CN105209637B - 非侵入性胎儿性别确定 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鉴于母体混合样品中的胎儿贡献百分比，通过检测和确定来自Y染色体的遗传序列的相对贡献，非侵入性确定胎儿性别或Y染色体频率异常的方法，所述Y染色体频率异常指示胎儿中的非整倍性或性镶嵌现象。

Description

非侵入性胎儿性别确定
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月8日提交的美国专利申请序列号13/790,642的权益并且所述专利申请被转让给本发明的受让人。
发明领域
本发明涉及鉴于母体混合样品中的胎儿贡献百分比，通过检测和确定来自Y染色体的遗传序列的相对贡献，非侵入性确定胎儿性别或Y染色体频率异常的方法。
发明背景
在以下讨论中，为了背景和介绍的目的将描述某些文章和方法。本文包含的任何事物都不被解释为是对现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当时表明本文提及的文章和方法基于适用的法定条款不构成现有技术的权利。
遗传异常造成大量病理学，包括由染色体非整倍性引起的综合征(例如，唐氏综合征)和由导致单基因或多基因疾病或紊乱的种系突变引起那些综合征。检测总染色体异常，诸如三体、易位和大的插入片段或缺失片段以及单基因性状，诸如与Rh血型状态、常染色体显性或X连锁紊乱或常染色体隐性紊乱有关的单基因突变或多态性，在检测可以影响胎儿的真实和潜在病理学和紊乱方面是有用的。例如，染色体异常(诸如13、18和21三体)、罗伯逊易位、和较大缺失片段(诸如在DiGeorge综合征中22号染色体上发现的那些)全部显著地影响胎儿的健康。
尽管常规的技术提供了用于这些不同遗传异常的检测方法，但是直到最近不同遗传异常要求不同技术来询问不同种类的突变。例如，用于染色体非整倍性的产前诊断测试的常规方法要求利用在11周和14周妊娠之间的绒毛膜绒毛取样(CVS)或在15周之后的羊膜穿刺术从子宫直接取出胎儿细胞的样品用于遗传分析。然而，这种侵入性程序携带约百分之一的流产的风险(参见，Mujezinovic和Alfirevic,Obstet.Gynecol.110:687-694(2007))。胎儿细胞的其他分析通常包括核型分析或原位荧光杂交(FISH)并且不提供关于单基因性状的信息；因此，需要另外的用于识别单基因疾病和紊乱的测试。
非侵入性检测在母体基因组中缺乏的父系遗传的DNA序列，例如用于胎儿性别检测的Y染色体序列和用于血型基因分型的RHD基因，自20世纪90年代中期已经是可能的。然而，最近出现的单分子计数技术-诸如数字聚合酶链式反应以及特别地大规模平行测序-已经允许循环中的胎儿DNA用于非侵入性产前诊断胎儿染色体非整倍性和单基因疾病，但用于测试的其他胎儿异常和/或质量控制参数仍未解决。
在本领域中存在对精确确定可能的样品污染、胎儿性别和Y染色体频率异常的需求。本发明解决此需求。
发明概述
提供该概述来以简化的形式介绍选择的在以下详述中进一步描述的概念。该概述并非意图标识所要求保护的主题的关键或必要特征，也并非意图用来限制所要求保护的主题的范围。根据以下书写的包括在所附的附图中表明的和在所附的权利要求中限定的那些方面的详述，要求保护的主题的其他特征、细节、效用、和优势将是明显的。
在一个方面中，该方法利用多重扩增并检测Y染色体和一个或更多个非Y染色体上选择的核酸区域以计算与母体混合样品中胎儿核酸贡献百分比有关的Y染色体的频率。利用如本文描述的分析方法确定感兴趣的基因组区域(例如，Y染色体序列和来自一个或更多个非Y染色体序列的序列)的选择的核酸区域的相对量。这样的方法被用于确定胎儿的性别、可能的Y染色体非整倍性和雌雄间性镶嵌现象以及用于评价母体混合样品的污染的可能性。
因此，在一些实施方案中本发明提供了一种用于确定胎儿中Y染色体频率异常的风险的方法，所述方法包括以下步骤：获得包含母体和胎儿核酸的母体样品；将两种固定序列寡核苷酸的组退火至母体和胎儿核酸，所述两种固定序列寡核苷酸对Y染色体上选择的核酸区域和至少一个非Y染色体上的多态性的和非多态性的选择的核酸区域是特异性的；选择性扩增来自Y染色体和至少一个非Y染色体的选择的核酸区域以产生扩增的选择的核酸区域；测序扩增的选择的核酸区域；定量测序的核酸区域；确定来自Y染色体和至少一个非Y染色体的定量的核酸区域的频率；通过考虑来自至少一个非Y染色体的定量的多态性的选择的核酸区域的频率来确定母体样品中胎儿核酸的百分比；和通过鉴于来自非Y染色体的定量的核酸区域的频率和母体样品中胎儿核酸的百分比评价来自Y染色体的定量的核酸区域的频率，来确定胎儿是正常男性胎儿的概率和胎儿中Y染色体频率异常的风险。
本发明的又另一实施方案提供了一种用于确定胎儿中Y染色体频率异常的风险的方法，所述方法包括以下步骤：获得包含母体和胎儿核酸的至少五个母体样品；将母体样品的每一个放置在单独的反应容器中；将两种固定序列寡核苷酸的组退火至母体和胎儿核酸，所述两种固定序列寡核苷酸对Y染色体上选择的核酸区域和至少两个非Y染色体上的多态性的和非多态性的选择的核酸区域是特异性的，其中固定序列寡核苷酸的至少一种包含样品标志；选择性扩增来自Y染色体和至少两个非Y染色体的选择的核酸区域以产生扩增的选择的核酸区域；汇集至少五个母体样品到单个反应容器；测序扩增的选择的核酸区域；使用在计算机上执行的软件，定量测序的核酸区域；使用在计算机上执行的软件，确定来自Y染色体和至少两个非Y染色体的定量的选择的核酸区域的频率；使用在计算机上执行的软件，通过考虑来自至少两个非Y染色体的定量的多态性的选择的核酸区域的频率来确定母体样品中胎儿核酸百分比；和使用在计算机上执行的软件，通过鉴于来自至少两个非Y染色体的定量的选择的核酸区域和母体样品中胎儿核酸的百分比评价来自Y染色体的选择的核酸区域的频率，来确定胎儿是正常男性胎儿的概率和胎儿中Y染色体频率异常的风险。
在一些方面，Y染色体频率异常由胎儿的Y染色体非整倍性、Y染色体镶嵌现象或样品污染引起。
在这些实施方案的一些方面，来自Y染色体和至少一个非Y染色体的至少八个选择的核酸区域被扩增，并且在一些方面，来自Y染色体和至少一个非Y染色体的至少四十八个选择的核酸区域或至少九十六个选择的核酸区域被扩增。在一些方面，在单独的容器中进行选择性扩增步骤。
在一些方面，选择性扩增、测序和定量来自至少两个非Y染色体的选择的核酸区域，并且在一些方面，选择性扩增、测序和定量来自至少三、四、五、六个或更多个非Y染色体的选择的核酸区域。
在一些方面，至少一个非Y染色体选自13号染色体、18号染色体或21号染色体。
在这些实施方案的优选方面，固定寡核苷酸的至少一种包含至少一种识别标志(identifying index)。在一些方面，至少一种标志包括样品标志。在其他的方面，至少一种标志包括基因座标志或等位基因标志。
在这种方法的一些方面，在选择性扩增步骤之前母体样品在用于反应的不同容器中，并且在选择性扩增步骤之后母体样品被汇集。在这样的方面，固定寡核苷酸中的至少一种包含至少一种识别标志且至少一种识别标志包括基因座标志。在一些方面，基因座标志和样品标志位于组中相同的固定序列寡核苷酸上，并且在一些方面，基因座标志和样品标志位于组中不同的固定序列寡核苷酸上。
在这些方法中的某些方面，确定来自Y染色体和至少一个非Y染色体的定量的核酸区域的频率的步骤通过与阵列杂交进行。在其他的方法中，定量步骤使用下一代测序进行。
在一些方面，选择的核酸区域各自被计数平均至少五次、平均至少10次、20次、36次、50次、100次、或250次或更多次。
在一些方面，寡核苷酸引物的组还包括桥接寡核苷酸。
这些和其他的方面、特征和优势将更详细地提供，如本文描述的。
附图简述
图1是根据本发明的一种方法的简化流程图。
图2阐明了用于检测两个或更多个选择的核酸区域的多重测定系统。
图3阐明了用于检测两个或更多个选择的核酸区域的可选的多重测定系统。
图4阐明了用于检测两个或更多个选择的核酸区域的又另一个可选的多重测定系统。
图5阐明了用于检测两个或更多个选择的核酸区域的又另一个可选的多重测定系统。
图6阐明了用于检测选择的核酸区域的又另一个可选的多重测定系统。
图7阐明了用于检测选择的核酸区域的又另一个可选的多重测定系统。
发明详述
除非另有说明，本文描述的方法可采用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、以及微阵列和测序技术的常规技术和说明，其在本领域熟练技术人员的能力范围内。此类常规技术包括聚合物阵列合成、寡核苷酸的杂交和连接、寡核苷酸的测序、和使用标记物检测杂交。可通过参考本文的实例获得合适的技术的具体说明。但是，当然也可使用等价的常规程序。此类常规技术和说明可见于标准的实验室手册，诸如Green等人,编辑,Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)(1999)；Weiner,等人,编辑,Genetic Variation:A Laboratory Manual(2007)；Dieffenbach,Dveksler,编辑,PCRPrimer:A Laboratory Manual(2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:AMolecular Cloning Manual(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and GenomeAnalysis(2004)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols from Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2006)；和Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(2002)(全部来自冷泉港实验室出版社)；Stryer,L.,Biochemistry(第4版.)W.H.Freeman,New York(1995)；Gait,"Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach"IRL Press,London(1984)；Nelson和Cox,Lehninger,Principles ofBiochemistry,第3版,W.H.Freeman Pub.,New York(2000)；和Berg等人,Biochemistry,第5版,W.H.Freeman Pub.,New York(2002)，所有这些出版物通过引用以其整体为了所有目的被并入本文。在描述本发明的组合物、研究工具和方法之前，要理解本发明不局限于描述的特定方法、组合物、目标和用途，因为这些当然可变化。还要理解，本文使用的术语只是为了描述特定方面的目的，而不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。
应注意，如本文以及在所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数所指对象，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个核酸区域”指一个、多于一个此类区域、或其混合物，和提及“一种方法”包括提及本领域技术人员已知的等价步骤和方法，等等。
在提供值的范围的情况下，要理解，在该范围的上限和下限之间的每个介于中间的值以及在该陈述的范围中的任何其他陈述的值或介于中间的值被包括在本发明内。在陈述的范围包括上限和下限的情况下，排除这些限值中的任一个的范围也被包括在本发明中。
为了包括描述和公开制剂和方法的目的所有目的，通过引用将本文提到的所有出版物并入，其可与本文描述的发明关联使用。
在以下的描述中，列出了很多具体细节以提供本发明的更透彻的理解。然而，对本领域技术人员来说将清楚的是，本发明可以被实施而不需要这些具体细节中的一个或更多个。在其他的情形中，为了避免模糊本发明，本领域技术人员熟知的特征和程序未被描述。
定义
本文使用的术语意图具有如由本领域普通技术人员所理解的清楚且普通的意义。除非特别指明，以下定义意图帮助读者理解本发明，但并非意图改变或以其他方式限制此类术语的含义。
术语“扩增的核酸”是其量与其起始量相比已通过体外进行的任何核酸扩增或复制方法增加了至少两倍的任何核酸分子。
术语“染色体异常”是指全部或部分染色体的任何遗传变异。遗传变异可以包括但不局限于诸如加倍或缺失、易位、倒位、和突变的任何拷贝数变化。
术语“染色体频率异常”是指由，例如，非整倍性或部分非整倍性(染色体异常)、或由胎儿或母体组织中的染色体镶嵌现象、或由样品污染所引起的样品中异常的染色体频率。
如本文使用的术语“诊断工具”是指，在例如为了对患者的样品进行诊断测试或测定的系统中使用的本发明的任何组合物或方法。
