CN110910956B - 单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法 - Google Patents
单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110910956B CN110910956B CN201911148956.5A CN201911148956A CN110910956B CN 110910956 B CN110910956 B CN 110910956B CN 201911148956 A CN201911148956 A CN 201911148956A CN 110910956 B CN110910956 B CN 110910956B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- single nucleotide
- nucleotide polymorphism
- addiction
- sites
- smoking
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 title claims abstract description 78
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 title claims abstract description 5
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 claims abstract description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008827 biological function Effects 0.000 claims abstract description 7
- 235000019505 tobacco product Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 22
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 17
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 17
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 claims description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 claims description 8
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- 101000741396 Chlamydia muridarum (strain MoPn / Nigg) Probable oxidoreductase TC_0900 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000741399 Chlamydia pneumoniae Probable oxidoreductase CPn_0761/CP_1111/CPj0761/CpB0789 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000741400 Chlamydia trachomatis (strain D/UW-3/Cx) Probable oxidoreductase CT_610 Proteins 0.000 claims description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 6
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 claims description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 4
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000779 smoke Substances 0.000 claims description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 3
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000009666 Cytochrome P-450 CYP2B6 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010020070 Cytochrome P-450 CYP2B6 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100038942 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 3A Human genes 0.000 claims description 2
- 102000017679 HTR3A Human genes 0.000 claims description 2
- 102000017678 HTR3B Human genes 0.000 claims description 2
- 101000761343 Homo sapiens 5-hydroxytryptamine receptor 3A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000964058 Homo sapiens 5-hydroxytryptamine receptor 3B Proteins 0.000 claims description 2
