CN104117071B - microRNA‑491‑3p在拮抗p‑糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药中的应用 - Google Patents

microRNA‑491‑3p在拮抗p‑糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了microRNA‑491‑3p(miR‑491‑3p)在制备用于拮抗p‑糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的用途以及一种用于治疗肿瘤的药物组合物。本发明中，microRNA‑491‑3p能够下调MDR1蛋白表达，特别是，能够增加化疗药物的细胞毒性。

Description

microRNA-491-3p在拮抗p-糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药中 的应用
技术领域
本发明涉及microRNA在拮抗肿瘤耐药中的用途，更具体而言，涉及microRNA-491-3p(miR-491-3p)在制备用于拮抗p-糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的用途。此外，本发明还涉及一种用于治疗肿瘤的药物组合物以及一种预防和/或治疗p-糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的方法。
背景技术
化疗是目前临床上治疗恶性肿瘤的最重要手段之一。然而，由于肿瘤细胞常常会对化疗药物产生耐药而导致患者对治疗不再敏感，最终导致化疗失败甚至疾病复发。近年来，科学家们针对肿瘤耐药机制开展了大量的研究工作，研究结果表明，肿瘤耐药与药物摄取减少，排出增多，活化减少，失活增加，DNA损伤修复增加，DNA甲基化以及信号传导通路异常等多种机制相关。
在肿瘤耐药机制中，外排性药物转运体是抗肿瘤药物在肿瘤细胞中排出增多的主要因素。这一类药物转运体主要包括以多药耐药基因（Multidrug resistance gene1,MDR1），又名p-糖蛋白（p-glycoprotein,p-gp），为代表的ABC药物转运体。ABC药物转运体（ATP binding cassette,ABC）是一组ATP能量依赖性跨膜转运蛋白，位于细胞膜以及内质网、过氧化物酶体、线粒体等细胞器膜上，介导内源性物质、药物以及环境毒物的外向排出。ABC药物转运体是一个超家族蛋白，现已发现48个异构成员，按照基因同源性被归类为A、B、C、D、E、F和G7个家族。其它比较重要的ABC药物转运体是MRP1（多药耐药蛋白1（MultidrugResistance Protein1））与BCRP（乳腺癌抗癌性蛋白（Breast Cancer ResistanceProtein））。以MDR1为靶点，开发研究下调MDR1蛋白表达的药物对拮抗肿瘤耐药具有重要的意义。
微小RNA(microRNA,miRNA)是细胞内源产生调节基因蛋白表达的小分子非编码RNA，其调节的效应通常是抑制基因表达。MicroRNA（miRNA）调节机体内若干基因的表达，它们参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等几乎所有生命过程，在心血管疾病、神经系统疾病、造血系统疾病、糖尿病及各种肿瘤的病理过程中也发挥重要作用。已知miRNA的靶位点大多位于mRNA的3’-非翻译区（3’-untranslated region,3’-UTR），功能性的单链（mature miRNA，成熟miRNA）被整合到RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）中，与靶mRNA结合，通过mRNA剪切、mRNA去腺苷或抑制翻译等方式在转录后水平抑制基因表达。这种调节方式依赖于miRNA种子区序列（2～7nt）与靶mRNA3’-非翻译区序列的互补配对。
发明内容
本发明人经过实验验证，发现了一种能够下调MDR1蛋白表达的microRNA，特别是，该microRNA能够增加化疗药物的细胞毒性。
因此，本发明的一个目的是提供microRNA-491-3p在制备用于拮抗p-糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的用途。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含：（a）治疗有效量的化疗药物；和（b）治疗有效量的microRNA-491-3p。
