JP6878631B2 - 非侵襲的に胎児の性染色体異数性のリスクを計算する方法 - Google Patents

Description

本発明は、母体混合試料中の胎児寄与割合を考慮して、Ｘ及びＹ染色体に由来する遺伝子配列の相対的寄与を検出及び決定することにより、胎児又はＸ及びＹ染色体の頻度異常の非侵襲的性別決定の統計分析に関する。

以下の考察では、特定の文献及び方法が、背景技術及び導入の目的のために説明される。本明細書に含まれているものは、従来技術の「承認」として解釈されるべきではない。該当する場合、出願人は、本明細書中に引用された文献及び方法が、該当する法令の条項に基づいて従来技術を構成しないことを論証する権利を明示的に保留する。

遺伝子異常は、染色体異数性により引き起こされる症候群（例えば、ダウン症候群）、及び単一遺伝子性又は多遺伝子性の疾患又は障害のいずれかをもたらす生殖細胞系突然変異により引き起こされるものを含む、多数の病理の原因である。トリソミー、転座、及び大規模な挿入又は欠失等の全染色体異常、並びにＲｈ式血液型状態、常染色体優性障害若しくはＸ連鎖性障害、又は常染色体劣性障害に関連する単一遺伝子突然変異又は多型等の単一遺伝子形質を両方とも検出することは、胎児に影響を及ぼす場合がある実際の潜在的な病理及び障害の検出に有用である。例えば、１３トリソミー、１８トリソミー、及び２１トリソミー等の染色体異常、ロバートソン転座、及び、例えばディ・ジョージ症候群の２２番染色体に見出されるような、より大規模な欠失は全て、胎児の健康に著しい影響を及ぼす。

これらの様々な遺伝子異常の検出法が、従来技術により提供されているものの、最近まで、異なる遺伝子異常には、異なる種類の突然変異を調査するための異なる技法が必要とされていた。例えば、染色体異数性の出生前診断検査の従来方法は、妊娠１１〜１４週での絨毛膜絨毛採取（ＣＶＳ）又は１５週以降の羊水穿刺のいずれかを使用して、遺伝子分析用に胎児細胞試料を子宮から直接取り出すことが必要であった。しかしながら、そのような侵襲的手技には、約１パーセントの流産のリスクが伴う（非特許文献１を参照）。胎児細胞の他の分析には、典型的には、核型分析又は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が含まれるが、それらは、単一の遺伝子形質に関する情報を提供しない。したがって、単一遺伝子疾患及び障害を特定するには、追加の検査が必要である。

母体ゲノムに存在しない父性遺伝子ＤＮＡ配列、例えば、胎児の性別を判定するためのＹ染色体の配列、及び血液型の遺伝子型を決定するためのＲＨＤ遺伝子の非侵襲的検出は、１９９０年代中頃から可能になっている。しかしながら、デジタルポリメラーゼ連鎖反応及び特に大規模並列配列決定等の単一分子計数技術が最近になって開発され、胎児染色体異数性及び単一遺伝子性疾患の非侵襲的出生前診断に、循環胎児ＤＮＡを使用することが可能になっている。しかし、他の胎児異常及び／又は検査の品質管理パラメータは、依然として未解決である。

Ｍｕｊｅｚｉｎｏｖｉｃ及びＡｌｆｉｒｅｖｉｃ、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１１０巻：６８７〜６９４頁（２００７年）

当技術分野では、胎児の性別、Ｘ染色体頻度、及びＹ染色体頻度の正確な決定が必要とされている。本発明は、この必要性に取り組むものである。

本概要は、単純化された形態の選択的な概念を紹介するためのものであり、これらは以下の詳細な説明に更に記載されている。本概要は、特許請求の主旨の重要な又は本質的な特徴を特定するためのものでもなければ、特許請求の主旨の範囲を限定するために使用されるものでもない。特許請求の主旨の他の特徴、詳細、有用性、及び利点は、添付の図面に示され、添付の特許請求の範囲で特定されている態様を含み、以下に記載の詳細な説明から明白になるであろう。

１つの態様では、本方法は、性染色体及び１つ又は複数の常染色体（つまり、常染色体）の選択核酸領域の多重化増幅及び検出を使用して、母体混合試料中の胎児核酸寄与割合に関連するＸ及びＹ染色体の頻度を計算する。目的ゲノム領域（例えば、性染色体配列並びに１つ又は複数の常染色体配列の配列）の選択核酸領域の相対量が、本明細書に記載の分析方法を使用して決定される。そのような方法は、胎児の性別、Ｘ及びＹの染色体異数性の可能性、及び雌雄モザイク現象の可能性の決定、並びに母体混合試料が汚染されている尤度を評価するために使用される。