- 101000713085 Homo sapiens C-C motif chemokine 21 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000603180 Homo sapiens Glutamate receptor ionotropic, NMDA 3A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000782865 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000745167 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000822103 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000726901 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit beta-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100035585 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100039909 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021511 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-7 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100030912 Neuronal acetylcholine receptor subunit beta-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035622 drinking Effects 0.000 claims description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000005586 smoking cessation Effects 0.000 description 3
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000009660 Cholinergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000875170 Homo sapiens Cytochrome P450 2A6 Proteins 0.000 description 1
- 101000745175 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000726905 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039907 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100030911 Neuronal acetylcholine receptor subunit beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000019315 Nicotinic acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050006807 Nicotinic acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
- G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
- G16B20/40—Population genetics; Linkage disequilibrium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，包括有以下步骤：步骤一：确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点，并定制Taqman OpenArray芯片进行基因分型；步骤二：为血液样本提取DNA和RNA；步骤三：对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行初步筛选；步骤四：基于基因分型、基因组甲基化测序、转录组测序的结果，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，本发明涉及生物遗传医学技术领域。本发明，能够精准、有效地为判断中国汉族人群吸烟成瘾易感性提供依据和指导，从而避免高风险个体直接或者过多的接触烟草产品，达到精准预防的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物遗传医学技术领域，具体涉及中国汉族人群吸烟成瘾易感基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒及其应用。
背景技术
吸烟成瘾作为一种慢性精神类疾病，全球范围内每年约造成600万人的非正常死亡。由于缺少有效的治疗方法和戒烟手段，以及一些国家和地区对于吸烟成瘾的危害认识有限，在2020年每年因为吸烟导致的非正常死亡人数将达到1000万人。根据中国疾控中心报告显示，在2015年中国有过吸烟经历的成年男性比例高达52.1％，烟民总数超过3亿，6000万人每天吸烟量超过1包，由于吸烟导致非正常死亡的人数高达130万。由于吸烟带来的经济损失在2014年约为3500亿元。数据显示，中国烟民戒烟成功率仅14.4％，而如果仅靠个人意志不借助医疗戒烟的话，成功率仅有3％-5％。
在过去的几十年中，连锁分析、候选基因关联分析以及全基因组关联分析的广泛应用，为吸烟成瘾找到了大量的易感位点。对于吸烟成瘾来说，遗传因素和环境因素都起到了重要的作用。其中，遗传因素对于吸烟成瘾的贡献大约为0.56。尽管对于吸烟成瘾这一表型已经经过了几十年的研究，但是最为广泛被大家接受的，还是乙酰胆碱受体家族的CHRNA5/A3/B4基因簇、CHRNB3/A6和尼古丁代谢通路的基因CYP2A6/A7。需要注意的是，这些研究结果也主要是基于欧洲裔和非洲裔的样本所得到的分析结果，而针对于中国汉族人群的吸烟相关的研究还是非常少的。但是，人种之间存在的基因型差异是不可忽略的问题。所以，寻找中国汉族人群特有的吸烟易感位点，不仅对于成瘾治疗药物的开发、精准治疗中国汉族人群吸烟成瘾的现象有重要意义；并且，可以鉴定出易于吸烟成瘾高风险的中国汉族人群，从而建议这些高风险的人群不要接触烟草制品，避免成瘾的发生。
候选基因关联分析是国际上使用最为普遍的一种算法，用于找到和表型最相关的单核苷酸多态性位点。我们使用软件PLINK(v.1.07)，结合样本的基因型和表型文件做关联分析，对所纳入的遗传位点根据关联分析的P值进行第一次的筛选。对于候选基因分析的方法，我们只局限于单个位点的扫描，找到显著的单核苷酸多态性位点，对其进行生物学解释。但是这样单一的分析，造成了遗传力的缺失，很多不够显著的位点从而被忽略，这一现象也解释了遗传力丢失的现象。现在，我们将构建广义线性回归模型，结合表型，可以探索到全基因组范围内多个基因的协同效应对表型产生的影响，检测其基因上位性，为进一步研究的吸烟成瘾等复杂疾病的遗传起因找到真正的单核苷酸多态性位点。结合候选基因的基因组、转录组和甲基化组数据，使用软件Matrix eQTL(v.2.1.1)进行cis-mQTL和cis-eQTL分析，我们可以进一步缩小研究范围，找到中国汉族人群中的成瘾相关的功能性遗传位点，而不是单纯只考虑关联分析结果中的P值，也可以为更多位于内含子区间的单核苷酸多态性位点解释其生物学功能。最终，通过生物信息学软件Polyphen和CADD进行单核苷酸多态性位点功能预测，找到最优的中国汉族人群中的吸烟成瘾相关的易感位点rs2304297(G)、rs1072003(C)、rs16969968(A)，组成检测所需的基因检测试剂盒。
