CN112877436B - 一种snp基因型的检测方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种SNP基因型的检测方法，步骤如下：从血细胞中提取细胞基因组DNA，设计该SNP位点的上下游引物，通过分子克隆技术得到PCR产物，电泳切胶回收后纯化产物，经测序确认SNP位点基因型A/C。本发明检测SNP基因型所需的样本是血细胞，对病人几乎无创伤；通过分子克隆之后得到纯化产物，相对快速便捷，避免了繁琐的组织切片制备过程；通过测序查看SNP位点基因型，结果直观清晰。

Description

一种SNP基因型的检测方法及用途
技术领域
本发明属于医学技术领域，尤其是一种SNP基因型的检测方法及用途。
背景技术
SNP-rs1192691(A/C)与卵巢癌风险有关。卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，其死亡率更是居于妇科恶性肿瘤首位，其高死亡率主要由于预后差，晚期病人生存率低。
临床分期往往通过物理诊断、影像学检查、病理活检等手段得到肿瘤分期的信息。很多肿瘤的治疗不仅仅依靠手术，手术前的治疗作为标准治疗方案应用于多种肿瘤。病理分期只能针对于接受手术切除肿瘤或者探查肿瘤的病例，并且要综合临床分期和手术结果所做出诊断。它对于判断患者的预后和制定术后辅助治疗的策略至关重要。
目前临床上判断卵巢癌患者的预后和制定术后辅助治疗主要依赖于病理检查。病理报告的信息包括肿瘤的大小，是否侵及其他组织和脏器，肿瘤细胞的类型，肿瘤的分化程度(反映肿瘤细胞与正常组织的相似程度)。通过对于切除的肿瘤或是通过内窥镜等手段获得组织切片在显微镜下的观察可以为确诊肿瘤和肿瘤的准确分期提供，从而提供有关于淋巴结和其他器官受累的相关信息。
目前，病理学检测必须经过手术切除获得样本才能完成检测，会对病人造成不可避免的创伤。另外，对于切除的肿瘤获得组织切片后完成确诊整个过程周期太长。同时，繁琐的制备过程可能会影响组织切片的质量，影响后期诊断。而且，在显微镜下的对组织切片染色的观察和后期对肿瘤的分期容易受诊断人主观判断，不能提供直观的信息。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种SNP基因型的检测方法及用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种SNP基因型的检测方法，步骤如下：
从血细胞中提取细胞基因组DNA，设计该SNP位点的上下游引物，通过分子克隆技术得到PCR产物，电泳切胶回收后纯化产物，经测序确认SNP位点基因型A/C。
如上所述的SNP基因型的检测方法检测得到的SNP位点基因型为rs1192691AA基因型。
如上所述的rs1192691AA基因型在作为卵巢癌预后的判断指标方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明检测SNP基因型所需的样本是血细胞，对病人几乎无创伤；通过分子克隆之后得到纯化产物，相对快速便捷，避免了繁琐的组织切片制备过程；通过测序查看SNP位点基因型，结果直观清晰。
2、本发明通过无创伤方法检测该SNP的基因型，不需要临床提供肿瘤样本，节约成本，效率高，可以利用已研究的结果(rs1192691AA基因型与卵巢癌病人恶性预后相关)预测病人预后，取代病理检查，从而推断病人分期，及时制定术后辅助治疗措施。
3、本发明使用检测血细胞中SNP-rs1192691基因型方法代替病理检查；通过临床样本检测得到SNP基因型是AA时与卵巢癌病人恶性预后相关；检测SNP基因型能预估临床卵巢癌病人预后，rs1192691可作为检测卵巢癌预后的指标(本发明中检测位点电泳图举例见图1；基因型测序峰图举例见图2、图3)。
附图说明
图1为本发明中SNP-rs1192691电泳图(749bp)；
图2为本发明中SNP-rs1192691测序峰图(A/A)；
图3为本发明中SNP-rs1192691测序峰图(A/C)；
图4为本发明中不同基因型在不同期病人中占比图；
图5为本发明中基因型与预后关联分析图；
图6为本发明中OVCA432和SKOV3两个细胞系BrdU检测图；
图7为本发明中OVCA432和SKOV3两个细胞系划痕实验图；
图8为本发明中OVCA432和SKOV3两个细胞系侵袭实验图；其中，左图为侵袭实验结晶紫染色后的镜下图，右图为两个细胞系侵袭细胞数计数统计图；
图9为本发明中裸鼠皮下成瘤(SKOV3)实验图；其中，上图为取出的肿瘤大小图，下图中左图为肿瘤体积大小统计图，下图中右图为肿瘤质量统计图；
图10为本发明中裸鼠皮下成瘤(SKOV3)的增殖情况检测图；其中，左图为皮下肿瘤SKOV3(A/A)组石蜡切片Ki-67免疫组化图，中图为皮下肿瘤SKOV3(C/C)组石蜡切片Ki-67免疫组化图，右图为两组肿瘤的石蜡切片Ki-67阳性细胞计数统计图；
