WO2009119809A1

WO2009119809A1 - 乳癌判定用のマーカー、検査方法および検査用キット

Info

Publication number: WO2009119809A1
Application number: PCT/JP2009/056293
Authority: WO
Inventors: 雅彦黒田; 正視田中; 恒輔及川; 隆之水谷; 正勝高梨
Original assignee: 株式会社ミラキュア; コニカミノルタホールディングス株式会社
Priority date: 2008-03-27
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2009-10-01
Also published as: US20110028332A1; EP2280078A1; EP2280078A4; EP2280078B1; JPWO2009119809A1; US20130012412A1; JP5737935B2

Abstract

［課題］本発明は、触診やマンモグラフィー検査では検出できない乳癌の発症、または初期段階（臨床病期０期）の乳癌であっても検出することができる、簡単かつ高い信頼性を有するマーカー、検査方法および検査用キットを提供することを課題とする。［解決手段］本発明の乳癌関連マーカーは、血清中または血漿中に見出されるマイクロＲＮＡであることを特徴とするものである。より具体的には、その血清中または血漿中に存在するレベルとして、乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期前）に対して、乳癌の発症以後、または乳癌の初期段階以後（臨床病期０期以後）の方が有意に低下しているマイクロＲＮＡを少なくとも用いるマーカーである。

Description

乳癌判定用のマーカー、検査方法および検査用キット

　本発明は、乳癌判定用のマーカー、乳癌の検査方法および乳癌の検査用キットに関する。さらに詳細には、本発明は、乳癌の発症、または乳癌の初期段階（臨床病期０期）を検出するための、血清中または血漿中に見出されるマイクロＲＮＡからなるマーカー、乳癌の検査方法および乳癌の検査用キットに関する。

　乳癌は、多くの文明諸国において、女性に最も多くみられる悪性腫瘍であり、浸潤性乳癌に進展するリスクは、依然として女性の生涯を通じて１０％を超える（非特許文献１）。これは、癌組織がある程度の大きさにまで進展しないと、触診やマンモグラフィー検査によって検出することができないことにも起因している。

　乳癌を含む癌の発生および進展は、従来、癌遺伝子や癌抑制遺伝子などの多段階変異の蓄積が原因であるとされていた。近年、ＤＮＡメチル化やヒストン脱アセチル化など、遺伝子の一次構造の変異を伴わない、いわゆるエピジェネティックな変異も、癌の発生および進展に関与していることがわかった。

　ＤＮＡメチル化やヒストンの修飾の異常は、マイクロＲＮＡと呼ばれる低分子ＲＮＡにより制御されることが明らかになりつつある。なお、マイクロＲＮＡ（以下「ｍｉＲＮＡ」ともいう。）とは、タンパク質のアミノ酸配列として翻訳されない１９～２５ヌクレオチドの小さな非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ヒトを含む生物に多数存在することが確認されており、系統的に高度に保存されている（非特許文献２～４）。これまで、特にヒトにおいては、約８００種類のｍｉＲＮＡが発見されている(非特許文献５～１０)。

　癌とｍｉＲＮＡとの関連について、Ｃａｌｉｎらは、リンパ性白血病において、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１５およびｍｉＲ－１６が頻繁にダウンレギュレーションしていることを報告している（非特許文献１１）。また、最近では、Ｍｉｃｈａｅｌらが、ヒト大腸癌においてｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１４３およびｍｉＲ－１４５の発現が低下していることを報告している（非特許文献１２）。

　しかしながら、これらの報告においてｍｉＲＮＡの発現低下が癌の臨床病理学的特性に影響を及ぼすか否かについては示されておらず、癌におけるマイクロＲＮＡの発現制御機構や発現異常、マイクロＲＮＡの標的遺伝子に関しては、未知の点が多い。
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　本発明は、触診やマンモグラフィー検査では検出できず、従来の病理細胞診において見落とす可能性の高い乳癌の発症、または初期段階（臨床病期０期）の乳癌であっても、乳癌細胞の存在を検出することができる、簡単かつ高い信頼性を有し、血清中または血漿中に存在するマイクロＲＮＡからなるマーカー、検査方法および検査用キットを提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記の問題、または従来の乳癌を検出する診断マーカーでは鋭敏度（感度）・特異度の観点において精度が低く、正確に診断することができないという問題を解決すべく鋭意検討した結果、乳癌を発症した後、被験者の血清中または血漿中に存在するマイクロＲＮＡ（α）のレベルが有意に低下すること、およびマイクロＲＮＡ（β）は血清中または血漿中に存在するレベルは乳癌の罹患にかかわらず一定であること、およびそれらの動態から乳癌の発症、または乳癌の初期段階（臨床病期０期）を診断できるマーカーとして使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。

