CN113186280A

CN113186280A - 抑制结直肠癌生长的靶标uc﹒77-与诊断标志物及其应用

Info

Publication number: CN113186280A
Application number: CN202110352441.8A
Authority: CN
Inventors: 金红蕾; 郑志坚; 楼哲丰
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2041-03-31
Also published as: CN113186280B

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种抑制结直肠癌生长的新靶标及其应用。本发明以结直肠癌HCT116，SW620细胞为模型，过表达uc.77‑可以在体外抑制结直肠癌细胞锚定非依赖生长、并在体内抑制裸鼠皮下肿瘤的形成。本发明有望成为抑制结直肠癌生长的新靶标。

Description

抑制结直肠癌生长的靶标uc﹒77-与诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抑制结直肠癌生长的新肿瘤标志物及新靶标的发现与其应用，更具体涉及uc.77-作为抑制结直肠癌生长研究的新肿瘤标志物及新靶标与其应用。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构(IARC)发布的全球癌症负担状况最新估计报告数据显示，全球癌症负担持续增长。国际癌症研究机构(IARC)通过GLOBOCAN 估算，2018年全球新发生癌症数约1810万例和癌症死亡数约960万例。其中，结肠癌新发生病例约占6.1％，死亡数约占5.8％；直肠癌新发生病例约占3.9％，死亡数约占3.2％。有数据预测，2030年结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的病例数会有60％增幅，新发病例数达到220万以上，死亡数达到110万例。近些年来，我国CRC的发病率和死亡率也处于上升趋势。2015年我国CRC发病率为0.282‰，死亡率为0.1361‰，分别居于恶性肿瘤的第三位和第五位。结直肠癌早期症状并不明显，患者住院时已是晚期，错过最佳治疗时间。因此寻找更加准确特异的诊断标志物及有效抑制肿瘤增殖治疗靶标，提高CRC患者的诊断与治疗效果，是本行业目前临床实践中需要迫切解决的问题。

在非编码RNA发现之前，人们一直认为生物在分子层面上的生物学行为是由蛋白质与蛋白质的相互作用实现的。而后来的研究发现，人类基因组中编码基因只占人基因组的3％。而 75％的基因组序列能够被转录成RNA，其中近74％的转录产物为非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)，起初人们认为这些转录产物都是基因表达的转录“噪声”，本身并不具备任何生物学功能。但是，随着研究的深入，近些年来越来越多的研究发现非编码RNA在生命过程中扮演着极为重要的角色。

UCR是非编码基因序列，共有481个区段，且在人、大鼠和小鼠等多种哺乳动物中100％保守。这些区段可以落在编码基因的外显子亦或者是内含子上。而这些从UCR区域转录过来的非编码RNA被称为T-UCR，也叫超保守基因(uc.)。一些新的证据发现UCRs转录出的非编码RNA可以调控基因的表达。T-UCR作为一种新型lncRNA在不同的肿瘤类型中发挥重要的功能，并且扮演着癌基因和抑癌基因的角色。大部分T-UCR的功能仍然未知，但其高度保守性及其在多种组织中的大量表达表明了其在生物功能中的重要作用。

uc.77-已被公开发表于Journal of Cellular and Molecular Medicine，目前已知的用途是：uc.77-的过表达诱导了EMT。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种抑制结直肠癌生长靶标与诊断标志物及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供uc.77-的用途：作为抑制结直肠癌生长的靶标、诊断标志物。

本发明还同时提供了uc.77-表达促进剂在制备抑制结直肠癌生长药物中的应用。

作为本发明应用的改进：抑制结直肠癌细胞体内增殖。

作为本发明应用的进一步改进：所述uc.77-表达促进剂为uc.77-的过表达质粒。

本发明还同时提供了一种预防或/和治疗结直肠癌的组合物，组合物包含：

(1)uc.77-的表达促进剂；

(2)药剂学上能够接受的载体。

作为本发明的预防或/和治疗结直肠癌的组合物的改进：所述uc.77-表达促进剂为uc.77- 的过表达质粒。

本发明还同时提供了一种检测uc.77-表达的试剂，所述uc.77-表达的试剂包含基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂，该试剂包含一对特异性引物：

