CN111485022A - 一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、检测引物、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、检测引物、试剂盒，属于基因工程及肿瘤学领域。本发明的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，所述lncRNA标志物为KCNMA1‑AS2‑201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，利用该标志物在结直肠癌组织中呈特异性低表达，而在正常组织中没有这种特异性低表达的特点，可将其作为一个特异的分子标志物来设计合成特异性检测试剂，用于临床结直肠癌的早期辅助诊断，提高结直肠癌的诊断效率。

Description

一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、 检测引物、试剂盒

技术领域

本发明涉及一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、检测引物、试剂盒，属于基因工程及肿瘤学领域。

背景技术

lncRNA是一类长度大于200bp的核苷酸，不具备蛋白质编码功能，但具有广泛的基因表达调控的非编码RNA分子。lncRNA在20世纪80年代以前并不认为在生物翻译功能中扮演重要角色。然而，lncRNA作为潜在的诊断性生物标志物和治疗靶点，近年来受到了临床和实验室的广泛关注。有报道称lncRNA在不同的癌症中异常表达，可分为致癌基因或抑癌基因。lncRNAs随后被证实参与了细胞增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭等多种生物学过程，并参与了多种生物学途径。此外，它们在控制微小RNA(microRNA,miRNA)功能方面也起着关键作用，lncRNA可作为内源竞争RNA从而进一步影响靶mRNA。lncRNA生物学功能广泛，涉及染色体修饰、转录及转录后调控、翻译调控、表观调控及细胞周期调节等。

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)作为消化系统常见的恶性肿瘤之一，癌症死亡率高且发病趋向老龄化。全世界每年有120万以上的新病例，超过60万例死亡。在亚洲国家，结直肠癌发病率和死亡率都在迅速增长，且五年生存率仅有64.9％。早发现、早诊断、早对大幅提高癌症治愈率和延长生存期意义重大，结直肠癌的检测手段亟待发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，能够提高结直肠癌早期诊断的效率。

本发明的目的还在于提供一种检测引物和包含该检测引物的试剂盒。

为了实现以上目的，本发明的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用所采用的技术方案是：

一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，所述lncRNA标志物为KCNMA1-AS2-201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，利用该标志物在结直肠癌组织中呈特异性低表达，而在正常组织中没有这种特异性低表达的特点，可将其作为一个特异的分子标志物来设计合成特异性检测试剂，用于临床结直肠癌的早期辅助诊断，提高结直肠癌的诊断效率。

优选的，根据所述的lncRNA标志物序列设计合成特异性检测试剂，用于制备结直肠癌早期诊断产品。

所述结直肠癌早期诊断产品为制剂、芯片或试剂盒。

本发明根据KCNMA1-AS2-201序列设计合成特异性检测试剂(如引物、DNA探针等)，该试剂能基于定量PCR方法和/或高通量测序方法和/或探针杂交方法等检测样本中KCNMA1-AS2-201的表达水平，或者基于免疫学方法检测KCNMA1-AS2-201调控的靶基因的表达水平，并以此作为结直肠癌早期诊断的有效信息。

本发明的检测引物所采用的技术方案为：

一种检测引物，所述检测引物根据lncRNA标志物序列设计合成；所述lncRNA标志物为KCNMA1-AS2-201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明的检测引物能特异性识别KCNMA1-AS2-201并检测组织中KCNMA1-AS2-201的表达量，为临床结直肠癌的早期诊断提供有效信息。

优选的，所述检测引物的序列如下所示：

KCNMA1-AS2-201 Primer F：5′-CTCCCTTATCCCACTTCC-3′；

KCNMA1-AS2-201 Primer R：5′-CTCTTGCATGGGTTCTGT-3′。

本发明的试剂盒所采用的技术方案为：

一种试剂盒，包括上述的检测引物。

本发明的试剂盒中包含上述能特异性识别KCNMA1-AS2-201并检测组织中KCNMA1-AS2-201的表达量的引物，组成简单，使用方便、定量准确，检测结果稳定可靠，可以提高临床结直肠癌早期诊断的敏感性和特异性。

