一种检测试剂盒
技术领域
本发明涉及辅助疾病检测领域,具体地涉及一种检测试剂盒。
背景技术
头颈部肿瘤是指自颅底到锁骨上,颈椎以前这样一个解剖范围的肿瘤,以恶性肿瘤为主。颈部肿瘤在综合性医院属于普通外科,比较常见的就是甲状腺肿瘤;耳鼻喉科肿瘤常见的有喉癌、副鼻窦癌等;口腔颌面部肿瘤常见的为各种口腔癌,如舌癌、牙龈癌、颊癌等。因此,头颈部所发生的肿瘤,其原发部位和病理类型之多,居全身肿瘤之首。
头颈部恶性肿瘤因其发病部位很多,因此其发病率在不同的国家、地区以及人种间都不相同。在美国华人中,男性发病率较高的是鼻咽癌,其次是甲状腺癌、口腔癌;女性发病率较高的是甲状腺癌,其次是鼻咽癌和涎腺肿瘤。在日本,男性发病率较高的是喉癌,其次是口腔癌;女性发病率较高的是甲状腺癌,其次是口腔癌。在我国,北京男性头颈部肿瘤发病率以喉癌占首位,其次为鼻咽癌和口腔癌;女性头颈部肿瘤发病率以甲状腺癌占首位,其次为口腔癌。而上海市统计资料显示,男性头颈部肿瘤发病率首位是鼻咽癌,其次为喉癌。女性头颈部肿瘤发病率首位是甲状腺癌,其次是鼻咽癌,头颈部肿瘤因其解剖复杂,组织病理类型繁多,一般常见鳞状上皮细胞癌,其次为各类腺癌、肉瘤少见。
癌症细胞的早期发现对于癌症的治疗及预防有十分重要的作用,本发明提供一种通过血清检测即可预测癌症的试剂盒,具有取样方便、检测方法简易、检测结果特异性高等特点,适用于日常体检、临床治疗等多种场景。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供提供一种检测试剂盒。
本发明是以如下技术方案实现的:
本发明提供一种检测试剂盒,所述试剂盒可用于定量检测hsa-miRNA-21,hsa-miRNA-27a,hsa-miRNA-25a,hsa-miRNA-93,hsa-miRNA-34a,hsa-miRNA-223a,hsa-miRNA-181a,hsa-miRNA-121,hsa-miRNA-97,hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210的表达量。
进一步地,所述试剂盒包括试剂盒本体,外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶;外源性参照瓶内装有外源性参照,茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂,实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂;所述外源性参照可采用U6序列,其工作浓度为5nmol,其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应效率;所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT 缓冲液、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品,所述miRNA标准品是指人工合成的miRNA,浓度为100nmol,所述试剂盒包括下述miRNA,所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97,cut-off值50%、hsa-miR-107,cut-off值30%、hsa-miR-192, cut-off值45%、hsa-miR-196a,cut-off值20%、hsa-miR-197,cut-off值65%、hsa-miR-148a ,cut-off值20%、hsa-miR-30c,cut-off值40%、hsa-miR-30d,cut-off值50%,检测过程中上述miRNA达到上述cut-off值时,即可判定阳性;所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10×Taq缓冲液、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和荧光探针,用于牙龈癌预测的miRNA试剂盒的制备工艺和操作流程是基于定量PCR技术的,试剂盒包括常用的Taq酶等,本试剂盒的价值在于能够提供精简的探针库以便检测血清样本中miRNA的变化趋势,探针库包括实施例2中筛选出的miRNA的反向互补序列,所述引物包括:
hsa-miRNA-97-f:ttaagagacccctaactttaa (SEQ ID NO.1)
hsa-miRNA-97-r:gaaagagagcctttggcga (SEQ ID NO.2)
hsa-miR-107-f:tcttttaaaacttgacatcgcg (SEQ ID NO.3)
hsa-miR-107-r:ccgtaacactttaatggyacc (SEQ ID NO.4)
hsa-miR-192-f:aattatggtacaagccctagac (SEQ ID NO.5)
hsa-miR-192-r:ttccatctttctattagctctctcaa (SEQ ID NO.6)
hsa-miR-196a-f:gcctaagctaaaatcggctagc (SEQ ID NO.7)
hsa-miR-196a-r:cccctcgaatcctagatcttta (SEQ ID NO.8)
hsa-miR-197-f:gggaatctctcaaaatttaata (SEQ ID NO.9)
hsa-miR-197-r:cccataaaaataaggttacact (SEQ ID NO.10)
hsa-miR-148a-f:attttccggaatttaagaaaatc (SEQ ID NO.11)
hsa-miR-148a-r:ccctaaattgttttaagtttctataa (SEQ ID NO.12)
hsa-miR-30c-f:aaatttctcgaattttcctatatcc (SEQ ID NO.13)
hsa-miR-30c-r:cctctaaatcctaaagttgggt (SEQ ID NO.14)。
进一步地,所述试剂盒用于检测hsa-miRNA-97,hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c的表达水平,当hsa-miRNA-97,hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c均达到cut-off值时,可以认为该样品来源有高罹患牙龈癌风险,需进行进一步排查,所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97,cut-off值50%、hsa-miR-107,cut-off值30%、hsa-miR-192,cut-off值45%、hsa-miR-196a,cut-off值20%、hsa-miR-197,cut-off值65%、hsa-miR-148a,cut-off值20%、hsa-miR-30c,cut-off值40%。
进一步地,所述试剂盒可用于辅助诊断甲状腺癌、口腔癌、喉癌、腭癌、牙龈癌、舌癌、唇癌,诊断样本为血清样本。
本发明的有益效果是:
