CN108251520A - 一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法 - Google Patents

一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法，主要包括如下步骤：步骤一：构建吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库；步骤二：对个体进行全基因测序得到个体全部遗传突变信息；步骤三：分析预测个体吸烟成瘾的风险；步骤四：指导个体化用药；步骤五：根据步骤三分析预测的个体吸烟成瘾风险，采取积极主动的健康干预行为。本发明利用全基因组测序技术得到个体全部遗传突变信息，再结合数据库信息，通过综合数据分析，筛选有效的吸烟成瘾易感遗传变异，明确变异导致的生理学变化，指导戒烟者选择合适的戒烟药物，制定个体化的治疗方案，能够大大提高吸烟者的戒烟效果，具有时间上超前，行为上主动，措施效果上精准。

Description

一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指 导方法
技术领域
本发明涉及生物遗传医学技术领域，具体涉及一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法。
背景技术
吸烟行为严重危害着人们的身体健康，它能导致多种疾病的发生，如癌症、心血管疾病、呼吸系统疾病等。其中受吸烟影响最严重的是肺癌，吸烟者因患肺癌死亡约为不吸烟者的10倍以上。目前全世界每天有13000多人死于烟草，按照该速度计算，从2000年到2030年吸烟者将从12亿上升到16亿，每年死于烟草的人数将从490万上升到1000万。
多年研究证明吸烟成瘾是由环境因素与遗传因素共同诱发的，其中，遗传诱因涉及到大量异常突变位点导致个体极其容易吸烟成瘾。最危险的人群是青少年，他们容易受外界影响尝试吸烟，如果有人含有尼古丁易感基因突变位点，则很快就会成瘾，一旦成瘾后则很难戒断。青少年尼古丁成瘾后持续抽烟，烟龄往往较长，吸烟量也与日俱增，是肺癌的高危人群。烟草使青少年期开始吸烟的吸烟者中半数死亡，而这些死亡者中的半数在中年丧生。
目前，世界上已有许多研究证明吸烟成瘾与遗传因素密切相关。科学家们已确定了多个吸烟成瘾易感基因及其遗传变异位点，这些遗传变异位点对个体吸烟成瘾起着重要作用。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了一种能够检测出个体所携带的吸烟成瘾易感基因的遗传变异位点，并计算出该个体吸烟成瘾风险的方法以及指导戒烟药物个体化用药的方法。
本发明所基于的原理如下：
现代医学证明戒烟药物的疗效也受戒烟者的遗传基因影响。同一种戒烟药，不同的戒烟者使用后疗效可能大不相同。因此，基因检测辅助选择戒烟药物得到了越来越多的临床医生和戒烟者的认可。目前，一线临床戒烟药物包括尼古丁替代疗法(NRT)类产品、安非他酮和伐尼克兰。研究发现编码尼古丁代谢催化酶的CYP2A6基因发生突变，会导致服用伐尼克兰的效果与安慰剂没有差别，但使用 NRT产品效果却很理想；如果没有携带CYP2A6基因突变，则使用伐尼克兰的疗效远胜于NRT。CYP2B6是安非他酮代谢的主要催化酶，其基因的突变可以提高安非他酮的戒烟疗效，而非突变者服用安非他酮的疗效与安慰剂无异。
全基因组测序技术的出现对医学研究领域来说是一次革命性的进步。全基因组测序技术能够全面、精确地检测个体基因组中的几乎全部碱基序列，进而得以破解其所包含的生物信息，揭示遗传与疾病的关系。因此，利用全基因组测序技术和生物信息分析技术，可以检测出所有吸烟成瘾易感基因的遗传变异位点，结合现有的研究发现，可预测出不同个体吸烟成瘾的风险，从而指导吸烟成瘾风险高的吸烟者及时进行早期干预。尤其是青少年更需及早进行吸烟成瘾风险预测，以防吸烟成瘾，难以戒断。此外，对于已经成瘾的吸烟者，全基因组测序技术能够同时检测出CYP2A6、CYP2B6的基因突变，辅助临床医生根据吸烟者的基因差异，选择合适的戒烟药物，制定个体化的治疗方案。
本发明采用如下技术方案：
一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法，主要包括如下步骤：
步骤一：构建吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库；
步骤二：对个体进行全基因测序得到个体全部遗传突变信息；
步骤三：根据步骤二得到的个体全部遗传突变信息和步骤一构建的数据库对比，分析预测个体吸烟成瘾的风险；
步骤四：根据步骤二确定的个体全部遗传突变信息中与戒烟药物相关基因的突变位点，从而指导个体化用药；