术语“雌雄间性镶嵌现象”或“性染色体镶嵌现象”或“性染色体镶嵌”是指在一个个体中存在具有不同性染色体基因型的两种或更多种细胞群。当个体中的一些细胞具有，例如两个X染色体(XX)并且该个体中的其他细胞具有一个X染色体和一个Y染色体(XY)时；当个体中的一些细胞具有一个X染色体(XO)并且该个体中的其他细胞具有一个X染色体和一个Y染色体(XY)时；或当个体中的一些细胞具有两个X染色体和一个Y染色体(XXY)并且该个体中的其他细胞具有一个X染色体和一个Y染色体(XY)时，雌雄间性镶嵌现象出现。
术语“杂交”通常地意指互补的核酸链藉以发生配对的反应。DNA通常地为双链，并且当链被分开时，它们在适当的条件下将重新杂交。杂合体可在DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA之间形成。它们可在短链和含有与该短链互补的区域的长链之间形成。不完全杂合体也可形成，但是它们越不完全，它们将越不稳定(并且越不可能形成)。
术语“似然”是指通过直接地计算似然得到的任何值或可以与似然相关或以其他方式指示似然的任何值。
如本文使用的术语“基因座(locus)”和“基因座(loci)”是指基因组中已知位置的核酸区域。
如本文使用的术语“母体样品”是指取自妊娠女性的含有胎儿和母体两者的核酸(例如，DNA)的任何样品。优选地，在本发明中使用的母体样品通过相对地非侵入性的手段，例如静脉切开术或用于从受试者提取外周样品的其他标准技术获得。
“微阵列”或“阵列”是指具有表面的固相支持物，所述表面优选地但不排他地是平面的或基本上平面的表面，其载有包含核酸的位点的阵列，使得阵列的每个位点包含基本上相同或相同拷贝的寡核苷酸或多核苷酸的，并且被空间上限定且不与阵列的其他成员位点重叠；即，位点是空间上离散的。阵列或微阵列还可包含具有表面的非平面的可询问结构，诸如珠或孔。阵列的寡核苷酸或多核苷酸可以共价地结合至固体支持物，或可以非共价地结合。常规的微阵列技术被综述在，例如，Schena,编辑,Microarrays:A PracticalApproach,IRL Press,Oxford(2000)中。“阵列分析”、“通过阵列分析”或“通过微阵列分析”是指利用微阵列的分析，诸如例如特定核酸的分离或一种或更多种生物分子的序列分析。
当关于检测选择的核酸区域使用时，“非多态性的”意指这样的核酸区域的检测：所述核酸区域可以包含一种或更多种多态性，但是其中检测不依赖于区域内的特定多态性的检测。因此选择的核酸区域可以包含多态性，但是利用本发明的方法检测该区域是基于该区域的存在而非在该区域中特定的多态性的存在或不存在。
如本文使用的术语“寡核苷酸(oligonucleotides)”或“寡核苷酸(oligos)”是指天然的或修饰的核酸单体的线性寡聚物，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其异头形式(anomeric form)、肽核酸单体(PNA)、锁核苷酸单体(LNA)等，或其组合，其能通过单体与单体相互作用的规则模式的方式与单链多核苷酸特异性地结合，所述单体与单体相互作用诸如Watson-Crick类型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反Hoogsteen类型的碱基配对等。通常地单体通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小范围从几个单体单位例如8-12个到几十个单体单位例如100-200个或更多个的寡核苷酸。
如本文使用的术语“聚合酶”是指利用另一条链作为模板将单个核苷酸连接在一起形成长链的酶。存在两种常见类型的聚合酶-合成DNA的DNA聚合酶和合成RNA的RNA聚合酶。在这两种类型中，取决于什么类型的核酸能起模板的作用以及形成什么类型的核酸，存在很多亚型的聚合酶。
如本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指用于体外复制靶DNA的特定片段、甚至在过量的非特异性DNA的存在下体外复制靶DNA的特定片段的技术。引物被添加至靶DNA，其中引物利用核苷酸和通常地Taq聚合酶等启动靶DNA的复制。通过循环温度，靶DNA被重复地变性和复制。单拷贝的靶DNA，即使是与其他随机DNA混合，也能被扩增以获得数十亿的复制物。聚合酶链式反应可被用来检测和测量很小量的DNA，并被用来产生DNA的定制片段。在一些情况中，线性扩增方法可被用作PCR的可替代选择。
如本文使用的术语“多态性”是指可以指示该特定基因座的基因座中的任何遗传变化，包括但不局限于单核苷酸多态性(SNP)、甲基化差异、短串联重复段(STR)等。
通常地，“引物”是诸如在聚合酶链式反应的合成步骤中，或在某些测序反应中使用的引物延伸技术中被用来例如引发DNA延伸、连接和/或合成的寡核苷酸。引物也可以在杂交技术中被用作提供核酸区域与捕获寡核苷酸的互补性的方法，用于特定核酸区域的检测。
如本文使用的术语“研究工具”是指被用于学术或商业性质的科学探究的本发明的任何方法，包括药物和/或生物治疗的开发。本发明的研究工具并非意图是治疗性的或要受制于监管机构批准；而是，本发明的研究工具意图促进研究且有助于此类开发活动，包括目的是产生支持监管机构提交的信息而执行的任何活动。
如本文使用的术语“选择的核酸区域”是指与个体染色体对应的核酸区域。选择的核酸区域可基于例如杂交和/或其他基于序列的技术从用于检测的样品直接地分离并富集，或在检测序列之前其可使用样品作为模板被扩增。
术语“选择性扩增”和“选择性地扩增”等是指整体上或部分的取决于寡核苷酸与选择的核酸区域中的序列的杂交的扩增过程。在某些选择性扩增中，用于扩增的引物与选择的核酸区域是互补的。在其他选择性扩增中，用于扩增的引物是通用引物，但是如果用于扩增的核酸区域与感兴趣的选择的核酸区域是互补的，则其只产生一种产物。
如本文使用的术语“测序”和“序列确定”等通常是指可以被用来确定核酸中的核苷酸碱基的顺序的任何和所有的生物化学方法。
当提及结合配偶体(例如，核酸探针或引物、抗体等)时，如本文使用术语“特异性地结合”和“特异性结合”等在指定的测定条件下导致统计学上显著的阳性信号的产生。通常地，相互作用将随后导致作为不期望的相互作用(背景)的结果产生的任何信号的标准偏差的至少两倍的可检测的信号。
当被用来描述扩增过程时，术语“通用的”是指使用单个引物或引物组用于多个扩增反应。例如，在检测96种不同的靶序列时，所有模板可共用同一通用引发序列，允许使用单组引物多重扩增96种不同的序列。这样的引物的使用极大简化了多重化，因为只需要两个引物来扩增多个选择的核酸序列。当被用来描述引发位点时，术语“通用的”是通用引物将与其杂交的位点。还应注意可使用通用引发序列/引物的“组”。例如，在高度多重化的反应中，使用几组而不是单组的通用序列可以是有用的；例如，96种不同的核酸可具有第一组通用引发序列，和第二96不同组的通用引发序列等。
一般发明
本发明提供了用于鉴定Y染色体的拷贝数变体的改进的方法。本发明的方法可用于确定胎儿的性别、评价胎儿中Y染色体非整倍性或性染色体镶嵌现象的可能性、或用于确定母体样品的可能的污染。
本发明的测定方法包括选择性富集来自Y染色体和一个或更多个非Y参考染色体的选择的核酸区域。本发明的明显优势是，可使用多种检测和定量技术进一步分析选择的核酸区域，所述多种检测和定量技术包括但不局限于杂交技术、数字PCR和优选地高通量测序确定技术。引物可以针对除Y染色体的任何染色体的任何数目的选择的核酸区域设计。尽管在选择的核酸区域的鉴定和定量之前的扩增是非强制性的，在检测之前有限的扩增是优选的。
本发明是在例如大规模平行鸟枪测序的更随机技术(例如，随机测序)或使用最近已经被用于检测母体样品，例如母体血液中拷贝数变化的随机数字PCR之上的改进。前面提及的方法依赖样品中全部或统计学上显著的DNA片段群体的测序，随后映射片段至其合适的染色体或以其他方式将片段关联到其合适的染色体。然后将鉴定的片段彼此比较或与一些其他参考(例如，具有已知的正常染色体互补物的样品)比较以确定特定染色体的拷贝数变化。随机或鸟枪法测序方法相比于本发明是固有地无效的，因为在感兴趣的染色体区域上产生的数据仅构成产生的数据的很少一部分。
取决于样品中非常广泛的DNA取样的技术提供分析的DNA的广泛覆盖，但是事实上是以1x或更少的基础取样样品内包含的DNA(即，二次取样)。与此相反，本方法中使用的选择性扩增和/或富集技术(例如，杂交)提供仅覆盖选择的核酸区域的深度；并且如此提供具有优选地2x或更大的平均序列覆盖率、更优选地100x或更大、200x或更大、250x或更大、500x或更大、750x或更大或者甚至更优选地选择的核酸区域的1000x或更大的序列覆盖率的选择的核酸区域的“超取样”。
因此，基本上大多数用于定量Y染色体序列的分析的序列提供了Y染色体和一个或更多个非Y染色体上一个或更多个选择的核酸区域的存在的信息。本发明的方法无需分析大量的并非来自感兴趣染色体和并不提供有关感兴趣的染色体的相对量的信息的序列。
检测和定量Y染色体
本发明提供用于确定母体样品中胎儿性别和/或鉴定Y染色体非整倍性或性染色体镶嵌现象和/或确定可能的样品污染的方法。样品是包含母体和胎儿DNA两者的母体样品，诸如母体血液样品(即，全血、血清或血浆)。该方法富集和/或分离和扩增母体样品中对应于Y染色体和一个或更多个参考(非Y)染色体的一个或优选地若干个至许多个选择的核酸区域，鉴于该样品中存在的胎儿DNA百分比，所述选择的核酸区域用于确定Y染色体序列的存在或不存在和相对量或频率。如以上详细描述的，本发明的方法优选地采用一个或更多个选择性扩增循环(例如，使用与选择的核酸区域特异性杂交的一种或更多种引物)或富集(例如，杂交和分离)步骤以提高样品中选择的核酸区域的含量。选择性扩增和/或富集步骤通常包括将选择的核酸区域的拷贝工程化用于进一步分离、扩增和分析的机制。这种选择性的方法与其他技术例如，大规模平行鸟枪测序法使用的随机扩增的方法直接不同，因为此类技术通常包括随机扩增基因组的全部或大部分。
在母体样品中检测和定量Y染色体特异性序列的一个挑战是，在诸如血液或血浆的母体样品中大多数无细胞胎儿DNA作为总的无细胞DNA的百分比可以从小于百分之一到约百分之四十变化，并且最通常地母体样品中胎儿DNA的百分比小于百分之二十并且经常地为百分之十或小于百分之十。因此，例如，在10％胎儿DNA的母体样品中，正常胎儿中每一个染色体将贡献10％的1/46th(或约0.22％)。在男性胎儿中，Y染色体因此将贡献10％的1/46th(0.22％)并且常染色体将贡献10％的2/46th或10％的1/23rd(0.44％，因为每一个常染色体有两条)。因此，在确定胎儿是否是正常的男性胎儿时，10％胎儿的样品中的Y染色体特异性的序列的频率应该是0.22％，并且例如3号染色体特异性序列的频率应该是0.44％，因为男性胎儿具有两条3号染色体。在确定是否存在Y染色体非整倍性时(即，两个或更多个的Y染色体)，Y染色体特异性序列的频率将是大约0.44％或更多(即，Y三体为0.66％)。在确定胎儿是否可能是性染色体镶嵌现象时，Y染色体特异性序列的频率应该是较小的并且可能基本上小于0.22％，并且对于评价具有来自女性胎儿的核酸的母体样品被具有来自男性胎儿的核酸的母体样品污染的样品污染可能性也是如此。如果人们将通过本文描述的方法稳健地检测以这样低的百分比存在的特定核酸，额外染色体测量中的变化必须显著小于额外染色体的百分比增加。
图1是根据本发明的一种方法100的简化的流程图。在第一步骤中，获得母体样品101。母体样品包含母体和胎儿核酸两者。母体样品可以是取自妊娠女性的包含胎儿和母体核酸(例如，DNA)的任何样品。优选地，本发明中使用的母体样品是无细胞的，并且通过相对地非侵入性的手段诸如静脉切开术或用于从受试者提取外周样品的其他标准技术获得。
在下一个步骤103中，将对Y染色体上和至少一个非Y染色体(和优选地几个或许多个非Y染色体)上的选择的核酸区域特异性的寡核苷酸引物退火至母体样品中的核酸。在步骤105中，寡核苷酸引物被用于选择性扩增选择的核酸区域以产生选择的核酸区域的拷贝。如下文详细描述的，选择的核酸区域经历选择性扩增步骤，但在选择性扩增步骤之前或者优选地在选择性扩增步骤后也可以经历通用的扩增步骤。此外，可以如下文描述的执行一个或更多个富集步骤。同样，作为扩增的可替代选择，富集步骤可以被执行，所述富集步骤诸如通过选择性杂交，这将选择的核酸区域与样品中的其他核酸分离。
在步骤107中，然后将扩增或拷贝的选择的核酸区域测序和定量。优选的实施方案利用高通量或下一代测序技术，尽管其他技术可以任选地被使用，如以下描述的。高通量测序允许测序确定和定量步骤的大规模平行化。
在步骤109中，确定母体样品中胎儿DNA的百分比。下一步，在步骤111中，鉴于步骤109中确定的胎儿DNA百分比，确定来自Y染色体的选择的核酸区域的频率。如本文详细描述的，鉴于胎儿百分比的来自Y染色体的选择的核酸区域的频率允许在步骤113评价胎儿是正常男性胎儿的概率并评价Y染色体频率异常的风险，诸如由Y染色体非整倍性、Y染色体镶嵌现象或来自怀有女性胎儿的女性的母体样品的Y染色体污染引起的那些。
因此，通常，与Y染色体上多个基因座对应的选择的核酸区域被检测并被求和以确定母体样品中Y染色体的相对频率，并且与一个或更多个非Y染色体上多个基因座对应的选择的核酸区域被检测并被求和以确定母体样品中一个或更多个另外的染色体的相对频率，这允许计算胎儿百分比。胎儿百分比被确定之后，根据胎儿百分比考虑Y染色体的频率以便评价Y染色体频率异常是否存在。