　本発明のマーカーは、乳癌関連マーカーであって、より具体的には（Ａ）「乳癌の発症、または乳癌の初期段階（臨床病期０期）を検出するためのマーカー」、あるいは乳癌の予後因子としてのマーカーであり、（Ｂ）「血清中または血漿中に見出されるマイクロＲＮＡ」であることを特徴とする。換言すれば、本発明は、該（Ａ）を該（Ｂ）として使用する方法を提供するものである。

　上記マイクロＲＮＡは、その血清中または血漿中に存在するレベルとして、乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期前）に対して、乳癌の発症以後、または乳癌の初期段階以後（臨床病期０期以後）の方が有意に低下しているマイクロＲＮＡ（α）であることが好ましく、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４からなる群より選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（α）であることがより好ましい。

　また、上記マイクロＲＮＡは、その血清中または血漿中に存在するレベルとして、乳癌の発症前後、または乳癌の初期段階前後（臨床病期０期前後）を通して一定であるマイクロＲＮＡ（β）と、上記マイクロＲＮＡ（α）との組み合わせであることが好ましく、該マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、該マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルによって除した数値として、乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期）に対して、乳癌の発症以後、または乳癌の初期段階以後（臨床病期０期）の方が統計学的に有意に低下している該マイクロＲＮＡ（α）と該マイクロＲＮＡ（β）との組み合わせであることがより好ましい。

　上記マイクロＲＮＡ（β）は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０およびｈｓａ－ｍｉＲ－５７２からなる群より選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡであることが好ましい。

　本発明の乳癌の検査方法は、被験者由来の血清中または血漿中に存在するマイクロＲＮＡレベルの動態を検出することを特徴とするものであって、（ｉ）上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の健常者または１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程、または（ｉｉ）上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、上記マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルで除することによって求められる、標準化された該マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の健常者または１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程を含むことが好ましい。特に、工程（ｉ）および（ｉｉ）において、比較対照とするサンプルとして、１以上の乳癌患者に由来するものがより好ましい。

　さらに、本発明の乳癌の検査用キットは、本発明のマーカーとなるマイクロＲＮＡ測定用の試薬を少なくとも含むことを特徴とする。

　本発明は、触診やマンモグラフィー検査では検出できず、従来の病理細胞診において見落とす可能性の高い乳癌の発症、または初期段階（臨床病期０期）の乳癌であっても、被験者の採血から簡単に検査することができ、かつ従来の乳癌マーカーと比較しても陰性／陽性の差が顕著に鋭敏であることから高い信頼性を有するマーカー、検査方法および検査用キットを提供することができる。さらに、乳癌の検査の際、採血のみで陰性／陽性の判定ができることから、被験者にとっても負担が少ないため好ましい。

図１は、実施例３の表５をグラフで表したものである。図２は、ｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａの保存安定性をＲＴ－ＰＣＲにより評価したグラフを示す。図３は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８の保存安定性をＲＴ－ＰＣＲにより評価したグラフを示す。

　次に、本発明のマーカー、乳癌の検査方法および乳癌の検査用キットについて詳細に説明する。

　＜マーカー＞
　本発明のマーカーは、乳癌関連マーカーであって、血清中または血漿中に見出されるマイクロＲＮＡであることを特徴とするものである。

　後述するように、さらに本発明のマーカーは、マイクロＲＮＡ（α）単独であっても、マイクロＲＮＡ（α）とマイクロＲＮＡ（β）との組み合わせであってもよい。

　〔マイクロＲＮＡ〕
　マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質をコードしない小さなＲＮＡ分子であり、発生、分化、増殖など様々な生命現象に関わっていると考えられている。この小さなＲＮＡをコードするｍｉＲＮＡ遺伝子は、ゲノム上に少なくとも数百存在している。それらの遺伝子からは、まず、数百から数千ヌクレオチドの長さの初期ｍｉＲＮＡが転写され、次に、マイクロプロセッサーと呼ばれるタンパク質複合体によって消化され、約６０～７０ヌクレオチドのヘアピン型前駆体ｍｉＲＮＡとなる。その後、エクスポーチン５を介して核から細胞質内に移り、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩによってさらに消化され、１９～２５ヌクレオチドの成熟したｍｉＲＮＡ二量体となる。そして、成熟したｍｉＲＮＡ二量体は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と関連のあるＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とともに複合体を形成し、機能すると考えられている。その作用機序は、ｍｉＲＮＡと一部（部分的に）相補的なメッセンジャーＲＮＡとの部分的（不完全な）ハイブリダイゼーションと、それに伴う未知の翻訳抑制作用であると考えられている。そのため、１種類のｍｉＲＮＡが、タンパク質をコードする複数のメッセンジャーＲＮＡの翻訳を制御するという極めてユニークな発現調節機構に携わっていると考えられている。

