CN109762880A - 一种检测健康人易感基因的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测健康人易感基因的方法，包括如下步骤：(1)提取健康人的基因组DNA；(2)采用步骤(1)所得基因组DNA构建基因组测序文库；(3)将步骤(2)构建的基因组测序文库上样至测序仪，设置测序参数，启动测序，得到健康人的全基因组测序数据，其中，测序深度为4.85～8.3倍；(4)从GWAS Catalog数据库选取有突变位点相对危险度的记录，建成易感基因数据库，用易感基因数据库对步骤(3)所得健康人的全基因组测序数据进行易感基因注释，即得。本发明还公开了上述检测方法在评估健康人患病风险中应用。采用本发明的检测健康人易感基因的方法，相比芯片法能更准确地得到健康人的易感基因信息，相比深度测序法具有成本优势。

Description

一种检测健康人易感基因的方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是一种检测健康人易感基因的方法及其应用。

背景技术

疾病的发生、发展过程受到遗传和环境两方面的共同影响。易感基因检测主要根据GWAS(Genome-wide association study，即全基因组关联分析)研究来推断某一特定人群中遗传突变和表型之间的相关性。GWAS的理论基础是连锁不平衡定律(linkagedisequilibrium，LD)，既假设观察到的SNP(单核苷酸多态性)与真正的致病突变(causalvariant)之间存在很强的LD。通过易感基因检测，我们可以了解自己是否容易患上某些常见疾病(易感风险)，如心脑血管疾病、自身免疫性疾病或肿瘤等。一方面可以帮助延缓疾病的发生、发展，提醒被检测者避免接触与特定疾病相关的有害物质，并定期进行特定方向的诊断学监测，以便在疾病初起时早诊断、早治疗，最大程度的降低疾病造成的损害；另一方面，可以帮助医生了解患者对治疗药物的敏感程度和发生不良反应的可能性，从而选择更加有效、更加安全的治疗方案。所以，目前的易感基因检测已经可以从患病风险预警和用药指导两方面来指导人们对抗疾病。

GWAS catalog(https://www.ebi.ac.uk/gwas/)是由美国基因组研究中心(NHGRI)和欧洲生物信息中心(EMBL-EBI)共同开发和制作的所有已公布的GWAS和相关结果的公开数据库。该数据库收集自2008年以来已发表的全基因组关联研究的数据。截至2018年10月21日，在411种不同的期刊、3,153篇文章中共摘取61,613个独特的SNP位点与3,007种性状的相关性条目90,428条。相关研究需符合一个严格的标准才能纳入该数据库。GWAScatalog数据库为我们做易感基因检测提供一个可靠的依据。

易感基因检测可以预测疾病的发病风险和用药选择，因此，具有广泛的社会价值和经济价值。目前流行的易感基因检测项目主要基于芯片和全基因组测序平台。芯片虽然价格便宜，但是检测的位点太少，预测准确性差；全基因组测序虽然检测的位点多，预测准确性强，但是费用太高。

早期的易感基因检测主要基于SNP芯片技术。随着二代测序技术的普及，人们逐渐采用测序，放弃芯片。因为芯片的探针数量最多只有几十万个，而人类的已知SNP位点达到几千万个，因此，常常有大量的疾病易感位点用芯片无法检测到。二代测序通常的测序深度为30X。但是这样带来的问题是，测序成本(几千元)要比芯片(几百元)高出十倍左右，从而使得易感基因检测项目很难普及。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种兼具预测准确性和低成本的检测健康人易感基因的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种检测健康人易感基因的方法，包括如下步骤：

(1)提取健康人的基因组DNA；

(2)采用步骤(1)所得基因组DNA构建基因组测序文库；

(3)将步骤(2)构建的基因组测序文库上样至测序仪，设置测序参数，启动测序，得到健康人的全基因组测序数据，其中，测序深度为4.85～8.3倍；

(4)从GWAS Catalog数据库选取有突变位点相对危险度的记录，建成易感基因数据库，用易感基因数据库对步骤(3)所得健康人的全基因组测序数据进行易感基因注释，即得。

优选地，所述测序深度为6.2～7.91倍；更优选地，所述测序深度为7.59倍。

优选地，所述步骤(1)所得基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.7～1.9。

优选地，所述步骤(2)所得基因组测序文库的插入片段大小为100～800bp。

作为本发明的另一个方面，本发明提供了一种评估健康人患病风险的方法，包括如下步骤：

1)以权利要求1中健康人的全基因组测序数据为基础数据进行本地化GATK4分析，得到健康人的突变SNP位点和/或INDEL位点，其中，参考基因组为hg38，突变位点数据库为dbsnp146；

