限公司合成)，8小时后消化细胞，并分盘到96孔板中；加入长春新碱(终浓度分别为10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和3000ng/mL)；48小时后，取出96孔板，向每孔加入10μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD值读数)；将培养板在培养箱内孵育3小时，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 1％(w/v)SDS溶液，并在室温条件下避光保存，24小时内测定则吸光度不发生变化。
结果显示，转染miRNA模拟物的HCT-8的细胞对长春新碱的耐药能力显著高于未转染组(见图4)，说明miRNA能够提高结肠癌细胞对长春新碱的耐药能力。
3、细胞增殖-毒性试验检测HCT-8/VCR细胞转染miRNA抑制物后的耐药特性
将生长活跃的HCT-8/VCR细胞悬液于转染前一天接种到12孔板中；第二天，转染miRNA抑制物(25nM，由吉满生物科技上海有限公司合成)，8小时后消化细胞，并分盘到96孔板中；加入长春新碱(终浓度分别为10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和3000ng/mL)；48小时后取出96孔板，向每孔加入10μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD值读数)；将培养板在培养箱内孵育3小时，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 1％(w/v)SDS溶液，并在室温条件下避光保存，24小时内测定则吸光度不发生变化。
结果显示，相对于对照组未转染细胞，转染miRNA抑制物的HCT-8/VCR细胞对长春新碱的耐药能力显著降低(见图5)，说明miRNA抑制物能够在一定程度上逆转结肠癌细胞对长春新碱的耐药能力，也进一步证明miRNA与结肠癌细胞对长春新碱的耐药能力密切相关。
试验例2
选取某医院2013～2015年62例结肠癌病例，提取石蜡标本中的miRNA，采用实施例4中方法检测SEQ ID NO:1所示miRNA的表达量。结果显示，该方法能够特异、有效地扩增出miRNA序列。统计分析结果表明，35例病例标本中miRNA表达量平均为8.862±1.530，其余27例标本中miRNA表达量平均为4.138±0.782，表达量相差2.14倍(P<0.01)。结合临床治疗效果分析，miRNA表达量高的样本采用长春新碱治疗结肠癌的效果较差，而表达量低的样本采用长春新碱治疗的效果较好，这也进一步证实了miRNA的表达与结肠癌对长春新碱的耐药性有关。
上述实施例及试验例中所用细胞系、试剂等均为市售商品。HCT-8细胞购自中国科学院上海细胞库。
本发明提供的试剂盒及检测方法可用于临床判断结肠癌对长春新碱的耐药性，进一步指导临床用药并实现精准治疗，提高疗效，降低副作用。
需要说明的是，说明书中所列实施例仅用于理解发明技术方案，不具有任何限制作用。除了上述实施例外，还可以有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的任何技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 新乡医学院
<120> 用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒、方法及应用
<170> PatentIn version 3.5
<211> 18
<212> RNA
<213> 序列
<221> miRNA序列
<222> (1)..(18)
<400> 1
CACGUGAAAC CCUGUCUG 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 序列
<221> 逆转录引物1
<222> (1)..(44)
<400> 2
CTCAACTGGT GTCGTGGAGT CGGCAATTCA GTTGAGCAGA CAGG 44
<211> 43
<212> DNA
<213> 序列
<221> 逆转录引物2
<222> (1)..(43)
<400> 3
CTCAACTGGT GTCGTGGAGT CGGCAATTCA GTTGAGCAGA CAG 43
<211> 42
<212> DNA
<213> 序列
<221> 逆转录引物3
<222> (1)..(42)
<400> 4
CTCAACTGGT GTCGTGGAGT CGGCAATTCA GTTGAGCAGA CA 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 序列
<221> 荧光定量PCR的正向引物1
<222> (1)..(27)
<400> 5
ACACTCCAGC TGGGCACGTG AAACCCT 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 序列
<221> 荧光定量PCR的正向引物2
<222> (1)..(26)
<400> 6
ACACTCCAGC TGGGCACGTG AAACCC 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> 荧光定量PCR的反向引物
<222> (1)..(20)
<400> 7
CTCAACTGGT GTCGTGGAGT 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 序列
<221> 内参U6 snRNA的逆转录引物
<222> (1)..(23)
<400> 8
CGCTTCACGA ATTTGCGTGT CAT 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> 内参U6 snRNA的正向引物
<222> (1)..(20)
<400> 9
CTCGCTTCGG CAGCACA 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> 内参U6 snRNA的反向引物
<222> (1)..(20)
<400> 10
AACGCTTCAC GAATTTGCGT 20
<211> 18
<212> RNA
<213> 序列
<221> miRNA抑制物序列
<222> (1)..(18)
<400> 11
CAGACAGGGU UUCACGUG 18

Claims (6)

1.用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物，其特征在于：根据SEQID NO:1所示的miRNA序列设计合成，包括逆转录引物和荧光定量PCR引物。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述逆转录引物如SEQ ID NO:2、3或4所示；所述荧光定量PCR引物的正向引物如SEQ ID NO:5或6所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示。
3.包含如权利要求1或2所述引物的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含内参的逆转录引物和荧光定量PCR引物，以及miRNA逆转录试剂和荧光定量聚合酶链反应试剂。
5.如SEQ ID NO:1所示miRNA序列在制备拮抗肿瘤细胞耐长春新碱的药物中的应用，或者在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
6.药物组合物，其特征在于：至少包含治疗有效量的miRNA抑制物；miRNA抑制物根据SEQ ID NO:1所示miRNA序列设计合成。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110964816A (zh) * 2019-11-20 2020-04-07 深圳市鲲鹏未来科技有限公司 包含血液稳定性纳米颗粒的溶液、其制备方法及miRNA标志物的检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074431A (zh) * 2013-01-14 2013-05-01 山东大学齐鲁医院 检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒及方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014515024A (ja) * 2011-04-12 2014-06-26 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター， インコーポレイテッド マイクロｒｎａ阻害剤および疾患におけるその使用
WO2013048345A1 (en) * 2011-09-28 2013-04-04 Agency For Science, Technology And Research Methods and pharmaceutical compositions for treating cancer
CN104056277B (zh) * 2013-03-21 2019-07-05 中国人民解放军第二军医大学 Mlh1基因或其表达产物在dkk4高表达的结直肠癌中的应用
CN104117071B (zh) * 2013-04-27 2017-06-13 中国科学院上海药物研究所 microRNA‑491‑3p在拮抗p‑糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药中的应用
WO2014193999A2 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Caris Science, Inc. Biomarker methods and compositions
US10351913B2 (en) * 2013-10-07 2019-07-16 Georgetown University Compositions and methods for identification of relapse risk and treatment in patients with colorectal cancer
EP3325662B1 (en) * 2015-07-17 2023-08-30 Pacylex Pharmaceuticals Inc. Epigenetic silencing of nmt2

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074431A (zh) * 2013-01-14 2013-05-01 山东大学齐鲁医院 检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI Reference Sequence: NR_004394.1;Lamba V等;《NCBI-GenBank》;20151224;1-4 *
微小RNA一125b在结肠癌组织中的表达及其与肿瘤细胞耐药性的关系;尚闯等;《中华实验外科杂志》;20160228;380-384 *
结肠癌细胞VCR耐药株的建立及相关miRNA筛选;张小燕;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20160115;全文 *
胃癌SGC7901细胞长春新碱耐药性相关miRNA的初步分析;陶一明等;《中国现代医学杂志》;20130630;45-50 *

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