本发明的方法分析了代表至少两个染色体上选择的基因座的多个选择的核酸区域：Y染色体和至少一个非Y染色体-染色体诸如1号染色体、2号染色体、3号染色体、4号染色体、5号染色体、7号染色体、10号染色体、11号染色体、12号染色体、13号染色体、17号染色体、18号染色体、20号染色体、21号染色体或23号染色体，或优选地13号染色体、18号染色体或21号染色体，并且分析和独立定量了每一个选择的核酸区域的相对频率以确定样品中每一个选择的核酸区域的相对频率。样品中选择的核酸区域的总和被用于确定样品中胎儿DNA的百分比并且进行比较以统计学上确定与Y染色体序列相关的染色体非整倍性或染色体频率异常是否存在。
在另一方面中，每一个染色体上选择的核酸区域的亚组被分析以确定染色体异常或染色体频率异常是否存在。特定染色体的选择的核酸区域频率可以被求和，并且选择的核酸区域的总和可以被用于确定异常。本发明的此方面对来自每一个染色体的单独的选择的核酸区域的频率进行求和并且然后比较Y染色体与一个或更多个非Y染色体上选择的核酸区域的和。在确定染色体异常是否存在时，选择的核酸区域的亚组可以被随机地选择但具有足够的数目以获得统计学上显著的结果。可以对母体样品进行选择的核酸区域的不同亚组的多重分析以获得更大的统计功效。例如，若对于Y染色体存在100个选择的核酸区域且对于2号染色体存在100个选择的核酸区域，则对染色体中的每一个可进行评价少于100个区域的一系列分析。例如，可以进行评价少于50个区域，诸如少于30个区域、少于或等于16个区域、少于10个区域或8个区域的一系列分析。在另一个方面中，特定的选择的核酸区域可以在已知具有较少的样品之间的变化的每一个染色体上来选择，或用于确定染色体频率的数据可以被限制，例如通过忽略样品内来自具有非常高或非常低频率的选择的核酸区域的数据。
在又另一个方面中，将选择的核酸区域的频率的比与已经被确定为遗传学上“正常”的受试者的统计学上显著的群体的参考平均比进行比较，所述遗传学上“正常”的受试者即不具有Y染色体非整倍性或Y染色体频率异常的受试者。
本领域技术人员应该理解，鉴于母体样品中胎儿DNA的百分比确定Y染色体频率的方法可以与其他的非侵入性产前诊断技术联合，所述非侵入性产前诊断技术诸如评价非Y染色体的胎儿非整倍性的风险的那些技术或检测胎儿中多态性序列的那些技术。
测定方法
在本发明中可以采用大量不同的测定方法，包括利用仅由固定寡核苷酸组成的寡核苷酸的组的测定，或由固定寡核苷酸和一种或更多种桥接寡核苷酸组成的寡核苷酸的组的测定。此外，组中的寡核苷酸可以在它们可以被连接的地方与直接彼此毗邻的选择的寡核苷酸序列杂交，或组中的寡核苷酸可以不与直接彼此毗邻的选择的核酸序列杂交，并且因而在连接组中的寡核苷酸之前使用利用聚合酶和dNTP的引物延伸反应。图2至7阐明了一些示例性的测定方法。
图2阐明了一种示例性方法的实施方案，其中在单串联反应测定中检测两个不同的选择的核酸区域。这样的方法的实施方案、测定系统和相关的实施方案被详细地描述在，例如2011年1月25提交的USSN 13/013,732；2011年9月26日提交的USSN 13/245,133；2011年8月8日提交的USSN 13/205,570；2011年11月10日提交的USSN 13/293,419；2011年8月8日提交的USSN 13/205,409；2011年8月8日提交的USSN 13/205,603；2012年2月29日提交的USSN 13/407,978；2011年10月15日提交的USSN 13/274,309；2011年12月9日提交的USSN13/316,154和2011年12月28日提交的USSN 13/338,963，其全部以其整体被并入本文。与两个不同的选择的核酸区域215、231特异性杂交的两组固定序列寡核苷酸(201和203、223和225)被引导202至遗传样品并且允许与各选择的核酸区域杂交204。固定序列寡核苷酸的每一组包括具有序列特异性区域205、227，通用引物区域209和标志区221、235的寡核苷酸201、223。组中其他固定序列寡核苷酸包含序列特异性区域207、229和通用引物区域211。固定序列寡核苷酸大小通常在约30-200个核苷酸长度、或约30-150个核苷酸长度、或约35-120个核苷酸长度、或约40-70个核苷酸长度的范围。如果采用桥接寡核苷酸，桥接寡核苷酸大小通常在约4个至约80个核苷酸长度、或约4个至约60个核苷酸长度、或约5个至约50个核苷酸长度、或约7个至约40个核苷酸长度、或约10个至约40个核苷酸长度、或约12个至约30个核苷酸长度、或约15个至约25个核苷酸长度的范围。
在杂交之后，优选地从样品的剩余物中分离未杂交的固定序列寡核苷酸(未显示)。桥接寡核苷酸213、233被引导至杂交的固定序列寡核苷酸/核酸区域对并且被允许与这些区域杂交206。尽管在图2中显示为两个不同的桥接寡核苷酸，事实上，相同的桥接寡核苷酸可以适用于两个杂交事件(假设序列是相同的或实质上相似的)，或它们可以是来自简并序列寡核苷酸的集合的两种寡核苷酸。连接208杂交的寡核苷酸以产生跨越感兴趣的每一个选择的核酸区域并且与其互补的连续核酸。应该注意的是，尽管该特定实施方案例证了利用两种固定序列寡核苷酸和一种桥接寡核苷酸以扩增每一个选择的核酸区域的方法，可以采用仅使用与彼此直接毗邻杂交的两种固定序列寡核苷酸的方法，或可以采用仅使用彼此不直接毗邻杂交的两个固定序列核苷酸，但其中使用聚合酶和dNTP填充“空隙”的方法。
在连接之后，通用引物217、219被引入以扩增210连接的寡核苷酸以产生212包含感兴趣的选择的核酸区域的序列的扩增产物237、239。这些扩增产物237、239被分离(任选地)、被检测(即，测序)并被定量以提供关于样品中选择的核酸区域的存在和量的信息。
大量扩增方法可以被用于选择性扩增本发明的方法中分析的选择的核酸区域，例如，通过高通量测序，以允许以保留起始样品中选择的核酸区域的相对量的方式增加选择的核酸区域的拷贝数。尽管本文未详细描述扩增和分析的所有组合，但是利用不同的、可比较的扩增和/或分析方法来分析与该说明书一致的选择的核酸区域充分在本领域技术人员能力范围内，因为在阅读本公开内容后这样的变化对本领域技术人员将是明显的。
本发明中有用的扩增方法包括但不局限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,683,195和4,683,202；并描述在PCR Technology: Principles and Applications forDNA Amplification,ed.H.A.Erlich,Freeman Press,NY,N.Y.,1992中)；连接酶链式反应(LCR)(Wu和Wallace,Genomics 4:560,(1989)；Landegren等人,Science 241:1077(1988))；链置换扩增(SDA)(美国专利号5,270,184和5,422,252)；转录介导的扩增(TMA)(美国专利号5,399,491)；连锁线性扩增(LLA)(美国专利号6,027,923)，自我持续序列复制(Guatelli等人,PNAS USA,87:1874(1990)和WO90/06995)；靶多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)；共有序列引发的聚合酶链式反应(CP-PCR)(美国专利号4,437,975)；任意引发的聚合酶链式反应(AP-PCR)(美国专利号5,413,909和5,861,245)；和基于核酸的序列扩增(NASBA)(参见美国专利号5,409,818、5,554,517和6,063,603,其每一个通过引用被并入本文)。可以被使用的其他扩增方法包括：PCT专利申请号PCT/US87/00880中描述的Qβ复制酶；Walker等人,Nucleic Acids Res.20(7):1691-6(1992)中描述的等温扩增方法，诸如SDA；和美国专利号5,648,245中描述的滚环扩增。可以被使用的又其他扩增方法被描述在美国专利号5,242,794、5,494,810、4,988,617和美国序列号09/854,317和美国公布号20030143599中，其每一个通过引用被并入本文。在优选的方面中，通过多重基因座特异性PCR扩增DNA。在一些方面中，利用衔接子连接和单引物PCR来扩增DNA。其他可得的扩增方法包括平衡PCR(Makrigiorgos等人,Nat.Biotechnol.,20:936-39(2002))和自我持续序列复制(Guatelli等人,PNAS USA,87:1874(1990))。基于这样的方法，本领域技术人员能够容易地在感兴趣的选择的核酸区域的5'和3'的任何合适区域中设计引物。这样的引物可被用于扩增任何长度的DNA，只要DNA在其序列中含有感兴趣的选择的核酸区域。
被选取的选择的核酸区域的长度是足够长以提供足以区分选择的核酸区域彼此的序列信息。通常地，选择的核酸区域长度是至少约16个核苷酸，并且更通常地，选择的核酸区域长度是至少约20个核苷酸。在本发明的优选的方面中，选择的核酸区域长度是至少约30个核苷酸。在本发明的更优选的方面中，选择的核酸区域长度是至少约32、40、45、50或60个核苷酸。在本发明的其他方面中，选择的核酸区域长度可以是约100、150或多达200。
在一些方面中，选择性扩增过程利用具有含有与选择的核酸区域互补的核酸的引物对(即，序列特异性扩增过程)的一轮或几轮扩增。在其他方面中，选择性扩增包括初始的线性扩增步骤(同样是序列特异性扩增过程)。如果DNA的初始量是有限的，线性扩增方法可以是特别有用的。线性扩增以代表原始DNA含量的方式提高DNA分子的量，这种方式有助于在例如其中需要选择的核酸区域的精确定量的本发明的情况下降低抽样误差。
因此，在优选的方面中，对含有无细胞DNA的起始母体样品执行有限数目的序列特异性扩增循环。循环数通常地小于用于通常PCR扩增的循环数，例如5-30个循环或更少。
寡核苷酸的组中的寡核苷酸被设计以序列特异性的方式与样品杂交并且扩增选择的核酸区域。用于选择性扩增的引物优选地被设计以1)有效扩增来自感兴趣的染色体的选择的核酸区域；2)具有从不同母体样品中的母体和/或胎儿来源的可预测范围的表达；以及3)是选择的核酸区域特有的，即，不会扩增非选择的核酸区域。可以用末端标签在5’端处(例如，用生物素)或沿着引物或探针的其他位置修饰引物或探针，使得扩增产物能够被纯化或附接至固体基质(例如，珠或阵列)，用于进一步的分离或分析。在优选的方面中，引物被工程化以具有例如将在多重反应中使用的相容的解链温度，其允许扩增许多选择的核酸区域，使得单个反应产生来自不同的选择的核酸区域并且优选地所有选择的核酸区域的多个DNA拷贝。然后，来自选择性扩增的扩增产物可以用标准PCR方法或用线性扩增被进一步扩增。
无细胞DNA可以从例如妊娠女性的全血、血浆、或血清中分离，并与被工程化以扩增与感兴趣的染色体对应的一组数目的选择的核酸区域的引物孵育。优选地，用于Y染色体特异性序列的初始扩增的引物对的数目(以及因此Y染色体上选择的核酸区域的数目)将是8个或更多，例如16个或更多、32个或更多、48个或更多、或96个或更多。引物对的每一个与单个选择的核酸区域对应，并且引物对任选地被加标签用于鉴定(例如，通过使用标志(indices)或标志(indexes))和/或分离(例如，包含用于捕获的核酸序列或化学部分)。执行有限数目的扩增循环，优选地10个或更少。通过本领域中已知的方法任选地随后分离扩增产物(扩增的选择的核酸区域)。例如，当引物被连接至生物素分子时，扩增产物可经由在固体基质上与亲和素或链霉亲和素结合被分离。然后可使扩增产物经受进一步的生化过程，例如用其他引物(例如，通用引物)的另外扩增和/或例如序列确定和杂交的检测技术。
扩增的效率在选择的核酸区域之间以及在循环之间可以变化，使得在某些系统中，归一化(如以下描述的)可以被用于确保来自选择的核酸区域的扩增的产物代表样品的核酸含量。实践本发明的方法的人们可挖掘关于扩增的产物的相对频率的数据以确定选择的核酸区域中的变化，包括样品内选择的核酸区域中的变化和/或不同样品中选择的核酸区域(特别是来自不同样品中相同的选择的核酸区域)之间的变化以使数据归一化。
作为对选择性扩增的可替代选择，选择的核酸区域可以通过杂交技术(例如，捕获杂交或与阵列杂交)，任选地随后一轮或更多轮循环扩增来富集。任选地，杂交的或捕获的选择的核酸区域在扩增和序列确定之前被释放(例如，通过变性)。可以使用允许选择性富集分析中使用的选择的核酸区域的多种方法从母体样品中分离选择的核酸区域。分离可以是移除分析中未使用的母体样品中的DNA和/或移除初始富集或扩增步骤中使用的任何过量的寡核苷酸。例如，可以使用杂交技术(富集)从母体样品分离选择的核酸区域，所述杂交技术(富集)例如利用将选择的核酸区域与固体基质例如珠或阵列上的互补寡核苷酸结合的捕获，随后移除来自样品的未结合的核酸。在另一个实例中，当锁式探针(padlock-typeprobe)技术被用于选择性扩增(参见，例如Barany等人，美国专利号6,858,412和7,556,924以及图7)时，可以从线性核酸分离环化的(circularized)核酸产物，环化的核酸产物经历选择性降解。其他有用的分离方法在阅读本说明书之后对本领域技术人员将是明显的。