优选的，所述试剂盒还包括聚合酶链式反应试剂及其反应缓冲液、dNTP、内参引物和荧光染料。所述内参引物可以为GAPDH管家基因的特异性检测引物。所述荧光染料可以选择SYBR-Green染料。

优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂和cDNA逆转录试剂。该试剂盒结合常用的RNA提取试剂和通用的逆转录试剂，可以特异地检测组织中KCNMA1-AS2-201的表达量，有效地用于结直肠癌早期辅助诊断。

试验证明，使用常用的PCR试剂和T7启动子转录合成RNA试剂，可以特异地在细胞中提高KCNMA1-AS2-201的表达量，结果表明提高KCNMA1-AS2-301的表达可对细胞增殖产生抑制作用。本发明中与结直肠癌早期诊断相关的lncRNA标志物为临床治疗结直肠癌提供了新的药物靶点，可通过干扰该lncRNA标志物的表达抑制结直肠癌的生长和转移。

附图说明

图1为试验例2中病例1～4以及病例7～10结直肠癌病人KCNMA1-AS2-201相对表达量；

图2为试验例2中病例5～6的结直肠癌病人KCNMA1-AS2-201相对表达量；

图3为试验例3中5种细胞系KCNMA1-AS2-201相对表达量；

图4为试验例4中在HCT116细胞系中过表达KCNMA1-AS2-201结果；

图5为试验例4中在SW1463细胞系中过表达KCNMA1-AS2-201结果；

图6为试验例5中MTT法检测过表达lncRNA KCNMA1-AS2-201对HCT116细胞增殖的影响；

图7为试验例5中MTT法检测过表达lncRNA KCNMA1-AS2-201对SW1463细胞增殖的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施方式本发明的技术方案作进一步的说明。

除特殊说明的外，以下各实施例及试验例中所用细胞系、试剂等均为市售商品。结直肠癌细胞系均来自于ATCC细胞库。

实施例1

本实施例的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，是依据lncRNA标志物KCNMA1-AS2-201设计合成特异性检测引物用于制备结直肠癌早期诊断的试剂盒；lncRNA标志物为KCNMA1-AS2-201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；上述的特异性检测引物序列如下所示：

KCNMA1-AS2-201 Primer F(SEQ ID NO.1)：5’-CTCCCTTATCCCACTTCC-3’；

KCNMA1-AS2-201 Primer R(SEQ ID NO.2)：5’-CTCTTGCATGGGTTCTGT-3’。

实施例2

本实施例的检测引物为用于检测与结直肠癌早期诊断相关的lncRNA标志物的表达水平的引物，根据KCNMA1-AS2-201序列设计合成，引物序列如下所示：

KCNMA1-AS2-201 Primer F(SEQ ID NO.1)：5’-CTCCCTTATCCCACTTCC-3’；

KCNMA1-AS2-201 Primer R(SEQ ID NO.2)：5’-CTCTTGCATGGGTTCTGT-3’。

本实施例的检测引物可用于检测样本中KCNMA1-AS2-201的表达量，作为结直肠癌早期诊断的有效信息。

实施例3

本实施例的试剂盒为用于结直肠癌早期诊断的lncRNA试剂盒(用于30次反应)，组成如下：

使用本实施例的试剂盒，结合常用的RNA提取试剂和通用的逆转录试剂，可以特异地检测组织中KCNMA1-AS2-201的表达量，有效地用于结直肠癌早期辅助诊断。

试剂盒的另一实施例与实施例3的试剂盒的区别仅在于包括RNA提取试剂和通用的逆转录试剂。

实施例3中lncRNA试剂盒的效果检查：

选取新乡医学院第一附属医院胃肠外科2018-2019年50例结直肠癌病例，提取新鲜组织标本中的总RNA，采用试验例3的方法检测KCNMA1-AS2-201的相对表达量。