2)对步骤1)所得突变SNP位点和/或INDEL位点过滤，只保留filter列为PASS的位点；

3)整合步骤2)所得位点信息、健康人的全基因组测序数据和易感基因数据库，得到健康人的SNP位点，以及SNP位点对应的性状；

4)采用如下公式来计算患病风险，风险值R＝log2(OR₁*OR₂*OR₃*..*OR_n)*e，其中，OR为有突变位点相对危险度，e＝n/N，n为某人检出某种性状的位点数，N为芯片上某种性状的总位点数。

应当说明的是，风险值R即，性状相关的n个风险位点的OR值连乘，乘积取log2对数后，乘以风险因子e，其中，e＝n/N(某人检出某种性状的位点数n/芯片上某种性状的总位点数N)；N值来自全基因组测序中芯片上检测的结果。

优选地，所述步骤1)中本地化GATK4的步骤为：参照美国Broad研究所提供的GATK最佳实践将GATK4本地化，其工作流程配置在WDL文件，在json文件配置流程所需参数并在cromwell中运行，通过GATK的docker容器运行数据处理(gatk4-data-processing)和突变检测(gatk4-germline-snps-indels)流程。

综上所述，本发明的有益效果为：

采用本发明的检测健康人易感基因的方法，相比芯片法能更准确地得到健康人的易感基因信息，相比深度测序法具有成本优势；应用本发明的检测健康人易感基因的方法获得的数据评估健康人患病风险，相比芯片法更加全面可靠。

附图说明

图1为华大智造MGI EasyDNA文库制备流程图；

图2为PE100文库PCR产物Agilent 2100检测结果图；

图3为唾液采集流程图。

具体实施方式

本发明探索了低深度测序能否达到高深度测序相似的效果，本申请的发明人发现低深度的全基因组测序的费用与芯片相当，但是，检出位点与传统高深度测序相当，因此，具有最高的性价比。同时，本发明提出一种全新的评估性状风险的算法，其能更好地反应中国人种特征和降低系统波动风险。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明书，本发明中的实验方法均为常规方法。

实施例1

收集7个健康人(4男3女，年龄25-40岁)的口腔拭子和唾液，提取DNA，分别进行全基因组测序和SNP芯片检测，然后进行比较分析。

一、全基因组测序

1、提取基因组DNA：7个健康人的口腔拭子用DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号：DP322)按说明书提取基因组DNA。

1)使用棉签在面颊内擦拭10次。注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内不能进食和饮水。

2)将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，按试剂盒说明书，先后加入400μl缓冲液GA、20μl蛋白酶K溶液、400μl缓冲液GB、200μl无水乙醇，然后将所得溶液加入一个吸附柱CR2中，离心获得基因组DNA。

3)回收得到的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260/OD280比值应为1.7-1.9。

2、制备测序文库：7个健康人提取的基因组DNA用DNA文库制备试剂盒(购自华大智造，货号：940-200022-00)按说明书制备PE100DNA文库。每个样品准备超过1μg完整度良好的基因组DNA(1％琼脂糖凝胶电泳图中DNA主带完整且>23kb的样品判断为完整基因组DNA样本)，采用轻微降解的基因组DNA也可进行风险建库。建库流程如图1所示。

构建成功的DNA需进行质控。PCR产物纯化后可选用琼脂糖凝胶电泳或Agilent2100Bioanalyzer检测PCR产物的长度分布范围。要求PCR产物片段主带在450bp左右，无dimer、无其他污染，如图2所示。消化并纯化后的产物选择Qubit ssDNA Assay Kit或者Quant-iT^TMOliGreen ssDNA Reagent等单链DNA定量试剂盒对产物进行定量，用1μL消化并纯化后的产物进行定量，产物浓度应大于0.78ng/μL。

3、全基因组测序：7个健康人样品构建的PE100DNA文库上机华大MGISEQ-2000RS测序仪进行测序，按照说明书进行操作。

1)准备文库。文库片段长度要求：文库插入片段范围在100-800bp，同时主带集中在450bp左右。文库要求：初始文库ssDNA浓度≥2fmol/μL，文库需用Qubit ssDNA AssayKit和Qubit Fluorometer定量，根据定量的结果计算投入量。取出文库、Make DNB Buffer、Make DNB Enzyme Mix、Low TE Buffer和Stop DNB Rxn Buffer，制备DNB并用Qubit ssDNAAssay Kit和Qubit Fluorometer仪器进行浓度检测(8ng/μL以上为合格)。MGISEQ-2000RS加载DNB。