选择的核酸区域的选择性扩增的拷贝任选地可以在选择性扩增(或富集步骤)之后，在检测步骤之前或者在检测步骤期间(即，测序或其他检测技术)在通用扩增步骤中被扩增。在执行通用扩增时，添加至选择性扩增步骤中的复制的选择的核酸区域的通用引物序列用于在单个通用扩增反应中进一步扩增选择的核酸区域。如描述的，通过使用用于选择性扩增步骤的具有通用引物序列的引物，通用引物序列可以在选择性扩增过程(如果执行)期间被添加至复制的选择的核酸区域，使得选择的核酸区域的扩增的拷贝并入通用引发序列。可选地，在扩增或富集(如果执行)之后，包含通用扩增序列的衔接子可以被连接至选择的核酸区域的末端，并且从母体样品分离选择的核酸区域。
在DNA扩增期间可以向样品引入偏差和变化性，并且这已知在聚合酶链式反应(PCR)期间发生。在其中扩增反应被多重化的情形中，存在选择的核酸区域将以不同速率或效率扩增的可能，因为对于给定的选择的核酸区域的每一组引物可以基于引物和模板DNA的碱基组成、缓冲液条件或其他条件而表现不同。用于多重测定系统的通用DNA扩增通常引入较少的偏差和变化性。另一种最小化扩增偏差的技术包括改变用于不同的选择的核酸区域的引物浓度以限制选择性扩增步骤中序列特异性扩增循环的数目。在扩增步骤中可以使用相同或不同的条件(例如，聚合酶、缓冲液等)以例如确保偏差和变化性不因为实验条件而被非故意地引入。
在优选的方面，执行小数目(例如1-10个、优选地3-5个)的选择性扩增循环或核酸富集，随后为利用通用引物的通用扩增。使用通用引物的扩增循环数将是变化的，但将优选地为至少5个循环、更优选地至少10个循环，甚至更优选地20个循环或更多。一个或几个选择性扩增循环之后，通过移至通用扩增，具有以比其他的更大的速率扩增的某些选择的核酸区域的偏差被减少。
任选地，方法包括选择性扩增和通用扩增之间的步骤以移除在选择性扩增中非特异性地扩增的任何多余的核酸。来自选择性扩增的整个产物或产物的等份可被用于通用扩增。
在方法中使用的引物的通用区域被设计为与在一个容器中的一个反应中同时地分析大量的核酸的常规多重化方法是相容的。这样的“通用的”引发方法允许有效、高容量分析存在于母体样品中的核酸区域的数量，并且允许用于确定非整倍性的这样的母体样品内核酸区域的存在的综合定量。
通用扩增方法的实例包括但不局限于用于同时地扩增和/或基因分型多个样品的多重方法，例如在Oliphant等人，美国专利号7,582,420中描述的那些，其通过引用被并入本文。
在某些方面中，本发明的测定系统利用以下组合的选择性和通用扩增技术之一：(1)与聚合酶链式反应("PCR")联合的连接酶检测反应("LDR")；(2)与联合至LDR的二次PCR联合的初次PCR；以及(3)与二次PCR联合的初次PCR。这些组合中的每一个对于最佳检测具有特定效用。但是，这些组合中的每一个使用多重检测，其中来自测定系统的早期的寡核苷酸引物包含用于测定系统的后期的序列。
Barany等人，美国专利号6,852,487、6,797,470、6,576,453、6,534,293、6,506,594、6,312,892、6,268,148、6,054,564、6,027,889、5,830,711、5,494,810描述了连接酶链式反应(LCR)测定用于检测多个核酸样品中的核苷酸的特定序列的用途。Barany等人，美国专利号7,807,431、7,455,965、7,429,453、7,364,858、7,358,048、7,332,285、7,320,865、7,312,039、7,244,831、7,198,894、7,166,434、7,097,980、7,083,917、7,014,994、6,949,370、6,852,487、6,797,470、6,576,453、6,534,293、6,506,594、6,312,892和6,268,148描述了与PCR联合的LDR用于核酸检测的用途。Barany等人，美国专利号7,556,924和6,858,412描述了锁式探针(也称“环前探针(precircle probe)”或“多倒置探针(multi-inversion probes)”)与LDR和PCR联合用于核酸检测的用途。Barany等人,美国专利号7,807,431、7,709,201和7,198,814描述了组合的核酸内切酶裂解和连接反应用于核酸序列的检测的用途。Willis等人，美国专利号7,700,323和6,858,412描述了环前探针在多重核酸扩增、检测和基因分型中的用途。Ronaghi等人，美国专利号7,622,281描述了用于使用包含独特的引物和条形码的衔接子标记和扩增核酸的扩增技术。可用于扩增和/或检测选择的核酸区域的示例性过程包括但不局限于本文描述的方法，其每一个通过引用以其整体被并入本文，用于教导可以在本发明的方法中使用的多种要素的目的。
除了多种扩增技术之外，很多序列确定方法与本发明的方法是相容的。优选地，这样的方法包括“下一代”测序方法。用于序列确定的示例性方法包括但不限于基于杂交的方法，例如在Drmanac，美国专利号6,864,052、6,309,824、6,401,267和美国公布号2005/0191656中公开的，其全部通过引用被并入本文；合成测序方法，例如Nyren等人，美国专利号7,648,824、7,459,311和6,210,891；Balasubramanian，美国专利号7,232,656和6,833,246；Quake，美国专利号6,911,345；Li等人，PNAS,100:414-19(2003)；焦磷酸盐测序，如在Ronaghi等人，美国专利号7,648,824、7,459,311、6,828,100和6,210,891中描述的；和基于连接的测序确定方法，例如Drmanac等人，美国公布号2010/0105052和Church等人，美国公布号2007/0207482和2009/0018024。
可选地，可以利用杂交技术选择和/或鉴定选择的核酸区域。用于实施用于检测的多核苷酸杂交测定的方法已经在本领域中良好开发。杂交测定程序和条件将取决于应用而不同并且根据已知的一般结合方法来选择，所述一般结合方法包括在以下中提到的那些：Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Berger和Kimmel，Methods in Enzymology,第152卷；Guide to MolecularCloning Techniques(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1987)；以及Young和Davis,PNAS,80:1194(1983)。在例如美国专利号5,871,928、5,874,219、6,045,996、6,386,749和6,391,623中已描述了用于实施重复和控制的杂交反应的方法和设备。
在某些优选的方面，本发明还涵盖了配体之间的杂交的信号检测；参见，美国专利号5,143,854、5,578,832、5,631,734、5,834,758、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,141,096、6,185,030、6,201,639、6,218,803和6,225,625，在USSN 60/364,731中以及在PCT申请PCT/US99/06097(作为WO99/47964公布)中。
用于强度数据的信号检测和处理的方法和设备公开在，例如美国专利号5,143,854、5,547,839、5,578,832、5,631,734、5,800,992、5,834,758、5,856,092、5,902,723、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,090,555、6,141,096、6,185,030、6,201,639、6,218,803和6,225,625中，在USSN 60/364,731中以及在PCT申请PCT/US99/06097(作为WO99/47964公布)中。
在图3中，使用包含基本上相同的序列特异性区域305、307但包含不同标志321、323的两组固定序列寡核苷酸。用来自相同遗传样品300的材料，但在具有不同的等位基因特异性寡核苷酸组的单独的管中实施连接反应。与选择的核酸区域313、333中两个可能的SNP对应的桥接寡核苷酸313、333被用于检测每一个连接反应中选择的核酸区域。指示SNP的两个等位基因标志321、323可以被用于鉴定扩增产物，使得感兴趣的核酸和SNP的实际序列的序列确定不一定是必需的，尽管这些序列可以仍被确定以鉴定和/或提供等位基因的确证。固定序列寡核苷酸的每一个包含与选择的核酸区域305、307互补的区域和用于在初始选择和/或分离之后扩增不同的选择的核酸区域的通用引物序列309、311。通用引物序列位于固定序列寡核苷酸301、303和323的末端并且位于标志和与感兴趣的核酸互补的区域的侧翼，因此将核酸特异性序列和等位基因标志保留在扩增产物中。在步骤302将固定序列寡核苷酸301、303、323引入遗传样品300的等份并且允许与选择的核酸区域315或325杂交。杂交之后，优选地将未杂交的固定序列寡核苷酸从遗传样品的剩余物分离(未显示)。
与A/T SNP 313或G/C SNP 333对应的桥接寡核苷酸在步骤304被引入并且允许在固定序列寡核苷酸的第一305和第二307核酸互补区域之间的选择的核酸区域315或325的区域中结合。可选地，可以用固定序列寡核苷酸将桥接寡核苷酸313、333同时引入样品。在步骤306在反应混合物中连接结合的寡核苷酸以产生跨越感兴趣的核酸区域并且与其互补的连续的寡核苷酸。
连接之后，分离反应优选地被组合用于通用扩增和检测步骤。在步骤308将通用引物317、319引入组合的反应以扩增连接的寡核苷酸并且在步骤310产生包含代表选择的核酸区域中的SNP的感兴趣的核酸区域的序列的产物327、329。通过测序产物或产物的部分，通过鉴定等位基因标志、包含来自选择的核酸区域的SNP的产物的区域或二者，检测并定量产物327、329。优选地，通过等位基因标志的下一代测序检测并且定量图3的方法的产物，因此，避免了确定与选择的核酸区域互补的产物的区域或整个产物的实际序列的需要。但是，在其他方面中，可以期望确定标志和与选择的核酸区域互补的产物的区域二者的序列以例如提供结果的确证。
在图3的方法中(以及在其他图中阐明的方法中)，已经描述了等位基因标志。但是，以321和323显示的标志可以是等位基因标志、样品标志、组合的等位基因和样品标志、基因座标志或本文描述的或本领域中另外使用的任何其他标志或标志的组合。
此外，在其中有区别的核苷酸位于固定序列寡核苷酸而不是桥接寡核苷酸的情况下可采用方法。因此在这样的示例性测定系统中，等位基因标志与等位基因特异性固定序列寡核苷酸关联，并且等位基因检测由等位基因标志的测序产生。等位基因标志可以嵌入等位基因特异性第一序列寡核苷酸或者第二固定序列寡核苷酸。在特定的方面中，等位基因标志存在于第一和第二固定序列寡核苷酸二者上以检测选择的核酸区域内的两种或更多种多态性。在这样的方面中使用的固定序列寡核苷酸的数目可以与待针对选择的核酸区域评价的可能的等位基因的数目对应，并且等位基因标志的序列确定可以检测遗传样品中特定等位基因的存在、量或不存在。
图4阐明了本发明的这方面。在图4中，使用三种固定序列寡核苷酸401、403和423。两种固定序列寡核苷酸401、423是等位基因特异性的，包含与分别含有例如A/T或G/C SNP的核酸区域中的等位基因互补的区域。等位基因特异性固定序列寡核苷酸401、423中的每一个还包含对应的等位基因标志421、431和通用引物序列409。第二固定序列寡核苷酸403具有第二通用引物序列411，并且这些通用引物序列被用于扩增选择的核酸区域，以将寡核苷酸组与来自遗传样品的选择的核酸区域杂交和连接。通用引物序列位于固定序列寡核苷酸401、403、423的末端，在标志和与感兴趣的选择的核酸区域互补的固定序列寡核苷酸中的区域的侧翼；因此将核酸特异性序列和标志捕获在任何通用扩增方法的产物中。
在步骤402中，将固定序列寡核苷酸401、403、423引入遗传样品400并且允许与选择的核酸区域415、425杂交。杂交之后，优选地将未杂交的固定序列寡核苷酸从遗传样品的剩余物分离(未显示)。桥接寡核苷酸413被引入并且被允许与核酸415在第一等位基因特异性固定序列寡核苷酸区域405和另一固定序列寡核苷酸区域407之间的区域中杂交404或与核酸425杂交，与第二等位基因特异性固定序列寡核苷酸区域435和另一固定序列寡核苷酸区域407之间的区域互补。可选地，可以将桥接寡核苷酸413与固定序列寡核苷酸的组同时引入样品。