本发明提供一种检测试剂盒,miRNA 是细胞的基因调控系统中的重要组成,miRNA作为癌症标记物是一种非侵入性取样,可以在无创条件下通过单独的miRNA或miRNA组合物的表达谱来辅助诊断被试者是否罹患癌症,提高诊断的准确率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明作进一步地详细描述。
实施例1:牙龈癌相关miRNA 的筛选
头颈癌样品来自南京医科大学收集的283个样本,样本类型为血清,血清以新鲜采集分离为好,采血6小时内分离、收集血清,并将血清转移至一次性使用无RNA酶的无菌微量离心管中。
获得了如下样本:甲状腺癌82例、口腔癌23例、喉癌31例、腭癌25例、牙龈癌59例、舌癌33例、唇癌30例。来自正常样品的RNA由6个样品来源的RNA混合(各来自6个正常的牙龈组织)组成,血清样本于2℃-8℃可稳定保存7天。
使用RNA提取试剂盒(Qiagen miRNeasy Mini Kit 试剂盒)提取样品总RNA,遵守厂商说明进行操作。然后在miRNA微阵列芯片上进行 RNA标记和杂交。具体步骤如下:用5μg生物素标记来自各样品的RNA,该芯片包含323个探针,包含245个人和小鼠miRNA基因。使用Perkin-Elmer Scan Array XL5K 对链霉素-Alexa647缀合物进行基于生物素结合的杂交信号进行检测;用Quantarray软件 (Perkin Elmer) 定量扫描图像,微阵列数据的统计学和生物信息学分析使用软件Silicon Genetics对原始数据进行标准化和分析。
将表达数据以中位数集中,用ANOVA (方差分析) 进行统计比较。使用PAM软件(Prediction Analysis of Microarrays, 获得自http://www.stat.stanford.edu/tibs/PAM/index.html) (Tibshirani, R.,等人Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:6567-6572 (2002))和Support Vector Machine (Furey, T.S.,等人Bioinformatics 16:906-914 (2000)) 软件确定用于预测牙龈癌的miRNA,两种算法都用交叉验证和Test-set检测。
根据微阵列分析获得与癌症进程有一定相关性的miRNA共计 156种,筛选出在牙龈癌中上调表达的miRNA,具体地,如下所述hsa-miRNA-21,hsa-miRNA-27a,hsa-miRNA-25a,hsa-miRNA-93,hsa-miRNA-34a,hsa-miRNA-223a,hsa-miRNA-181a,hsa-miRNA-121,hsa-miRNA-97,hsa-miR-107,hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210。
实施例2:牙龈癌相关miRNA 的验证
1、牙龈癌样品来源如实施例1中所示,取Trizol Reagent (Invitrogen,Carlsbad,CA)提取各样品血清总RNA ,提取步骤如下:
步骤101、取6-8ml的血清,加入等体积的Trizol Reagent;
步骤102、相分离室温放置12min,然后按0.3ml氯仿/1.5ml Trizol Reagent的体积比加入氯仿,剧烈震荡25s,室温静置10min,于12000g,4℃离心10min;
步骤103、将水相转移到新的50ml离心管,苯酚/氯仿除去蛋白相二次;
步骤104、将水相转移到新的离心管中,按0.6ml异丙醇/1ml Trizol Reagent体积加入异丙醇,-20℃保存50min,于12000g,4℃离心60min;
步骤105、用2ml Trizol重悬沉淀,将悬液转移到新的1.5ml的离心管中;
步骤106、重复2,4步 (第四步离心改为15min);
步骤107、 RNA洗涤去掉上清,加入75%乙醇,于12000g,4℃离心5min;
步骤108、测量获得的RNA浓度,通常能得到浓度为8μg RNA/100ml血清的血清总RNA。
2、针对上述RNA样品进行Solexa测序,具体步骤如下:
步骤201、总RNA进行PAGE电泳回收16-29nt RNA分子;
步骤202、将adaptor prime酶联在小RNA分子的3’与5’端;
步骤203、进行RT-PCR反应后并进行测序;
步骤204、常规方法进行数据分析与处理。
3、Real-time PCR方法具体操作步骤如下:
步骤301、取血清总RNA,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品;或者取血清样本,以血清样本作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品;
步骤302、用hsa-miRNA-21,hsa-miRNA-27a,hsa-miRNA-25a,hsa-miRNA-93,hsa-miRNA-34a,hsa-miRNA-223a,hsa-miRNA-181a,hsa-miRNA-121,hsa-miRNA-97,hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210设计引物;
步骤303、加入荧光探针进行PCR反应;
步骤304、检测并比较正常人或牙龈癌患者样本中微小核糖核酸的量的变化,检测结果表明牙龈癌患者的血清中hsa-miRNA-21,hsa-miRNA-27a,hsa-miRNA-25a,hsa-miRNA-93,hsa-miRNA-34a,hsa-miRNA-223a,hsa-miRNA-181a,hsa-miRNA-121,hsa-miRNA-97,hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210等miRNA均有不同程度的过表达,从中筛选出7中显著过表达的miRNA作为生物标志物进行癌症预测。
实施例3:用于辅助诊断牙龈癌的试剂盒的制备
本发明提供一种试剂盒,包括试剂盒本体,外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶;外源性参照瓶内装有外源性参照,茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂,实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
所述外源性参照可采用U6序列(RNU6-1 RNA, U6 small nuclear 1 [ Homosapiens ] Gene ID: 26827),其工作浓度为5nmol,其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应效率;
茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT 缓冲液(5×RT缓冲液由250mmol Tris-HCl,375mmol KCl,15mmol MgCl2,50mmol DTT 组成)、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA,浓度为100nmol,本试剂盒包括下述miRNA,所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97,cut-off值50%、hsa-miR-107,cut-off值30%、hsa-miR-192, cut-off值45%、hsa-miR-196a,cut-off值20%、hsa-miR-197,cut-off值65%、hsa-miR-148a ,cut-off值20%、hsa-miR-30c,cut-off值40%、hsa-miR-30d,cut-off值50%),检测过程中上述miRNA达到上述cut-off值时,即可判定阳性;
实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl,500mmolKCl)、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和荧光探针。用于牙龈癌预测的miRNA试剂盒的制备工艺和操作流程是基于定量PCR技术的,试剂盒包括常用的Taq酶等,本试剂盒的价值在于能够提供精简的探针库以便检测血清样本中miRNA的变化趋势,探针库包括实施例2中筛选出的miRNA的反向互补序列。
所述引物包括:
hsa-miRNA-97-f:ttaagagacccctaactttaa (SEQ ID NO.1)
hsa-miRNA-97-r:gaaagagagcctttggcga (SEQ ID NO.2)
hsa-miR-107-f:tcttttaaaacttgacatcgcg (SEQ ID NO.3)
hsa-miR-107-r:ccgtaacactttaatggyacc (SEQ ID NO.4)
hsa-miR-192-f:aattatggtacaagccctagac (SEQ ID NO.5)
hsa-miR-192-r:ttccatctttctattagctctctcaa (SEQ ID NO.6)
hsa-miR-196a-f:gcctaagctaaaatcggctagc (SEQ ID NO.7)
hsa-miR-196a-r:cccctcgaatcctagatcttta (SEQ ID NO.8)
hsa-miR-197-f:gggaatctctcaaaatttaata (SEQ ID NO.9)
hsa-miR-197-r:cccataaaaataaggttacact (SEQ ID NO.10)
hsa-miR-148a-f:attttccggaatttaagaaaatc (SEQ ID NO.11)
hsa-miR-148a-r:ccctaaattgttttaagtttctataa (SEQ ID NO.12)
hsa-miR-30c-f:aaatttctcgaattttcctatatcc (SEQ ID NO.13)
hsa-miR-30c-r:cctctaaatcctaaagttgggt (SEQ ID NO.14)
本试剂盒用于检测hsa-miRNA-97,hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c的表达水平,当hsa-miRNA-97,hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c均达到cut-off值时,所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97,cut-off值50%、hsa-miR-107,cut-off值30%、hsa-miR-192, cut-off值45%、hsa-miR-196a,cut-off值20%、hsa-miR-197,cut-off值65%、hsa-miR-148a ,cut-off值20%、hsa-miR-30c,cut-off值40%,可以认为该样品来源有高罹患牙龈癌风险,需进行进一步排查。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 杭州更蓝生物科技有限公司
<120> 一种检测试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miRNA-97-f
<400> 1
ttaagagacc cctaacttta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miRNA-97-r
<400> 2
gaaagagagc ctttggcga 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-107-f
<400> 3
tcttttaaaa cttgacatcg cg 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-107-r
<400> 4
ccgtaacact ttaatggyac c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-192-f
<400> 5
aattatggta caagccctag ac 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-192-r
<400> 6
ttccatcttt ctattagctc tctcaa 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-196a-f
<400> 7
gcctaagcta aaatcggcta gc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-196a-r
<400> 8
cccctcgaat cctagatctt ta 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-197-f
<400> 9
gggaatctct caaaatttaa ta 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-197-r
<400> 10
cccataaaaa taaggttaca ct 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-148a-f
<400> 11
attttccgga atttaagaaa atc 23
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-148a-r
<400> 12
ccctaaattg ttttaagttt ctataa 26
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-30c-f
<400> 13
aaatttctcg aattttccta tatcc 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> hsa-miR-30c-r
<400> 14
cctctaaatc ctaaagttgg gt 22