これらの及び他の態様、特徴、及び利点は、本明細書に記載のように、より詳細に提供されるであろう。

本発明による１つのアッセイ法の単純化されたフローチャートである。 ２つ以上の選択核酸領域を検出するための多重アッセイ系を示す図である。 ２つ以上の選択核酸領域を検出するための代替的多重アッセイ系を示す図である。 ２つ以上の選択核酸領域を検出するための更に別の代替的多重アッセイ系を示す図である。 ２つ以上の選択核酸領域を検出するための更に別の代替的多重アッセイ系を示す図である。 選択核酸領域を検出するための更に別の代替的多重アッセイ系を示す図である。 選択核酸領域を検出するための更に別の代替的多重アッセイ系を示す図である。 本発明による統計分析を実施するための例示的な方法の単純化されたフローチャートである。 本発明による統計分析を実施するための例示的な方法の更に別の単純化されたフローチャートである。

本明細書に記載の方法は、別様の指定がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及びマイクロアレイの従来技法及び説明、並びに配列決定技法を使用することができる。それらは当業者の技術内にある。そのような従来技法には、オリゴヌクレオチドのポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、及びライゲーション、オリゴヌクレオチドの配列決定、並びに標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が含まれる。好適な技法は、本明細書中の実施例を参照して具体的に説明することができる。しかしながら、同等の従来手順も、無論、使用することができる。そのような従来技法及び説明は、以下のもの等の標準的実験手引き書に見出すことができる：Ｇｒｅｅｎら編、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｉ〜ＩＶ巻）（１９９９年）；Ｗｅｉｎｅｒら編、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００７年）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００３年）；Ｂｏｗｔｅｌｌ及びＳａｍｂｒｏｏｋ、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（２００３年）；Ｍｏｕｎｔ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００４年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００６年）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００２年）（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社刊）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５年）；Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８４年）；Ｎｅｌｓｏｎ及びＣｏｘ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００年）；及びＢｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２年）。これらの文献は全て、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。本組成物、研究ツール、及び方法を説明する前に、本発明は、記載されている特定の方法、組成物、標的、及び使用に限定されず、無論、それ自体、様々であってもよいことが理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、特定の態様を説明するためのものであるに過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになることが理解されるべきである。

本明細書で使用される場合及び添付の特許請求の範囲では、単数の「１つの」、「前記」、及び「その」は、状況が明白にそうではないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの核酸領域」への言及は、１つ、複数、又はそのような領域の混合物を指し、「方法」への言及は、当業者に知られている同等のステップ及び方法への言及を含む等である。

一連の値が提供される場合、その範囲の上限及び下限間の各介在値、及びその記載されている範囲の任意の他の記載されている値又は介在値は、本発明内に包含されることが理解されるべきである。記載されている範囲が、上限及び下限を含む場合、それらの限界値のうちのいずれかを除外した範囲も、本発明に含まれる。

本明細書で言及された刊行物は全て、本発明に関連して使用することができる配合及び方法を説明及び開示する目的を含むあらゆる目的のために、参照により組み込まれる。
以下の記載には、本発明のより良い理解を提供するために、多数の特定の詳細が示されている。しかしながら、本発明は、これら特定の詳細の１つ又は複数がなくとも実施することができることは、当業者であれば明白であろう。他の場合には、周知の特徴及び当業者に周知の手順は、本発明の曖昧さを回避するために記載されていない。

定義
本明細書で使用される用語は、当業者により理解されているような明白な通常の意味を有することが意図される。以下の定義は、読者による本発明の理解を支援するためのものであるが、具体的に指定されていない限り、そのような用語の意味を変更したり、その他の方法で限定したりすることは意図されていない。

用語「増幅核酸」は、その量が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施された任意の核酸増幅法又は複製法により、その開始量と比較して、少なくとも２倍増加された任意の核酸分子である。

用語「染色体異常」は、染色体の全て又は一部のあらゆる遺伝子変異を指す。遺伝子変異には、限定するものではないが、重複又は欠失、転座、逆位、及び突然変異等の任意のコピー数変異が含まれる。この用語はまた、胎児組織又は母体組織における染色体モザイク現象も含む。

用語「診断ツール」は、本明細書で使用される場合、患者試料での診断検査又はアッセイを実施するために、例えばシステムで使用される本発明の任意の組成物又は方法を指す。

用語「雌雄モザイク現象」又は「性染色体モザイク現象」又は「性染色体モザイク」は、１つの個体に異なる性染色体遺伝子型を有する２つ以上の細胞集団が存在することを指す。雌雄モザイク現象は、以下の場合に生じる：例えば、個体の幾つかの細胞が２つのＸ染色体を有し（ＸＸ）、その個体の他の細胞が１つのＸ染色体及び１つのＹ染色体を有する（ＸＹ）場合；個体の幾つかの細胞が１つのＸ染色体を有し（ＸＯ）、その個体の他の細胞が１つのＸ染色体及び１つのＹ染色体を有する（ＸＹ）場合；又は個体の幾つかの細胞が２つのＸ染色体及び１つのＹ染色体を有し（ＸＸＹ）、その個体の他の細胞が１つのＸ染色体及び１つのＹ染色体を有する（ＸＹ）場合。

