JP2019528758A - 前立腺癌の診断および治療のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2016年6月8日に出願された米国仮特許出願第62/347,600号の利益を主張する。
前立腺癌のためのコア針生検予後プラットフォーム。
コア針生検からのmiRNAおよびsnoRNA(まとめてncRNAと呼ばれる)の抽出および特徴付けのための標準操作プロトコル。予後診断に使用された情報価値のあるncRNAのリスト。ウォーターフォールプロットは、比較のためのncRNA発現データセットを使用し、高悪性度腫瘍と低悪性度腫瘍を区別してコア針生検から作成した。
FFREコア針生検からのRNA抽出
このSOPでは、それらを実験室に送った後にRNA材料を得るための、非特定化されたバーコード付きのコア針生検切片の抽出プロセスと取り扱いについて説明する。
A.準備
標本を取り扱うときや運搬するときは、すべての実験室関係者が手袋を着用し、作業環境を適切な除染剤で除染するべきである。
1. 1mLの脱パラフィン溶液またはヘキサデカンを加え、10秒間激しくボルテックスする。チューブを軽く遠心してサンプルを底に移す。840μLの溶媒を取り除き、56℃で3分間インキュベートした後、室温で冷却する。(混合物が不透明に見える場合は、1mLの脱パラフィン溶液またはヘキサデカンを追加して、過剰のパラフィンを溶解する。過剰の溶媒を除去して、160μLの最終容量とする)。
1.NanoDrop分光光度計を1.5μLの最終溶出液に使用して、各前立腺コア針生検材料から得られた全RNAの濃度を決定する。
FFPE組織からのRNA抽出のためのQIAcube自動化システム。
このSOPは、FFPE組織切片からの全RNA精製のためのQIAcube自動化システムを実行するためのセットアップと手順を説明している。
A.準備
標本を取り扱うときや運搬するときは、すべての実験室関係者が手袋を着用し、作業環境を適切な除染剤で除染するべきである。
1. 2mL RBサンプルチューブに12サンプル用のDNase Iインキュベーションミックス(145μLのDNase Iミックス+232μLのDNase Booster緩衝液)を調製する。チューブをマイクロ遠心チューブのスロットAに入れる。
1.DNase Iインキュベーションミックスを有するものおよびフィルターチップを含むすべてのサンプルチューブRBをゴミ箱からバイオハザードビンに移して取り除く。
アッセイ設計。
分子生物学における最近の進歩により、多くのヒト疾患における低分子の非コードRNAの新たな役割を解き明かし、そして複数のタイプのRNAの複合効果がヒト疾患の病因に寄与することが明らかになってきた。このことにより、臨床サンプル中の複数のRNA種を調べることができる新しいアッセイの開発が保証される。
逆転写およびAffymetrix/OpenArrayマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび発現プロファイリング。
このSOPは、QuantStudio(登録商標)12K Flex Real−Time PCRシステムによるOpenArray(登録商標)プラットフォーム上で実行される、RT−PCRに基づく分析のための、非特定化されバーコードを付けたコア針生検切片から得られるRNA材料の調製および実行を記述する。OpenArray(登録商標)技術は特定のハイブリダイゼーション標的を用いたカスタマイズされたアレイが可能であるが、様々なAffymetrixアレイは予めロードされたハイブリダイゼーション標的と共に市販されている。
A.準備
標本を取り扱うときや運搬するときは、すべての実験室関係者が手袋を着用し、作業環境を適切な除染剤で除染するべきである。
I.cDNA合成
1.事前にバーコードを入れた96ウェルプレート中で、非特定化されていない生検材料から抽出したRNAをDNaseおよびRNaseフリーH2Oで50ng/3μLに希釈する。サンプル情報と受託番号は、将来の追跡のために各々のプレートごとにエクセル形式で協調的に記録され保存される。同じ96ウェルプレート内のサンプルは作業バッチと見なされる。
1反応 96反応(10%増)
0.75 79.20 μL カスタムRTプライマー(10倍)
0.15 15.84 μL dNTPs 含dTTP(100mM)
1.50 158.4 μL MultiScnbe(商標)逆転写酵素(50U/μL)
0.75 79.20 μL 10X RT緩衝液
0.90 95.04 μL MgC12(25mM)
0.09 9.50 μL RNase阻害剤(20U/μL)
0.36 38.02 μL ヌクレアーゼフリー水
1.以下のように前増幅サイクル用のPreAmpマスターミックスを調製する(96サンプルに十分):
1反応 96反応(10%増)
12.5 1320μL カスタムPreAmpプライマー(10倍)
2.5 264μL TaqMan PreAmpマスターミックス(2倍)
7.5 792μL ヌクレアーゼフリーH20
1.PCRグレード96ウェルプレートに152μLの0.1X TE緩衝液を添加する。1:20希釈を行うために、8μLの前増幅産物を各ウェルに移す。
指定の−80℃で、適切なQRコードを有するすべての初期RNA材料ならびにcDNA合成、前増幅および希釈した前増幅サイクルからのすべての作業バッチ96ウェルプレートを保存する。
Quant Studio 12K Flexにおいてカスタム設計された56 miRNA Customized Open Arrayを使用したmiRNAの調査。
