CN112501302A - 一种结直肠癌血清学诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种结直肠癌早期诊断的分子标志物及其应用。生物标志物为血清CST1分子标志物，序列如SEQ ID NO：1所示。ROC曲线分析显示，此血清CST1分子标志物对早期结直肠癌具有较高的诊断效率，能够诊断早期结直肠癌患者。

Description

一种结直肠癌血清学诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种结直肠癌早期诊断的分子标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌是全球第三大常见癌症和第四大常见癌症死因，每年约有130万新发病例和60万例死亡。结肠癌作为中国最常见的恶性肿瘤之一，是目前最受关注的恶性肿瘤之一 。在2012年诊断的全球1361000例结直肠癌中，中国结直肠癌的新发病例数达到253000例，占全球结直肠癌新发病例的18.6%。作为全球结直肠癌每年新发病例最多的国家，开展积极的肿瘤防治对策，对降低中国结直肠癌的发病率和死亡率具有重要的意义。一方面，结直肠癌缺乏典型的临床表现，早期仅存在腹痛、腹胀等消化系统症状，往往不能引起患者足够的重视；除此之外，虽然我国发布了关于结直肠癌筛查的相关专家建议，建议对具有高龄、肥胖及结直肠癌相关家族史的高危人群进行相关筛查，其推荐筛查方式为结肠镜检查，尽管结肠镜检查可以较早诊断出结直肠癌患者，但患者依从性较差。综上所述，临床上缺乏高灵敏度和高特异度的结直肠癌诊断标志物，患者就诊时就处于中晚期，丧失了最佳治疗时机。因此，亟需寻找一种新型非侵入性、高灵敏度和高特异性的生物标志物用于早期结直肠癌的诊断。

发明内容

本发明针对临床上缺乏高灵敏度和高特异度的结直肠癌诊断标志物，患者就诊时就处于中晚期，丧失了最佳治疗时机的问题提出一种新型的结直肠癌早期诊断的分子标志物及其应用。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

本发明提供了血清中的CST1标志物在早期结直肠癌中的应用。CST1的序列为：gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcctctgaggagaccatggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctgtggccctggc ctggagccccaaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacgcagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtgcccttcactt cgccatcagc gagtataaca

aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagccaggcaacagaccgttggggg ggtgaattac ttcttcgacg tagaggtggg ccgcaccatatgtaccaagtcccagcccaa cttggacacc tgtgccttcc atgaacagcc agaactgcagaagaaacagttgtgctcttt cgagatctac gaagttccct gggagaacag aaggtccctggtgaaatccaggtgtcaaga atcctaggga tctgtgccag gccattcgca ccagccacca cccactccca

ccccctgtag tgctcccacc cctggactgg tggcccccac cctgcgggaggcctccccatgtgcctgcgc caagagacag acagagaagg ctgcaggagt cctttgttgctcagcagggcgctctgccct ccctccttcc ttcttgcttc taatagccct ggtacatggtacacacccccccacctcctg caattaaaca gtagcatcgc ctccctctga aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

进一步，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR检测CST1的表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括特异性扩增CST1的引物。

进一步，所述特异性扩增CST1的引物序列为：GCCCAGTATCTGAGTACCCT；GTCTGTTGCCTGGCTCTTAGT。

进一步，所述产品包括检测表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括CST1引物、试剂盒。

本发明提供了CST1结直肠癌早期诊断中的应用。

mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。大多数真核成熟的mRNA分子具有典型的5’端的7-甲基鸟苷三磷酸（m7GTP）帽子结构和3’-端的多聚腺苷酸(polyA)尾巴结构。mRNA的功能是为蛋白质的合成提供模板，分子中带有遗传密码。由于基因表达具有时空特异性，因此作为基因转录产物的mRNA也具有相对应的时空特异性，其在不同组织及疾病的不同时期表达模式行为也不同，与现有的蛋白类分子标志物相比，能够更早的反映机体状态的改变，因此可以作为疾病的分子标志物。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin,CST)是对半胱氨酸蛋白酶具有抑制作用的一类蛋白质,在血液及尿液等体液中广泛存在。目前有研究表明CST超家族可以通过影响STAT等信号通路进而影响肿瘤细胞的生长以及迁移侵袭等生物学行为，从而改变肿瘤的生长和转移。其中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN(Cystatin SN)为CST1基因所表达的产物,在多种肿瘤中表达异常。

通过图2提供的ROC曲线分析显示，此血清CST1分子标志物对早期结直肠癌具有较高的诊断效率，能够诊断早期结直肠癌患者。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1.ROC曲线分析显示，此血清CST1分子标志物对早期结直肠癌具有较高的诊断效率，能够诊断早期结直肠癌患者。