在步骤406将与选择的核酸区域杂交的寡核苷酸连接以产生跨越感兴趣的选择的核酸区域并且与其互补的连续的寡核苷酸。仅当等位基因特异性固定序列寡核苷酸的等位基因特异性末端与选择的核酸区域中的SNP互补时，连接主要地发生。连接之后，将通用引物417、419引入以在步骤408扩增连接的寡核苷酸以在步骤410产生包含感兴趣的核酸区域的序列的产物427、429。通过序列确定产物的全部或部分、以及特别地包含选择的核酸区域中的SNP的产物的区域和/或等位基因标志，检测并且定量这些产物427、429。这里，等位基因特异性核苷酸显示为是在等位基因特异性固定序列寡核苷酸的末端，然而等位基因特异性核苷酸不必需被这样定位。然而，为了使连接是等位基因特异性的，等位基因特异性核苷酸必须接近连接的末端。通常，等位基因特异性核苷酸必须在连接的末端的5个核苷酸内。在优选的方面中，等位基因特异性核苷酸是倒数第二的或终端(末端)核苷酸。
在本发明的测定的又另一个实例中，等位基因检测从基因座标志与阵列的杂交获得。通过等位基因特异性标记步骤检测每一个等位基因，其中在通用扩增期间以例如光谱上不同的荧光标记物标记每一个等位基因。图5阐明了本发明的这方面。在图5中，使用三种固定序列寡核苷酸501、503和523。两种固定序列寡核苷酸501、523是等位基因特异性的，并且每一种包含在相同的选择的核酸区域中匹配不同等位基因的区域、基因座标志521和等位基因特异性通用引物序列509、539。第三、非等位基因特异性固定序列寡核苷酸503包含另一个通用引物序列511。寡核苷酸杂交并连接之后，通用引物序列被用于扩增选择的核酸区域。将区分每一个等位基因的标记物并入扩增产物。如在之前的实例中相同，通用引物序列位于固定序列寡核苷酸501、503、523的近端并且因此将等位基因特异性序列和标志捕获在任何通用扩增方法的产物中。在步骤502中将固定序列寡核苷酸501、503、523引入遗传样品500并且允许与选择的核酸区域515、525特异性地结合。杂交之后，优选地将未杂交的固定序列寡核苷酸从遗传样品的剩余物分离(未显示)。将桥接寡核苷酸513引入并且允许在步骤504与选择的核酸区域515、525在第一(等位基因特异性的)505和第二(非等位基因特异性的)507固定序列寡核苷酸之间的区域和第一(等位基因特异性的)535和第二507(非等位基因特异性的)固定序列寡核苷酸之间的区域结合。可选地，可以将桥接寡核苷酸513与固定序列寡核苷酸同时引入样品。
在步骤506连接结合的寡核苷酸以产生跨越感兴趣的选择的核酸区域并且与其互补的连续的寡核苷酸。当等位基因特异性末端匹配时，连接主要地发生。连接之后，将通用引物517、519、537引入以在步骤508扩增连接的寡核苷酸以在步骤510产生包含感兴趣的选择的核酸区域的序列的产物527、529。通用引物517和537具有光谱上不同的荧光标记物，使得等位基因特异性信息被捕获并且可以通过这些荧光标记物被读出。通过将基因座标志521与阵列杂交并成像来检测并定量产物527、529。如关于图4描述的，重要的是注意连接506优选地是等位基因特异性的；因此，有区别的核苷酸位于从等位基因特异性固定序列寡核苷酸的末端的至少5个核苷酸处并且优选地位于作为倒数第二或终端核苷酸。显示在图5中的其中基因座标志用于与阵列杂交的实例可以在本文描述的多种方法的任一种中被使用，例如其中固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸不毗邻杂交并且聚合酶和dNTP被用于封闭寡核苷酸之间的“空隙”、随后连接的方法。类似地，基因座标志/杂交方法可以在以下方案中被使用：其中仅固定序列寡核苷酸被使用-即不存在桥接寡核苷酸-并且其中固定序列寡核苷酸毗邻地杂交并且通过连接作用来连接或其中固定序列寡核苷酸以在它们之间具有空隙的方式杂交并使用聚合酶和dNTP随后为连接作用来连接。
在可选的方面中，等位基因标志存在于第一和第二固定序列寡核苷酸二者上以使用用于给定等位基因的每一个固定序列寡核苷酸的对应的光谱上不同的荧光标记物检测每一个固定序列寡核苷酸末端的多态性。在该方法中，固定序列寡核苷酸的数目对应于待被评价的选择的核酸区域的可能的等位基因的数目。在以上的图和实例中，固定序列寡核苷酸被表示为两个不同的寡核苷酸。在另一个方面中，固定序列寡核苷酸可以是相同的寡核苷酸的相对的末端(参见，例如以上图7)。
在以上描述的方面中，使用的桥接寡核苷酸杂交至与固定序列寡核苷酸互补的区域毗邻的感兴趣的核酸的区域，使得当固定序列和桥接寡核苷酸特异性杂交时，它们直接彼此毗邻用于连接。然而，在其他方面中，将桥接寡核苷酸杂交至不与固定序列寡核苷酸的一个或两个互补的区域直接毗邻的区域，并且需要延伸寡核苷酸的一个或更多个的中间步骤在连接之前是必需的。例如，如图6中阐明的，每一组寡核苷酸优选地包含两个固定序列寡核苷酸601、603和一个或更多个桥接寡核苷酸613。固定序列寡核苷酸中的每一个包含与选择的核酸区域605、607互补的区域，以及优选地通用引物序列609、611；即，与通用引物互补的寡核苷酸区域。通用引物序列609、611位于或接近固定序列寡核苷酸601、603的末端，并且因此将核酸特异性序列捕获在任何通用扩增方法的产物中。
在步骤602将固定序列寡核苷酸601、603引入遗传样品600并且允许与感兴趣的选择的核酸区域615的互补部分特异性结合。杂交之后，优选地将未杂交的固定序列寡核苷酸从遗传样品的剩余物分离(未显示)。然后将桥接寡核苷酸引入并且允许在步骤604与选择的核酸区域615在第一601和第二603固定序列寡核苷酸之间的区域结合。可选地，可以将桥接寡核苷酸与固定序列寡核苷酸同时引入样品。在这里显示的示例性方面中，将桥接寡核苷酸杂交至与第一固定序列寡核苷酸区域605直接毗邻的但与第二固定序列寡核苷酸607的互补区域被一个或更多个核苷酸隔开的区域。固定序列和桥接寡核苷酸杂交之后，在步骤606例如使用聚合酶和dNTP将桥接寡核苷酸613延伸，以填充桥接寡核苷酸613和第二固定序列寡核苷酸603之间的空隙。延伸之后，在步骤608将杂交的寡核苷酸连接以产生跨越感兴趣的选择的核酸区域615并且与其互补的连续的寡核苷酸。连接之后，在步骤610将通用引物617、619引入以扩增连接的寡核苷酸以在步骤612产生包含感兴趣的核酸区域的序列的产物623。将这些产物623分离、检测并定量以提供关于遗传样品中选择的核酸区域的存在和量的信息。优选地，通过等位基因标志621的下一代测序检测并定量产物，或可选地通过扩增产物623中与感兴趣的选择的核酸615互补的扩增产物的部分的序列确定检测并定量产物。
图7阐明了固定序列寡核苷酸如何可以是相同分子的一部分。在特定的方面中，单个固定序列寡核苷酸701与选择的核酸区域715在两个末端是互补的。当将该单个固定序列寡核苷酸701与选择的核酸区域715杂交时，它形成环前寡核苷酸703，其中末端被若干核苷酸隔开。然后桥接寡核苷酸713在环前寡核苷酸703的互补区域705、707之间结合以填充此空隙。然后将与遗传样品715结合的环前寡核苷酸703的寡核苷酸区域705、707与桥接寡核苷酸713连接在一起，形成完整的圆。与本文示例的其他方法相同，使用桥接寡核苷酸不是必需的，并且在这样的实施方案中固定序列寡核苷酸可以毗邻地杂交或如果固定序列寡核苷酸不毗邻地杂交，则可以使用聚合酶和dNTP填充空隙。优选地使用一个或更多个通用引物位点裂解并且扩增环形模板。在特定的方面中，利用如在Lizardi等人，美国专利号6,558,928中公开的技术，例如滚环复制，将单通用引物区域用于复制模板。
如图7中阐明的，固定序列寡核苷酸在环形模板上具有两个通用引发位点709、711和任选地与选择的核酸区域互补的构建体的末端之间的一个或更多个标志721。这里显示，裂解位点723存在于两个通用引发位点之间。在步骤702将构建体701引入遗传样品，允许与感兴趣的选择的核酸区域杂交，并且在步骤704将桥接寡核苷酸引入并且允许与选择的核酸区域杂交。然后在步骤706通过连接将构建体环化以桥接寡核苷酸713，并且可以使用核酸酶移除全部或大部分未环化的寡核苷酸。在移除未环化的寡核苷酸之后，将环化的寡核苷酸裂解，保存并且在一些方面中暴露通用引发位点709、711。在步骤708加入通用引物717、719并且通用扩增发生710以产生712包含感兴趣的选择的核酸区域的序列的产物725。通过，例如下一代测序与选择的核酸区域互补的产物的部分或可选地标志检测并且定量产物725，这避免了测序整个构建体的需要。然而，在其他方面中期望确定包含标志和选择的核酸区域二者的序列的产物，例如，以提供结果的内部确证或其中标志提供样品信息并且不提供选择的核酸区域的信息。如以上提及的，该单个固定序列寡核苷酸方法可以被应用于图2-7中的实例中的任一个。
标志在本发明的方法中的使用
如以上关于图2-7描述的，在某些方面中，组中的固定序列寡核苷酸包含一个或更多个标志(indexes)或标志(indices)，所述一个或更多个标志(indexes)或标志(indices)例如鉴定选择的核酸区域(基因座标志)、选择的核酸区域内的SNP(等位基因标志)和/或被分析的特定的样品(样品标志)。例如，一个或更多个基因座标志的检测可以作为用于整个选择的核酸区域的替代检测，如以下描述的，或如果标志的序列和与核酸区域自身互补的寡核苷酸产物的序列两者均被确定则标志的检测可以作为特定的选择的核酸区域的存在的确证。优选地，在利用包含标志和特异性地杂交至选择的核酸区域的区域(即，选择的核酸区域特异性的序列)二者的引物选择性扩增步骤期间，标志与选择的核酸区域关联。
通常标志是扩增引物内使用的非互补、独特的序列以提供与利用引物分离和/或扩增的选择的核酸区域有关的信息。标志的顺序和位置以及标志的长度可以变化，并且它们可以以多种组合的形式被使用。可选地，在初始选择性扩增之后，利用包含这些序列的衔接子的连接，可将标志和/或通用扩增序列添加至选择性地扩增的选择的核酸区域。使用标志的优势是，能够获得选择的核酸区域的存在(和最终地量或频率)而不需要测序选择的核酸区域的整个长度，尽管在某些方面测序选择的核酸区域的整个长度可以是期望的。然而，通常地，通过鉴定一个或更多个标志来鉴定并定量选择的核酸区域的能力将减少所需的测序的长度，尤其如果标志序列被捕获在分离的选择的核酸区域的3'或5'端，接近测序引物可以定位的地方。因为较长的测序读段更容易引入错误，所以使用标志作为选择的核酸区域的鉴定的替代还可减少测序错误。同样，如以上关于图5描述的，基因座标志-与例如荧光标记物联合-可以被用于通过与阵列杂交鉴定并且定量选择的核酸区域。
在标志的一个实例中，用于选择的核酸区域的选择性扩增的引物被设计为在与选择的核酸区域互补的区域和通用扩增引物位点之间包含基因座标志。基因座标志通常对于每一个选择的核酸区域是独特的，使得特定的基因座标志在样品中发生的次数的定量能够与对应的单核酸区域和含有单核酸区域的特定染色体的相对拷贝数相关联。通常地，基因座标志足够长以独特地标记每一个已知的单核酸区域。例如，如果方法使用192个已知的单核酸区域，那么存在至少192个独特的基因座标志，每一个独特地鉴定来自染色体上特定基因座的单核酸区域。在本发明的方法中使用的基因座标志可以指示样品中单个染色体上的不同的单核酸区域以及在不同染色体上存在的已知的单核酸区域。基因座标志可包含允许鉴定和修正测序错误以及可能在测序之外诸如寡核苷酸合成、扩增、或方法的任何其他方面发生的核苷酸改变的另外的核苷酸，所述鉴定和修正测序错误包括检测在测序期间一个或更多个碱基的缺失、取代或插入。
在另一个实例中，用于选择的核酸区域的扩增的引物可以被设计为在与选择的核酸区域互补的区域和通用扩增引物位点之间提供等位基因标志(作为对基因座标志的可替代选择)。等位基因标志对于选择的核酸区域的特定的等位基因是独特的，使得特定的等位基因标志在样品中发生的次数的定量能够与该等位基因的相对拷贝数相关联，并且特定的选择的核酸区域的等位基因标志的总和能够与包含选择的核酸区域的特定染色体上该选择的核酸区域的相对拷贝数相关联。
在又另一个实例中，用于选择的核酸区域的扩增的引物可被设计为在与选择的核酸区域互补的区域和通用扩增引物位点之间提供鉴定标志。在这样的方面中，存在足够数目的鉴定标志以独特地鉴定样品中的每一个扩增的分子。鉴定标志序列优选地长度是6个或更多个核苷酸。在优选的方面中，鉴定标志足够长以具有用单核酸区域独特地标记每一个分子的统计概率。例如，如果存在3000个拷贝的特定单核酸区域，则存在大幅度地多于3000个鉴定标志，使得特定单核酸区域的每一个拷贝有可能被独特的鉴定标志标记。如同其他标志，鉴定标志可以包含允许鉴定和修正测序错误以及可能在测序之外诸如寡核苷酸合成、扩增、和分析的任何其他方面发生的核苷酸改变的另外的核苷酸，所述鉴定和修正测序错误包括检测在测序期间一个或更多个碱基的缺失、取代或插入。
鉴定标志可以与任何其他标志组合以产生提供两种特性的信息的一个标志。鉴定标志还可被用以检测和定量在将选择的核酸区域从样品的初始分离的下游出现的扩增偏差并且此数据可以被用于归一化样品数据。
除了本文描述的其他标志，可以使用修正标志。修正标志是允许修正扩增、测序或其他实验误差的短核苷酸序列，所述修正扩增、测序或其他实验误差包括检测在测序期间一个或更多个碱基的缺失、取代或插入以及可能在测序之外诸如寡核苷酸合成、扩增、或测定的其他方面发生的核苷酸改变。修正标志可以是为单独的序列的独立标志，或它们可以被嵌入其他标志内以辅助证实所使用的实验技术的准确性，例如，修正标志可以是基因座标志或鉴定标志的序列的亚组。