　最近、発明者らは、細胞質内に存在するはずである成熟したｍｉＲＮＡ二量体を、血清中または血漿中から検出した。ｍｉＲＮＡが血液中に移動するメカニズムおよびその理由については不明な点もあるが、ある特定のｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ（β））は、そのレベルが恒常的（一定）であるのに対し、ある特定のｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ（α））は、そのレベルが変動的であることもわかった。

　なお、本発明において「レベル」は、例えば、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（またはＲＴ－ｑＰＣＲ）検出法で測定された数値（Ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）、マイクロアレイ解析法やノーザンブロット分析法で検出されたシグナル強度など、いずれかを指標として用いることができる。

　（マイクロＲＮＡ（β））
　血清中または血漿中に存在する成熟したｍｉＲＮＡ二量体のうち、マイクロＲＮＡ（β）は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０およびｈｓａ－ｍｉＲ－５７２からなる群より選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡであることが好ましく、これらはいずれも乳癌の発症前後、または乳癌の初期段階前後（臨床病期０期前後）を通してそのレベルが恒常的（一定）である。

　したがって、乳癌の罹患または乳癌の病期の進展に伴って生じるマイクロＲＮＡ（α）の、変動的なレベルの動態を検出する場合、マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルを基準として、異なるサンプル同士を標準化することができる、すなわち、マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルによって除すことによって、得られた数値は、乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期）に対して、乳癌の発症以後、または乳癌の初期段階以後（臨床病期０期以後）の方が有意に低下するため、マイクロＲＮＡ（α）と（β）との組み合わせは、本発明のマーカーとして好適である。

　このようなマイクロＲＮＡ（β）それぞれの配列を以下に示す。

　（ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８）ａｇｇｇａｕｃｇｃｇｇｇｃｇｇｇｕｇｇｃｇｇｃｃｕ
　（ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０）ａｇｕａｕｕｃｕｇｕａｃｃａｇｇｇａａｇｇｕ
　（ｈｓａ－ｍｉＲ－５７２）ｇｕｃｃｇｃｕｃｇｇｃｇｇｕｇｇｃｃｃａ
　（マイクロＲＮＡ（α））
　また、マイクロＲＮＡ（α）として、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４などのマイクロＲＮＡが挙げられる。これらマイクロＲＮＡは、乳房、乳管および乳腺からなる組織に由来する細胞の癌化に伴い特異的にそのレベルが減少する（すなわち、これらマイクロＲＮＡは、その血清中または血漿中に存在するレベルとして、乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期）に対して、乳癌の発症以後、または乳癌の初期段階以後（臨床病期０期）の方が統計学的に有意に低下している。）ため、乳癌の発症、および初期段階（臨床病期０期）を検出するためのマーカーとして好適である。

　このようなマイクロＲＮＡ（α）は、１種単独でも２種以上併用することもできる。

　なお、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ１およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ２は、異なるゲノム領域から転写されたものでありながら、成熟型の配列は同一である。以下、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ１およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ２を合わせて「ｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ」ともいう。

　このようなマイクロＲＮＡ（α）それぞれの配列を以下に示す。

　（ｈａｓ－ｍｉＲ－^*９２ａ）ｕａｕｕｇｃａｃｕｕｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｇｕ
　（ｈｓａ－ｍｉＲ－２２）ａａｇｃｕｇｃｃａｇｕｕｇａａｇａａｃｕｇｕ
　（ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０）ｇｃｃｕｇｃｕｇｇｇｇｕｇｇａａｃｃｕｇｇｕ
　（ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１）ｕｇｇｕｃｕａｇｇａｕｕｇｕｕｇｇａｇｇａｇ
　（ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８）ｇｇｃｇｇａｇｇｇａａｇｕａｇｇｕｃｃｇｕｕｇｇｕ
　（ｈａｓ－ｍｉＲ－４９４）ｕｇａａａｃａｕａｃａｃｇｇｇａａａｃｃｕｃ
　〔乳癌〕
　本明細書において「乳癌」は、終末乳管から発生する乳管癌および小葉から発生する小葉癌の両方を含む。なお、「癌」は、悪性腫瘍をいうが、単に「腫瘍」と言及することもある。「悪性転換」と「癌化」とは、同義のように使用することもある。