用語「ハイブリダイゼーション」は、一般的に、核酸の相補鎖の対合により生じる反応を意味する。ＤＮＡは、通常は二本鎖であり、鎖は、分離しても、適切な条件下で再ハイブリダイズする。ハイブリッドは、ＤＮＡ−ＤＮＡ間、ＤＮＡ−ＲＮＡ間、又はＲＮＡ−ＲＮＡ間に形成され得る。ハイブリッドは、短鎖と、短鎖に相補的な領域を含む長鎖との間に形成され得る。また、不完全なハイブリッドが形成される場合があるが、それらは、より不完全になるほど、より不安定になる（また、より形成されにくくなる）。

用語「尤度」は、尤度を直接算出することにより得られる任意の値、又は尤度と相関するか、或いは他の方法で尤度を示すことができる任意の値を指す。
用語「遺伝子座」は、本明細書で使用される場合、ゲノムの既知位置の核酸領域を指す。

用語「母体試料」は、本明細書で使用される場合、胎児核酸及び母体核酸（例えば、ＤＮＡ）を両方とも含む妊娠女性（雌）から採取される任意の試料を指す。好ましくは、本発明で使用される母体試料は、比較的非侵襲的な手段、例えば静脈穿刺又は被験者から末梢試料を抽出するための他の標準的技法により得られる。

「マイクロアレイ」又は「アレイ」は、表面、好ましくは（ただし排他的ではない）平坦な又は実質的に平坦な表面を有する固相支持体を指し、この表面は核酸を含む部位のアレイを担持し、アレイの各部位はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのほぼ同一の又は同一のコピーを含み、空間的に画定されており、アレイの他のメンバーの部位と重複していない。すなわち、各部位は空間的に別個のものである。また、アレイ又はマイクロアレイは、ビーズ又はウェル等の表面を有する非平坦調査構造を含んでいてもよい。アレイのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、固体支持体に共有結合で結合されていてもよく、又は非共有結合で結合されていてもよい。従来のマイクロアレイ技術は、例えば、Ｓｃｈｅｎａ編、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（２０００年）に概説されている。「アレイ分析」、「アレイによる分析」、又は「マイクロアレイによる分析」は、例えば、マイクロアレイを使用する１つ又は複数の生体分子の特定の核酸の単離又は配列分析等の分析を指す。

「非多型性」又は「多型不可知性」とは、選択核酸領域の検出に関して使用される場合、核酸領域の検出を意味し、これは１つ以上の多型を含んでいてもよいが、その検出は、その領域内の特定の多型の検出には依存しない。したがって、選択核酸領域は多型を含んでいてもよいが、本発明の方法を使用した領域の検出は、その領域の特定の多型の有無ではなく、領域の出現に基づく。

用語「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ」は、本明細書で使用される場合、ワトソン−クリックタイプの塩基対合、塩基スタッキング、及びフーグスティーン又は逆フーグスティーンタイプの塩基対合等の通常パターンのモノマー間相互作用により一本鎖ポリヌクレオチドと特異的に結合可能な、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのアノマー形態、ペプチド核酸モノマー（ＰＮＡ）、及びロックドヌクレオチド酸モノマー（ＬＮＡ）等、又はそれらの組合せを含む、天然又は修飾核酸モノマーの直鎖オリゴマーを指す。通常、モノマーは、リン酸ジエステル結合又はその類似体により連結されて、サイズが、少数のモノマー単位、例えば８〜１２個から、数十個のモノマー単位、例えば１００〜２００個以上の範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。

本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ」は、別の鎖をテンプレートとして使用して、個々のヌクレオチドを共に連結し、鎖を長くする酵素を指す。２つの一般的なタイプのポリメラーゼ：ＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡを合成するＲＮＡポリメラーゼがある。これらの２つの種類の中には、テンプレートとして機能することができる核酸のタイプに応じて、及び形成される核酸のタイプに応じて、多数のサブタイプのポリメラーゼが存在する。

本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、過剰な非特異的ＤＮＡが存在する場合でさえ、特定の１片の標的ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで複製するための技法を指す。プライマーを標的ＤＮＡに加えると、プライマーは、ヌクレオチド及び典型的にはＴａｑポリメラーゼ等を使用して、標的ＤＮＡの複製を開始する。温度をサイクルさせることにより、標的ＤＮＡが、反復して変性及び複製される。他の無作為ＤＮＡと混合されている場合でさえ、標的ＤＮＡの単一コピーが増幅され、何十億個もの複製物を得ることができる。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、非常に少量のＤＮＡを検出及び測定し、特注のＤＮＡを生成することができる。幾つかの場合では、ＰＣＲの代わりに線形増幅法を使用してもよい。

用語「多型」は、本明細書で使用される場合、限定するものではないが、一塩基多型（ＳＮＰ）、メチル化の相違、及びショートタンデムリピート（ＳＴＲ）等を含む、その特定の遺伝子座を示すことができる遺伝子座の任意の遺伝子変化を指す。

一般的に、「プライマー」は、ポリメラーゼ連鎖反応の合成ステップ又はある配列決定反応で使用されるプライマー伸長技法等、例えばＤＮＡの伸長、ライゲーション、及び／又は合成を開始するために使用されるオリゴヌクレオチドである。プライマーは、特定の核酸領域を検出するための捕捉オリゴヌクレオチドに核酸領域の相補性を提供する手段として、ハイブリダイゼーション技法にも使用することもできる。