2)按说明书准备测序试剂盒和芯片。

3)开始测序：放置测序样品，配置测序参数，放置测序试剂盒和芯片，复核信息无误后开始测序。

二、SNP芯片检测

1、收集唾液：7个健康人的唾液用唾液DNA采集器(购自HiDNA，货号：YM-A001)按说明书收集。具体流程如图3所示。

2、提取唾液基因组DNA：7个健康人的唾液样品用唾液基因组DNA提取试剂盒(购自康为世纪，货号：CW2533S)在全自动核酸提取仪(购自康为世纪，型号：CWE9600)上安装说明书提取基因组DNA。回收得到的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。核酸DNA260/A280值应在1.7–1.9，DNA260/A230应在2.0左右，DNA长度应≥23Kb。

3、SNP芯片检测：7个健康人的唾液基因组DNA采用SNP芯片及其检测试剂盒(购自Illumina，货号：Infnium Global Screening Array-24v1.0)按照说明书的Infinium HTS流程进行杂交检测。

1)将基因组DNA样品加入MSA3板，变性、中和，过夜扩增；

2)将基因组DNA酶切成一定大小的片段；

3)用异丙醇和PM1使DNA样本沉淀；

4)用RA1使DNA沉淀重新悬浮；

5)将重悬的DNA片段加到芯片上，进行杂交；

6)洗片：准备进行芯片染色；

7)染色：洗去芯片上未杂交和非特异性杂交的DNA样本，加上标记的寡核苷酸，与DNA杂交上的引物进行延伸，引物染色，芯片包被；

8)扫描：用芯片扫描仪(购自Illumina，型号：)扫描获得芯片的杂交信号；

9)分析和基因分型：Illumina软件自动开展分析和基因型检出。

三、数据分析

从GWAS Catalog数据库选取有突变位点相对危险度(OR值，odds ratio)的记录，得到10,241种SNP，对应674种性状的13,127条记录，建成易感基因数据库。用该数据库对7个健康人的SNP芯片数据和全基因组测序数据进行易感基因注释。

1、SNP芯片数据分析

1)整合7个健康人的SNP芯片分析数据(共698,500个SNP位点)和易感基因数据库，得到4795个SNP位点，对应518种性状。可见，SNP芯片可以检测数据库中77％的性状，但却只能检测数据库中47％的SNP位点。即，SNP芯片遗失了接近一半的性状已知相关SNP位点。因此，SNP芯片在评估性状风险方面，相比数据库必然存在失真。

2)因易感基因数据库中收录的位点来自于不同国家的人群研究，很多危险等位基因在中国人群发生频率很高，远大于相关性状的发生频率，因此不太可能是主要驱动基因。为此，筛选7个健康人中危险等位基因发生频率小于等于20％的SNP位点，即7个人中有且只有一个人出现危险等位基因。结果得到269个位点，对应137种性状。

3)风险计算：采用公式—风险值R＝log2(OR₁×OR₂×OR₃×..×OR_n)×e，来计算性状风险，即，性状相关的n个风险位点的OR值连乘，乘积取log2对数后，乘以风险因子e，其中，e＝n/N(某人检出某种性状的位点数n/芯片上某种性状的总位点数N)。取log2的目的是对总风险因子进行降维，使之具有可比性。通过风险因子消除某种性状由于相关的位点数量多而增加随机发生的可能。

例如，表1所示为6号样品关于非酒精性脂肪肝病的检测结果。芯片上关于非酒精性脂肪肝病总共有6个位点。该样品的6个位点全部检出风险等位基因。因此，根据上述公式计算他的发病风险为：

log2(1.47*1.44*1.47*1.85*1.66*1.54)*6/6＝3.87

表1样品6关于非酒精性脂肪肝病的芯片检测结果

4)结果报告。根据风险值R从大到小排序，给出客户发生某种性状风险的概率，提醒客户注意防范最大风险的性状(或者性状组)。

例如，表2所示为6号样品的前20名结果报告。从表2可以看到，该健康人的最大发病风险为非酒精性脂肪肝病及其衍生的肝细胞癌。了解到6号个体确实患有非酒精性脂肪肝病，告知其遗传易感性，希望其控制非酒精性脂肪肝病，预防肝癌的发生。

表2样品6的芯片分析结果

2、全基因组测序数据分析

1)本地化GATK4。参照美国Broad研究所提供的GATK最佳实践(GATK BestPractices)将GATK4本地化，其工作流程配置在WDL文件，在json文件配置流程所需参数并在cromwell中运行，通过GATK的docker容器运行数据处理(gatk4-data-processing)和突变检测(gatk4-germline-snps-indels)流程，最终得到突变位点。其中，参考基因组为hg38，突变位点数据库为dbsnp146。