　本明細書において「発症」とは、疾患特異的臨床症状、検査データ等をもとに総合的判断により特定疾患と診断された時点をもって発症とよぶ。

　本明細書において「予後因子」とは、疾患が、術後どのような経過をたどるのかを予測し、見通しを立て、適切な治療方法を選択するための判断材料のことを言う。なお、予後因子には、本発明のマーカー以外に、一般に以下のものが知られている。しこりの大きさ、リンパ節への転移状況、遠隔転移の有無、ホルモンレセプター（エストロゲンレセプター（ＥＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰｇＲ））の有無、閉経状況、核異型度など。

　乳癌の臨床病期（ステージ）は一般に、非浸潤癌（上皮内癌）、局所浸潤癌、領域浸潤癌および遠隔転移癌（転移癌）という名称として、または腫瘍のサイズ、リンパ節への浸潤の有無、癌細胞の遠隔転移により決定され、具体的にステージ０～ＩＶ（臨床病期０～ＩＶ期）として表現される。

　　非浸潤癌（上皮内癌）：局所に留まっている癌という意味であり、最も初期の癌に相当する。乳房内で著しく大きくなっていることもあるが、周囲の組織への浸潤や体内の他の部位への転移は起こしていない。通常はマンモグラフィー検査で発見される。

　　局所浸潤癌：周囲の組織に浸潤しているものの、乳房内に留まっている癌をいう。

　　領域浸潤癌：胸壁やリンパ節など乳房周囲の組織にも浸潤している癌をいう。

　　遠隔転移癌（転移癌）：乳房から体内の別の部位に転移した癌をいう。

　　ステージ０：腫瘍が、乳管または乳腺に限局し、周囲の乳腺組織への浸潤がない（非浸潤癌（上皮内癌））。乳癌の初期段階ともいう。

　　ステージＩ：腫瘍の直径が２ｃｍ未満で、乳房外への転移がない。

　　ステージＩＩ：腫瘍の直径が２～５ｃｍで、腫瘍と同じ側の腋（片側または両側）のリンパ節に転移がみられる。

　　ステージＩＩＩ：腫瘍の直径が５ｃｍを超え、リンパ節への転移があり、周囲の組織への癒着やリンパ節内の癒着がみられる。または、腫瘍の大きさに拘わらず、皮膚、胸壁、乳房より下流の胸部リンパ節への転移がみられる。

　　ステージＩＶ：腫瘍の大きさに拘わらず、乳房から離れた肺や骨などの臓器および組織、または乳房から離れた部位のリンパ節への転移がみられる。

　また、乳癌は、癌細胞が最初に発生した組織の種類と、病巣の広がりの範囲によっても分類される。乳管で発生した癌を乳管癌といい、乳癌のおよそ９０％は乳管癌である。乳腺で発生した癌は小葉癌という。脂肪組織や結合組織から発生したものは肉腫というが、乳房の癌では稀である。

　非浸潤性乳管癌は、乳管内に限局した癌である。この癌は乳房周囲の組織には浸潤していないが、乳管に沿って広がり、乳房内でかなり大きくなることもある。この癌は乳癌の２０～３０％を占める。

　非浸潤性小葉癌は、乳腺の内部で増殖する。両側の乳房の複数の部位に生じることも多い。非浸潤性小葉癌は乳癌の１～２％を占める。

　浸潤性乳管癌は、乳管内で発生するが、管壁を越えて周囲の乳腺組織に浸潤した癌である。乳房以外の部位にも転移することがあり、乳癌の６５～８０％を占めている。

　浸潤性小葉癌は、乳腺内で発生して周囲の乳腺組織に浸潤し、さらに乳房以外の部位にも転移する癌である。この癌は乳癌の１０～１５％を占めている。

　他に、乳癌全体のおよそ1％を占める炎症性乳癌、および乳頭のパジェット病が知られ、さらに発生頻度が低い乳管由来の浸潤性癌として、髄様癌、管状癌、粘液癌（膠様癌）などがある。

　本願に係る乳癌は、乳房、乳管および乳腺からなる組織を原発とするこれらのガン（癌）、および触診やマンモグラフィー検査によって検出することができない臨床病期０期の非浸潤癌（上皮内癌）もすべて含むものとする。

　＜乳癌の検査方法＞
　本発明の乳癌の検査方法は、被験者由来の血清中または血漿中に存在するマイクロＲＮＡレベルの動態を検出することを特徴とするものであって、以下の工程（ｉ）または（ｉｉ）を含むことが好ましい。

　工程（ｉ）：上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の健常者または１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程。

　工程（ｉｉ）：上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、上記マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルで除することによって求められる、標準化された該マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の健常者または１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程。