步骤五：根据步骤三分析预测的个体吸烟成瘾风险，采取积极主动的健康干预行为。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤一：构建吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库的具体实施方法为：
阶段(一)、在ClinVar数据库以及GWAS-catalog数据库中，通过程序语言编写脚本搜索并提取与吸烟成瘾相关的所有易感基因和遗传变异；
阶段(二)、数据筛选和分类：根据ClinVar数据库中提取的关于每个遗传变异的相关信息筛选易感SNP位点，对所有遗传变异进行可靠性分类；同时，根据GWAS-catalog数据库中提取的关于变异的P-value值对遗传变异进行筛选，以便筛选出有效的吸烟成瘾易感基因遗传变异；
阶段(三)、整理汇总在阶段(二)中收集的数据，以便形成吸烟成瘾易感基因panel以及吸烟成瘾易感基因panel所包含的所有有效遗传变异信息，同时，用MySQL系统构建与吸烟成瘾易感基因panel所包含的所有有效遗传变异信息相关的本地数据库。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤二：对个体进行全基因测序得到个体全部遗传突变信息的具体方法为：
A、全基因测序：使用Covaris仪器对个体的DNA样本进行随机打断，将打断后的DNA样本的末端补平并加接头，采用磁珠对末端补平并加接头的DNA样本进行目的片段的筛选，之后进行DNA样本的cluster制备，最后使用IlluminaHiSeq X Ten对DNA样本的cluster进行测序，得到测序原始数据；
B、下机原始数据的质控：利用FastQC软件对测序原始数据进行包括测序质量、接头、序列重复水平的质控指标的检测，然后使用Trimmomatic软件去除测序原始数据中低质量的Reads、切去接头和低质量序列，得到测序质控数据；
C、序列比对：利用BWA对测序质控数据进行片段比对和拼接，所述片段比对和拼接包括测序片段覆盖倍数的估计、重复片段标记、将比对到Indel附近的 Reads进行局部重新比对、将比对的错误率降到最低以及将测序质控数据的bam 文件中Reads的碱基质量值进行重新校正，以使最后输出的测序质控数据的bam 文件中的Reads与人类的参考基因组序列能更好地匹配；
D、突变位点提取：利用GATK软件中的HaplotypeCaller对在C中完成比对的测序质控数据中的序列进行遗传突变位点提取，所述遗传突变位点包括SNP和 Indel两种突变类型，再利用GATK软件中的VQSR方法对提取的变异结果进行过滤，得到高质量遗传突变信息并保存在VCF文件中。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤三中关于分析预测个体吸烟成瘾的风险的具体方法为：
根据步骤一中所得的吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库以及步骤二中所得的个体全部遗传突变信息，联立以下公式计算出每一个SNP位点不同基因型分别导致的吸烟成瘾风险Pr(D|Gm)：
Pr(D)＝Pr(D|G1)Pr(G1)+Pr(D|G2)Pr(G2)+Pr(D|G3)Pr(G3)
其中：
Pr(D)＝某疾病在特定人群或种族中的发病率
Gm＝一个SNP位点有三种基因型，分别是野生纯合子G1、突变杂合子G2和突变纯合子G3
Pr(Gm)＝某SNP位点的特定基因型在特定人群或种族中的出现频率
ORm＝某SNP位点的特定基因型与该疾病之间的相关性
Pr(D|Gm)＝某SNP位点的特定基因型导致的该疾病发病率
然后，再联立以下公式计算个体全部易感位点共同作用导致的吸烟成瘾风险
其中：
个体全部易感位点共同作用与该疾病之间的相关性
个体全部易感位点共同作用导致的该疾病发病率
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤四中关于指导个体化用药的具体方法为：
根据步骤二中得到的个体全部遗传突变信息确定个体所携带的基因突变类型，从而选择合适的戒烟药物，其中具体的基因突变类型及对应药物的选择方案如下：
当个体所述携带的基因型为CYP2A6*1/*1基因型时，使用伐尼克兰作为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2A6*4等位基因时，使用NRT作为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2B6*6等位基因时，使用安非他酮作为为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2B6*1/*1基因型时，使用安非他酮或安慰剂作为为戒烟药物。