2)通过上述流程可获得每例样本的遗传突变SNP或INDEL位点，进一步过滤低质量的结果，只保留filter列为PASS的位点。结果7个健康人检出的突变位点数目如表3所示，其中Sample2同时进行高深度的测序得到Sample2b。

从表3可以看到：1)全基因组测序，哪怕是只有5X不到的测序深度，检测到的SNP位点数也是SNP芯片的3倍以上；2)全基因组测序，哪怕是测序深度达到48X，检测到的SNP位点数也仅比7X的测序深度增加10％不到。因此，低深度的全基因组测序表现出最高的性价比，即价格与芯片相当，但是检出位点比芯片多2倍以上，而且与高深度测序相当。

表3 7个健康人唾液DNA全基因组测序结果

样本	测序深度	检出位点数
			Sample1	8.3X	3,876,296
Sample2	7.59X	4,015,014
			Sample3	7.91X	3,725,866
Sample4	7.94X	3,754,957
			Sample5	6.2X	3,342,196
Sample6	4.86X	2,217,528
			Sample7	4.85X	2,875,206
Sample2b	48.2X	4,348,099

3)整合7个健康人的全基因组分析数据和易感基因数据库，得到6577个SNP位点，对应586种性状，分别是芯片的1.4倍和1.1倍。可见芯片漏检了约30％的危险等位基因。筛选7个健康人中危险等位基因发生频率小于等于20％的SNP位点，即7个人中有且只有一个人出现危险等位基因。结果得到1067个位点，对应327种性状，分别是芯片检测结果的4倍和2.4倍。可见低深度全基因组测序的危险等位基因检出敏感度是芯片的3倍以上。因此，低深度全基因组测序比芯片检出结果更多而且更可靠。

4)风险计算和结果报告。采用与上述芯片分析相同的流程计算性状风险和产生结果报告。例如，同样对6号样品，计算非酒精性脂肪肝病的发病风险(参见表4)。全基因组测序上关于非酒精性脂肪肝病总共有6个位点，该样品检出4个危险等位基因。因此，根据上述公式计算他的发病风险为：

log2(1.47*1.47*1.85*1.66)*4/6＝1.82。

表4样品6关于非酒精性脂肪肝病的测序检测结果

根据风险值R从大到小排序，给出客户发生某种性状风险的概率。例如，表5所示为6号样品的前20名结果报告。从表5可以看到，芯片提示的非酒精性脂肪肝病及其衍生的肝癌同样排在前三位。除此之外，全基因组测序新发现了6号样品有发生非酒精性脂肪肝衍生肝硬化的风险(风险值1.01)。这符合肝癌发病的病理规律：肝炎->肝硬化->肝癌。因此，更进一步提示6号个体有发生肝癌的风险，有必要控制非酒精性脂肪肝病的发生。这也再次说明，全基因组测序能比芯片提供更全面的预测信息。

表5样品6的全基因组分析结果

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种检测健康人易感基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取健康人的基因组DNA；

(2)采用步骤(1)所得基因组DNA构建基因组测序文库；

(3)将步骤(2)构建的基因组测序文库上样至测序仪，设置测序参数，启动测序，得到健康人的全基因组测序数据，其中，测序深度为4.85～8.3倍；

(4)从GWAS Catalog数据库选取有突变位点相对危险度的记录，建成易感基因数据库，用易感基因数据库对步骤(3)所得健康人的全基因组测序数据进行易感基因注释，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序深度为6.2～7.91倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序深度为7.59倍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)所得基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.7～1.9。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)所得基因组测序文库的插入片段大小为100～800bp。

6.一种评估健康人患病风险的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以权利要求1中健康人的全基因组测序数据为基础数据进行本地化GATK4分析，得到健康人的突变SNP位点和/或INDEL位点，其中，参考基因组为hg38，突变位点数据库为dbsnp146；

2)对步骤1)所得突变SNP位点和/或INDEL位点过滤，只保留filter列为PASS的位点；

3)整合步骤2)所得位点信息、健康人的全基因组测序数据和易感基因数据库，得到健康人的SNP位点，以及SNP位点对应的性状；

4)采用如下公式来计算患病风险，风险值R＝log2(OR₁*OR₂*OR₃*..*OR_n)*e，其中，OR为有突变位点相对危险度，e＝n/N，n为某人检出某种性状的位点数，N为芯片上某种性状的总位点数。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中本地化GATK4的步骤为：参照美国Broad研究所提供的GATK最佳实践将GATK4本地化，其工作流程配置在WDL文件，在json文件配置流程所需参数并在cromwell中运行，通过GATK的docker容器运行数据处理和突变检测流程。