CN111778330B - 一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

一种结直肠癌诊断生物标志物,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明首次发现circ‑PNN可作为结直肠癌诊断的生物标志物。与正常对照相比，circ‑PNN在结直肠癌病人血清外泌体中的表达水平显著上调。ROC曲线显示血清外泌体来源的circ‑PNN具备良好的诊断结直肠癌的能力。本发明提出的方法对结直肠癌的早期诊断也具有很好的诊断效能。

Description

一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，涉及一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌包括结肠癌和直肠癌，是全世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，其病死率在恶性肿瘤中排第二，严重危害人类的健康及生命安全。结直肠的癌变是一个多因素共同参与的复杂过程，其发病与饮食、生活方式、遗传等因素密切相关，男女发病率无明显差异。因结直肠癌症状不明显，患者就诊时多为晚期，且结直肠癌的复发和转移率较高，因此结直肠癌的生存率仍然不尽人意。目前常用来诊断结直肠癌的几种诊断方法在临床应用方便存在着不同程度的局限性：血清肿瘤标志物（CEA、CA19-9）检测及粪便隐血试验灵敏度及特异性较低；结直肠镜检查价格昂贵、病人依从性差；CT结肠成像检查对早期诊断有限，对细小肿块较易出现漏诊。因此，寻找一种新型非侵入性、高灵敏度和高特异度的结直肠癌诊断标志物已成为当前医学界的研究热点。

环状RNAs（circular RNAs，circRNAs）是一类新型的内源性非编码RNA分子，是近年来RNA领域的研究热点。CircRNAs分子呈闭合环状，与传统的线性RNA不同，circRNAs不具有5′帽和3′poly(A)结构，这一特性可以保护它们不易被核糖核酸外切酶（RNase R）降解，与mRNAs相比更稳定。CircRNAs表达丰度较高，在某些情况下，circRNAs的表达丰度是mRNAs的十倍。CircRNAs的闭环结构和对RNase R的不敏感的特性，使其成为肿瘤生物标志物的更好选择。且大多数circRNAs半衰期长达48 h，半衰期较长的特性为circRNAs作为标志物增加了一份优势。已有许多研究工作指明，癌症病人组织细胞中circRNAs表达会出现异常，使用circRNAs作为癌症诊断和预后的标志物也成为一个新的研究方向。

人体血液标本具有较易获得和保存等优势。外泌体可由活体细胞释放至体液循环中，因此血清中同样可检测到外泌体，且丰度较高。由于外泌体的膜结构可以保护外泌体核酸分子不被RNA酶降解，因而血清外泌体中RNA稳定性较高。在肿瘤患者血清外泌体中可检测到与原发肿瘤一致的RNA分子，提示外泌体RNA以独特的方式反映肿瘤的生物学特性。以外泌体为载体对肿瘤等疾病进行早期诊断以及治疗检测，可为肿瘤的无创性检测研究开辟新途径。

发明内容

本发明针对传统结直肠癌诊断过程中存在的问题提出一种新型的结直肠癌诊断生物标志物及其应用。

针对上述现有技术的不足，本发明提供了circRNA PNN(circ-PNN)在结直肠癌诊断及治疗方面的应用，为临床结直肠癌的早期诊断和治疗提供技术支持。血清外泌体来源的circ-PNN可作为结直肠癌患者的诊断标志物，这一检查方法容易被受检者接受，更可成为结直肠癌患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。本发明公开了circ-PNN作为一种新的潜在的结直肠癌诊断生物标志物:circ-PNN在结直肠癌病人的血清外泌体样本中表达显著上调；受试者工作特征(ROC)曲线显示circ-PNN具备良好的诊断结直肠癌的潜能。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

一种结直肠癌诊断生物标志物,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述结直肠癌诊断生物标志物在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。

本发明提供结直肠癌诊断生物标志物的引物组合，由以下两组序列构成，

circ-PNN：上游5’-GCTTGCGCAGCTGCAAGAAG-3’，

下游5’- TGGCGCCGCTTTTGCGTTCA-3’；

β-Actin：上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，

下游5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

上述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。

上述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合在制备或筛选结直肠癌的诊断药物中的应用。

一种结直肠癌诊断试剂盒，包括权利要求1所述结直肠癌诊断生物标志物。

一种结直肠癌诊断试剂盒，包括权利要求3所述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合。

本发明的提供了一种结直肠癌潜在诊断生物标志物，其为circ-PNN (hsa_circ_0101802|chr14:39648294-39648666-|PNN) (核苷酸序列如SEQ ID No .1所示)。circ-PNN是由PNN基因第7-8号外显子反向剪接所形成，环化序列有295个碱基。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1.首次发现circ-PNN可作为结直肠癌诊断的生物标志物。

2.与正常对照相比，circ-PNN在结直肠癌病人血清外泌体中的表达水平显著上调。

3.ROC曲线显示血清外泌体来源的circ-PNN具备良好的诊断结直肠癌的能力。

4.本发明提出的方法对结直肠癌的早期诊断也具有很好的诊断效能。

附图说明

图1为circ-PNN的性质示意图。

图2为circ-PNN在血清外泌体中的表达情况。

图3为circ-PNN对结直肠癌的诊断效能。

图4为circ-PNN对早期结直肠癌的诊断效能。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

1、研究对象

血清标本共来自经受试者同意的146例结直肠癌患者（CRC）和146例排除肿瘤的健康对照者。所有结直肠癌患者均来自山东大学第二医院外科住院患者，患者均为首次入院接受治疗，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经结直肠镜检查或病理学检查确认。所有血清标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。本实验所有标本均获得患者或其委托人签署知情同意，所有涉及人体标本的研究均获得山东大学第二医院伦理委员会批准。