　本発明の乳癌の検査方法として、具体的には、まず、検体から全ＲＮＡを抽出する。なお、本明細書において「検体」とは、乳癌患者（病理細胞診により乳癌と診断されたヒトまたはヒト以外の哺乳動物をいう。）、健常者（特定の慢性疾患を抱えておらず、日常生活行動に支障がないヒトまたはヒト以外の哺乳動物をいい、より具体的には、年１回以上実施される定期検診（癌検診を含む。）によって、癌ではないと診断されたヒトまたはヒト以外の哺乳動物をいう。）、被験者（乳癌発症が疑われるヒトまたはヒト以外の哺乳類動物をいう。）などから分離された血液である。

　すなわち、ヒト等の被験者から採血をし、その血液から得られた上澄みを遠心し、血球を除いたものを血清または血漿とする。得られた血清または血漿から全ＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡの抽出方法としては、例えば、グアニジン－塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ　Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法などが挙げられる。

　次いで、抽出された全ＲＮＡ中の本発明に係るｍｉＲＮＡを検出する。検出方法は、本発明に係るｍｉＲＮＡの発現量を測定できる方法である限り特に限定されないが、例えば、マイクロアレイ解析法、ノーザンブロット分析法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ検出法などが挙げられる。

　マイクロアレイ解析法としては、例えば、実施例１に記載されている方法などが挙げられる。

　ノーザンブロット分析法では、電気泳動により、全ＲＮＡを鎖長に応じて分離し、ニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンに転写する。このメンブランを、本発明に係るｍｉＲＮＡと相補的な配列を有し、かつ放射性物質（例えば、³²Ｐ等）などにより標識されたプローブとバッファー中でインキュベートする。その結果、プローブに付した標識に基づいて、プローブとハイブリダイズした本発明に係るｍｉＲＮＡを検出することができる。なお、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップは、ストリンジェントな条件で行う。ここで、ストリンジェンな条件とは、例えば、³²Ｐ標識したＤＮＡをプローブとして用いる場合には、０．２５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳおよび０．５％ピロリン酸ナトリウムからなるハイブリダイゼーションバッファー中で温度３７℃である。また、洗浄ステップにおいては、２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳからなる洗浄バッファー中で温度３７℃、さらに０．１×ＳＳＣからなる洗浄バッファー中で温度が室温である。その他の場合には、その検出法の標準的な条件であってよい。放射性標識したプローブにより検出する場合には、オートラジオグラフィーを用いて、バンド密度に基づき、プローブとハイブリダイズした本発明に係るｍｉＲＮＡを定量することができる。

　また、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（またはＲＴ－ｑＰＣＲ）検出法によれば、全ＲＮＡに対応するランダムプライミングｃＤＮＡおよび本発明に係るｍｉＲＮＡに相補的なプライマーを用いたＰＣＲにより、例えば、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ等の二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素を介して、本発明に係るｍｉＲＮＡを定量的に検出することができる。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ検出法は、公知の方法または検出機器や試薬の製造業者のマニュアル（例えば、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Perkin-Elmer Applied Biosystems）、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲマスターミックス（Perkin-Elmer Applied Biosystems）など）に従って実施することができる。

　抽出された全ＲＮＡ中の本発明に係るｍｉＲＮＡを検出した後に、工程（ｉ）または工程（ｉｉ）を実施することが好ましい。

　（工程（ｉ））
　工程（ｉ）とは、上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の健常者または１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程である。

　すなわち、工程（ｉ）とは、ｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４からなる群より選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（α）、好ましくはｈｓａ－ｍｉＲ－４９４、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ、特に好ましくはｈｓａ－ｍｉＲ－４９４であるマイクロＲＮＡ（α）の発現量の絶対値が、
（ｉ－１）１以上の健常者に由来するサンプルから得られたマイクロＲＮＡ（α）の発現量の絶対値と比較し、統計学的に有意に低い（有意水準は、好ましくは５％、より好ましくは１％である。）か否かを検定する、または
（ｉ－２）１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られたマイクロＲＮＡ（α）の発現量の絶対値と比較し、統計学的に有意に高いか否かを検定する工程である。

　より具体的には、（ｉ－１）において、比較した結果、統計学的に有意に低ければ、そのサンプルを提供した被験者を乳癌患者であると診断する、逆に言えば、統計学的に有意差がなければ健常者であると診断する有用な情報となり、（ｉ－２）において、比較した結果、統計学的に有意に高ければ、そのサンプルを提供した被験者を健常者であると診断する、逆に言えば、統計学的に有意差がなければ乳癌患者であると診断する有用な情報となる。

　なお、被験者が１個体である場合、乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期前）にあらかじめ検体を分離しておき、該検体に由来するサンプルから得られたマイクロＲＮＡ（α）の発現量を比較対象とすることが好ましい。