因此，本发明申请提供了单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，能够精准、有效地为判断中国汉族人群吸烟成瘾易感性提供依据和指导，从而避免高风险个体直接或者过多的接触烟草产品，达到精准预防的目的。
发明内容
为了能够精准、有效地为判断中国汉族人群吸烟成瘾易感性提供依据和指导，从而避免高风险个体直接或者过多的接触烟草产品，达到精准预防的目的，本发明的目的是提供单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，包括有以下步骤：
步骤一：通过搜索查阅数据库以及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点，并定制Taqman OpenArray芯片进行基因分型；
步骤二：为血液样本提取DNA和RNA；
步骤三：基于基因分型的结果，结合样本吸烟相关的表型，利用候选基因关联分析，对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行初步筛选，将关联分析P值小于0.05的单核苷酸多态性位点纳入下一步分析；
步骤四：基于基因分型、基因组甲基化测序、转录组测序的结果，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，对单核苷酸多态性位点进行打分，保留最可能对吸烟成瘾具有贡献并具有潜在生物学意义的位点，构成中国汉族人群吸烟成瘾的基因检测试剂盒。
优选的，所述步骤一中，通过搜索查阅数据库及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点为：
1)提供了一组与吸烟成瘾相关的18个候选基因；
A.尼古丁受体家族的基因：CHRNA3-CHRNB4-CHRNA5、CHRNB3-CHRNA6、CHRNA2、CHRNB2、CHRNA7、CHRNA4；
B.尼古丁代谢的相关基因：CYP2B6；
C.神经递质系统中的相关基因：GRIN3A、DRD2-ANKK1-TTC12-NCAM1、HTR3A、HTR3B、SLC6A4；
2)提供了与吸烟成瘾相关的203个单核苷酸多态性位点；
3)根据203个单核苷酸多态性位点，将所选择的位点及对应的探针信息提交给Thermo Fisher Scientific公司，定制Taqman OpenArray芯片，根据样本的数量和单核苷酸多态性位点数目选择最优的模块组合。
优选的，所述步骤二中，，DNA样本用于基因分型实验和甲基化测序，RNA样本用于转录组测序，利用Illumina X10测序仪为样本进行测序，通过Illumina二代测序，获得样本甲基化和转录组的原始测序数据，之后将18个易感基因±500kb范围内的基因表达水平和甲基化信息提取出来，对于转录组测序下机数据，我们在使用数据之前，首先要对原始数据进行质量控制，删除低质量的样本和序列，避免低质量的结果对之后的分析产生影响，产生假阳性，之后对单个样本进行有参联配、对基因进行组装和定量。使用的软件组合是Hisat2(v.2.1.0)和Stringtie(v.1.3.6)，甲基化测序原理是使用亚硫酸盐处理DNA后，甲基化的胞嘧啶不受影响，非甲基化的胞嘧啶会转化为尿嘧啶，经PCR后转化为胸腺嘧啶，测序并比对到参考基因组上后通过以上原理可区分出胞嘧啶的甲基化状态，使用Bismark(v.0.22.1)和Bowtie2(v.2.3.5.1软件组合来对甲基化序列进行比对和回帖，通过这一步的分析，我们得到了18个吸烟成瘾易感基因上下游500kb范围内所有基因的基因表达水平数据和基因甲基化水平数据。
优选的，所述步骤三中，根据步骤一中的203个单核苷酸多态性位点基因型，结合样本吸烟相关的表型信息，矫正年龄以及喝酒等影响因素，构建线性回归模型，找到具有统计学意义的多态性位点，利用候选基因关联分析，对汉族人群中吸烟成瘾易感位点进行初步筛选，保留关联分析结果中P值小于0.05的单核苷酸多态性位点。
优选的，所述步骤四中，通过在步骤二中基于基因分型的到的吸烟成瘾相关位点信息，结合和步骤二中得到的这些位点所位于的基因的基因组甲基化测序、转录组测序的结果，使用cis-mQTL分析和cis-eQTL分析，对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行进行第二次筛选，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，以及通过生物信息学软件Polyphen和CADD等生物信息学分析技术，对所纳入的单核苷酸多态性位点进行打分，保留最可能导致个体易于吸烟成瘾的3个位点(rs2304297(G)、rs1072003(C)、rs16969968(A))，构成可以精准区分中国汉族人群吸烟成瘾的基因检测试剂盒，用于精准的判定是否属于吸烟成瘾的易感个体，从而避免直接和过多的接触烟草产品。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明提供了一组与成瘾相关的18个候选基因；本发明还提供了与吸烟成瘾相关的203个单核苷酸多态性位点；本发明还提供了中国汉族人群吸烟成瘾易感基因检测试剂盒中所包含的易感位点，包括：rs2304297(G)、rs1072003(C)、rs16969968(A)；本发明的公开目的是公开了一个可以用于快速区分中国汉族个体是否携带吸烟成瘾的易感位点，从而做到精准医学中的精准预防；并且，该方法不仅适用于吸烟成瘾易感位点的筛选，甚至可以应用于不同表型易感位点的鉴定，TaqmanOpenArray基因分型系统和候选基因关联分析、cis-mQTL分析、cis-eQTL分析、Polyphen和CADD方法的结合，确定了rs2304297(G)、rs1072003(C)和rs16969968(A)这3个位点用于构成中国汉族人群吸烟成瘾易感基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒，可以做到快速精准的为汉族人群进行吸烟成瘾风险的鉴定。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1为本发明整体的示意图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1。
实施例1：根据相关研究筛选吸烟成瘾的易感位点和Taqman OpenArray定制：
我们根据国内外同行评议期刊论文以及本团队在之前的工作研究结果，筛选了尼古丁受体家族的基因(Nicotinic receptor subunit and other cholinergic systemgenes)、尼古丁代谢的相关基因(Nicotine metabolism genes)、神经递质系统中的相关基因(Neurotransmitter system genes)，共18个候选基因和203个单核苷酸多态性位点作为研究靶点(详细信息见表1)。