在一些方面中，指示选择的核酸区域从其分离的样品的标志被用于鉴定多重测定系统中选择的核酸区域的来源。在这样的方面中，来自一个个体的选择的核酸区域将被指定至特定独特的样品标志并与其关联。样品标志因此可以被用于辅助单反应容器中不同样品的多重化(即，在汇集样品的情况下)的核酸区域鉴定，使得每一个样品可以基于其样品标志而被鉴定。在优选的方面中，一组样品中的每个样品存在独特的样品标志，并且在测序期间样品被汇集。例如，如果12个样品被汇集进入单个测序反应，存在至少12个独特的样品标志使得每个样品被独特地标记。在执行测序步骤之后，在确定每一个样品的每一个选择的核酸区域的频率之前，并且在确定每一个样品是否存在染色体异常之前，测序数据优选地首先根据样品标志被分开。
样品内变化最小化
检测混合的样品中染色体异常的一个挑战是，来自具有染色体异常的细胞类型的DNA(即，胎儿DNA)经常以比来自正常细胞类型的DNA(即，母体DNA)低得多的丰度存在。在含有胎儿和母体的无细胞DNA的混合的母体样品的情况下，无细胞胎儿DNA作为总的无细胞DNA的百分比可以从小于百分之一到百分之四十变化，并且最通常地以百分之二十或小于百分之二十并且经常地以百分之十或小于百分之十存在。在检测这样的混合的母体样品的胎儿DNA中Y染色体非整倍性时，如果胎儿是正常的男性，Y染色体序列的相对增加是Y序列的预计百分比的倍数，并且因此作为混合的样品中总DNA的百分比，其中作为一个实例，胎儿DNA是总的5％时，Y染色体的贡献的增加作为总的百分比是5％的1/47th(样品中总DNA百分比的0.11％)。如果人们将通过本文描述的方法稳健地检测该差异，Y染色体的测量中的变化必须比Y染色体的百分比增加小的多。
在一些方面中，染色体上一个或更多个选择的核酸区域的测量的量被归一化以解释已知的来自来源例如测定系统(例如，温度、试剂批次差异)、样品的潜在生物学(例如，核酸含量)、操作者差异，或任何其他变量的变化。进一步，用于确定选择的核酸区域的频率的数据可排除由于实验误差出现的离群数据，或具有基于特定样品内先天遗传偏差的提高的或降低的水平的离群数据。在一个实例中，用于求和的数据可排除一个或更多个样品中具有特定地升高的频率的核酸区域。在另一个实例中，用于求和的数据可排除一个或更多个样品中以特别低的丰度存在的选择的核酸区域。
利用分析方法的组合可以最小化样品之间和/或样品内选择的核酸区域之间的变化。例如，通过在测定中使用内部参考减少变化。内部参考的实例是利用以“正常”丰度(例如，常染色体的二体性)存在的染色体与相同样品中的可能以异常的丰度，即非整倍性或痕量污染物存在的Y染色体比较。虽然使用单个这样的“正常”染色体作为参考染色体可以是足够的，但是优选使用两个至若干个非Y染色体作为内部参考染色体以增加定量的统计功效。
内部参考的一个利用是计算样品中的假定异常的Y染色体频率的丰度与非Y染色体的丰度的比，称为染色体比。在计算染色体比时，每一个染色体的每一个选择的核酸区域的丰度或计数被加在一起以计算每一个染色体的总计数。然后一个染色体的总计数除以不同的染色体的总计数以产生那两个染色体的染色体比。
可选地，每一个染色体的染色体比可以通过首先将每一个染色体的每一个选择的核酸区域的计数求和并且然后将一个染色体的总和除以两个或更多个染色体的总和来计算。计算后，然后将染色体比与来自正常群体的平均染色体比比较。
平均数可以是具有或不具有归一化或离群数据的排除的平均值、中值、众数或其他平均数。在优选的方面中，使用平均值。在从正常群体开发染色体比的数据集时，计算测量的染色体的标准变化。此变化可以以很多方式表示，最通常地表示为变异系数，或CV。当来自样品的染色体比与来自正常群体的平均染色体比比较时，若样品的染色体比统计学上落在正常群体的平均染色体比之外，则样品包含指示，例如非整倍性、性染色体镶嵌现象或样品污染的Y染色体频率异常。用于设定统计阈值以表明非整倍性的标准取决于在染色体比的测量中的变化和对于期望的方法可接受的假阳性率和假阴性率。通常，这个阈值可以是在染色体比中观察到的变化的倍数。在一个实例中，这个阈值是染色体比的变化的三倍或更多倍。在另一个实例中，它是染色体比的变化的四倍或更多倍。在另一个实例中，它是染色体比的变化的五倍或更多倍。在另一个实例中，它是染色体比的变化的六倍或更多倍。在上述实例中，通过对每个染色体的选择的核酸区域的计数求和来确定染色体比率。通常情况下，对每一个染色体使用相同数目的选择的核酸区域。一种用于产生染色体比的替代方法将是计算每个染色体或染色体区域的选择的核酸区域的平均计数。虽然通常使用平均数，但平均数可以是平均值、中值或众数的任何估计(estimate)。平均数可以是所有计数的平均值或一些变化形式，诸如截尾平均数或加权的平均数。计算每个染色体的平均计数后，可将每个染色体的平均计数除以另一个染色体的平均计数以获得两个染色体之间的染色体比，可将每个染色体的平均计数除以所有测量的染色体的平均数的总和以获得每个染色体的染色体比，如以上所描述的。如上面所强调的，检测母体样品中Y染色体或Y染色体频率异常的能力在极大程度上取决于测定中不同的选择的核酸区域的测量中的变化，在所述母体样品中胎儿DNA为低的相对丰度。众多分析方法可以用来减少这种变化，且从而提高该方法的灵敏度以检测非整倍性。
用于减少测定的变化性的一种方法是增加用于计算染色体的丰度的选择的核酸区域的数目。通常地，如果染色体的单个选择的核酸区域的测量的变化是X％并且在相同的染色体上测量Y个不同的选择的核酸区域，则通过对该染色体上的每一个选择的核酸区域的丰度求和或求平均数计算的染色体丰度的测量的变化将是大约X％除以Y1/2。换句话说，染色体丰度的测量的变化将大约是每一个选择的核酸区域的丰度的测量的平均变化除以选择的核酸区域的数目的平方根。
在本发明的优选的方面中，对于每一个染色体(Y染色体和一个或更多个非Y染色体)测量的选择的核酸区域的数目是至少8。在本发明的另一个优选的方面中，对于每一个染色体测量的选择的核酸区域的数目是至少24。在本发明的又另一个优选的方面中，对于每一个染色体测量的选择的核酸区域的数目是至少32。在本发明另一个优选的方面中，对于每一个染色体测量的选择的核酸区域的数目是至少100。在本发明的另一个优选的方面中，对于每一个染色体测量的选择的核酸区域的数目是至少200。测量每一个选择的核酸区域存在增加的成本并且因此最小化选择的核酸区域的数目，同时仍然产生在统计学上稳健的数据是重要的。在本发明的优选的方面中，对于每一个染色体测量的选择的核酸区域的数目是少于2000。在本发明的优选的方面中，对于每一个染色体测量的选择的核酸区域的数目是少于1000。在本发明的最优选的方面，对于每一个染色体测量的选择的核酸区域的数目是至少32且少于1000。
在一个方面中，测量每一个选择的核酸区域的丰度之后，选择的核酸区域的亚组可被用于确定Y染色体频率异常的存在或不存在。存在用于选取选择的核酸区域的亚组的许多标准方法，包括排除，其中具有低于和/或高于特定百分位数的检测的水平的选择的核酸区域从分析中被丢弃。在一个方面中，百分位数可以是最低和最高的5％，如通过丰度测量的。在另一个方面中，百分位数可以是最低和最高的10％，如通过丰度测量的。在另一个方面中，百分位数可以是最低和最高的25％，如通过丰度测量的。
用于选取选择的核酸区域的亚组的另一种方法包括消除落在一些统计限值之外的区域。例如，落在平均丰度的一个或更多个标准偏差之外的区域可从分析被移除。用于选取选择的核酸区域的亚组的另一种方法可以是将选择的核酸区域的相对丰度与健康群体中相同的选择的核酸区域的预期丰度比较，并丢弃预期值测试不合格的任何选择的核酸区域。为了进一步使测定中的变化最小化，可以增加每一个选择的核酸区域被测量的次数。如所讨论的，与检测Y染色体频率异常的随机方法相比，其中基因组被测量平均少于一次，本发明的方法有意地测量每一个选择的核酸区域多次。通常地，当计数事件时，通过Poisson统计来确定计数中的变化，并且计数变化通常地等于1除以计数的数目的平方根。在本发明的优选的方面中，选择的核酸区域每一个被测量平均至少5次。在本发明的特定方面中，选择的核酸区域每一个被测量平均至少10、50或100次。在本发明的特定方面中，选择的核酸区域每一个被测量平均至少250次。在本发明的特定方面中，选择的核酸区域每一个被测量平均至少500次。在本发明的特定方面中，选择的核酸区域每一个被测量平均至少1000次或至少5,000次或至少10,000次。
在另一个方面中，在确定染色体异常是否存在时，可利用足够的数目，随机地选取选择的核酸区域的亚组以获得统计学上显著的结果。在母体样品内可以执行选择的核酸区域的不同亚组的多重分析以获得更大的统计功效。在该实例中，在随机分析之前，移除或消除任何的选择的核酸区域可以是必需的或可以不是必需的。例如，如果Y染色体存在100个选择的核酸区域且例如2号染色体存在100个选择的核酸区域，则可对每一个染色体进行评价少于100个区域的一系列分析。
还可以通过利用关于对数变换计数的中位数平滑(median polish)系统地移除样品和测定偏差来归一化序列计数。对于每一个样品，度量可以被计算为选择的核酸区域的计数的平均值除以特定染色体上选择的核酸区域的计数的平均值与不同染色体上选择的核酸区域的计数的平均值的总和。比例的标准Z检验可以被用于计算Z统计：
其中pj是给定的样品j中给定的感兴趣的染色体的观察到的比例，p0是计算为中值pj的给定测试染色体的期望的比例，并且nj是比例度量的分母。可以利用迭代检查进行Z统计标准化。在每一次迭代时，移除落在例如三个中值绝对偏差以外的样品。在十次迭代之后，仅利用未经检查的样品计算平均值和标准偏差。然后将所有样品针对该平均值和标准偏差标准化。可以使用Kolmogorov-Smirnov检验(参见Conover,Practical NonparametricStatistics,295-301页(John Wiley&Sons,New York,NY,1971))和Shapiro-Wilk's检验(参见Royston,Applied Statistics,31:115–124(1982))以检验正常样品的Z统计的正态性。
除了以上用于减小测定中的变化的方法之外，其他分析技术可被组合使用，所述其他分析技术中的很多在本申请的前面被描述。例如，当每一个样品的所有选择的核酸区域在单个容器中的单个反应中被询问时，测定中的变化可被减少。相似地，当使用通用扩增体系时，测定中的变化可以被减少。此外，当扩增的循环数被限制时，测定的变化可以被减少。
母体样品中胎儿DNA含量的确定
确定母体样品中胎儿DNA的百分比提高选择的核酸区域的计算的频率的准确性，因为胎儿贡献的知识提供关于来自Y染色体的选择的核酸区域的预期的统计学存在的重要信息。考虑胎儿百分比在其中母体样品中胎儿DNA的水平是低的环境中是尤其重要的，因为胎儿贡献百分比被用于确定样品中Y染色体序列的定量统计学显著性。当评价Y染色体非整倍性或性染色体镶嵌现象的存在和/或确定是否存在样品污染时，这是尤其重要的。
在感兴趣的等位基因处的母体DNA的相对母体贡献可以与在该等位基因处的非母体贡献比较，以确定样品中的大概的胎儿DNA浓度。在优选的方面中，单独父系衍生序列，例如非Y染色体上父系特异性多态性的相对量被用于确定母体样品中胎儿DNA的相对浓度。确定母体样品中胎儿贡献百分比的另一种示例性方法是通过分析具有在胎儿和母体DNA之间的不同DNA甲基化模式的DNA片段。
因为Y染色体序列通常不用于计算本发明方法中胎儿百分比，确定胎儿多态性需要靶SNP和/或突变分析以鉴定母体样品中胎儿DNA的存在。在每一个母体衍生的样品中，来自胎儿的DNA将具有约50％的遗传自母亲的其基因座和50％的遗传自父亲的基因座。确定来自父亲来源的对胎儿贡献的基因座允许估计母体样品中的胎儿DNA，并且因此提供了用来计算感兴趣的染色体的染色体频率中的统计学上显著差异的信息。在一些方面中，可以进行使用父本和母本的在先的基因分型。例如，亲本可以已经历用于鉴定疾病标志物的基因型确定，例如，关于诸如囊性纤维化、肌肉萎缩症、脊髓性肌萎缩的紊乱或甚至RhD基因的状态的基因型确定可被确定。如果这样，在多态性、拷贝数变体或突变中的差异可以被用于确定母体样品中的胎儿贡献百分比。
在可选的优选的方面中，母体样品中胎儿无细胞DNA百分比可以利用多重SNP检测来定量，而无需母体或亲本基因型的在先知识。在该方面中，使用每一个区域中具有一个或更多个已知SNP的选择的多态性核酸区域。在优选的方面中，选择的多态性核酸区域位于不可能是非整倍性的常染色体例如6号染色体上。在优选的实施方案中，在一个容器中的一个反应中扩增选择的多态性核酸区域。利用例如高通量测序确定并定量母体样品中每一个选择的多态性核酸区域的等位基因。序列确定之后，鉴定其中母体和胎儿基因型是不同的基因座，例如，母体基因型是纯合的且胎儿基因型是杂合的基因座。父本遗传的序列可以通过检测的以低的但统计学上相关的频率发生的多态性来鉴定。通过针对特定的选择的核酸区域观察一个等位基因的高相对频率(＞60％)和其他等位基因的低相对频率(＜20％且＞0.15％)来完成鉴定。由于多个基因座的使用在等位基因的丰度的测量中减少变化的量，其是特别地有优势的。满足该要求的所有的基因座或其亚组被用来通过统计学分析确定胎儿浓度。
在一个方面中，通过将来自两个或更多个基因座的低频率等位基因加在一起，除以高和低频率等位基因的和并乘以2来确定胎儿浓度。在另一个方面中，通过对来自两个或更多个基因座的低频率等位基因求平均值，除以高和低频率等位基因的平均值并乘以2来确定胎儿无细胞DNA的百分比。