本发明的有益效果是：
1、本发明利用全基因组测序技术可以得到个体全部遗传突变信息，再结合数据库信息，通过综合分析所收集到的信息，筛选有效的吸烟成瘾易感遗传变异，明确遗传变异导致的生理学变化，作为疾病发生的医学解释，具有时间上超前，行为上主动，措施效果上精准；
2、本发明在使用过程中还能够不断地更新数据库，以增加个体吸烟成瘾风险预测的准确性；
3、本发明通过全基因组测序技术检测，并结合权威吸烟成瘾易感突变数据库进行风险评估，对吸烟者尤其是初步进行吸烟行为的青少年发出警示，从而能够及时采取积极主动的健康干预行为；此外，对于已经成瘾的吸烟者，本发明能够根据戒烟药物相关基因(CYP2A6、CYP2B6)的突变类型，指导戒烟者选择合适的戒烟药物，制定个体化的治疗方案，从而大大提高戒烟效果。
具体实施方式
现在结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法，主要包括如下步骤：
步骤一：构建吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库；
步骤二：对个体进行全基因测序得到个体全部遗传突变信息；
步骤三：根据步骤二得到的个体全部遗传突变信息和步骤一构建的数据库对比，分析预测个体吸烟成瘾的风险；
步骤四：根据步骤二确定的个体全部遗传突变信息中与戒烟药物相关基因的突变位点，从而指导个体化用药；
步骤五：根据步骤三分析预测的个体吸烟成瘾风险，采取积极主动的健康干预行为；
所述步骤一：构建吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库的具体实施方法为：
阶段(一)、在ClinVar数据库以及GWAS-catalog数据库中，通过程序语言编写脚本搜索并提取与吸烟成瘾相关的所有易感基因和遗传变异；
其中，ClinVar数据库是一个公开的数据库，其中收集了与疾病相关的遗传变异。这一数据库由美国国立卫生研究院2013年为了生物技术信息开发而构建，到目前为止，已经从研究人员和其它数据库中获得了包含超过125,000份独特突变的临床注释。
阶段(二)、数据筛选和分类：根据ClinVar数据库中提取的关于每个遗传变异的相关信息筛选易感SNP位点，并根据多年来遗传研究结果对所有遗传变异进行可靠性分类；同时，根据GWAS-catalog数据库中提取的关于变异的P-value 值以及发表文章报道的人群等信息对遗传变异进行筛选，阅读遗传变异的相关文献以及参考其他数据库中该变异的描述，筛选出有效的吸烟成瘾易感基因遗传变异；
阶段(三)、整理汇总在阶段(二)中收集的数据，以便形成吸烟成瘾易感基因panel以及吸烟成瘾易感基因panel所包含的所有有效遗传变异信息，同时，用MySQL系统构建与吸烟成瘾易感基因panel所包含的所有有效遗传变异信息相关的本地数据库。本实施例一共确定了72个吸烟成瘾易感基因，见表1：
表1吸烟成瘾易感基因panel
ACOT12 ACTN1 ADAMTSL1 ANKK1 ARHGAP39 BBX
BDNF C1orf100 CABLES1 CACNA2D3 CAMKK1 CDH13
CDYL2 CHRM1 CHRM2 CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5
CHRNA6 CHRNB1 CHRNB2 CHRNB3 CNTN3 COMT
CTNNA3 CYP2A6 CYP2A7 CYP2B6 CYP2F2P CYP2T1P
DBH DCC DDC DRD1 DRD2 DRD4
GABABR2 GABBR2 GLIS3 GRIN2B GRIN3A GTF2H5
HSD17B3 HTR3A HTR5A HYKK LPAR3 MORN5
NR5A2 NRXN1 PDE1C SASH1 SBF2 SETD7
SGCD SLC22A23 SLC39A11 SLC6A3 SLC6A4 SNX18
SULT1B1 TANC1 TAPT1 TENM3 TRPC5 UBR2
UGT2B10 UGTB10 VPS13B ZFAT ZNF93
所述步骤二：对个体进行全基因测序得到个体全部遗传突变信息的具体方法为：
A、全基因测序：使用Covaris仪器(超声波DNA破碎仪)对个体的DNA样本进行随机打断，将打断后的DNA样本的末端补平并加接头，采用磁珠对末端补平并加接头的DNA样本进行目的片段的筛选，之后进行DNA样本的cluster制备，最后使用IlluminaHiSeq X Ten(测序仪)对DNA样本的cluster进行测序，得到测序原始数据；