结果显示，lncRNA试剂盒能够特异、有效地扩增出KCNMA1-AS2-201序列。统计分析结果表明，在50例结直肠癌病人中KCNMA1-AS2-201相对表达量均有明显的降低，平均降低了16.131倍(P＜0.01)。因此，KCNMA1-AS2-201可以作为一个特异的分子标志物来提高结直肠癌的诊断效率。

试验例1

筛选与结直肠癌早期诊断相关的lncRNA标志物，包括以下步骤：

1)选取胃肠外科收治的结直肠癌患者的肿瘤组织和邻近5cm以外正常结肠组织作为对照，病人肿瘤分型确定，病人未经任何放疗和化疗，使用lncRNA测序检测差异表达的lncRNA；

2)使用Trizol，提取总RNA；

3)总RNA质量检测，浓度及纯度采用nanodrop2000检测，完整性采用RNA专用琼脂糖电泳(或是2100生物分析仪)检测；

4)使用Ribo-Zero rRNA Removal Kit去除总RNA中的核糖体RNA；

利用RNase R消化线性RNA；

利用带有oligo-dT的磁珠调取带有PolyA尾的RNA，以最大程度消除线性RNA；

5)对纯化后的RNA通过离子打断的方式，打断到200-300bp片段；

6)第一链cDNA的合成：通过随机引物和逆转录酶的作用合成第一链cDNA；

第二链cDNA的合成：以第一链cDNA为模板进行第二链cDNA的合成(注：第二链cDNA合成时，其中的碱基T，被替换成U，从而达到链特异性文库的目的)；

对双链cDNA进行末端修复补平，再在3’端加个A，然后在链接酶的作用下加上测序接头；

7)通过磁珠的方式对上述加好接头的产物进行片段的选择，去除多余的接头序列；

8)PCR扩增富集文库片段，扩增完后进行一个片段大小的选择，文库大小在300-400bp；

9)文库质检：2100检测文库大小，荧光定量检测文库总浓度；

10)文库的稀释与混合：根据文库的有效浓度、文库需要得到的数据量，将含有不同index序列的文库按比例进行混合；

混合文库统一稀释到2nM，通过碱变性，形成单链文库；

11)Nextseq/Hiseq上机测序：根据文库的不同，选择最佳的上样量上机，以单链文库为模板进行PCR扩增、测序引物退火、边合成边测序。

测序结果表明，与临近正常结肠组织相比，结直肠癌组织中KCNMA1-AS2-201的表达水平显著降低(p＜0.01)。

试验例2

结直肠癌组织与正常组织中KCNMA1-AS2-201的表达量检测，包括以下步骤：

1)选取胃肠外科收治的10名结直肠癌患者的肿瘤组织和邻近5cm以外正常结肠组织作为对照，病人肿瘤分型确定，病人未经任何放疗和化疗。选取的肿瘤组织应尽可能避免纤维结缔组织或坏死的瘤组织，并立刻放入液氮中。

10例结直肠癌患者资料如表1所示。

表1 10例结直肠癌患者资料

2)提取RNA

采用TRIzol一步法提取结直肠癌肿瘤组织和正常结肠组织的总RNA，操作按照RNA提取试剂盒(Invitrogen，USA)说明书进行。采用NanoDrop2000c分别测定波长230、260、280nm处的吸光度值，确定总RNA的纯度和浓度。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样品，鉴定其纯度和完整度。

3)逆转录

操作按照HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康为世纪)说明书进行。

表2去除基因组DNA体系

表3逆转录体系

4)RT qPCR

qPCR反应体系如表4所示。

表4 SYBR Green qPCR体系：

qPCR反应条件如表5所示。

表5 qPCR反应条件

5)RT-qPCR结果分析

以GAPDH管家基因作为内参，采用相对定量法，计算基因的相对表达量。基因的相对表达量F＝2^-△△ct，F值越小意味着相对表达量降低越多。其中△△ct＝(待测样本中目的基因的ct的平均值-待测样本中管家基因的ct的平均值)-(对照样本中目的基因的ct的平均值-对照样本中管家基因的ct的平均值)。