1)18个与成瘾相关的候选基因；
2)203个候选基因的单核苷酸多态性位点(表1)；
3)定制Taqman OpenArray芯片，根据样本的数量和单核苷酸多态性位点数目选择最优的模块组合。
实施例2：基因分型、转录组测序、甲基化测序结果：
在完成基因分型实验后，使用TaqMan Genotyper(v.3.3)对下机数据进行分析和质检。使用“自动调用(Autocall)”功能调用所有SNP，该过程需要由两名独立的研究人员对自动调用的结果进行人工核查，已确保结果的准确性。根据基因分型的结果，即野生纯合型、纯合突变型和杂合型，从而判断一个人是否携带吸烟成瘾易感位点。
对于转录组测序和甲基化测序下机数据，首先要对原始数据进行质量控制，去除低质量的样本和序列，避免低质量的结果对分析产生影响。之后对单个样本进行有参联配、对基因进行组装和定量。之后，我们提取出18个吸烟成瘾易感基因上下游500kb范围内所有基因的基因表达水平数据和基因甲基化水平数据。
实施例3：基于基因分型、基因组甲基化测序、转录组测序的结果，使用cis-mQTL分析和cis-eQTL分析，对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行进行第二次筛选，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，以及通过生物信息学软件Polyphen和CADD等生物信息学分析技术，对所纳入的单核苷酸多态性位点进行打分，保留最可能对吸烟这一表型具有贡献的位点，构成可以精准区分中国汉族人群吸烟成瘾的基因检测试剂盒，用于精准的判定是否属于吸烟成瘾的易感个体，从而避免直接和过多的接触烟草产品，达到精准预防的目的，找到中国汉族人群特有的吸烟成瘾位点的检测试剂盒。
A.基因分型的实验结果，需要使用QuantStudioTM 12K Flex Instrument进行检测，对实验结果进行第一次质检；
B.对转录组测序下机原始数据进行质量控制，删除低质量的样本和序列后，使用Hisat2(V 2.1.0)和Stringtie(V 1.3.6)软件组合对单个样本进行有参联配、对基因进行组装和定量；
C.对甲基化测序下机原始数据进行质量控制后，删除低质量的样本和序列后，使用Bismark(V 0.22.1)和Bowtie2(V 2.3.5.1)软件组合来对甲基化序列进行比对和回帖；
D.使用软件PLINK(v.1.07)，结合样本的基因型和表型文件做候选基因关联分析，对所纳入的遗传位点根据关联分析的P值进行第一次的筛选；
E.数量性状基因座(Quantitative Trait Loci,QTL)是指染色体上一些能特定调控mRNA(eQTL)、甲基化水平(mQTL)的单核苷酸多态性位点，其基因表达、甲基化的表达水平量与数量性状成比例关系。结合候选的单核苷酸多态性位点的基因组数据、转录组数据和甲基化组数据，使用软件Matrix eQTL(v.2.1.1)进行QTL分析，我们可以进一步缩小研究范围，找到具有调节附近基因表达和甲基化功能的位点，而不是单纯只考虑关联分析结果中的P值，提高分析结果准确性；
F.对所得到的中国汉族人群吸烟成瘾易感位点，根据CADD进行位点的风险度评估；
G.对所得到的中国汉族人群吸烟成瘾易感位点，如果属于错义突变，则在Polyphen软件中进行预测，预测该突变位点是有害突变还是良性突变。
本发明，通过探索这些基因以及该基因中所含有的功能性单核苷酸多态性位点对于吸烟成瘾中的生物学作用，并找到最优化的单核苷酸位点集合，用于准确快速的区分吸烟易感人群，并为精准戒烟药物的开发提供生物学基础。
表1:吸烟成瘾易感位点基因分型结果：
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (4)
1.单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，其特征在于，包括有以下步骤：
步骤一：通过搜索查阅数据库以及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点，并定制TaqmanOpenArray芯片进行基因分型；
所述步骤一中，通过搜索查阅数据库及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点为：
1）提供一组与吸烟成瘾相关的18个候选基因；
A.尼古丁受体家族的基因：CHRNA3-CHRNB4-CHRNA5、CHRNB3-CHRNA6、CHRNA2、CHRNB2、CHRNA7、CHRNA4；
B.尼古丁代谢的相关基因：CYP2B6；
C.神经递质系统中的相关基因：GRIN3A、DRD2-ANKK1-TTC12-NCAM1、HTR3A、HTR3B、SLC6A4；
2）提供与吸烟成瘾相关的203个单核苷酸多态性位点；
所述单核苷酸多态性位点具体包括：rs4845378、rs12072348、rs2072659、rs3811450、rs2292974、rs891398、rs2565061、rs2565065、rs2472553、rs2741338、rs2565055、rs9298629、rs2304297、rs16891583、rs892413、rs17621710、rs10087172、rs2196128、rs2217732、rs1072003、rs10958725、rs10958726、rs13273442、rs4736835、rs1955186、rs6474413、rs7004381、rs4950、rs1530848、rs13280604、rs6474414、rs6474415、rs4954、rs7030238、rs3739722、rs11788456、rs17189632、rs10121600、rs4460436、rs1924032、rs7849782、rs942142、rs10512285、rs10989589、rs1323423、rs10989591、rs10819979、rs2050641、rs2067056、rs2417283、rs1800497、rs2734849、rs4938016、rs11604671、rs7118900、rs4938015、rs4938013、rs17115439、rs4590907、rs4938012、rs10891545、rs877138、rs6589377、rs1799978、rs4938019、rs11214613、rs4648317、rs4581480、rs4245148、rs4648318、rs7103679、rs1079597、rs1800498、rs2283265、rs1076560、rs6277、rs1079594、rs6279、rs6278、rs1062613、rs33940208、rs1985242、rs2276302、rs10160548、rs1150220、rs1176713、rs3758987、rs4938056、rs1176744、rs2276305、rs3782025、rs1672717、rs7103866、rs593217、rs618114、rs2298703、rs2186798