　（工程（ｉｉ））
　工程（ｉｉ）とは、上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、上記マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルで除することによって求められる、標準化された該マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の健常者または１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程である。

　すなわち、工程（ｉｉ）とは、ｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４からなる群より選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（α）、好ましくはｈｓａ－ｍｉＲ－３７０またはｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａであるマイクロＲＮＡ（α）の発現量を、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０およびｈｓａ－ｍｉＲ－５７２からなる群より選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（β）、好ましくはｈｓａ－ｍｉＲ－６３８の発現量により除する（割る）ことによって、マイクロＲＮＡ（α）の発現量を標準化し、得られたマイクロＲＮＡ（α）の発現量の相対値が、
（ｉｉ－１）１以上の健常者に由来するサンプルから得られたマイクロＲＮＡ（α）の発現量の相対値と比較し、統計学的に有意に低い（有意水準は、好ましくは５％、より好ましくは１％である。）か否かを検定する、または
（ｉｉ－２）１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られたマイクロＲＮＡ（α）の発現量の相対値と比較し、統計学的に有意に高いか否かを検定する工程である。

　より具体的には、（ｉｉ－１）において、比較した結果、統計学的に有意に低ければ、そのサンプルを提供した被験者を乳癌患者であると診断する、逆に言えば、統計学的に有意差がなければ健常者であると診断する有用な情報となり、（ｉｉ－２）において、比較した結果、統計学的に有意に高ければ、そのサンプルを提供した被験者を健常者であると診断する、逆に言えば、統計学的に有意差がなければ乳癌患者であると診断する有用な情報となる。

　なお、工程（ｉ）と同様に、被験者が１個体である場合、乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期）にあらかじめ検体を分離しておき、該検体に由来するサンプルから得られたマイクロＲＮＡ（α）の発現量を比較対象とすることが好ましい。

　工程（ｉｉ）は、標準化することによって、使用するマイクロＲＮＡ（α）の種類、被験者（個体）、乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期）の採血の有無に依存しないことから、工程（ｉ）より好ましい。

　工程（ｉｉ）およびそれに続く乳癌判定の具体的な手順の一態様を以下に例示する。

　あらかじめマイクロアレイ解析法によって得られたシグナル強度で内部標準によって補正したｈｓａ－ｍｉＲ－６３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０またはｈｓａ－ｍｉＲ－５７２の発現量により、それぞれｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の発現量を、除することによって標準化する。すなわち、上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、上記マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルで割ることによって、標準化する。

　標準化されたｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８またはｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の発現量が、それぞれ健常者由来の標準化したｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の発現量よりも有意に低下している場合、被験者は乳癌であると判定することができる。例えば、乳癌患者由来の標準化したｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８またはｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の発現量は、健常者由来の補正したｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８またはｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の発現量よりも、統計学的に有意に低下している。

　工程（ｉ）または（ｉｉ）における有意差があるか否かを検定するための統計学的手法は、サンプル数などに応じて適切なものを選択すればよく、例えば、Ｔｔｅｓｔ（Ｔ検定）、Ｆ検定、カイ二乗検定などが挙げられる。

　このような検査方法により、乳癌の臨床病期０期であって、乳癌を発症していない被験者であっても、高い信頼性をもって乳癌であると判定することができることから、投薬や手術を含む治療方針の決定に対して重要な情報を提供することができる。

　＜乳癌の検査用キット＞
　本発明の乳癌の検査用キットは、本発明のマーカーとなるマイクロＲＮＡ測定用の試薬を少なくとも含むことを特徴とするものであって、本発明の乳癌の検査方法を実施するために必要とされる各種器材、資材、試薬および／または遺伝子増幅するためのプライマー類ならびに遺伝子増幅に係る試薬等を含むとするものである。

　このようなマイクロＲＮＡ測定用の試薬としては、例えば、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液等も含まれる。具体的には、検体を希釈するための溶解液を少なくとも含み、さらにマイクロＲＮＡを検出するための、ＰＣＲ用プライマーを含む。キット要素として、さらに多数検体の同時処理が可能なマイクロタイタープレート、ＤＮＡ増幅用具等の必要な器材一式などを含んでもよい。

　本発明による乳癌の検査方法のハイスループットな態様は、上記検査用キットの中に、マイクロリアクタ形態のもの、具体的にはチップ形状の器材を含んでもよい。このような構成の向上した態様は、チップから得られる信号についての数値化されたものを取り込み、コンピュータ処理を通じてファイルを作成し、コンピュータ上の所定のディレクトリに保存する形態を採用するシステムが好ましい。さらに数値データを統計的に処理し、コントロール（実験対照）に対する有意差を表示する能力まで含めることができる。データ処理は、必要な補正、正規化を経て、統計的解析を可能とする好適なソフトウェアを使用して行われる。このようなデータ処理のためのシステム構築は、当業者であれば既存の技術、方式、手順を利用して行うことができる。

　次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

　［実施例１］
　表１に記載の健常者（年１回以上実施される癌検診を含む定期検診によって乳癌であると診断されなかったヒト）および乳癌患者（病理細胞診により乳癌と診断されたヒト）からそれぞれ採血し血清を分離した。血清から「（商品名）Ｉｓｏｇｅｎ－ＬＳ」（（株）ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡ濃度を１００ｎｇ／μＬとなるように調整した。

　次に、全ＲＮＡを仔牛小腸由来アルカリホスファターゼである「（商品名）Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（ＣＩＡＰ）」（タカラバイオ（株）製）を用いて脱リン酸化反応を行った。その後、「（商品名）Ｔ４　ＲＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（Ｃｌｏｎｅｄ）」（アンビオン（株）製）を用いて、色素であるシアニンによりラベル化した。以上の操作は、「（商品名）ｍｉＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（カタログナンバー：５１９０－０４０８）」（アジレント・テクノロジー（株）製）を用い添付のプロトコールに従った。

　さらに、「（商品名）Ｈｕｍａｎ　ｍｉＲＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｋｉｔ　８×１５Ｋ　Ｖ２（カタログナンバー：Ｇ４４７０Ｂ）」（アジレント・テクノロジー（株）製）のマイクロアレイスライドを用いて、シアニンによりラベル化した全ＲＮＡのハイブリダイゼーションを行い、シグナルを得た。

　続いて、マイクロアレイスライドを「（商品名）ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒ」（アジレント・テクノロジー（株）製）を用いてスキャニングを行った。シグナルの検出には、上記スキャナーに付属の「Ｆｅａｔｕｒｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　９．５．３　Ｓｏｆｔｗａｒｅ」および「Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｓｃａｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ．７．０）」を用いた。

　得られた結果を表１に示す。

　［実施例２］
　実施例１で得られた解析データに基づき、健常者と乳癌患者との平均値のＴ検定（有意差検定）を行った。具体的には、被験者（サンプルＮｏ．４～１０）および乳癌患者（サンプルＮｏ．１３～２１）から得られたｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１およびｈｓａ－ｍｉＲ－６５８の数値を用いてそのままＴ検定を行い、得られたｐ値を表２に示す。さらに表１に記載の健常者（サンプルＮｏ．４～１０）および乳癌患者（サンプルＮｏ．１３～２１）で得られたｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１およびｈｓａ－ｍｉＲ－６５８の数値を、同じく健常者（サンプルＮｏ．４～１０）および乳癌患者（サンプルＮｏ．１３～２１）で得られたｈｓａ－ｍｉＲ－６３８でそれぞれ除し、Ｔ検定を行った。得られたｐ値を表２に示す。

　表２から、健常者および乳癌患者の平均値の有意差検定を行った結果、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８で標準化したｐ値はいずれのマーカーもｐ＜０．０５となり有意差が認められた。したがって、表２から、ｈａｓ－ｍｉＲ－３７０、ｈａｓ－ｍｉＲ－６０１、ｈａｓ－ｍｉＲ－９２、ｈａｓ－ｍｉＲ－２２およびｈａｓ－ｍｉＲ－６５８のマーカーはｈｓａ－ｍｉＲ－６３８で標準化することにより、より正確に乳癌を判定することができることがわかった。

　［比較例１］
　表３に記載のサンプルＮｏ．ｉ～ｉｖは、いずれも検体としてサンプルＮｏ．１３～２１のうち４人の乳癌患者由来の血液（血清または血漿）を用い、さらにマーカーとして従来使用されているＣＡ１５－３、ＣＥＡ、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９およびＢＣＡ２２５を用い、それぞれ所定のイムノアッセイ法により定量した。得られた結果を表３に示す。

　表３から、サンプルＮｏ．ｉのＣＡ１５－３およびＮＣＣ－ＳＴ－４３９以外、得られた結果はすべて、従来の乳癌マーカーの基準値の指標を満たすものであった。すなわち、従来の乳癌マーカーを用いて乳癌を判定すると、すべてホールスネガティブとなり、乳癌が判別できない結果となった。

　［実施例３］
　健常者および乳癌患者からそれぞれ採血し血清を分離した。血清から「（商品名）Ｉｓｏｇｅｎ－ＬＳ」（(株)ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。それぞれのサンプルから抽出した全ＲＮＡを用いてｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａおよびｈｓａ－ｍｉＲ－６３８をＲＴ－ＰＣＲにより定量した。ＲＴ－ＰＣＲは「（商品名）ＴａｑＭａｎ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ」（アプライドバイオシステムズジャパン(株)製）を使用し、添付のプロトコールに従い測定した。それらの結果を表４～７および図１に示す。