对于许多等位基因，母体和胎儿序列可以是纯合且是同一的，并且由于该信息不会区分母体和胎儿DNA，其在确定母体样品中的胎儿DNA百分比中是没有用的。本发明的方法利用等位基因的信息计算胎儿百分比，其中胎儿和母体DNA之间存在差异(例如，胎儿等位基因包含与母体等位基因不同的至少一个等位基因)。因此与对于母体和胎儿DNA来讲相同的等位基因区域有关的数据不会被选择用于分析，或在确定胎儿DNA百分比之前从相关数据中移除，以不会使有用的数据无效。用于定量母体血浆中胎儿DNA的示例性方法可以见于例如Chu等人,Prenat Diagn,30:1226-29(2010)中，其通过引用被并入本文。
在一个方面中，如果由于实验误差、或来自特定样品内的先天的遗传偏差使得区域的量或频率表现出异常值，选择的核酸区域可被排除。在另一个方面中，选择的核酸可以在求和或求平均数例如如本领域中已知的或如以上描述的之前，经历统计学的或数学的调整，诸如归一化、标准化、聚类或转化。在另一个方面中，选择的核酸可以在求和或求平均数之前经历归一化和数据实验误差排除两者。在优选的方面中，12个或更多个基因座被用于分析。在另一个优选的方面中，24个或更多个基因座被用于分析。在另一个优选的方面中，48个或更多个基因座、72个或更多个基因座、96个或更多个基因座、100个或更多个基因座或200个或更多个基因座被用于分析。
在一个优选的方面，可利用母体和胎儿等位基因中的串联SNP检测来定量母体样品中的胎儿贡献百分比。用于鉴定从母体样品中提取的DNA中的串联SNP的技术被公开在Mitchell等人，美国专利号7,799,531和USSN 12/581,070；12/581,083；12/689,924和12/850,588中。这些参考文献描述了通过检测母体样品中在胎儿和母体基因组之间具有不同的单倍型的至少一个串联单核苷酸多态性(SNP)来区分胎儿和母体基因座。这些单倍型的鉴定和定量可以对母体样品直接地进行，如在Mitchell等人的公开内容中描述的，并被用于确定母体样品中的胎儿贡献百分比。
在又另一个可替代选择中，某些基因已经被鉴定为具有母体和胎儿基因拷贝之间的表观遗传学区别，并且这样的基因是母体样品中胎儿DNA标志物的候选基因座。参见，例如，Chim等人，PNAS USA,102:14753-58(2005)。在胎儿DNA中可以是甲基化的但在母体DNA中可以是未甲基化的(或反之亦然)的这些基因座，可以通过利用甲基化特异性PCR(MSP)以高特异性容易地被检测，甚至当这样的胎儿DNA分子存在于母体来源的过量的背景血浆DNA之中时，也可以通过利用甲基化特异性PCR(MSP)以高特异性容易地被检测。比较母体样品中甲基化的和未甲基化的扩增产物可以被用于通过计算已知与母体DNA相比胎儿DNA中通过甲基化不同地调节的一个或更多个这样的序列的表观遗传的等位基因比来定量胎儿DNA对母体样品的贡献的百分比。
为了确定母体样品中核酸的甲基化状态，使样品的核酸经历样品的亚硫酸氢盐转化并且然后经历MSP，随后是等位基因特异性引物延伸。用于这样的亚硫酸氢盐转化的常规方法包括但不限于使用商业上可得的试剂盒，诸如MethylampTMDNA修饰试剂盒(Epigentek,Brooklyn,NY)。等位基因的频率和比可以直接被计算并且从数据中输出以确定母体样品中胎儿DNA的相对百分比。
胎儿无细胞DNA百分比在Y染色体频率分析中的用途
胎儿无细胞DNA百分比已经被计算之后，将该数据与用于检测和定量Y染色体序列的方法联合以确定胎儿可能是男性、可能是Y染色体的非整倍性、可能是Y染色体镶嵌现象、或待被测试的母体样品被污染的可能性。
例如，在10％胎儿DNA的母体样品中，每一个染色体将贡献正常胎儿中的10％的1/46th(或约0.22％)。在正常男性胎儿中，因此Y染色体将贡献10％的1/46th(0.22％)，并且常染色体将贡献10％的2/46th或1/23rd(0.44％，因为每一个常染色体有两条)。因此，在确定胎儿是否是正常男性胎儿时，10％胎儿的样品中Y染色体特异性序列的频率应该是0.22％并且例如3号染色体特异性序列的频率应该是0.44％，因为男性胎儿具有两条3号染色体。在确定是否存在Y染色体非整倍性时(即，两个或更多个Y染色体)，对于两个Y染色体，Y染色体特异性序列的频率将是约0.44％并且对于三个Y染色体将是约0.66％。在确定胎儿是否可能是性染色体镶嵌现象时，Y染色体特异性序列的频率应该是较小的并且可以是基本上小于0.22％，并且对于评价具有来自女性胎儿的核酸的母体样品被具有来自男性胎儿的核酸的母体样品的样品污染的可能性也是如此。在另一个实例中，在5％胎儿DNA的母体样品中每一个染色体将贡献正常胎儿中的5％的1/46th(或约0.11％)。在正常男性胎儿中，Y染色体将因此贡献5％的1/46th(0.11％)并且常染色体将贡献5％的2/46th或1/23rd(0.22％，因为每一个常染色体有两条)。
在优选的方面，在单个反应中(即，在单个容器中)进行用于确定母体样品中选择的核酸区域，包括用于确定样品中胎儿DNA百分比的选择的多态性核酸区域和来自Y染色体的选择的核酸区域二者的反应。当利用胎儿DNA含量以辅助确定染色体异常的存在或不存在时，该单个反应有助于使可能在测定系统中的各个步骤中引入的污染或偏差的风险被最小化，否则所述污染或偏差可使结果出现偏差(skew results)。
在其他方面中，可以利用一个选择的核酸区域或更多个选择的核酸区域用于确定胎儿DNA含量百分比和检测Y染色体异常两者。选择的核酸区域的等位基因可以被用于确定胎儿DNA含量，并且然后这些相同的选择的核酸区域可以被用于检测胎儿染色体异常，忽略等位基因的信息。对于胎儿DNA含量和检测染色体异常两者利用相同的选择的核酸区域还可有助于使由于实验误差或污染造成的任何偏差最小化。
在一个实施方案中，不考虑胎儿性别，使用常染色体SNP测量母体样品中胎儿来源的贡献(参见，Sparks等人，Am.J.Obstet&Gyn.,206:319.e1-9(2012))。使用的程序不需要父本基因型的在先知识，因为在该方法期间鉴定非母体等位基因而不考虑父本遗传的知识。利用二项分布的最大似然估计可以被用于计算跨每一个母体样品中若干提供信息的基因座的估计的胎儿核酸分布。使用的用于计算胎儿核酸贡献的程序被描述在，例如2012年7月19日提交的USSN 13/553,012中，其通过引用被并入。用于确定胎儿贡献的多态性区域可以来自1-12号染色体并且优选地不以血型抗原为靶标。
在某些方面，来自多态性测定的胎儿贡献的估计被用于确定胎儿差异值。例如，在某些方面，胎儿差异可以被定义为
其中FPPoly是来自多态性测定的胎儿贡献且FPYN是Y计数的归一化分数。当胎儿差异值接近于零时，胎儿可能是女性。当胎儿差异值接近于1时，胎儿可能是男性。如果胎儿差异值接近于2，胎儿DNA可能包含两个拷贝的Y染色体。在某些方面，胎儿差异值被用来确定样品的胎儿DNA中多于两个拷贝，诸如三、四或五个拷贝的Y染色体的存在。
测量的胎儿差异值可能受到发生在分析过程中的变化的影响，所述变化诸如来自测定系统、操作者的差异或其他变量的变化。在某些方面，为了报告结果的目的，胎儿差异值的特定范围可以被排除在基线水平的确定性之外。在一些方面，在小于0的胎儿差异值将被认为清楚地表明胎儿不具有Y染色体。在一些方面，在0和1之间的胎儿差异值不提供确定Y染色体的存在或不存在的必需水平的确定性。因此，在某些方面，落入一定范围诸如0至1的胎儿差异值，诸如在0.1至0.9范围内诸如0.2至0.8的胎儿差异值将被视为在确定性范围以外。
本发明的程序的计算机实施
本发明的程序可以通过计算机或计算机系统来实施。例如，将来自方法的“读出(read out)”的原始数据-即高通量测序扩增产物或杂交至阵列-与计算机或处理器通讯，并且计算机可以执行软件，所述软件例如“计数”或“记录”感兴趣的多种序列的发生的频率、比较频率、归一化频率、执行质量控制和/或统计分析、计算母体样品的胎儿比例或百分比、鉴于胎儿核酸百分比计算基因组区域和/或染色体的剂量或频率、确定风险概率或执行其他计算以确定染色体异常。在一个实施方案中，计算机可包括个人计算机，但计算机可包括包含至少一个处理器和存储器的任何类型的机器。软件组件的输出包括具有例如基因组区域和/或染色体(诸如，在此情况下，Y染色体)具有剂量异常的概率的值的报告。在一些方面中，此报告是区域或染色体具有两个拷贝(例如，是二体)的似然值和区域或染色体具有更多个拷贝(例如，是三体)或更少(例如，是单体)拷贝的似然值的比值比。报告可以是打印出来的纸或电子的，报告可以显示在显示器上和/或通过电子邮件、FTP、发送文本讯息、发布在服务器上等电子通讯至用户。尽管本发明的归一化程序被描述为作为软件实现，其也可以作为硬件和软件的组合实现。此外，用于归一化的软件可以作为在相同或不同计算机上操作的多个组件实施。服务器(如果存在)和计算机二者可以包括典型计算设备的硬件组件(未显示)，包括处理器、输入设备(例如，键盘、定点设备、用于语音命令的传声器、按钮、触摸屏等)和输出设备(例如，显示器、扬声器等)。当通过处理器来执行时，服务器和计算机可以包括计算机可读介质，例如包含实施公开的功能的计算机指令的存储器和储存设备(例如，闪存、硬盘驱动器、光盘驱动器、磁盘驱动器等)。服务器和计算机还可以包括用于通讯的有线或无线网络通讯接口。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供完整的公开内容和如何进行和利用本发明的说明，并且不意图限制发明人视为其发明的内容的范围，也不意图表示或暗示以下实验是进行的全部实验或仅有的实验。本领域技术人员将领会，可对本发明进行很多变化和/或修该，如在具体的方面中显示的，而不偏离如广泛地描述的本发明的精神或范围。因此本方面将被认为在所有的方面为例证性的且非限制性的。
已经做出努力以确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数按重量份数计，分子量是重量平均分子量，温度是以摄氏温度计，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例1：利用染色体特异性基因组区域中非多态性位点检测Y染色体频率异常
在第一个实施方案中，使用针对Y染色体上特定基因组区域的测定来鉴定Y染色体频率异常的存在或不存在。本测定系统允许使用高度多重化系统鉴定多个个体的DNA中这样的异常的存在或不存在。
使用与Y染色体(chrY)和13、18和21号染色体(chr13、chr18和chr21)互补或来源于其的寡核苷酸制备多重询问。使用常规固相化学反应合成串联连接格式中使用的所有寡核苷酸。第一固定组的寡核苷酸和桥接寡核苷酸被合成为具有使能够连接至毗邻寡核苷酸的3’羟基末端的5'磷酸部分。针对chrY开发了三十二个非多态性测定并且与针对chr13、chr18和chr21开发的测定进行比较(参见，例如Sparks等人，Prenat.Diagn.,32(1):3-9(2012)和Sparks等人，Am J.Obstet.Gynecol.(2012),doi:10.1016/j.ajog.2012.01.030)。使用1至12号染色体上的一组含有SNP的基因座测量胎儿分数。计算来自FORTE算法的胎儿分数估计和Y计数的分数的差并且除以来自FORTE算法的胎儿分数估计。将结果从1中减去以提供胎儿差异值。当差异接近0时，胎儿可能是女性，并且当差异接近1时，胎儿可能是男性。利用bootstrap抽样来计算这种胎儿差异值的分布，并且通过比较差异来自男性样品的似然与差异来自女性样品的似然来计算对数比值比(log oddsratio)。
实施例2：制备用于串联连接程序的DNA
从Coriell Cell Repositories(Camden,New Jersey)获得来自受试者的基因组DNA并且通过声学剪切(Covaris,Woburn,MA)片段化成约200bp的平均片段大小。
使用标准程序将DNA生物素化。简略地，通过在1.5ml微管中产生以下反应来将Covaris片段化的DNA末端修复：5ug DNA、12μl 10x T4连接酶缓冲液(Enzymatics,BeverlyMA)、50U T4多核苷酸激酶(Enzymatics,Beverly MA)和H2O至120μl。将此微管在37℃孵育30分钟。将DNA用10mM Tris 1mM EDTA pH 8.5稀释至～0.5ng/μl的期望的终浓度。
将5μl DNA置于96孔板的每一个孔中，并且将板用粘合性板封口膜密封并以250xg旋转10秒钟。然后将板在95℃孵育3分钟，并且冷却至25℃，并且再次以250x g旋转10秒钟。将生物素化master mix在1.5ml微管中制备成以下的终浓度：1x TdT缓冲液(Enzymatics,Beverly MA)、8U TdT(Enzymatics,Beverly MA)、250μM CoCl2、0.01nmol/μl生物素-16-dUTP(Roche,Nutley NJ)和H2O至1.5ml。将15μl的master mix等分入96孔板的每一个孔中，并且将板用粘合性板封口膜密封。将板以250x g旋转10秒钟并且在37℃孵育60分钟。孵育之后，将板以250x g再次旋转10秒钟并且将7.5μl沉淀混合物(1ng/μl葡聚糖蓝，3mM NaOAc)加至每一个孔。