実施例6では、56個のセンチネル(Sentinel)miRNA用のプローブをカスタマイズされたOpen Arrayプレートに予めロードし、56個の特定のmiRNAを調査するように設計された48個の同一のサンプルウェルを提供した。
Quant Studio 12K Flexの384ウェルブロックを使用した混合miRNAとsnoRNAの調査。
6つのマイクロRNA(miR15b、miR20a、miR21、miR22、miR320cおよびmiR1275)および6つのsncRNA(4つのH/ACA box snoRNA(ACA20、ACA34、ACA42、ACA54)ならびに2つのC/D box snoRNA(U35AおよびU74))の試験セットを使用して、ミックスmiRNAおよび低分子ncRNAを効率的に調べるアッセイの能力を検証した。これらのRNA種のcDNAは、本明細書に記載の遺伝子特異的プライマーを用い、単一のRTミックス中で、本明細書の実施例に記載のように逆転写および増幅された。同じ逆転写cDNA産物を使用し、それら自身の特異的RT−qPCRアッセイ混合液を用いて個々の各miRNAおよびncRNAを首尾よく検出した。シグナル取得は実施例6に記載の通りであった。図10のプロットは、各々の特異的miRNA sncRNA配列についてのCt曲線を示す未変換データを示す。イベントまでの時間を決定するためのデータの変換は、わずかに異なるハイブリダイゼーション速度を有するプローブについてのCtの決定に関連する問題を排除する。
ncRNA配列。
Claims (25)
- 対象における低悪性度または高悪性度前立腺癌を診断するための方法であって、
a)ヒト患者から生物学的サンプルを得るステップ;
b)インビトロアッセイにおいて前記生物学的サンプルを試薬と接触させることによって、配列番号1〜209からなる群から選択される少なくとも10個のncRNAの発現レベルを検出するステップ;および
c)前記少なくとも10個のncRNAの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも高い場合、対象が高悪性度前立腺癌を有すると同定し、または前記少なくとも10個のncRNAの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも低いかもしくは同等である場合、対象が低悪性度前立腺癌を有すると同定するステップ
を含む方法。 - 前記生物学的サンプルが前立腺組織および前立腺細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記前立腺組織がホルマリン固定パラフィン包埋組織である、請求項2に記載の方法。
- 前立腺組織または前立腺細胞からncRNAを抽出するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記検出するステップが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される方法によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記試薬が、オリゴリボヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴリボヌクレオチドプローブ、およびオリゴヌクレオチドプローブ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- ncRNAが、miRNA、C/D box snoRNA、H/ACA box snoRNA、scaRNA、piRNA、およびIncRNAからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記前立腺組織サンプルが、配列番号21、27、33、55、61、67、71、86、94、95、102、105、111、112、126、131、136、141、160、162、166、185、189、193、および202からなる群から選択される少なくとも10個のncRNAについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じncRNAについての相対および累積発現プロファイルと比較される、請求項4に記載の方法。
- 低悪性度または高悪性度前立腺癌について対象をスクリーニングする方法であって、
a)前記対象からの生物学的サンプル由来のncRNAを、全ゲノムncRNAに対するプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズさせるステップ;
b)配列番号1〜209からなる群から選択される少なくとも10個のncRNAについてのハイブリダイゼーション生成物の相対存在量を検出するステップ;および
c)前記生物学的サンプルからの前記少なくとも10個のncRNAの累積発現レベルと低悪性度前立腺癌生物学的サンプルからの前記少なくとも10個のncRNAの累積発現レベルとを比較するステップ
を含み、前記対象における前記少なくとも10個のncRNAの発現のレベルの増加は、さらなる治療を必要とする高悪性度前立腺癌の指標となり、および前記対象における前記少なくとも10個のncRNAの発現の同等かまたはそれ未満のレベルは、さらなる治療を必要としない低悪性度前立腺癌の指標となる、方法。 - 前記生物学的サンプルが前立腺組織および前立腺細胞からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記前立腺組織がホルマリン固定パラフィン包埋前立腺組織である、請求項10に記載の方法。