、rs646558、rs584427、rs595278、rs686934、rs1821693、rs1836796、rs2117912、rs2043602、rs4595575、rs9651679、rs1245131、rs1245119、rs4492854、rs754672、rs2282511、rs7130431、rs719804、rs2276070、rs4987094、rs2288159、rs948176、rs2303380、rs10502172、rs723077、rs7927508、rs2236709、rs4517559、rs660652、rs578776、rs6495307、rs1051730、rs3743077、rs1317286、rs12914385、rs2869546、rs8042374、rs4887069、rs3743075、rs3743074、rs8040868、rs6495309、rs503464、rs684513、rs667282、rs588765、rs6495306、rs17486278、rs601079、rs680244、rs621849、rs692780、rs951266、rs555018、rs647041、rs16969968、rs514743、rs615470、rs3826029、rs868437、rs883473、rs1606659、rs4779563、rs6494182、rs1913456、rs11637923、rs2175886、rs1355920、rs12591836、rs982574、rs6494211、rs2133965、rs8036104、rs8035668、rs10438287、rs16956223、rs904951、rs904952、rs7175359、rs1909884、rs7178176、rs1948、rs7178270、rs17487223、rs950776、rs11636605、rs12441998、rs11072768、rs1316971、rs3813567、rs11637890、rs1042173、rs3760657、rs8109525、rs2099361、rs16974790、rs8100458、rs3745274、rs8192719、rs7257703、rs2236196、rs3787137、rs3827020、rs1044397、rs1044393、rs3787140、rs755203；
3）根据203个单核苷酸多态性位点，将所选择的位点及对应的探针信息提交给ThermoFisherScientific公司，定制TaqmanOpenArray芯片，根据样本的数量和单核苷酸多态性位点数目选择最优的模块组合；
步骤二：为血液样本提取DNA和RNA；
步骤三：基于基因分型的结果，结合样本吸烟相关的表型，利用候选基因关联分析，对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行初步筛选，将关联分析P值小于0.05的单核苷酸多态性位点纳入下一步分析；
步骤四：基于基因分型、基因组甲基化测序、转录组测序的结果，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，对单核苷酸多态性位点进行打分，保留最可能对吸烟成瘾具有贡献并具有潜在生物学意义的位点，构成中国汉族人群吸烟成瘾的基因检测试剂盒；
所述步骤四中，通过在步骤二中基于基因分型得到的吸烟成瘾相关位点信息，结合和步骤二中得到的这些位点所位于的基因的基因组甲基化测序、转录组测序的结果，使用cis-mQTL分析和cis-eQTL分析，对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行第二次筛选，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，以及通过生物信息学软件Polyphen和CADD，对所纳入的单核苷酸多态性位点进行打分，保留最可能导致个体易于吸烟成瘾的3个位点rs2304297（G）、rs1072003(C)、rs16969968（A），构成可以精准区分中国汉族人群吸烟成瘾的基因检测试剂盒，用于精准的判定是否属于吸烟成瘾的易感个体，从而避免直接和过多的接触烟草产品。
2.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，其特征在于：所述步骤二中，DNA样本用于基因分型实验和甲基化测序，RNA样本用于转录组测序，利用IlluminaX10测序仪为样本进行测序，通过Illumina二代测序，获得样本甲基化和转录组的原始测序数据，之后将18个易感基因±500kb范围内的基因表达水平和甲基化信息提取出来，对于转录组测序下机数据，在使用数据之前，首先要对原始数据进行质量控制，删除低质量的样本和序列，避免低质量的结果对之后的分析产生影响，产生假阳性，之后对单个样本进行有参联配、对基因进行组装和定量。
3.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，其特征在于：使用的软件组合是Hisat2和Stringtie，甲基化测序原理是使用亚硫酸盐处理DNA后，甲基化的胞嘧啶不受影响，非甲基化的胞嘧啶会转化为尿嘧啶，经PCR后转化为胸腺嘧啶，测序并比对到参考基因组上后通过以上原理可区分出胞嘧啶的甲基化状态，使用Bismark和Bowtie2软件组合来对甲基化序列进行比对和回帖，通过这一步的分析，得到18个吸烟成瘾易感基因上下游500kb范围内所有基因的基因表达水平数据和基因甲基化水平数据。
4.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，其特征在于：所述步骤三中，根据步骤一中的203个单核苷酸多态性位点基因型，结合样本吸烟相关的表型信息，矫正年龄以及是否喝酒构建线性回归模型，找到具有统计学意义的多态性位点，利用候选基因关联分析，对汉族人群中吸烟成瘾易感位点进行初步筛选，保留关联分析结果中P值小于0.05的单核苷酸多态性位点。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911148956.5A CN110910956B (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911148956.5A CN110910956B (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110910956A CN110910956A (zh) | 2020-03-24 |
| CN110910956B true CN110910956B (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=69818517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911148956.5A Active CN110910956B (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110910956B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111518896B (zh) * | 2020-06-28 | 2023-09-26 | 云南中烟工业有限责任公司 | 用于检测尼古丁依赖相关的snp位点的引物组、应用、产品及方法 |