将板用粘合性板封口膜密封并且用IKA板涡旋仪以3000rpm混合2分钟。将27.5μl的异丙醇加入每一个孔中，将板用粘合性板封口膜密封并且以3000rpm涡旋5分钟。将板以3000x g旋转20分钟，轻轻倒出上清液，并且将板倒置并且在吸附剂擦拭物上以10x g离心1分钟。将板风干5分钟，并且将沉淀物重悬在10μl 10mM Tris pH8.0，1mM EDTA中。从如以上陈述的制备的寡核苷酸产生第一和第二基因座特异性固定寡核苷酸的组的等摩尔的集合(各40nM)。基于选择的基因组基因座的序列，同样地产生桥接寡核苷酸的单独的等摩尔的集合(各20nM)用于测定程序。
将10μg的链霉亲和素珠转移进入96孔板的孔中，并且将上清液移除。将60μl结合缓冲液(100mM Tris pH 8.0、10mM EDTA、500mM NaCl2、58％甲酰胺、0.17％Tween-80)、实施例2中制备的10μL 40nM固定序列寡核苷酸集合和30μL生物素化的模板DNA添加至珠。将板用粘合性板封口膜密封并且以3000rpm涡旋直到将珠重悬。通过在70℃孵育5分钟将寡核苷酸退火至模板DNA，随后慢慢冷却至30℃。
将板置于凸起的条形磁板上2分钟以将磁珠和缔合的DNA拉至孔的侧面。通过移液器将上清液移除并且用50μL的60％结合缓冲液(水中v/v)替换。通过涡旋将珠重悬，再次置于磁体上并且将上清液移除。使用50uL 60％结合缓冲液重复该珠洗涤程序一次，并且使用50μL洗涤缓冲液(10mM Tris pH 8.0，1mM EDTA，50mM NaCl2)再重复两次。
将珠重悬在由1X Taq连接酶缓冲液(Enzymatics,Beverly MA)、10U Taq连接酶、和2uM桥接寡核苷酸集合(取决于测定格式)组成的37μl连接反应混合物中，并且在37℃孵育1小时。在适当的情况下并且取决于测定格式，将非校正的热稳定聚合酶加200nM每一种dNTP包括在该混合物中。将板置于凸起的条形磁板上2分钟以将磁珠和缔合的DNA拉至孔的侧面。通过移液器将上清液移除，并且用50μL洗涤缓冲液来替换。通过涡旋将珠悬浮，再次置于磁体上并且将上清液移除。重复洗涤程序一次。
为了从链霉亲和素珠中洗脱产物，将30μl的10mM Tris 1mM EDTA，pH 8.0加至96孔板的每一个孔中。将板密封并且使用IKA涡旋仪以3000rpm混合2分钟以重悬珠。将板在95℃孵育1分钟，并且使用8通道移液器将上清液吸出。将来自每一个孔的25μl的上清液转移进入新的96孔板用于通用扩增。
实施例3：连接产物的通用扩增
使用与存在于杂交至感兴趣的核酸区域的第一和第二固定序列寡核苷酸中的通用序列互补的通用PCR引物扩增聚合的和/或连接的核酸。在每一个扩增反应中使用25μl的实施例3中的每一种反应混合物。由25μL洗脱的连接产物加1x Pfusion缓冲液(Finnzymes,Finland)、1M甜菜碱、400nM每一种dNTP、1U Pfusion误差校正热稳定DNA聚合酶和具有样品标签的引物对组成的50μL通用PCR反应用于在汇集和测序之前独特地鉴定个体样品。使用BioRad TetradTM热循环仪在严格的条件下实施PCR。
将来自每一个样品的10μl的通用PCR产物汇集并且使用AMPureTMSPRI珠(Beckman-Coulter,Danvers,MA)将汇集的PCR产物纯化并且使用Quant-iTTMPicoGreen,(Invitrogen,Carlsbad,CA)定量。将纯化的PCR产物在Illumina HiSe 2000上的载玻片的单泳道上进行测序。测序运行通常产生～100M原始读段，其中～85M(85％)映射至预期的测定结构。这转化为跨实验的平均～885K读段/样品，和跨96个选择的核酸区域的(在使用96个基因座的实验的情况下)9.2K读段/复制物/基因座。为了确定Y染色体的剂量，针对染色体Y以及13、18和21号染色体的每一个上的非多态性基因座设计测定。
实施例4：分析多态性基因座以评价胎儿贡献百分比
为了评价母体样品中胎儿核酸的比例，针对1至12号染色体上的一组含SNP的基因座设计测定，其中具有一个碱基差别的两个中间寡核苷酸被用于询问每一个SNP。在HapMap3数据集中针对次要等位基因频率优化SNP。Duan,等人，Bioinformation，3(3):139-41(2008)；Epub 2008Nov 9。
通过IDT来合成寡核苷酸并且汇集在一起以产生单个多重化的测定集合。如之前描述的从每一个受试者样品产生PCR产物。提供信息的多态性基因座被定义为其中胎儿等位基因不同于母体等位基因的基因座。因为测定表现出超过99％的等位基因特异性，所以当基因座的胎儿等位基因比例被测量为在1％和20％之间时，提供信息的基因座容易地被鉴定出。诸如在2012年7月19日提交的共同待审的申请USSN 13/553,012中描述的，利用二项分布来估计最大似然，以基于来自几个提供信息的基因座的测量结果来确定最可能的胎儿比例。结果与由Chu和合作者(参见,Chu,等人,Prenat.Diagn.,30:1226-29(2010))提出的加权平均法良好地相关(R2＞0.99)。
虽然本发明由以很多不同形式的方面满足，但是如结合本发明优选的方面详细描述的，应理解本公开内容应被视为是本发明的原则的示范且不意图将本发明限制为本文例证和描述的具体方面。本领域技术人员可做出很多变化而不偏离本发明的精神。本发明的范围将通过所附的权利要求书和其等价物来度量。摘要和发明名称不被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使有关当局以及一般公众能够快速地确定本发明的一般性质。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则本文提及的特征或要素不应解释为根据35U.S.C.§112,的手段-加-功能(means-plus-function)的限制。

Claims (23)

1.对Y染色体上选择的非多态性的核酸区域和对至少一个非Y染色体上的多态性和非多态性的选择的核酸区域是特异性的两种固定序列寡核苷酸的组在制备用于确定胎儿中Y染色体频率异常的风险的组合物中的用途，所述确定包括以下步骤：
(a)将对Y染色体上选择的非多态性的核酸区域和对至少一个非Y染色体上的多态性和非多态性的选择的核酸区域是特异性的所述两种固定序列寡核苷酸的组退火至母体样品中包含的母体和胎儿核酸，其中所述两种固定序列寡核苷酸中的每一种的一部分与所选择的非多态性或多态性核酸区域之一是互补的，所述两种固定序列寡核苷酸中的至少一种包含基因座标志，对多态性核酸区域特异性的两种固定序列寡核苷酸中的至少一种包含等位基因标志，每一组的两种固定序列寡核苷酸的至少一种包含通用引用序列，并且其中对母体和胎儿核酸中的至少一个非Y染色体上的多态性的选择的核酸区域特异的寡核苷酸是对所选择的多态性核酸区域中的不同等位基因特异的；
(b)使用所述通用引物序列选择性扩增来自所述Y染色体和所述至少一个非Y染色体的所述选择的核酸区域以产生扩增的选择的核酸区域；
(c)通过所述固定序列寡核苷酸中包含的基因座标志使所述扩增产物与阵列杂交；
(d)通过与所述阵列杂交确定来自所述Y染色体和所述至少一个非Y染色体的选择的非多态性核酸区域的频率；
(e)通过与所述阵列杂交定量来自所述至少一个非Y染色体的选择的多态性的核酸区域来确定所述母体样品中胎儿核酸的百分比，其中所述母体核酸和所述胎儿核酸具有不同的基因型；和
(f)确定所述胎儿是正常男性胎儿的概率和Y染色体频率异常的风险，其中如果所述Y染色体上的非多态性核酸区域贡献不超过胎儿核酸在母体样品中的百分比的1/46，则所述胎儿是正常男性胎儿，而如果所述Y染色体上的非多态性核酸区域胎儿核酸在母体样品中的百分比的1/23或更多，则所述胎儿处于Y染色体频率异常的风险。
2.如权利要求1所述的用途，其中来自所述Y染色体和所述至少一个非Y染色体的至少八个选择的核酸区域被扩增。
3.如权利要求2所述的用途，其中来自所述Y染色体和所述至少一个非Y染色体的至少四十八个选择的核酸区域被扩增。
4.如权利要求3所述的用途，其中来自所述Y染色体和所述至少一个非Y染色体的至少九十六个选择的核酸区域被扩增。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述Y染色体频率异常由所述胎儿的Y染色体非整倍性、Y染色体镶嵌现象或样品污染引起。
6.如权利要求1所述的用途，其中来自至少两个非Y染色体的选择的核酸区域被选择性扩增和定量。
7.如权利要求6所述的用途，其中来自至少四个非Y染色体的选择的核酸区域被选择性扩增和定量。
8.如权利要求7所述的用途，其中来自至少六个非Y染色体的选择的核酸区域被选择性扩增和定量。
9.如权利要求1所述的用途，其中所述至少一个非Y染色体选自13号染色体、18号染色体或21号染色体。
10.如权利要求1所述的用途，其中所述固定序列寡核苷酸中的至少一种包含至少一种识别标志。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述至少一种识别标志包括样品标志。
12.如权利要求11所述的用途，其中在所述选择性扩增步骤之前所述母体样品在用于反应的不同的容器中，并且在所述选择性扩增步骤之后所述母体样品被汇集。
13.如权利要求1所述的用途，其中所述固定序列寡核苷酸的至少一种还包括样品标志，并且所述基因座标志和样品标志位于组中相同的固定序列寡核苷酸上。
14.如权利要求1所述的用途，其中所述固定序列寡核苷酸的至少一种还包括样品标志，并且所述基因座标志和样品标志位于组中不同的固定序列寡核苷酸上。
15.如权利要求1所述的用途，其中来自所述Y染色体和所述至少一个非Y染色体的选择的核酸区域在单独的容器中被选择性扩增。
16.如权利要求1所述的用途，其中所述选择的核酸区域各自被计数平均至少5次。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述选择的核酸区域各自被计数平均至少250次。
18.如权利要求1所述的用途，所述确定还包括使桥接寡核苷酸退火到选择的非多态性核酸区域和选择的多态性核酸区域，其中所述桥接寡核苷酸在每一组的两个固定序列寡核苷酸之间杂交。
19.对Y染色体上选择的非多态性核酸区域和对至少两个非Y染色体上的多态性和非多态性的选择的核酸区域是特异性的两种固定序列寡核苷酸的组在制备用于确定胎儿中Y染色体频率异常的风险的组合物中的用途，所述确定包括以下步骤：
(a)获得包含母体和胎儿核酸的至少五个母体样品；
(b)将所述母体样品的每一个放置于单独的反应容器中；
(c)将对Y染色体上选择的非多态性核酸区域和对至少两个非Y染色体上的多态性和非多态性的选择的核酸区域是特异性的所述两种固定序列寡核苷酸的组退火至所述母体样品中包含的母体和胎儿核酸，其中所述两种固定序列寡核苷酸中的每一种的一部分与所选择的非多态性或多态性核酸区域之一是互补的，所述两种固定序列寡核苷酸中的至少一种包含基因座标志，对多态性核酸区域特异性的两种固定序列寡核苷酸中的至少一种包含等位基因标志，每一组的两种固定序列寡核苷酸的至少一种包含通用引用序列，并且其中对母体和胎儿核酸中的至少一个非Y染色体上的多态性的选择的核酸区域特异的寡核苷酸是对所选择的多态性核酸区域中的不同等位基因特异的，并且其中所述固定序列寡核苷酸的至少一种包含样品标志；
(d)使用通用引物序列选择性扩增来自所述Y染色体和所述至少两个非Y染色体的所述选择的核酸区域以产生扩增的选择的核酸区域；
(e)汇集所述至少五个母体样品到单个反应容器中；
(f)通过所述固定序列寡核苷酸中包含的基因座标志使扩增产物与阵列杂交；
(g)使用在计算机上执行的软件，定量选择的核酸区域，
使用在计算机上执行的软件，确定来自所述Y染色体和所述至少两个非Y染色体的定量的选择的核酸区域的频率；
(h)使用在计算机上执行的软件，通过考虑来自所述至少两个非Y染色体的定量的多态性的选择的核酸区域的频率来确定所述母体样品中胎儿核酸的百分比；和
(i)使用在计算机上执行的软件，确定胎儿是正常男性胎儿的概率和Y染色体频率异常的风险，其中如果所述Y染色体上的非多态性核酸区域贡献不超过胎儿核酸在母体样品中的百分比的1/46，则所述胎儿是正常男性胎儿，而如果所述Y染色体上的非多态性核酸区域贡献胎儿核酸在母体样品中的百分比的1/23或更多，则所述胎儿处于Y染色体频率异常的风险。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述固定序列寡核苷酸中的至少一种包含至少一种另外的标志。
21.如权利要求19所述的用途，其中所述基因座标志和样品标志位于组中相同的固定序列寡核苷酸上。
22.如权利要求19所述的用途，其中所述基因座标志和样品标志位于组中不同的固定序列寡核苷酸上。
23.如权利要求19所述的用途，所述确定还包括使桥接寡核苷酸退火到选择的非多态性核酸区域和选择的多态性核酸区域，其中所述桥接寡核苷酸在每一组的两个固定序列寡核苷酸之间杂交。
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