图11为本发明中裸鼠尾静脉注射(SKOV3)后肺转移实验图；其中，左图为肺转移结节(箭头指向)图，左图第一行从左至右依次为SKOV3(A/A)组五只裸鼠肺结节图(箭头指向)，左图第二行从左至右依次为SKOV3(C/C)组五只裸鼠肺结节图(没有可见结节)，右图为两组裸鼠的肺转移结节统计图；
图12为本发明中裸鼠尾静脉注射(SKOV3)实验肺组织组石蜡切片HLA-1免疫组化图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种SNP基因型的检测方法，步骤如下：
从血细胞中提取细胞基因组DNA，设计该SNP位点的上下游引物，通过分子克隆技术得到PCR产物，电泳切胶回收后纯化产物，经测序确认SNP位点基因型A/C。
如上所述的SNP基因型的检测方法检测得到的SNP位点基因型为rs1192691AA基因型。
如上所述的rs1192691AA基因型在作为卵巢癌预后的判断指标方面中的应用。
具体地，相关制备及检测如下：
一、SNP位点的检测
(1)获得血细胞标本
(2)用试剂盒提取基因组DNA(TIANamp Genomic DNAKit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒为例)
(3)以SNP-rs1192691为中心设计上下游引物，扩增产物片段749bp(rs1192691-F:5′-CTGCAGTCTGAACACCGT-3′；rs1192691-R:5′-CCAAGCTAAAGTAAGAATCCATATC-3′)，以基因组DNA为模板做PCR。
扩增体系如下：
Vazyme高保真酶试剂盒PCR体系50μl：
Figure BDA0002965041890000031
Figure BDA0002965041890000041
二、通过测序得到该SNP位点基因型(A/C)
100例卵巢癌患者rs1192691位点的基因型与预后进行关联分析，前期已经通过对100例卵巢癌患者rs1192691位点进行基因型检测并与预后进行关联分析，发现A/A基因型在晚期病人中相对早期病人占比更高(病人基因型检测结果见图4)，且A/A基因型病人预后更差(相关性分析见图5)。之后通过细胞体外实验BrdU检测，结果证明基因型为(A/A)的卵巢癌细胞增值水平高于基因型(C/C)卵巢癌细胞(相关检测见图6)。同时划痕实验和小室侵袭实验证明基因型为(A/A)的卵巢癌细胞迁移和侵袭水平强于基因型(C/C)卵巢癌细胞(划痕实验见图7，侵袭实验见图8)。本申请人采用异种移植模型，将SKOV3(A/A)和SKOV3(C/C)细胞皮下接种BALB/C裸鼠。接种2个月后，SKOV3(A/A)细胞比SKOV3(C/C)细胞形成更大的皮下肿瘤，表明rs1192691等位基因A/A促进了体内的增殖(小鼠成瘤情况见图9)。与SKOV3(C/C)肿瘤相比，SKOV3(A/A)肿瘤的Ki67活性几乎增加了2倍(Ki-67免疫组化染色见图10)。接下来，本申请人将癌细胞静脉注射到BALB/c裸小鼠的尾静脉，以评估rs1192691在肿瘤转移中的作用。经尾静脉注射2个月后，小鼠携带SKOV3(A/A)细胞组可见肺转移结节，而在携带SKOV3(C/C)细胞组未见肺转移结节(肺转移见图11)，提示rs1192691等位基因在体内促进肺转移。当本申请人对带有SKOV3(C/C)细胞的小鼠肺组织切片进行HLA-I染色时，发现肺组织中有大量的人类癌细胞播种。HLA-I可以区分人类细胞和小鼠细胞。这些癌细胞在小鼠肺组织中呈分散的单细胞分布，没有定植(图12)。这些结果表明，SKOV3(C/C)细胞能够浸润肺组织，但不产生肉眼可见的转移。
因此通过体内体外实验进一步能验证此项发明，通过检测该SNP位点基因型，利用该位点基因型与肿瘤增殖转移有关，且与病人预后相关这一新用途可以针对卵巢癌病理分期进行预判。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津医科大学
<120> 一种SNP基因型的检测方法及用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> rs1192691-F(Unknown)
<400> 1
ctgcagtctg aacaccgt 18
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> rs1192691-R(Unknown)
<400> 2
ccaagctaaa gtaagaatcc atatc 25

Claims (1)

1.检测rs1192691AA基因型的试剂在制备用于卵巢癌预后的试剂盒中的应用。
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