| CN111893174A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-11-06 | 上海联吉医学检验所有限公司 | 一种脑卒中用药基因位点联合检测的方法及其引物组、探针组和试剂盒 |
| CN113462772B (zh) * | 2021-09-03 | 2021-11-16 | 中南大学湘雅医院 | 一种用于检测尼古丁依赖性相关的snp位点的引物组以及应用 |
| CN117153250B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-03-01 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 烟草依赖个体化干预基因变异位点筛选方法及试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101437960A (zh) * | 2006-03-01 | 2009-05-20 | 佩勒根科学有限公司 | 成瘾性的标志物 |
| CN101845501A (zh) * | 2010-05-18 | 2010-09-29 | 孟涛 | 一种复杂疾病易感性综合遗传分析方法 |
| CN107653311A (zh) * | 2017-09-07 | 2018-02-02 | 中国医学科学院阜外医院 | 与血脂水平相关的单核苷酸多态性rs4883263检测系统及相关应用 |
| CN107653342A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-02-02 | 成都百泰赛维生物科技有限公司 | 一种pcr法检测汉族人hdv病毒的方法 |
| CN108251520A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-07-06 | 杭州同欣基因科技有限公司 | 一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110294680A1 (en) * | 2008-02-22 | 2011-12-01 | Duke University | Methods and compositions for predicting success in addictive substance cessation and for predicting a risk of addiction |
| ES2426517B1 (es) * | 2012-04-20 | 2014-05-14 | Genetracer Biotech S.L | Método para predecir la seguridad de un tratamiento farmacológico |
-
2019
- 2019-11-21 CN CN201911148956.5A patent/CN110910956B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101437960A (zh) * | 2006-03-01 | 2009-05-20 | 佩勒根科学有限公司 | 成瘾性的标志物 |
| CN101845501A (zh) * | 2010-05-18 | 2010-09-29 | 孟涛 | 一种复杂疾病易感性综合遗传分析方法 |
| CN107653342A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-02-02 | 成都百泰赛维生物科技有限公司 | 一种pcr法检测汉族人hdv病毒的方法 |
| CN107653311A (zh) * | 2017-09-07 | 2018-02-02 | 中国医学科学院阜外医院 | 与血脂水平相关的单核苷酸多态性rs4883263检测系统及相关应用 |
| CN108251520A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-07-06 | 杭州同欣基因科技有限公司 | 一种基于高通量测序技术的吸烟成瘾风险预测方法及戒烟指导方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Genetic Association of the CHRNA6 and CHRNB3 Genes with Tobacco Dependence in a Nationally Representative Sample;Nicole R Hoft等;Neuropsychopharmacology;第34卷;698-706 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110910956A (zh) | 2020-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110910956B (zh) | 单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法 | |
| Rodin et al. | The landscape of somatic mutation in cerebral cortex of autistic and neurotypical individuals revealed by ultra-deep whole-genome sequencing | |
| Nakka et al. | Characterization of prevalence and health consequences of uniparental disomy in four million individuals from the general population | |
| Quach et al. | Expanding the genetic architecture of nicotine dependence and its shared genetics with multiple traits | |
| Hwang et al. | Dynamic regulation of RNA editing in human brain development and disease | |
| Suter et al. | Maternal tobacco use modestly alters correlated epigenome-wide placental DNA methylation and gene expression | |