- 前立腺組織または前立腺細胞からncRNAを抽出するステップをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記検出するステップが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される方法によって行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記試薬が、オリゴリボヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴリボヌクレオチドプローブ、およびオリゴヌクレオチドプローブ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- ncRNAが、miRNA、C/D box snoRNA、H/ACA box snoRNA、scaRNA、piRNA、およびIncRNAからなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記前立腺組織サンプルが、配列番号21、27、33、55、61、67、71、86、94、95、102、105、111、112、126、131、136、141、160、162、166、185、189、193、および202からなる群から選択される少なくとも10個のncRNAについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じncRNAについての相対および累積発現プロファイルと比較される、請求項9に記載の方法。
- 対象における高悪性度前立腺癌を治療する方法であって、
a)ヒト患者から生物学的サンプルを得るステップ;
b)インビトロアッセイにおいて前記生物学的サンプルを試薬と接触させることによって、配列番号1〜209からなる群から選択される少なくとも10個のncRNAの発現レベルを検出するステップ;
c)前記少なくとも10個のncRNAの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも高い場合、対象が高悪性度前立腺癌を有すると同定し、または前記少なくとも10個のncRNAの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも低いかもしくは同等な場合、対象が低悪性度前立腺癌を有すると同定するステップ;および
d)i)前立腺組織の部分的または完全な外科的除去のための手術;
ii)実効線量の放射線の投与;および
iii)高悪性度前立腺癌の治療のための治療有効量の薬物の投与
の1つまたは複数により高悪性度前立腺癌を治療するステップを含む方法。 - 前記手術が、腹腔鏡手術、腹腔鏡下根治的前立腺摘除術、前立腺摘除術、および根治的恥骨後式前立腺摘除術から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記放射線が、外照射療法、近接照射療法、3Dコンホメーション療法、ガンマナイフ療法、および粒子線療法から選択される、請求項17に記載の方法。
- 高悪性度前立腺癌の治療のための前記薬物が、化学療法薬および性ホルモン抑制薬から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記化学療法薬が、ドセタキセル(docetaxel)(Taxotere;タキソテール)、カバジタキセル(cabazitaxel)(Jetvana;ジェトバナ)、ゴセレリン(Goserelin)(Zoladex;ゾラデックス)、フルタミド(Flutamide)(Eulexin;ユーレキシン)、ビカルタミド(Bicalutamide)(Casodex;カソデックス)、アビラテロン(Abiraterone)(Zytiga;ジティガ)、およびニルタミド(Nilutamide)(Nilandron;ニランドロン)から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記化学療法薬が前記少なくとも10個のncRNAの複合発現レベルに基づいて選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記性ホルモン抑制剤がロイプロリド(Leuprolide)(ルプロン;Lupron)である、請求項20に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、配列番号21、27、33、55、61、67、71、86、94、95、102、105、111、112、126、131、136、141、160、162、166、185、189、193、および202からなる群から選択される少なくとも10個のncRNAについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じncRNAについての相対および累積発現プロファイルと比較される、請求項17に記載の方法。
- a)患者の生物学的サンプルからncRNAを単離するための第1の試薬溶液;および
b)配列番号1〜209からなる群から選択される、前記第1の試薬溶液からの、少なくとも10個のncRNAの発現レベルを検出するための第2の試薬溶液:
を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法のためのキット。
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