本发明的又一个目的是提供一种预防和/或治疗p-糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的方法。
根据本发明的一个方面，提供了microRNA-491-3p在制备用于拮抗p-糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的用途。
本发明中，所述microRNA-491-3p的核苷酸序列如下：
5’-CUUAUGCAAGAUUCCCUUCUAC-3’（SEQ ID NO:1）。
本发明中，所述microRNA-491-3p能够下调MDR1蛋白表达，特别是，所述microRNA-491-3p能够增加化疗药物（例如，多柔比星）的细胞毒性。
本发明中，所述化疗药物，指的是对病原微生物、寄生虫、某些自身免疫性疾病、恶性肿瘤所致疾病的治疗药物。化疗药物可杀灭肿瘤细胞，这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。众所周知，化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。本发明中，所述化疗药物可为本领域中通常施用的任何化疗药物，优选地，所述化疗药物可为选自紫杉醇、柔红霉素、长春碱、长春新碱和多柔比星等中的一种或多种；且最优选，多柔比星或长春碱。
本发明中，所述肿瘤指的是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。本发明中，优选地，所述肿瘤可为肝细胞癌、白血病、卵巢癌和/或乳腺癌等。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含：（a）治疗有效量的化疗药物；和（b）治疗有效量的microRNA-491-3p。
本发明中，所述化疗药物指的是对病原微生物、寄生虫、某些自身免疫性疾病、恶性肿瘤所致疾病的治疗药物。化疗药物可杀灭肿瘤细胞，这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。本发明中，所述化疗药物可为本领域中通常施用的任何化疗药物，优选地，所述化疗药物可为选自紫杉醇、柔红霉素、长春碱、长春新碱和多柔比星等中的一种或多种；且最优选，多柔比星或长春碱。
本发明中，所述肿瘤指的是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。本发明中，优选地，所述肿瘤可为肝细胞癌、白血病、卵巢癌和/或乳腺癌等。
本发明中，优选地，所述药物组合物可以进一步包含可药用载体。所述可药用载体为本领域中通常使用的。
根据本发明的又一个方面，提供了一种预防和/或治疗p-糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的方法，包括向需要治疗的对象施用治疗有效量的microRNA-491-3p。
本发明中，术语“有效量”可指为实现预期的效果所需的剂量和时段的有效的量。此有效量可能因某些因子而产生不同的变化，如疾病的种类或治疗时疾病的病症、被施用的特定标的器官的构造、病人个体大小、或疾病或症状的严重性。本领域具有通常知识者不需要过度实验即可凭经验决定特定化合物的有效量。
本发明人首先使用TargetScan数据库对MDR1的3’非翻译区进行microRNA结合位点预测，发现microRNA-491-3p可以结合到MDR1基因的3’UTR区域（图1A）。经研究发现，在培养的人肝癌细胞中，miR-491-3p可剂量依赖地引起MDR1蛋白水平表达下降（图1B和1D）。miR-491-3p可引起MDR1mRNA3’-非翻译区荧光素酶报告系统的荧光素酶活性降低，突变种子序列区后此作用逆转（图1A和1C）。上述结果说明miR-491-3p确实可以通过与MDR1的3’-非翻译区的特定位点结合，从而起到显著下调MDR1蛋白表达的作用。
本发明人随后采用Hep3B-1肝癌细胞系，给予多柔比星或长春碱，观察miR-491-3p对多柔比星细胞毒性的影响。在这一细胞模型中，给予miR-491-3p的模拟物，发现miR-491-3p在Hep3B-1肝癌细胞中，可以显著增加多柔比星或长春碱的细胞毒性（图2A和2B）。
本发明中，所述TargetScan数据库为http://www.targetscan.org/。该数据库是目前应用最广泛且在科研领域、药物开发领域认可程度最高的数据库。本发明使用该数据库可以保证预测的准确性与可靠性。
本发明中使用TargetScan数据库预测，确认筛选得到microRNA-491-3p与MDR13’非翻译区的结合位点，使用化学合成的方法得到microRNA-491-3p上与MDR13’非翻译区的结合位点序列突变的microRNA模拟物，然后将野生型与突变型的microRNA模拟物以及阴性对照NC分别与携带有MDR13’非翻译区的萤光素酶载体（psiCHECK2）共同转入细胞中，检测突变的microRNA模拟物对萤光素酶活性的影响，确认microRNA与目的基因3’非翻译区的结合位点，最终确定该microRNA-491-3p是否是通过MDR1的3’-非翻译区的特定位点结合，从而起到显著下调MDR1蛋白表达的作用。在本发明中，用“NC”表示阴性对照，其是一种非特异性的miRNA模拟物，核酸序列如下：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUUU-3，由上海吉玛公司合成。
本发明中所使用的肝癌细胞系Hep3B-1是在科研以及药物开发领域常用的细胞系。
本发明中以临床上最常用的一线化疗药物多柔比星及长春碱作为例子，MDR1在多柔比星或长春碱的耐药中起着关键的作用。
附图说明
下面结合附图与实施例对本发明做进一步的详细说明，其仅仅是对本发明的描述而不是限定。
图1为显示miR-491-3p通过结合于MDR1的3’非翻译区下调MDR1蛋白表达的图。其中：
(A)：MDR1mRNA3’-UTR区与miR-491-3p种子序列区部分互补配对。斜体字母代表MDR1mRNA3’-UTR区中miR-491-3p可能的结合位点突变后的核苷酸序列。
(B)：Hep3B-1细胞中转染系列浓度的miR-491-3p后检测MDR1表达的蛋白印迹图。β-actin作为上样量对照。NC是指阴性对照。
(C)：荧光素酶报告基因实验显示miR-491-3p抑制MDR13’-UTR活性，而对miR-491-3p序列上可能的结合位点突变了的microRNA（M2）不能发挥抑制作用。归一化萤光素酶活性：以NC为1，对各组的萤光素酶活性进行归一化处理，从而得到归一化萤光素酶活性水平。*p<0.05。
(D)：MDR1蛋白表达被miR-491-3p下调。归一化MDR1蛋白表达水平：使用ImageQuant Solutions软件对MDR1与内参基因β-actin的条带进行灰度检测，然后依据β-actin的灰度值，以NC为1，对MDR1的蛋白表达水平进行归一化处理，从而得到归一化MDR1蛋白表达水平。
图2A为显示microRNA-491-3p增加多柔比星的细胞毒性的图；图2B为显示microRNA-491-3p增加长春碱的细胞毒性的图。其中：Hep3B-1细胞中先转染microRNA-491-3p模拟物，然后加入系列浓度的多柔比星或长春碱药物，检测细胞活力。NC是指阴性对照。
具体实施方式
在下文中，将通过示例性提出的实施例来更加详细地描述本发明，然而，本发明的范围并不限于实施例。
实施例中所使用的试剂、仪器：
人肝癌细胞Hep3B-1细胞：中科院上海生命科学院生化与细胞研究所细胞库；
所用质粒（psiCHECK2）均购自Promega；
萤光素酶活性检测试剂盒：购于Promega；
转染试剂：lipofectamine2000购于Invitrogen；
细胞培养液：购于Invitrogen；
细胞活力检测试剂盒，购自于Promega；
蛋白免疫印迹仪器：购于BioRad；
MDR1蛋白印迹检测用抗体：购于Santacruz；
除特别指定外，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法。
制备实施例
实施例1microRNA-491-3p(miR-491-3p)的制备
通过在Targetscan上对可能与MDR1的3’UTR结合的microRNAs的预测，本发明人得到了miR-491-3p的序列（5’-CUUAUGCAAGAUUCCCUUCUAC-3’（SEQ ID NO:1）），并委托上海吉玛公司合成该miRNA。在人肝癌细胞Hep3B-1细胞中转染miR-491-3p，用蛋白印迹实验检测细胞内MDR1的蛋白表达变化，如图1所示，miR-491-3p可显著降低MDR1蛋白水平(图1B和1D)。萤光素酶报告基因实验则显示miR-491-3p确实通过结合于MDR1的3’非翻译区起作用(图1A和1C)。
实验实施例
实施例1在人肝癌细胞Hep3B-1细胞中检测miR-491-3p对MDR1蛋白表达水平的抑制作用。
所用细胞模型为人肝癌细胞Hep3B-1，其培养条件如下：用含10%的胎牛血清的DMEM高糖培养基，于含5%二氧化碳的370C恒温培养箱中进行细胞培养。在人肝癌细胞Hep3B-1细胞中分别转染12.5nM、25nM、50nM、100nM的miR-491-3p或100nM的NC（阴性对照），用蛋白印迹实验检测细胞内MDR1的蛋白表达变化。如图1B所示，miR-491-3p可引起MDR1蛋白水平表达下降。