B、下机原始数据的质控：利用FastQC软件对测序原始数据进行包括测序质量、接头、序列重复水平的质控指标的检测，然后使用Trimmomatic软件去除测序原始数据中低质量的Reads、切去接头和低质量序列，得到测序质控数据；
C、序列比对：利用BWA(生物序列对比软件)对测序质控数据进行片段比对和拼接，所述片段比对和拼接包括测序片段覆盖倍数的估计、重复片段标记、将比对到Indel附近的Reads进行局部重新比对、将比对的错误率降到最低以及将测序质控数据的bam文件中Reads的碱基质量值进行重新校正，以使最后输出的测序质控数据的bam文件中的Reads与人类的参考基因组序列能更好地匹配；
D、突变位点提取：利用GATK软件中的HaplotypeCaller对在C中完成比对的测序质控数据中的序列进行遗传突变位点提取，所述遗传突变位点包括SNP和Indel两种突变类型，再利用GATK软件中的VQSR方法对提取的变异结果进行过滤，得到高质量遗传突变信息并保存在VCF文件中。
所述步骤三中关于分析预测个体吸烟成瘾的风险的具体方法为：
根据步骤一中所得的吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库以及步骤二中所得的个体全部遗传突变信息，联立以下公式计算出每一个SNP位点不同基因型分别导致的吸烟成瘾风险Pr(D|Gm)：
Pr(D)＝Pr(D|G1)Pr(G1)+Pr(D|G2)Pr(G2)+Pr(D|G3)Pr(G3)
其中：
Pr(D)＝某疾病在特定人群或种族中的发病率
Gm＝一个SNP位点有三种基因型，分别是野生纯合子G1、突变杂合子G2和突变纯合子G3
Pr(Gm)＝某SNP位点的特定基因型在特定人群或种族中的出现频率
ORm＝某SNP位点的特定基因型与该疾病之间的相关性
Pr(D|Gm)＝某SNP位点的特定基因型导致的该疾病发病率
然后，再联立以下公式计算个体全部易感位点共同作用导致的吸烟成瘾风险
其中：
一般而言，计算出的吸烟成瘾风险高于群体发病率20％以内，属于低风险；高于群体发病率20％-50％，属于中风险，需要引起警惕；高于群体发病率50％以上，则属于高风险，建议尽早进行干预，避免持续吸烟。
所述步骤四中关于指导个体化用药的具体方法为：
根据步骤二中得到的个体全部遗传突变信息确定个体所携带的基因突变类型，从而选择合适的戒烟药物，其中具体的基因突变类型及对应药物的选择方案如下：
当个体所述携带的基因型为CYP2A6*1/*1基因型时，使用伐尼克兰作为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2A6*4等位基因时，使用NRT作为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2B6*6等位基因时，使用安非他酮作为为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2B6*1/*1基因型时，使用安非他酮或安慰剂作为为戒烟药物。
上述方案的汇总，见表2：
表2戒烟药物用药指导
本发明利用全基因组测序技术可以得到个体全部遗传突变信息，再结合数据库信息，通过综合分析所收集到的信息，筛选有效的吸烟成瘾易感遗传变异，明确变异导致的生理学变化，作为疾病发生的医学解释，具有时间上超前，行为上主动，措施效果上精准。同时，不断地更新数据库，以增加个体吸烟成瘾风险预测的准确性。因此，本发明通过全基因组测序技术检测，并结合权威吸烟成瘾易感突变数据库进行风险评估，对烟民尤其是初步进行吸烟行为的青少年发出警示，从而及时采取积极主动的健康干预行为。此外，对于已经成瘾的吸烟者，本发明根据戒烟药物相关基因(e.g.,CYP2A6、CYP2B6)的突变类型，指导戒烟者选择合适的戒烟药物，制定个体化的治疗方案，能够大大提高吸烟者的戒烟效果。
最后应说明的是：这些实施方式仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。此外，对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法，其特征在于：主要包括如下步骤：
步骤一：构建吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库；
步骤二：对个体进行全基因测序得到个体全部遗传突变信息；
步骤三：根据步骤二得到的个体全部遗传突变信息和步骤一构建的数据库对比，分析预测个体吸烟成瘾的风险；
步骤四：根据步骤二确定的个体全部遗传突变信息中与戒烟药物相关基因的突变位点，从而指导个体化用药；
步骤五：根据步骤三分析预测的个体吸烟成瘾风险，采取积极主动的健康干预行为。