| Abbasi et al. | Laryngeal cancer risk associated with smoking and alcohol consumption is modified by genetic polymorphisms in ERCC5, ERCC6 and RAD23B but not by polymorphisms in five other nucleotide excision repair genes | |
| Kim et al. | A highly annotated whole-genome sequence of a Korean individual | |
| Bacchelli et al. | A genome-wide analysis in cluster headache points to neprilysin and PACAP receptor gene variants | |
| Sangaré et al. | Genetics of low spinal muscular atrophy carrier frequency in sub‐Saharan Africa | |
| TW200847056A (en) | Genetic analysis systems and methods | |
| Al Khleifat et al. | Structural variation analysis of 6,500 whole genome sequences in amyotrophic lateral sclerosis | |
| Liskova et al. | Heterozygous deletions at the ZEB1 locus verify haploinsufficiency as the mechanism of disease for posterior polymorphous corneal dystrophy type 3 | |
| JP2009528063A (ja) | 依存症に対するマーカー | |
| Brassat et al. | Familial factors influence disability in MS multiplex families | |
| Zhao et al. | Genome-wide association studies detects candidate genes for wool traits by re-sequencing in Chinese fine-wool sheep | |
| Lee et al. | A case‐control study of the association of the polymorphisms and haplotypes of DNA ligase I with lung and upper‐aerodigestive‐tract cancers | |
| Roostaei et al. | Proximal and distal effects of genetic susceptibility to multiple sclerosis on the T cell epigenome | |
| Lago-Docampo et al. | Characterization of rare ABCC8 variants identified in Spanish pulmonary arterial hypertension patients | |
| Eusebi et al. | Aggressive behavior in cattle is associated with a polymorphism in the MAOA gene promoter | |
| Clukay et al. | DNA methylation of methylation complex genes in relation to stress and genome‐wide methylation in mother–newborn dyads | |
| Van Eyk et al. | Targeted resequencing identifies genes with recurrent variation in cerebral palsy | |
| Yingjun et al. | Copy number variations independently induce autism spectrum disorder | |
| Pérez-Rubio et al. | Polymorphisms in HTR2A and DRD4 predispose to smoking and smoking quantity | |
| Tajima et al. | Blood lipid-related low-frequency variants in LDLR and PCSK9 are associated with onset age and risk of myocardial infarction in Japanese |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Mingding Inventor after: Liu Qiang Inventor after: Ma Yunlong Inventor before: Liu Qiang Inventor before: Ma Yunlong Inventor before: Li Mingding |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240223 Address after: Room 901, 9th Floor, Building 9, Dongsheng Huigu, 1299 Kehai Avenue, Anchang Street, Keqiao District, Shaoxing City, Zhejiang Province, 312000 Applicant after: Zhejiang Maiyata Bacterial Testing Intelligent Technology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Room 105, Unit 1, Building 1, No. 9 Longbao Street, Yingze District, Taiyuan City, Shanxi Province, 030000 Applicant before: Liu Qiang Country or region before: China Applicant before: Ma Yunlong |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |