CN107858424B - miRNA-4731-3p作为原发性肺癌诊断标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及循环miRNA‑4731‑3p作为原发性肺癌的诊断标志物及其检测方法。通过对已经确诊为肺癌患者的血浆中循环miRNA的种类进行高通量的筛查，并与健康体检者血浆中相应miRNA进行比较，找到表达量较高的MiRNA‑4731‑3p作为该实验的目标标记物。miRNA‑4731‑3p的表达水平明显高于对照组P＜0.001。ROC曲线分析显示miRNA‑4731‑3p鉴别正常人与肺癌患者的效能AUC＝0.048，灵敏度为95.0％，特异度为57.5％。生存曲线分析显示，表达量越高生存期限越短，相反，表达量越低生存期限越长。

Description

miRNA-4731-3p作为原发性肺癌诊断标志物的应用
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，涉及miRNA-4731-3p作为原发性肺癌的诊断标志物的用途。
背景技术
全球每年有超过100万人死于肺癌，在所有恶性肿瘤相关性死亡中排第一位，其中80％属于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。在中国，2009年肺癌以53.57/10万人的发病率和45.57/10万人的死亡率高居恶性肿瘤的首位。虽然近年来肺癌诊断和治疗技术不断进步，肺癌患者5年生存率由15％上升到16.8％，但仍是预后最差的肿瘤之一。肺癌患者还呈现年轻化趋势，在早几年前，肺癌患者，大多在55岁以上，45岁以下的很少，但是，近几年来，45岁以下的肺癌患者陆续出现。因此，肺癌已经严重影响威胁我国人民的生命健康。约有80％的肺癌患者在获得诊断时，已经是手术难以切除的局部晚期或进展期疾病。虽然目前仍没有非常有效的治疗手段，但早期NSCLC的治疗已取得较大的进步，其中以手术为主的综合治疗可以明显延长Ι期NSCLC患者的生存期，5年生存率达到45％-65％。因此早期发现肺癌可以减少肺癌的死亡率，但是目前还没有一种非常安全有效的方法对肺癌高危人群进行筛查，以往的肺癌标记物如细胞角蛋白21-1、肿瘤多糖、癌胚抗原诊断肺癌的敏感度较低。有研究报道影像学检查发现的肺部结节，大约50％是良性的，对减少肺癌死亡率作用有限。此外，超声气管内镜下活检、肺穿刺活检为有创检查方式。而microRNA(miRNA)的出现为准确早期诊断肺癌开辟了新的道路，作为一种非侵入性的诊断方法，越来越多有关于血液循环中的miRNA在癌症诊断中的应用的研究得以开展。
MicroRNA是一类内源性、非编码、具有调控功能的小分子RNA，通过与目标mRNA互补配对导致mRNA降解或抑制转录后翻译诱导基因沉默。MiRNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育、造血、器官形成、凋亡和细胞增殖，以及癌症的发生、发展，其通过切割靶mRNA或抑制靶mRNA翻译实现miRNAs抑制基因表达。最近研究发现，血清/血浆中有大量稳定存在的miRNA，并且可作为肺癌的诊断标记物。miRNA在肿瘤发生中的作用主要在于3个方面:1)有些miRNA在正常组织表达下调，在肿瘤组织表达上调，可能起着癌性miRNA的作用；2)有些miRNA则在正常组织表达上调，在肿瘤组织表达下调，可能起着抑癌miRNA的作用；3)一些致癌病毒编码的miRNA也可能参与相关肿瘤的发生。其介导肿瘤生物学调控作用机制主要是：一部分miRNA抑制靶基因的表达，作用于各种引起细胞增殖分化的基因；另一部分miRNA类似于抑癌基因，其在肿瘤细胞中的降低，或功能缺失后引起细胞的恶性转变。检测相关miRNA不仅可以优化肿瘤诊断和个体化治疗，而且可以作为判断疾病预后的工具。研究发现肺癌发生发展过程中有些microRNA含量上升，有些microRNA含量下降，异常表达的microRNA对于肺癌的发生发展有着重要意义，可为肺癌诊断提供重要依据。
发明内容
本发明首先是在临床常规收集已经确诊的原发性肺癌患者血浆样本为实验组，收集来院体检的健康人血浆为对照组。高通量筛查出差异明显的microRNA作为目标标记物。利用RT-qPCR技术检测实验组与对照组目标microRNA的表达量，并进行分析对比。
本发明的一个方面涉及miRNA-4731-3p作为原发性肺癌的诊断标志物的用途，所述miRNA-4731-3p的碱基序列为CACACAAGUGGCCCCCAACACU。
本发明的另一个方面涉及miRNA-4731-3p用于制备肺癌预后判断试剂的用途。
本发明还提供了一种检测血浆样本中miRNA-4731-3p水平的方法，该方法包括：1)采集血浆样本；2)提取样本中总的RNA；3)以提取的RNA为模板合成cDNA；4)使用miRNA-4731-3P引物QIAGEN，218300-MS00039648，miRNA-39引物QIAGEN，218300-MS00019789)进行RT-qPCR反应，获得待测血浆标本中miRNA-4731-3p的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，即CT值；
5)以microRNA39作内参计算出该削减样本的CT值，根据公式(ΔCT＝CTmiRNA-4731-3p–CTreference)，根据得到的CT值减去内参的CT值，得到该被检测者miRNA-4731-3p的表达水平△CT，
其中CTmiRNA-4731-3p是指肺癌患者血浆标本中miRNA-4731-3p的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CTreference是指内参miR-39的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
所述方法优选进一步包括：
6)根据以下公式，计算出待测样品与参照样品(正常人)的△CT差异：
△ΔCT＝待测样品中目的基因△CT–正常人目的基因△CT，其中正常人目的基因△CT是根据以上公式计算出的正常人的miRNA-4731-3p的表达水平，以2-△ΔCT值进行目的基因相对定量。
在上述方法中使用用QIAzol Lysis Reagent提取RNA，使用步骤2)获得的Purified RNA、miScript Hispec Buffer、miScript Nucleics Mix、RNase-free water、miScript Reverse transcription Mix合成cDNA，使用QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix、miScript Universal、Ce_miR-39_1miScipt PrimerAssay或miRNA-4731-3PmiScipt Primer Assay、RNase-free water、以上合成的Template cDNA进行PCR反应。
本发明进一步提供了一种用于检测血浆样本中miRNA-4731-3p水平的试剂盒，其包括：RNA提取试剂；cDNA合成试剂；PCR反应试剂；miRNA-4731-3P特异性引物。
进一步，RNA提取试剂为QIAzol Lysis Reagent；cDNA合成试剂为Purified RNA、miScript Hispec Buffer、miScript Nucleics Mix、RNase-free water、miScriptReverse transcription Mix；PCR反应试剂为QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、miScript Universal、Ce_miR-39_1miScipt PrimerAssay或miRNA-4731-3P miSciptPrimer Assay、RNase-free water，特异性引物为QIAGEN 218300-MS00039648。
根据每个生物标记物的PCR相对定量值计算P值，当P值小于0.05时，认为该microRNA可用于鉴别原发性肺癌患者与正常人。
本发明的实验结果表明，肺癌患者血浆中miRNA-4731-3p较正常人表达上调，差异有统计学意义。
目前临床上常用的肺癌诊断方法为细胞角蛋白21-1、肿瘤多糖、癌胚抗原(CEA)、影像学等检查方法，然而这些诊断标方法的敏感度和特异度并不十分理想。将肺癌患者血浆中miRNA-4731-3p的表达量与临床病例参数进行分析，发现miRNA-4731-3p的表达量与CEA正相关，与患者性别、年龄、吸烟、病理类型、肿瘤大小、临床分期、远处转移均无明显相关性，差异并无统计学意义。
将循环miRNA-4731-3p对原发性肺癌患者的诊断效能进行ROC曲线分析，其结果显示AUC＝0.048，灵敏度为95.0％，特异度为57.5％。
CEA水平、肿瘤生物学特性以及肿瘤患者免疫功能方面等临床表现均被作为肺癌预后判断和治疗选择的参考因素。我们对肺癌患者循环miRNA-4731-3p进行生存曲线分析，miRNA-4731-3p的平均2-△CT为0.11，＞0.11的称为高表达，相反则为低表达。经SPSS22.0统计分析发现：循环miRNA-4731-3p的表达量越高患者的生存时间越短，相反表达量越低生存时间越长，P＜0.05。
附图说明
图1为MiR-4731-3p在肺癌患者及健康对照组血浆中的表达图。散点图显示，原发性肺癌患者循环miRNA-4731-3p表达量较正常人明显上调(图中横线表示各组血清miRNA-4731-3p的中位数值)。
图2为ROC曲线，ROC曲线分析提示循环miRNA-4731-3p对原发性肺癌及正常人的鉴别效能AUC＝0.048，灵敏度为95.0％，特异度为57.5％。
图3为MiR-4731-3p与肺癌患者总生存期的关系图，生存曲线显示：循环miRNA-4731-3p的表达量越高肺癌患者的生存时间越短，相反，表达量越低生存时间越长。
具体实施方式
收集已确诊的原发性肺癌患者血清40例，体检的健康人血清40例。各取外周血4ML，并取得知情同意。室温下离心，3600r，5分钟，取上层血浆，至于-80℃冰箱保存备用。
RNA提取方法如下，取200UL已提取的血浆，按1:5的比例加入1ML的TRIzol中充分混匀，依照TRIzol提供的方案提取总RNA。
cDNA的合成，按照QLAGEN逆转录试剂盒的方法，在普通PCR仪上将溶解的总RNA为模版，加入试剂盒提供的逆转录酶、dNTP以及反应缓冲液，将mRNA逆转录成cDNA。-20℃保存待用。
表1：反应体系的组成
Component Volume
Purified RNA 3ul
5x miScript Hispec Buffer 4ul
10x miScript Nucleics Mix 2ul
RNase-free water 9ul
miScript Reverse transcription Mix 2ul
Total volume 20ul
RT-qPCR检测，血浆样本逆转录的cDNA，按照SYBR Green RNA assay荧光实时定量PCR试剂盒的方法，进行荧光实时定量PCR，在ABI7500荧光定量PCR仪读出各个样本的Ct值。以miRNA39作内参，△CT＝目的基因CT-内参CT；△ΔCT＝待测样品中目的基因△CT–参照样品中目的基因△CT；按2-△ΔCT值进行目的基因相对定量。
表2实时荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0001161097930000041
所使用的miRNA-4731-3P引物为QIAGEN，218300-MS00039648)，miRNA-4731-3P序列：5'CACACAAGUGGCCCCCAACACU；
所使用的miRNA-39引物为QIAGEN，218300-MS00019789)，miRNA-39序列：5'UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG。
数据整理分析，采用2ΔCT法整理数据，ΔCT＝CTmiR-4731-3p－CTmiRNA-39；统计方法采用SPSS 22.0软件分析，T检验方法检测所有数据并采用(x±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。
定量分析结果显示，原发性肺癌患者血浆中miRNA-4741表达水平较正常人显著上调(P＜0.05)(图2)；通过ROC曲线得到的最佳cut-off值对应的曲线下面积为0.048(95CI:0.750～0.921,P<0.001).(图3)，灵敏度为95.0％，特异度为57.5％。
综上实验，本发明认为循环miRNA-4731-3p检测可提高原发性肺癌患者诊断的灵敏度；并且对判断肺癌患者预后有一定帮助，患者血清miRNA-4731-3p表达量越高，生存时间越短。
表3 MiR-4731-3p表达水平与肺癌临床病理参数之间的关系
Figure BDA0001161097930000051
Figure BDA0001161097930000061
从表3可以看出，循环miRNA-4731-3p与CEA呈正相关。与患者性别、年龄、吸烟、病理类型、肿瘤大小、临床分期、远处转移无明显相关性。

Claims (2)

1.miRNA-4731-3p用于制备肺癌预后判断试剂的用途，所述miRNA-4731-3p的碱基序列为CACACAAGUGGCCCCCAACACU。
2.miRNA-4731-3p用于制备肺癌预后判断试剂盒的用途，其中肺癌预后判断试剂盒包括：RNA提取试剂；cDNA合成试剂；PCR反应试剂；miRNA-4731-3P特异性引物。
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