2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法，其特征在于：
所述步骤一：构建吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库的具体方法为：
阶段(一)、在ClinVar数据库以及GWAS-catalog数据库中，通过程序语言编写脚本搜索并提取与吸烟成瘾相关的所有易感基因和遗传变异；
阶段(二)、数据筛选和分类：根据ClinVar数据库中提取的关于每个遗传变异的相关信息筛选易感SNP位点，对所有遗传变异进行可靠性分类；同时，根据GWAS-catalog数据库中提取的关于变异的P值对遗传变异进行筛选，以便筛选出有效的吸烟成瘾易感基因遗传变异；
阶段(三)、整理汇总在阶段(二)中收集的数据，以便形成吸烟成瘾易感基因panel以及吸烟成瘾易感基因panel所包含的所有有效遗传变异信息，同时，用MySQL系统构建与吸烟成瘾易感基因panel所包含的所有有效遗传变异信息相关的本地数据库。
3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法，其特征在于：
所述步骤二：对个体进行全基因测序得到个体全部遗传突变信息的具体方法为：
A、全基因组测序：使用Covaris仪器对个体的DNA样本进行随机打断，将打断后的DNA样本的末端补平并加接头，采用磁珠对末端补平并加接头的DNA样本进行目的片段的筛选，之后进行DNA样本的cluster制备，最后使用IlluminaHiSeq X Ten对DNA样本的cluster进行测序，得到测序原始数据；
B、下机原始数据的质控：利用FastQC软件对测序原始数据进行包括测序质量、接头、序列重复水平的质控指标的检测，然后使用Trimmomatic软件去除测序原始数据中低质量的Reads、切去接头和低质量序列，得到测序质控数据；
C、序列比对：利用BWA对测序质控数据进行片段比对和拼接，所述片段比对和拼接包括测序片段覆盖倍数的估计、重复片段标记、将比对到Indel附近的Reads进行局部重新比对、将比对的错误率降到最低以及将测序质控数据的bam文件中Reads的碱基质量值进行重新校正，以使最后输出的测序质控数据的bam文件中的Reads与人类的参考基因组序列能更好地匹配；
D、突变位点提取：利用GATK软件中的HaplotypeCaller对在“C”中完成比对的测序质控数据中的序列进行遗传突变位点提取，所述遗传突变位点包括SNP和Indel两种突变类型，再利用GATK软件中的VQSR方法对提取的变异结果进行过滤，得到高质量遗传突变信息并保存在VCF文件中。
4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法，其特征在于：
所述步骤三中关于分析预测个体吸烟成瘾的风险的具体方法为：
根据步骤一中所得的吸烟成瘾易感基因遗传突变信息数据库以及步骤二中所得的个体全部遗传突变信息，联立以下公式计算出每一个SNP位点不同基因型分别导致的吸烟成瘾风险Pr(D|Gm)：
Pr(D)＝Pr(D|G1)Pr(G1)+Pr(D|G2)Pr(G2)+Pr(D|G3)Pr(G3)
其中：
Pr(D)＝某疾病在特定人群或种族中的发病率
Gm＝一个SNP位点有三种基因型，分别是野生纯合子G1、突变杂合子G2和突变纯合子G3
Pr(Gm)＝某SNP位点的特定基因型在特定人群或种族中的出现频率
ORm＝某SNP位点的特定基因型与该疾病之间的相关性
Pr(D|Gm)＝某SNP位点的特定基因型导致的该疾病发病率
然后，再联立以下公式计算个体全部易感位点共同作用导致的吸烟成瘾风险
其中：
。
5.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法，其特征在于：
所述步骤四中关于指导个体化用药的具体方法为：
根据步骤二中得到的个体全部遗传突变信息确定个体所携带的基因突变类型，从而选择合适的戒烟药物，其中具体的基因突变类型及对应药物的选择方案如下：
当个体所述携带的基因型为CYP2A6*1/*1基因型时，使用伐尼克兰作为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2A6*4等位基因时，使用NRT作为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2B6*6等位基因时，使用安非他酮作为为戒烟药物；
当个体所述携带的基因型为CYP2B6*1/*1基因型时，使用安非他酮或安慰剂作为为戒烟药物。
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