F(上游引物):5’CTGTCACACTGCTCCCAAGAA3’；

R(下游引物):5’GGGAGAACTCAGCCAAAGATG 3’。

本发明的目的在于表明uc.77-可以应用为结直肠癌生长的诊断标志物以及治疗靶标，即， uc.77-作为治疗结直肠癌的靶标的作用。

本发明所采取的技术方案如下：将5对配对的结直肠正常组织和结直肠癌组织临床样本进行T-UCR微阵列芯片测序送样，发现uc.77-在芯片表达谱中显著下调。然后进一步采用实验室收集的150对临床组织样本通过RT-QPCR技术进行验证，发现在150对临床组织样本中，相较于癌旁正常组织，uc.77-基因在癌组织中表达水平同样显著下调，与芯片结果一致。

本发明通过构建uc.77-过表达载体并建立HCT116细胞和SW620细胞稳转细胞株后，通过ATP活力测定实验和soft agar实验，体外研究发现，uc.77-的下调显著促进了HCT116细胞和SW620细胞的增殖。

本发明采取皮下注射的方式建立裸鼠异位移植瘤模型，观察HCT116细胞在裸鼠皮下的生长情况。研究发现，uc.77-显著抑制了结直肠癌细胞HCT116细胞的体内增殖能力。

需要说明的是：虽然现有技术已经告知了uc.77-在肺癌细胞中表达上调并促进EMT，但并无相关的数据证明uc.77-在结直肠癌中发挥怎样的功能，即，该现有技术与本发明的用途没有任何关联性。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过对芯片测序结果进行分析，并通过Q-PCR等实验技术发现，相较于癌旁正常组织在癌组织中uc.77-在转录水平呈现显著下调趋势，表明uc.77-可以作为结直肠癌诊断标志物。同时，本发明进一步以结直肠癌HCT116、SW620细胞为模型，过表达uc.77-可显著抑制结直肠癌细HCT116、SW620的体外增殖能力，动物实验表明，过表达uc.77-可显著抑制结直肠癌细胞HCT116的体内增殖能力，表明uc.77-可以作为抑制结直肠癌增殖的潜在的治疗靶标。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为uc.77-在结直肠癌组织和细胞系中表达相对下调；

图1中：

A通过Q-PCR实验在150对结直肠癌组织中验证uc.77-的表达，发现uc.77-显著下调。

B通过在结直肠癌细胞系中验证uc.77-的表达，发现uc.77-出现不同程度的下调趋势。

图2为uc.77-可显著抑制结直肠癌细胞HCT116和SW620的体外增殖能力；

图2中：

A为在HCT116和SW620细胞中过表达uc.77-后通过Q-PCR鉴定过表达效率；

B、C通过ATP实验，实验验证uc.77-对结直肠癌细胞体外增殖能力的影响；

D、E通过soft agar实验，实验验证uc.77-对结直肠癌细胞体外增殖能力的影响。

图3为uc.77-可显著抑制结直肠癌细胞HCT116的体内增殖能力；

图3中：

A、B为采取皮下注射的方式建立了裸鼠异位移植瘤模型，观察过表达uc.77-后HCT116 细胞相较于对照细胞在裸鼠皮下的生长情况；

C为所得瘤体称重。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、

1、Q-PCR检测uc.77-在150对临床样本中转录水平的表达情况以及在细胞系中的表达情况

1)首先将5对结直肠正常组织和结直肠癌组织进行T-UCR微阵列芯片测序送样，分析芯片结果发现uc.77-显著下调。在150对结直肠癌临床样本中验证uc.77-的表达，同样发现 uc.77-显著下调(图1A)，接着在结直肠癌细胞系中验证uc.77-的表达，发现uc.77-出现不同程度的下调趋势(图1B)。

2)组织样本

已确诊并实施手术切除的结直肠癌临床组织样本与由温州医科大学附属第一医院提供，样本采集与利用已通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会的伦理批准，严格按照相关制度与流程进行采集与利用。采集到样本后，一部分组织采取液氮速冻的方式保存于液氮罐中，一部分组织立即用4％的PFA固定24h-48h，具体处理流程如下：

a.组织脱水：组织经4％PFA固定后，流水过夜冲洗组织，除去残余的PFA固定液。之后按照30％酒精1h→50％酒精1h→70％酒精4℃过夜→80％酒精1h→90％酒精1h→95％酒精1h→100％酒精Ⅰ1h→100％酒精Ⅱ1h的顺序将组织梯度脱水(Ⅰ与Ⅱ代表玻璃瓶编号，酒精试剂无差异)。