2、临床资料采集

临床资料的收集主要分为结直肠癌患者和健康对照者两部分，均需包含一般资料：包括患者的姓名、性别、年龄、既往病史等。结直肠癌患者临床资料主要由结直肠癌患者的住院资料整理而来。除了上述一般资料外，还应包括肿瘤的组织学类型、部位、大小、浸润程度、淋巴结有无转移，肿瘤细胞分化程度，肿瘤TNM分期以及常规辅助检查等资料。同时获得所有人的随访同意，检查结果资料完善保存。

3、标本采集

每位研究对象采血一次(5ml/管)后，立即4℃低温条件下，3000g离心5分钟，然后10000g离心10分钟，将分离上清液保存于-80℃待用。

4、血清外泌体分离

首先将-80℃冻存的血清解冻。随后3000g/15min离心以去除细胞碎片，取上清250µL并向其中加入63µL ExoQuickTM试剂，涡旋混匀，4℃孵育30分钟。4℃离心两次：1500g /30min，1500g /5min，以沉淀血清外泌体，弃上清，用50µL PBS重悬外泌体沉淀。按QiagenmiRNeasy Serum/Plasma Kit (50) RNA试剂使用说明提取组织总RNA。

5、cDNA的合成

按照PrimerscriptTM RT逆转录试剂盒附带说明书的要求，在冰上配置如下表1反应体系。按照37℃30min，85℃5sec，4℃∞的条件进行逆转录反应。反应完毕将获得的cDNA存放于-20℃冰箱。

表1 反应体系配置表

6、qPCR反应

按照SYBR Premix Ex TaqTM（Takara，中国）说明书，首先避光在冰上配置反应体系如下表2所示：

表2 反应体系试剂及用量

qPCR反应程序设置为：95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，共设置40个反应循环。采用2^-ΔΔCt的方法计算基因的相对表达量，本次研究选取β-Actin作为本研究过程中qRT-PCR反应的内参。引物序列如下表3所示。Circ-PNN的序列见SEQ ID NO.1；PCR产物送测序公司测序，明确检测到环化位点，结果见图1。

表3 引物序列表

7、数据处理与统计学分析

通过SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，使用Mann-Whitney U非参数检验比较两组样本间circRNAs的浓度差异，P<0.05被认为具有统计学差异。采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析诊断效能。

8、检测结果

图1显示circ-PNN是由14号染色体的第7外显子和第8外显子环化而来，且sanger测序证实PCR产物含有circ-PNN环化位点。

图2为circ-PNN在血清外泌体中的表达情况。 A.表示在训练集样本（包含有88对结直肠癌患者及健康对照组的血清样本）中检测其表达情况，发现circ-PNN在结直肠癌患者血清外泌体中高表达；B. 表示circ-PNN在验证集样本（包含有58对结直肠癌患者及健康对照组的血清样本）依然高表达。

训练集样本：本次实验首先提取88对结直肠癌患者及健康对照组的血清样本并在该样本集中初步检测circ-PNN的表达情况，并初步分析其诊断效能。

验证集样本：为了该结果更加准确可靠，也为了实验更加严谨。本实施例又在58对结直肠癌患者及健康对照组的血清样本再次检测其表达情况，并再次分析其诊断效能。

图3为circ-PNN对结直肠癌的诊断效能。采用ROC曲线检测了circ-PNN在两独立样本集中对结直肠癌的诊断效能。结果分别为：A.训练集样本中该分子诊断对结直肠癌诊断效能为0.855；B：验证集样本中该分子对结直肠癌的诊断效能达0.826。

图4为circ-PNN对早期结直肠癌的诊断效能。本实施例分析了circ-PNN对验证集样本中早期结直肠癌患者（TNM I/II期）的诊断效能，曲线下面积为0.854，证实该分子可较好的诊断早期结直肠癌。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaaagcggc gccaggaaat tgaacaaaaa cttgaagttc aggcagaaga agagagaaag 60

caggttgaaa atgaaaggag agaactgttt gaagagaggc gtgctaaaca gacagaactg 120

cggcttttgg aacagaaagt tgagcttgcg cagctggtga gtggtaattt ggaattctaa 180

gattggtaat cctttgtgtt tacaaaagca ctgacccttt accttttctt tagcaagaag 240

aatggaatga acataatgcc aaaataatta aatatataag aactaagaca aagccccatt 300

tgttttatat tcctggaaga atgtgtccag ctacccaaaa actaatagaa gagtcacaga 360

gaaaaatgaa cg 372

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcttgcgcag ctgcaagaag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggcgccgct tttgcgttca 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctccttaatg tcacgcacga t 21

Claims (7)

1.一种结直肠癌诊断生物标志物, 其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述结直肠癌诊断生物标志物在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。

3.权利要求1所述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合，其特征在于，由以下两组序列构成，

circ-PNN：上游5’-GCTTGCGCAGCTGCAAGAAG-3’，

下游5’- TGGCGCCGCTTTTGCGTTCA-3’；

β-Actin：上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，

下游5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

4.权利要求3所述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。

5.权利要求3所述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合在制备或筛选结直肠癌的诊断药物中的应用。

6.一种结直肠癌诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述结直肠癌诊断生物标志物。

7.一种结直肠癌诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合。

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