结果发现，在10例结直肠癌病人中KCNMA1-AS2-201相对表达量均有明显的降低。在病例1中KCNMA1-AS2-201相对表达量降低了1.442倍，在病例2中降低了2.301倍，在病例3中降低了6.406倍，在病例4中降低了16.003倍，在病例5中降低了2.880倍，在病例6中降低了1640.696倍，在病例7中降低了19.673倍，在病例8中降低了167.851倍，在病例9中降低了29.925倍，在病例10中降低了23.905倍。10例结直肠癌病人KCNMA1-AS2-201相对表达量见图1和图2。

试验例3

5种细胞系中KCNMA1-AS2-201的表达量检测，包括以下步骤：

1)选取5种细胞系，其中HT-29、HCT-116和CaCo2是结肠癌细胞系；SW1463是直肠癌细胞系；NCM460是正常人结肠粘膜上皮细胞系。

5种细胞系具体信息见表6。

表6结直肠癌和正常人结肠粘膜上皮细胞系

ATCC<sup>@</sup>No.	名称	组织	疾病	生物
					HTB-38<sup>TM</sup>	HT-29	结肠	结直肠腺癌	人
CCL-247<sup>TM</sup>	HCT-116	结肠	结直肠癌	人
					HTB-37<sup>TM</sup>	CaCo-2	结肠	结直肠腺癌	人
CCL-234<sup>TM</sup>	SW1463	直肠	结直肠腺癌C型	人
						NCM460	结肠	正常人结肠粘膜上皮	人

2)提取RNA

采用TRIzol一步法提取结直肠癌肿瘤组织和正常结肠组织的总RNA，操作按照RNA提取试剂盒(Invitrogen，USA)说明书进行。采用NanoDrop2000c分别测定波长230、260、280nm处的吸光度值，确定总RNA的纯度和浓度。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样品，鉴定其纯度和完整度。

3)逆转录

操作按照HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康为世纪)说明书进行。

表7去除基因组DNA体系

表8逆转录体系

4)RT qPCR

qPCR反应体系如表9所示。

表9 SYBR Green qPCR体系：

qPCR反应条件如表10所示。

表10 qPCR反应条件

5)RT-qPCR结果分析

以GAPDH管家基因作为内参，采用相对定量法，计算基因的相对表达量。基因的相对表达量F＝2^-△△ct，F值越小意味着相对表达量降低越多。其中△△ct＝(待测样本中目的基因的ct的平均值-待测样本中管家基因的ct的平均值)-(对照样本中目的基因的ct的平均值-对照样本中管家基因的ct的平均值)。

结果发现，在4种结直肠癌细胞系中KCNMA1-AS2-201相对表达量均有明显的降低(P＜0.01)。在HT29细胞系中KCNMA1-AS2-201相对表达量降低了5.490倍，在SW1640细胞系中降低了4.482倍，在HCT116细胞系中降低了7.015倍，在CaCo2细胞系中降低了2.542倍。5种细胞系中KCNMA1-AS2-201相对表达量见图3。

试验例4

本试验例是在细胞系内对lncRNA KCNMA1-AS2-201进行过表达，具体方法为：

1)合成目标DNA片段，包括以下步骤i)合成序列T7 promoter+KCNMA1-AS2-201，作为双链DNA模板，使用

High-Fidelity 2X Master Mix kit(NEB)进行扩增。

表11 PCR体系

表12 PCR程序

ii)纯化PCR产物

在上一步PCR产物中加入3M NaAC和100％无水乙醇使其最终浓度分别为0.3M和70％。高速离心10min，弃上清，1ml 70％乙醇清洗沉淀。离心2min,弃上清，自然风干沉淀物，加入Nuclease free水溶解沉淀，测定浓度，1.5％琼脂糖凝胶电泳验证片段大小。

iii)使用HiScribe^TMT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成RNA片段。

表13合成RNA反应体系

将含有上述体系的反应管至于37℃条件下孵育10hr。加入30μl Nuclease free水稀释产物。加入2μl DNase I，混合并于37℃孵育15min去除DNA。加入25μl LiCl混合均匀，放置于-20℃孵育30min。4℃离心15分钟沉淀RNA。弃上清，加入500μl 75％乙醇清洗沉淀。风干沉淀，加入0.1mM EDTA溶解沉淀，测定RNA浓度，存放于-80℃。

2)过表达转染

i)使用12孔板进行转染，转染前用不含双抗的培养基铺板细胞，每孔铺1x10⁵细胞，至融合度70％-90％进行转染。

ii)转染

a)将10ng RNA溶于100μl无血清无双抗培养基中。

b)将2μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)溶于100μl无血清无双抗培养基中，混匀室温放置5min。

c)将A、B两管混合放置20min。

d)每孔加入200μl混合物

iii)转染24hr之后用qPCR测定相对表达量，结果如图4～5，KCNMA1-AS2-201过表达成功。

试验例5

本试验例使用MTT法测定过表达lncRNA KCNMA1-AS2-201对结直肠癌细胞增殖的影响，具体包括以下步骤：

i)使用96孔板，转染前用不含双抗的培养基铺板细胞，每孔铺5000-10000个细胞，第二天待细胞贴壁后进行转染。

ii)转染

a)将1.25ng、2.5ng RNA分别溶于25μl无血清无双抗培养基中

b)将0.25μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)溶于25μl无血清无双抗培养基中，混匀室温放置5min。

c)将A、B两管混合放置20min。

d)每孔加入50μl混合物

iii)转染0hr、24hr、48hr、72hr之后，弃去培养基，加入100μl培养基和10μl 5mg/ml MTT溶液混合物，37℃孵育4hr。

iv)弃去培养基与MTT混合物，加入100μl DMSO，孵育10min。

v)酶联免疫检测仪OD540nm测定吸光度值，结果如图6～7，结果表明过表达lncRNAKCNMA1-AS2-201可以降低细胞增殖。

<110> 新乡医学院

<120> 一种与结直肠癌早期诊断相关的lncRNA标志物、检测引物、试剂盒、制剂及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> KCNMA1-AS2-201 Primer F

<400> 1

ctcccttatc ccacttcc 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> KCNMA1-AS2-201 Primer R

<400> 2

ctcttgcatg ggttctgt 18

<211> 427

<212> DNA

<213> 人

<221> KCNMA1-AS2-201

<400> 3

ataaaaacct gaactcaaag aagagaactg gaataatcct cccttatccc acttcccatg 60

gtgagcccca gctgggacgc tgacacatgg ccccaacttt tcctcctgcc tgatgtctgg 120

acccacaggg gacagatggt ggtccctggt cactgaagta cccacagaac ccatgcaaga 180

ggcacaaaac catctgctta gtggtcatgt ggcagcagac agtatctcag aagtcctcgc 240

agcatatgac ttcactgatg aagatggatc acacttgagc agggattctt gatctctgca 300

aaacagctca tacacaacag gaacaatctc acagataaga aaaactccag aagttggtct 360

cgggctatga aaatttctgc cacaatatga tttatatgaa aataaataaa gtgggtctac 420

tacttta 427

Claims (8)

1.一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：所述lncRNA标志物为KCNMA1-AS2-201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：根据所述的lncRNA标志物序列设计合成特异性检测试剂，用于制备结直肠癌早期诊断产品。

3.根据权利要求2所述的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：所述结直肠癌早期诊断产品为制剂、芯片或试剂盒。

4.一种检测引物，其特征在于：所述检测引物根据lncRNA标志物序列设计合成；所述lncRNA标志物为KCNMA1-AS2-201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的检测引物，其特征在于：所述检测引物的序列如下所示：

KCNMA1-AS2-201 Primer F：5′-CTCCCTTATCCCACTTCC-3′；

KCNMA1-AS2-201 Primer R：5′-CTCTTGCATGGGTTCTGT-3′。

6.一种试剂盒，其特征在于：包括如权利要求4或5所述的检测引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：还包括聚合酶链式反应试剂及其反应缓冲液、dNTP、内参引物和荧光染料。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：还包括RNA提取试剂和cDNA逆转录试剂。

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