b.组织透明：组织经梯度脱水后，将组织置入50％无水乙醇与50％二甲苯的混合液玻璃缸中5min，之后将组织转入二甲苯Ⅰ中5min，之后再转入二甲苯Ⅱ中5min(Ⅰ与Ⅱ代表玻璃瓶编号，二甲苯试剂无差异)。

c.组织浸蜡：组织透明后，将组织浸入软蜡中1h，之后浸入硬蜡中1h。

d.组织包埋：将组织从塑料包埋盒中取出，放入金属包埋盒中，将塑料包埋盒掩于其上，滴加适量的硬蜡，使硬蜡充分包裹塑料包埋盒，待硬蜡微凝固后将蜡块继续转入冰盒中，使蜡块与金属包埋盒脱离，取出蜡块，常温或4℃长期保存。

3)组织总RNA提取

a.从超低温冰箱中取出结直肠癌临床样本，每个样本取样约50mg于EP管中，加入700μl 的Qiazol混匀，组织需要剪碎并用组织破碎仪充分破碎。

b.加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置5min。提前预冷离心机至4℃。4℃离心,12000g，15min。

c.用200μl的去酶枪头吸取上清，移至新的EP管中，约400μl。加入等体积的400μl异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10min。4℃离心,12000g，10min，弃去上清。

d.用DEPC水配制75％酒精，向上述沉淀中加入1ml配置好的75％酒精，吹打沉淀，4℃离心,12000g，5min,弃去上清，重复此步骤。

e.弃去上清后空离5min，用去酶小枪头吸取残留上清，留底部白色沉淀。开盖晾干，待底部白色沉淀透明后加入去酶水。4℃溶解2h，测定RNA浓度。

2、RT-QPCR

依照上述步骤提取并测定完成RNA浓度后，使用购买于Invitrogen公司的SuperScriptTM

IV逆转录试剂盒进行逆转录，根据试剂说明书逆转录反应体系及步骤如下：

按照说明书将各组分加入到PCR管中，振荡混匀，之后将其置于PCR仪，设置PCR仪第一步反应程序：65℃，5min。反应完成后，冰上静置大于1min，按照如下体系将各组分混匀并加入到第一步反应所得产物中，进行第二步PCR反应。

上按照说明书将各组分加入到PCR管中，振荡混匀，之后将其置于PCR仪，设置PCR仪第二步反应程序：50-55℃10min，80℃10min。得到cDNA后，封口膜密封-80℃保存或完成下一步实验后再进行保存处理。将所需细胞获得cDNA后，利用Qiagen所购试剂盒进行PCR，PCR反应体系如下(4℃操作)：

按照以上反应体系将各组分充分混匀，加入384孔板中,每个样本设置3个复孔，离心1000g，1min，使各组分混匀并沉于孔底，置于Q6荧光定量PCR仪中进行检测。PCR反应条件为预变性：95℃，30s，变性：95℃，5秒，退火：58℃，30秒，延伸：72℃，30秒，共设置40cycles。

PCR Forward Primer(上游引物):5’CTGTCACACTGCTCCCAAGAA3’；

PCR Reverse Primer(下游引物):5’GGGAGAACTCAGCCAAAGATG 3’。

所得结果为：uc.77-在结直肠癌组织中表达相对下调且与结直肠癌增殖相关；

根据该结果，可得知：uc.77-可以作为结直肠癌的诊断标志物。

实施例2、uc.77-显著抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力

1)选用HCT116细胞与SW620细胞，于北京擎科生物科技有限公司购买uc.77-过表达质粒，将uc.77-序列片段插入至pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-pruo的XbaI-EcoRI多克隆位点上；依据慢病毒转染体系方法在HCT116细胞与SW620细胞中转染uc.77-过表达质粒，经puro筛选建立稳定转染细胞HCT116-uc.77-，SW620-uc.77-及其对照HCT116-Vector， SW620-Vector，Q-PCR实验验证过表达效率，如图2A所示。

说明：对照HCT116-Vector，SW620-Vector与HCT116-uc.77-，SW620-uc.77-的区别在于： HCT116-Vector，SW620-Vector是转染了对照载体质粒的稳定转染细胞株，而HCT116-uc.77-， SW620-uc.77-是转染了uc.77-过表达质粒的稳定转染细胞株。

2)采用ATP实验检测肿瘤细胞HCT116-uc.77-、SW620-uc.77-相较于对照 HCT116-Vector、SW620-Vector细胞生长活力变化，如图2B、C所示。