实施例2在Hep3B-1细胞中检测miR-491-3p对多柔比星的细胞毒性的影响。
在人肝癌细胞Hep3B-1细胞中首先转染50nM的NC（阴性对照）或miR-491-3p，72小时后，分别给予1μg/mL、2μg/mL、3μg/ml和4μg/ml的多柔比星，48h小时后使用MTT方法测定细胞存活率。如图2A所示，给药后，与NC组相比，miR-491-3p可显著降低细胞存活率，增加多柔比星的细胞毒性。
实施例3在Hep3B-1细胞中检测miR-491-3p对长春碱的细胞毒性的影响。
在人肝癌细胞Hep3B-1细胞中首先转染50nM的NC（阴性对照）或miR-491-3p，72小时后，分别给予10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和40μg/ml的长春碱，48h小时后使用MTT方法测定细胞存活率。给药后，与NC组相比，miR-491-3p可以非常显著地降低细胞存活率，增加长春碱的细胞毒性。
通过上述实施例2和3的结果，可以显示miR-491-3p不仅可以降低MDR1的表达，也可抑制其活性，这为日后攻克癌症耐药性提供了化疗辅助用药前景。
实施例4建立荧光素酶报告系统，在Hep3B-1细胞中，检测miR-491-3p对MDR13’UTR的抑制作用。
对基因组DNA进行PCR，合成出MDR13’UTR序列后，插入Sicheck2质粒，将总质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，待细菌长出单克隆菌落后，挑取单克隆进行菌液PCR，并将可能含有重组质粒的菌液委托给生工测序公司进行测序，待测序完毕后，确定已成功构建重组质粒。在人肝癌细胞Hep3B-1细胞中共转100nM的miR-491-3p和500ng的3’UTR重组质粒，72小时后，使用荧光素酶报告系统检测试剂盒，测定miR-491-3p对MDR13’UTR的抑制作用。如图1C所示，miR-491-3p可引起MDR13’UTR表达下降。
实施例5在Hep3B-1细胞中，利用荧光素酶报告系统，检测miR-491-3p及其突变体对MDR13’UTR的作用。
在人肝癌细胞Hep3B-1细胞中共转100nM的miR-491-3p和500ng的3’UTR重组质粒或100nM的miR-491-3p突变体（M2）和500ng的3’UTR重组质粒，72小时后，使用荧光素酶报告系统检测试剂盒，测定miR-491-3p对MDR13’UTR的作用。如图1C所示，miR-491-3p可引起MDR13’UTR表达下降，而miR-491-3p的突变体则可逆转该作用。

Claims (9)

1.microRNA-491-3p在制备用于拮抗p-糖蛋白(MDR1)介导的肿瘤耐药的药物中的用途，其中，所述microRNA-491-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述microRNA-491-3p能够增加化疗药物的细胞毒性。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述化疗药物为选自紫杉醇、柔红霉素、长春碱、长春新碱和多柔比星中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的用途，其中，所述化疗药物为多柔比星或长春碱。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述肿瘤为肝细胞癌、白血病、卵巢癌和/或乳腺癌。
6.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含：(a)治疗有效量的化疗药物；和(b)治疗有效量的microRNA-491-3p，其中，所述microRNA-491-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述化疗药物为选自紫杉醇、柔红霉素、长春碱、长春新碱和多柔比星中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述化疗药物为多柔比星或长春碱。
9.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述肿瘤为肝细胞癌、白血病、卵巢癌和/或乳腺癌。
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