2.血清CST1表达量的检测是通过非侵入性方式进行取样，可降低组织活检带来并发症的风险，患者依从性较高，具有高性价比。

附图说明

图1：CST1在结直肠癌组和健康对照组中的表达。

图2：CST1对结直肠癌的诊断ROC曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

1、研究对象

血清标本共来自经受试者同意的48例结直肠癌患者（CRC）和36例排除肿瘤的健康对照者。所有结直肠癌患者均来自山东大学第二医院（以下称本院）胃肠外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经术前或术后病理检查确认。所有血清标本均在患者接受治疗前取得。

2、标本采集

采集血清3 ml，立即提取RNA或者立即4℃低温条件下，以1600g/min的离心力离心5min，然后以16000g/min的离心力离心10min，将分离上清液保存于-80℃以备进行下一步实验。

3、RNA 分离及提取

取冻存的血清样本于常温下解冻，按试剂盒试剂使用说明提取血清总RNA。

4、逆转录

逆转录之前将试剂盒取出置于冰上，待完全融解后将试剂放入离心机4℃条件下瞬时离心，然后放在冰上待用。按照PrimeScript^TMRT reagent试剂盒说明书开始配体系。

表1 试剂体系组成

5. qRT-PCR反应

按照SYBR® Premix Ex Taq^TM试剂盒说明书配置实时荧光定量PCR反应体系，如表2所示，此操作在冰上进行，防止RNA 降解。通过PrimeScript^TM RT Reagent Kit试剂盒（Takara公司）将上述总RNA逆转成成cDNA，然后通过SYBR Premix Ex Taq (Takara)在CFX96TM实时荧光定量PCR分析仪(Bio-Rad Laboratories, USA)上进行PCR反应。设置程序，首先是预变性，95℃进行30s；然后95℃进行5s变性，60℃进行34s退火延伸，如此进行42个循环。溶解曲线是从65℃开始以每秒0.5℃的速度缓慢升温至95℃，检测荧光信号强度的变化，从而实现多整个反应过程的连续监测。

表2 实时荧光定量PCR反应体系

6、数据处理与统计学分析

通过Prism7.0及MedCalc软件对数据进行统计学分析，使用Mann-Whitney U非参数检验比较两组样本间CST1的浓度差异，P <0.05被认为具有统计学差异。采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析评价该分子的诊断效能。

7、检测结果

1）CST1经RT-qPCR 验证，以平均Ct值小于35且检测率大于75%；在结直肠癌组和健康对照组表达差异具有统计学意义（P<0.05)，如图1所示。检测引物为自主设计，其序列如表3所示。

表3引物序列

2）利用该分子标志物对结直肠癌患者进行分析，其诊断结直肠癌患者的AUC为0.816，95％CI（0.714-0.893），如图2所示。说明该分子可作为结直肠癌早期诊断分子标志物，且具有较高的准确率。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 一种结直肠癌血清学诊断标志物及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 782

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcct 60

ctgaggagac catggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctg 120

tggccctggc ctggagcccc aaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacg 180

cagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtg cccttcactt cgccatcagc gagtataaca 240

aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagcc aggcaacaga 300

ccgttggggg ggtgaattac ttcttcgacg tagaggtggg ccgcaccata tgtaccaagt 360

cccagcccaa cttggacacc tgtgccttcc atgaacagcc agaactgcag aagaaacagt 420

tgtgctcttt cgagatctac gaagttccct gggagaacag aaggtccctg gtgaaatcca 480

ggtgtcaaga atcctaggga tctgtgccag gccattcgca ccagccacca cccactccca 540

ccccctgtag tgctcccacc cctggactgg tggcccccac cctgcgggag gcctccccat 600

gtgcctgcgc caagagacag acagagaagg ctgcaggagt cctttgttgc tcagcagggc 660

gctctgccct ccctccttcc ttcttgcttc taatagccct ggtacatggt acacaccccc 720

ccacctcctg caattaaaca gtagcatcgc ctccctctga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aa 782

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcccagtatc tgagtaccct 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtctgttgcc tggctcttag t 21

Claims (4)

1.一种结直肠癌血清生物标志物,其特征在于,所述生物标志物为血清CST1分子标志物，序列如SEQ ID NO：1所示。

2.血清CST1分子标志物在制备结直肠癌早期诊断试剂或试剂盒中的应用。

3.检测血清CST1分子标志物的试剂在制备早期结直肠癌诊断试剂或试剂盒中的应用。

4.特异性扩增CST1的引物，其特征在于，所述引物序列为GCCCAGTATCTGAGTACCCT，GTCTGTTGCCTGGCTCTTAGT。

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