　表６は、２８人の健常者および１７人の乳癌患者からそれぞれ血清を分離して得られたｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａの値を用いて検査した結果である。健常者サンプルで得られた値の２５％を閾値に設定すると、鋭敏度７０．６％、特異度７５％となった。一般に使用されている乳癌マーカーは鋭敏度が２０～４０％、特異度が３０～５０％程度であるのに対し、ｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａは鋭敏度、特異度ともに優れたマーカーであるといえる。

　また、表７は、同様にｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａをｈｓａ－ｍｉＲ－６３８で除して検査した結果を示す。これも同様に健常者サンプルで得られた値の２５％を閾値に設定すると鋭敏度は１００％となり、ｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａのみで検査するよりもさらに精度良く乳癌を識別できることができた。

　［参考例１］
　健常者の血液から血清を分離して得られたｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａおよびｈｓａ－ｍｉＲ－６３８の保存安定性を評価した。

　具体的な手順として、まず血清を室温（２５℃）で７日間放置し、次にそれぞれのマイクロＲＮＡ量の経時変化を、実施例３と同様にＲＴ－ＰＣＲにより定量した。

　ｈｓａ－ｍｉＲ－^*９２ａについて得られた結果を図２に、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８について得られた結果を図３に示す。

　図２，３から、いずれも７日間までのＣｔ値はほぼ変化が見られず、血清中のマイクロＲＮＡは極めて安定であることがわかる。この結果から、臨床診断において、血清中のマイクロＲＮＡは乳癌を判定するために用いるマーカーとして充分に使用できることが示された。

産業上の利用の可能性

　本願発明であるマーカーは、触診やマンモグラフィー検査では検出できず、従来の病理細胞診において見落とす可能性の高い乳癌の発症、または初期段階（臨床病期０期）の乳癌を、簡単かつ高い信頼性によって検出可能であることから、マイクロＲＮＡ測定用の試薬を少なくとも含む乳癌の検査用キットとして好適である。

Claims

　乳癌関連マーカーであって、
　血清中または血漿中に見出されるマイクロＲＮＡであることを特徴とするマーカー。
　上記マイクロＲＮＡが、その血清中または血漿中に存在するレベルとして、
　乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期前）に対して、
　乳癌の発症以後、または乳癌の初期段階以後（臨床病期０期以後）の方が有意に低下しているマイクロＲＮＡ（α）である請求項１に記載のマーカー。
　上記マイクロＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４からなる群より選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（α）である請求項１または２に記載のマーカー。
　上記マイクロＲＮＡが、その血清中または血漿中に存在するレベルとして、
　乳癌の発症前後、または乳癌の初期段階前後（臨床病期０前後）を通して一定であるマイクロＲＮＡ（β）と、上記マイクロＲＮＡ（α）との組み合わせである請求項１～３のいずれかに記載のマーカー。
　上記マイクロＲＮＡが、
　上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、上記マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルによって除した数値として、
　乳癌の発症前、または乳癌の初期段階前（臨床病期０期前）に対して、
　乳癌の発症以後、または乳癌の初期段階以後（臨床病期０期以後）の方が統計学的に有意に低下している該マイクロＲＮＡ（α）と該マイクロＲＮＡ（β）との組み合わせである請求項１～４のいずれかに記載のマーカー。
　上記マイクロＲＮＡ（β）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０およびｈｓａ－ｍｉＲ－５７２からなる群より選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡである請求項４または５に記載のマーカー。
　被験者由来の血清中または血漿中に存在するマイクロＲＮＡレベルの動態を検出することを特徴とする乳癌の検査方法。
　上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の健常者または１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程を含む請求項７に記載の乳癌の検査方法。
　上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、上記マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルで除することによって求められる、標準化された該マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の健常者または１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程を含む請求項７に記載の乳癌の検査方法。
　上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、または
　上記マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルを、上記マイクロＲＮＡ（β）の血清中または血漿中に存在するレベルで除することによって求められる、標準化された該マイクロＲＮＡ（α）の血清中または血漿中に存在するレベルとして、
　被験者に由来するサンプルから得られた数値が、１以上の乳癌患者に由来するサンプルから得られた数値と比較し、統計学的に有意差があるか否かを検定する工程を含む請求項７に記載の乳癌の検査方法。
　請求項１～６のいずれかに記載のマーカーとなるマイクロＲＮＡ測定用の試薬を少なくとも含むことを特徴とする乳癌の検査用キット。