具体步骤如下：用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞，用培养基吹打成为单细胞悬液，计数后取相应悬液体积的细胞加入相应细胞数至96孔板中。细胞贴壁后从培养箱取出相应细胞，显微镜下观察状态。从-20℃取出ATP检测试剂，室温溶解。甩去96孔板中的旧培养基，每孔加25μl的PBS，再加入每孔25μl的ATP检测试剂，避光操作。避光，振荡器上震荡 3min，室温静置10min。将96孔板中的西细胞裂解产物转移至避光板，每孔加40μl。上机检测。

3)采用软琼脂克隆形成(soft agar)实验评价肿瘤细胞HCT116-uc.77-、SW620-uc.77- 相较于对照HCT116-Vector、SW620-Vector细胞锚定非依赖的恶性增殖能力,如图2D,E所示。

具体步骤如下：按照每孔取1.2ml的1.25％琼脂糖溶液与1.8ml配制的培养基(即：medium) 于15ml离心管中，轻轻吹打混匀后加入6孔板的孔中，避免吹打出气泡，铺板要平而均匀，避免产生气泡。静置至少2h后，按照如下体系铺上层胶：

先将1.25％的琼脂糖凝胶与2×细胞培养基混匀后放入42℃水浴锅中预热，然后用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞，用培养基吹打成为单细胞悬液，计数后取相应悬液体积的细胞加入相应细胞数至1.25％的琼脂糖凝胶与2×细胞培养基中，铺板。静置1-2小时后，用封口膜密封6孔板，之后放入37℃5％二氧化碳细胞培养箱中继续培养，7天左右开始观察克隆生长状态，待到克隆生长至合适大小时，采用显微镜5倍镜拍照并计数，计算细胞集落数形成率。

所得结果为：过表达uc.77-显著抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力；

根据该结果，可得知：uc.77-可以作为抑制结直肠癌增殖的新治疗靶标。

实施例3、过表达uc.77-显著抑制结直肠癌细胞的体内增殖能力

1)动物饲养

BALB/C-nu雌性裸鼠，周龄为3-4周，体重15±0.5克，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心SPF级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。

2)皮下注射

0.25％胰酶消化处于对数生长期的HCT116-Vector细胞、HCT116-uc.77-细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50ml离心管中，1500rpm离心5min，之后弃去上清培养基，用PBS重悬细胞洗一次，再次1500rpm离心5min后弃去PBS，加入1ml PBS重悬，按照一定比例稀释细胞后充池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠皮下注射100μl细胞悬液，其中包含400万细胞量。裸鼠皮下注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，接种前将细胞充分混匀，用1ml无菌胰岛素注射器吸取100ul细胞悬液，均匀注射于小鼠右背部皮下位置，每组注射6只裸鼠。

3)测定拍照

1周左右PBS被裸鼠充分吸收，肿瘤细胞初步成瘤；待裸鼠接种肿瘤细胞生长4周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出瘤体，拍照(图3A-B)并将瘤体称重(图3C)。

所得结果为：过表达uc.77-显著抑制结直肠癌细胞的体内增殖能力；

根据该结果，可进一步表明uc.77-可以作为抑制结直肠癌增殖的新治疗靶标。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 抑制结直肠癌生长的靶标uc.77-与诊断标志物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtcacact gctcccaaga a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggagaactc agccaaagat g 21

Claims

1.uc.77-的用途，其特征是：作为抑制结直肠癌生长的靶标、诊断标志物。

2.uc.77-表达促进剂在制备抑制结直肠癌生长药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：抑制结直肠癌细胞体内增殖。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述uc.77-表达促进剂为uc.77-的过表达质粒。

5.一种预防或/和治疗结直肠癌的组合物，其特征在于，组合物包含：

(1)uc.77-的表达促进剂；

(2)药剂学上能够接受的载体。

6.根据权利要求5所述的预防或/和治疗结直肠癌的组合物，其特征在于：所述uc.77-表达促进剂为uc.77-的过表达质粒。

7.一种检测uc.77-表达的试剂，其特征在于：所述uc.77-表达的试剂包含基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂，该试剂包含一对特异性引物：

F(上游引物):5’CTGTCACACTGCTCCCAAGAA 3’；

R(下游引物):5’GGGAGAACTCAGCCAAAGATG 3’。