用語「研究ツール」は、本明細書で使用される場合、性質が学術的又は商業的である科学的調査に使用される本発明の任意の組成物又は方法を指し、これは薬学的な及び／又は生物学的な治療法の開発を含む。本発明の研究ツールは、治療用又は規制認可の対象になることが意図されていない。むしろ、本発明の研究ツールは、規制申請を支援するための情報をもたらす意図を持って実施される任意の活動を含む、そのような開発活動における研究及び支援を容易にするためのものである。

用語「選択核酸領域」は、本明細書で使用される場合、個々の染色体に対応する核酸領域を指す。選択核酸領域は、例えばハイブリダイゼーション及び／又は他の配列決定に基づく技術に基づいて、検出用の試料から直接単離及び濃縮してもよく、又は配列を検出する前に、試料をテンプレートとして使用して増幅してもよい。

用語「選択的増幅」及び「選択的に増幅する」等は、選択核酸領域の配列に対するオリゴのハイブリダイゼーションに、完全に又は部分的に依存する増幅手順を指す。ある選択的な増幅では、増幅に使用されるプライマーは、選択核酸領域に相補的である。他の選択的な増幅では、増幅に使用されるプライマーは、ユニバーサルプライマーであるが、増幅に使用される核酸の領域が目的の選択核酸領域に相補的である場合にのみ、産物をもたらす。

用語「配列決定する」及び「配列決定」等は、本明細書で使用される場合、一般的に、核酸のヌクレオチド塩基の順序を決定するために使用することができるありとあらゆる生化学的方法を指す。

用語「特異的に結合する」及び「特異的結合」等は、本明細書で使用される場合、結合パートナー（例えば、核酸プローブ又はプライマー、抗体等）について言及する場合、指定されたアッセイ条件下で統計的に有意な陽性シグナルの生成をもたらす。典型的には、相互作用は、不要な相互作用の結果として生成される任意のシグナル（バックグラウンド）の標準偏差の少なくとも２倍である検知可能なシグナルを連続的にもたらす。

用語「ユニバーサル」は、増幅手順を説明するために使用される場合、複数の増幅反応に単一のプライマー又は１セットのプライマーを使用することを指す。例えば、９６個の異なる標的配列の検出では、テンプレートは全て、同一のユニバーサルプライマー結合配列を共有していてもよく、単一セットのプライマーを使用して９６個の異なる配列を多重増幅することが可能になる。そのようなプライマーの使用は、複数の選択核酸配列を増幅するのに２つのプライマーしか必要としないという点で、多重化を非常に単純化する。用語「ユニバーサル」は、プライマー結合部位を説明するために使用される場合、ユニバーサルプライマーがハイブリダイズする部位である。また、ユニバーサルプライマー結合配列／プライマーの「セット」を使用してもよいことに注目すべきである。例えば、高度に多重化された反応では、単一のセットではなく、幾つかのセットのユニバーサル配列を使用することが有用であり得る。例えば、９６個の異なる核酸は、第１のセットのユニバーサルプライマー結合配列を有していてもよく、第２の９６個は、異なるセットのユニバーサルプライマー結合配列を有する等である。

本発明の基本
本発明は、Ｘ及びＹ染色体のコピー数変異体を特定するための改良方法を提供する。本発明の方法は、胎児の性別を決定するために、胎児のＸ染色体異数性、Ｙ染色体異数性、又は性染色体モザイク現象の確率を評価するために、又は母体試料の汚染の可能性を決定するために有用である。幾つかの態様では、本発明の方法は、母体のＸ染色体異数性又はモザイク現象の検出にも有用である。

本発明のアッセイ法は、Ｘ染色体、及びＹ染色体、及び１つ又は複数の参照非性染色体（常染色体）に由来する選択核酸領域を選択的に濃縮することを含む。本発明の特徴的な利点は、限定するものではないが、ハイブリダイゼーション技法、デジタルＰＣＲ、及び好ましくはハイスループット配列決定技法を含む様々な検出技法及び定量技法を使用して、選択核酸領域を更に分析することができるということである。プライマーは、Ｘ及びＹ染色体に加えて任意の染色体の任意の数の選択核酸領域に対して設計することができる。選択核酸領域の特定及び定量前の増幅は必ずしも必要ではないが、検出前に限定的な増幅を行うことが好ましい。

本発明は、母体血液等の母体試料でコピー数変異を直接検出するために最近使用されている大規模並列ショットガン配列決定（例えば、ランダム配列決定）又はランダムデジタルＰＣＲの使用等の、よりランダムな技法の改良である。前述の手法は、試料中のＤＮＡ断片の全て又は統計的に有意な集団を配列決定し、その後、断片を、それらの適切な染色体にマッピング又はその他の方法で関連付け若しくはアラインメントすることに依存する。その後、特定された断片を互いに、又は幾つかの他の参照（例えば、既知の正倍数性染色体対を有する試料）と比較して、特定の染色体のコピー数変異を決定する。ランダム又はショットガン配列決定法は、目的染色体領域に関して生成されるデータが、生成されるデータの少数を構成するに過ぎないため、本発明と比較して本質的に非効率的である。

試料中のＤＮＡの非常に広範なサンプリングに依存する技法は、分析されるＤＮＡの幅広い網羅範囲を提供するが、実際は、試料内に含まれているＤＮＡを１×以下でサンプリングしている（つまり、サブサンプリング）。対照的に、本方法で使用される選択的な増幅及び／又は濃縮技法（ハイブリダイゼーション等）は、選択核酸領域のみの読み深度（ｄｅｐｔｈ ｏｆ ｃｏｖｅｒａｇｅ）を提供し、それ自体、選択核酸領域の好ましくは２×以上の平均配列読み深度、より好ましくは１００×以上の、２００×以上の、２５０×以上の、５００×以上の、７５０×以上の配列読み深度、又は更に好ましくは１０００×以上の配列読み深度を有する選択核酸領域の「スーパーサンプリング」を提供する。

したがって、本発明のアッセイでは、定量のために分析した実質的に大多数の配列が、Ｘ及びＹ染色体並びに１つ又は複数の常染色体の１つ又は複数の選択核酸領域の存在に関する情報を提供する。本発明の方法は、目的染色体に由来せず、目的染色体の相対量に関する情報を提供しない多数の配列の分析を必要としない。

性染色体の検出及び定量
本発明は、母体試料中のＸ及びＹ配列の頻度を決定するための方法を提供する。それらの頻度は、例えば、胎児の性別を決定するために、及び／又はＸ染色体の異数性、Ｙ染色体の異数性、及び／又は性染色体モザイク現象を特定するために使用することができる。試料は、母体血液試料（つまり全血、血清、又は血漿）等の、母体ＤＮＡ及び胎児ＤＮＡを両方とも含む母体試料である。本方法では、試料に存在する胎児ＤＮＡの割合を考慮して、Ｘ及びＹ染色体配列の存在若しくは非存在及び／又は相対量若しくは頻度を決定するために使用されるＸ及びＹ染色体並びに１つ又は複数の常染色体に対応する、母体試料中の１つの領域又は好ましくは幾つかから多数の選択核酸領域が濃縮及び／又は単離及び増幅される。上記で詳細に記載されているように、本発明の方法は、好ましくは、試料中の選択核酸領域の含有量を高めるために、選択的な増幅、ライゲーション、又は濃縮ステップ（例えば、選択核酸領域に特異的にハイブリダイズする１つ又は複数の核酸を使用して）の１つ以上を使用する。選択的な増幅、ライゲーション、及び／又は濃縮ステップは、典型的には、更なる単離、増幅、及び分析のために、選択核酸領域のコピーを操作する機序を含む。この選択的手法は、他の技法、例えば大規模並列ショットガン配列決定に用いられるランダム増幅手法とは、そのような技術が一般的にゲノムの全て又はかなりの部分をランダム増幅することを含むため、全く対照的である。

ある態様では、本発明の方法は、母体モザイク現象を含む、母体異数性を特定することができる。母体Ｘ及びＹの染色体物質の頻度は、母体試料中の胎児ＤＮＡを考慮して分析されなければならない。そのような母体異数性の確定リスク特性は、特定の異数性に応じて様々であり得る。例えば、母体がＸＸ／ＸＯモザイクである場合、決定される確率は、母体モザイク現象のレベル、影響を受ける組織、並びに母体試料中の胎児割合に依存することになる。

上記の例は、本明細書に記載の方法により、そのような低い割合で存在する特定の核酸を確実に検出しようとする場合、追加染色体の測定における変動は、追加染色体の増加割合よりも著しく小さくなければならないことを示す。

図１は、本発明による１つの方法１００の単純化されたフローチャートである。第１のステップでは、母体試料が取得される（１０１）。母体試料は、母体核酸及び胎児核酸を両方とも含んでいる。母体試料は、胎児核酸及び母体核酸（例えば、ＤＮＡ）を両方とも含む妊娠女性から採取される任意の試料であってよい。好ましくは、本発明で使用される母体試料は細胞を含んでおらず、静脈穿刺又は被験者から末梢試料を抽出するための他の標準的技法等の比較的非侵襲的手段により取得される。

次のステップ１０３では、Ｘ染色体、及びＹ染色体、及び少なくとも１つの常染色体（及び好ましくは複数の常染色体）の選択核酸領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを、母体試料中の選択核酸にアニーリングさせる。ステップ１０５では、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、選択核酸領域を選択的に増幅し、選択核酸領域のコピーを生成する。下記で詳細に記載されるように、選択核酸領域は、選択的増幅ステップに供されるが、選択的増幅ステップ前又は好ましくは選択的増幅ステップ後のいずれかに、ユニバーサル増幅ステップにも供される場合がある。加えて、下記に記載のように、１つ又は複数の濃縮ステップを実施してもよい。また、増幅の代替法として、選択的ハイブリダイゼーション等による濃縮ステップを実施してもよく、それにより、選択核酸領域は、試料中の他の核酸から分離される。

その後、ステップ１０７では、増幅された又は複製された選択核酸領域を配列決定及び定量する。好ましい実施形態では、下記に記載のように、ハイスループット配列決定技法又は次世代配列決定技法が使用されるが、任意選択で他の技法を使用してもよい。ハイスループット配列決定は、配列決定及び定量ステップの大規模並列化を可能にする。

ステップ１０９では、母体試料中の胎児ＤＮＡ割合が決定される。次に、ステップ１１１では、Ｘ染色体及びＹ染色体の選択核酸領域の頻度が、ステップ１０９で決定された胎児ＤＮＡ割合を考慮して決定される。本明細書に詳細に記載されているように、ステップ１１３では、胎児割合を考慮したＸ染色体及びＹ染色体の選択核酸領域の頻度は、女性胎児を妊娠している女性に由来する母体試料のＸ染色体異数性、Ｘ染色体モザイク現象、又はＸ染色体汚染から生じるもの等のＸ染色体頻度異常、及び／又はＹ染色体異数性、Ｙ染色体モザイク現象、又はＹ染色体汚染から生じるもの等のＹ染色体頻度異常のリスクの評価を可能にする。

したがって、一般的に、Ｘ染色体の複数の遺伝子座に対応する選択核酸領域を検出及び合計して、母体試料中のＸ染色体の相対頻度が決定される。１つ又は複数の常染色体の複数の遺伝子座に対応する選択核酸領域を検出及び合計して、母体試料中の１つ又は複数の更なる染色体の相対頻度を決定し、それにより胎児割合の計算が可能になる。胎児割合が決定されたら、Ｘ染色体異常が存在するか否かを評価するために、胎児割合を考慮してＸ染色体の頻度を検討する。同様に、Ｙ染色体の複数の遺伝子座に対応する選択核酸領域を検出及び合計して、母体試料中のＹ染色体の相対頻度を決定し、Ｙ染色体異常が存在するか否かを評価するために、胎児割合を考慮してＹ染色体の頻度を検討する。

本発明の方法では、少なくとも３つの染色体：Ｘ染色体、Ｙ染色体、及び少なくとも１つの常染色体の選択遺伝子座を表す複数の選択核酸領域が分析され、各選択核酸領域の相対頻度が分析され、独立して定量され、試料中の各選択核酸領域の相対頻度が決定される。試料中の選択核酸領域の合計は、試料中の胎児ＤＮＡ割合を決定するために使用され、染色体異数性又は他の染色体異常がＸ及び／又はＹ染色体配列に関して存在するか否かを統計的に決定するために比較される。

別の態様では、各染色体の選択核酸領域のサブセットが分析され、染色体異常又は染色体頻度異常が存在するか否かが決定される。特定の染色体について選択核酸領域頻度を合計し、選択核酸領域の合計を使用して異常を決定することができる。本発明のこの態様では、各染色体の個々の選択核酸領域の頻度が合計され、次にＸ染色体の選択核酸領域の合計が１つ又は複数の非性染色体と比較され、Ｙ染色体の選択核酸領域の合計が１つ又は複数の常染色体と比較される。無作為だが十分な数の選択核酸領域のサブセットを選択して、染色体異常が存在するか否かの決定をもたらす統計的に有意な結果を得ることができる。選択核酸領域の異なるサブセットの複合分析を母体試料で実施して、より高い統計能力を得ることができる。例えば、染色体Ｙに１００個の選択核酸領域があり、２番染色体に１００個の選択核酸領域がある場合、上記各染色体の１００個未満の領域を評価する一連の分析を実施してもよい。例えば、３０個未満の領域、１６個以下の領域、１０個未満の領域、又は８個の領域等の５０個未満の領域を評価する一連の分析を実施してもよい。別の態様では、試料間の変動が少ないことが知られている各染色体にある特定の選択核酸領域を選択してもよいし、あるいは、例えば、試料内での頻度が非常に高いか又は非常に低い選択核酸領域のデータを無視することにより、染色体頻度の決定に使用されるデータを限定してもよい。

更に別の態様では、選択核酸領域の頻度の比率は、遺伝学的に正倍数性である被験者、つまりＸ染色体異常又はＹ染色体異常のない被験者の統計的に有意な集団で決定された参照平均比率と比較される。

母体試料中の胎児ＤＮＡ割合を考慮してＸ及びＹ染色体の頻度を決定する方法は、胎児常染色体異数性のリスクを評価する技法、又は胎児の多型配列を検出する技法等の、他の非侵襲性出生前診断技法と組み合わせることができることが、当業者には理解されよう。

アッセイ法
本発明では、固定オリゴヌクレオチドのみで構成されるオリゴヌクレオチドのセットが使用されるアッセイ、又は固定オリゴヌクレオチド及び１つ又は複数の架橋オリゴヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドのセットが使用されるアッセイを含む、幾つかの異なるアッセイ法を使用することができる。加えて、セット中のオリゴヌクレオチドは、それらがライゲーションされ得る場合、互いに直接隣接して選択核酸配列にハイブリダイズしてもよく、又はセット中のオリゴヌクレオチドは、互いに直接隣接して選択核酸配列にハイブリダイズしなくともよい。したがって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰが使用されるプライマー伸長反応は、セット中のオリゴヌクレオチドのライゲーション前に使用される。図２〜７には、幾つかの例示的なアッセイ法が示されている。

図２には、２つの異なる選択核酸領域が単一のタンデム反応アッセイで検出される１つの例示的な方法実施形態が示されている。そのような方法実施形態、アッセイ系、及び関連実施形態は、以下の文献に詳細に記載されている：例えば、米国特許出願第１３／０１３，７３２号明細書、２０１１年１月２５日出願；第１３／２４５，１３３号明細書、２０１１年９月２６日出願；第１３／２０５，５７０号明細書、２０１１年８月８日出願；第１３／２９３，４１９号明細書、２０１１年１１月１０日出願；第１３／２０５，４０９号明細書、２０１１年８月８日出願；第１３／２０５，６０３号明細書、２０１１年８月８日出願；第１３／４０７、９７８号明細書、２０１２年２月２９日出願；第１３／２７４，３０９号明細書、２０１１年１０月１５日出願；第１３／３１６，１５４号明細書、２０１１年１２月９日に出願；第１３／３３８，９６３号明細書、２０１１年１２月２８日に出願。これらの文献は全て、全体が参照により本明細書に組み込まれる。２つの異なる選択核酸領域２１５、２３１に特異的にハイブリダイズする２セットの固定配列オリゴヌクレオチド（２０１及び２０３、２２３及び２２５）を、遺伝子試料に導入して（２０２）、対応する選択核酸領域にハイブリダイズさせる（２０４）。固定配列オリゴヌクレオチドの各セットは、配列特異的領域２０５、２２７、ユニバーサルプライマー領域２０９、及びインデックス領域２２１、２３５を有するオリゴヌクレオチド２０１、２２３を含む。セット中の他の固定配列オリゴヌクレオチドは、配列特異的領域２０７、２２９及びユニバーサルプライマー領域２１１を含む。固定配列オリゴヌクレオチドは、一般的に、約３０〜２００ヌクレオチド長、又は約３０〜１５０ヌクレオチド長、又は約３５〜１２０ヌクレオチド長、又は約４０〜７０ヌクレオチド長の範囲のサイズである。架橋オリゴヌクレオチドが使用される場合、架橋オリゴヌクレオチドは、一般的に、約４〜約８０ヌクレオチド長、又は約４〜約６０ヌクレオチド長、又は約５〜約５０ヌクレオチド長、又は約７〜約４０ヌクレオチド長、又は約１０〜約４０ヌクレオチド長、又は約１２〜約３０ヌクレオチド長、又は約１５〜約２５ヌクレオチド長の範囲のサイズである。

ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドは、試料の残りから分離されることが好ましい（ステップは非表示）。架橋オリゴ２１３、２３３を、固定配列オリゴヌクレオチド／核酸領域のハイブリダイズ対に導入し、これらの領域にハイブリダイズさせる（２０６）。図２には２つの異なる架橋オリゴヌクレオチドとして示されているが、実際は、同じ架橋オリゴヌクレオチドが、両ハイブリダイゼーション事象に好適であってもよく（配列が同じ又は実質的に類似していると仮定して）、又はそれらは、縮重配列オリゴヌクレオチドのプールに由来する２つのオリゴヌクレオチドであってもよい。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて（２０８）、各目的選択核酸領域にわたって伸長する相補的なひと続きの核酸を生成する。この特定の実施形態では、２つの固定配列オリゴヌクレオチド及び架橋オリゴヌクレオチドを使用して各選択核酸領域を増幅する方法が例示されているが、互いに直接隣接してハイブリダイズする２つの固定配列オリゴヌクレオチドのみが使用される方法を使用してもよく、又は互いに直接隣接してハイブリダイズしない２つの固定配列オリゴヌクレオチドのみが使用され、「ギャップ」がポリメラーゼ及びｄＮＴＰを使用して埋められる方法を使用してもよい。

ライゲーションの後、ユニバーサルプライマー２１７、２１９を導入して、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドを増幅させ（２１０）、目的選択核酸領域の配列を含む増幅産物２３７、２３９を生成する（２１２）。試料中の選択核酸領域の存在及び量に関する情報を提供するために、これらの増幅産物２３７、２３９を、単離（任意選択）、検出（つまり、配列決定）、及び定量する。

数多くの増幅方法を使用して、本発明の方法で分析される選択核酸領域を選択的に増幅し、初期試料中の選択核酸領域の相対量の保存を可能にする様式で選択核酸領域のコピー数を増加させることができる。増幅及び分析の全ての組合せが本明細書に詳細に記載されているわけではないが、本明細書と矛盾しない、選択核酸領域を分析するための様々な同様の増幅法及び／又は分析法を使用することは、十分に当業者の技術範囲内にあり、そのような変法は、当業者であれば本開示に照らして自明であるはずである。

本発明に有用な増幅法には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び第４，６８３，２０２号明細書、及びＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．、１９９２年に記載）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻：５６０頁（１９８９年）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：１０７７頁（１９８８年））；鎖置換増幅（ＳＤＡ、ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（米国特許第５，２７０，１８４号明細書及び第５，４２２，２５２号明細書）；転写媒介性増幅（ＴＭＡ、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（米国特許第５，３９９，４９１号明細書）；連鎖線形増幅（ＬＬＡ、ｌｉｎｋｅｄ ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（米国特許第６，０２７，９２３号明細書）、自己持続的配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８７巻：１８７４頁（１９９０年）及び国際公開第９０／０６９９５号）；標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号明細書）；コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ、ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（米国特許第４，４３７，９７５号明細書）；任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ、ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（米国特許第５、４１３，９０９号明細書及び第５，８６１，２４５号明細書）；及び核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ、ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（米国特許第５，４０９，８１８号明細書、第５，５５４，５１７号明細書、及び第６，０６３，６０３号明細書を参照。これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。使用することができる他の増幅方法には、以下のものが含まれる：Ｑｂｅｔａレプリカーゼ、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号に記載；ＳＤＡ等の等温増幅法、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０巻（７号）：１６９１〜６頁（１９９２年）に記載；及びローリングサークル増幅、米国特許第５，６４８，２４５号明細書に記載。使用することができる更に他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号明細書、第５，４９４，８１０号明細書、第４，９８８，６１７号明細書、及び米国特許出願第０９／８５４，３１７号明細書、及び米国特許出願公開第２００３０１４３５９９号明細書に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。好ましい態様では、ＤＮＡは、多重化遺伝子座特異的ＰＣＲにより増幅される。幾つかの態様では、ＤＮＡは、アダプターライゲーション及び単一プライマーＰＣＲを使用して増幅される。他の使用可能な増幅法には、バランス調整したＰＣＲ（Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：９３６〜３９頁（２００２年））及び自己持続的配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８７巻：１８７４頁（１９９０年））が含まれる。当業者であれば、そのような方法に基づいて、目的選択核酸領域に対する任意の好適な５’及び３’領域のプライマーを容易に設計することができる。そのようなプライマーは、その配列に目的選択核酸領域を含む限り、任意の長さのＤＮＡの増幅に使用することができる。

選択核酸領域の長さは、選択核酸領域を互いに区別するための十分な配列情報を提供するのに十分な長さを有する。一般的に、選択核酸領域は、少なくとも約１６ヌクレオチド長であり、より典型的には、選択核酸領域は、少なくとも約２０ヌクレオチド長である。本発明の好ましい態様では、選択核酸領域は、少なくとも約３０ヌクレオチド長である。本発明のより好ましい態様では、選択核酸領域は、少なくとも約３２、４０、４５、５０、又は６０ヌクレオチド長である。本発明の他の態様では、選択核酸領域は、長さが約１００、１５０、又は最大２００であってもよい。

幾つかの態様において、選択的増幅プロセスでは、選択核酸領域に相補的な核酸を含むプライマー対を用いた１回又は少数回の増幅（つまり、配列特異的増幅プロセス）が使用される。他の態様では、選択的増幅は、初期線形増幅ステップ（これも配列特異的増幅プロセス）を含む。線形増幅法は、ＤＮＡの開始量が制限されている場合、特に有用であり得る。線形増幅は、ＤＮＡ分子の量を、元のＤＮＡ含有量を示す様式で増加させ、それにより、選択核酸領域の正確な定量が必要な本発明等の場合のサンプリングエラーの低減が支援される。

したがって、好ましい態様では、限定的サイクル数の配列特異的増幅が、無細胞ＤＮＡを含む開始母体試料に対して実施される。サイクル数は、一般的に、典型的なＰＣＲ増幅に使用されるサイクル数よりも少なく、例えば、５〜３０サイクル又はそれ以下である。

オリゴヌクレオチドのセット中のオリゴヌクレオチドは、配列特異的な様式で試料にハイブリダイズして、選択核酸領域を増幅するように設計される。選択的増幅用のプライマーは、好ましくは、１）目的染色体の選択核酸領域を効率的に増幅し、２）異なる母体試料中の母体供給源及び／又は胎児供給源からの発現が予測可能な範囲であり、かつ３）選択核酸領域に特異的である、つまり非選択核酸領域を増幅しないように設計される。プライマー又はプローブは、更なる単離又は分析のために増幅産物を精製することができるか又は固体基材（例えば、ビーズ又はアレイ）に結合させることができるように、５’末端を末端標識で（例えば、ビオチンで）、或いはプライマー又はプローブに沿って他所を修飾してもよい。好ましい態様では、プライマーは、例えば、複数のＤＮＡコピーが、異なる選択核酸領域及び好ましくは選択核酸領域全てから単一反応で産生されるように、多数の選択核酸領域の増幅を可能にする多重化反応で使用するのに適合した融解温度を有するように作製されている。その後、選択的増幅に由来する増幅産物を、標準的ＰＣＲ法又は線形増幅で更に増幅してもよい。

無細胞ＤＮＡを、例えば、妊娠女性に由来する全血、血漿、又は血清から単離し、目的染色体に対応する所定数の選択核酸領域を増幅するように作製されているプライマーと共にインキュベートしてもよい。好ましくは、Ｘ染色体特異的配列の初期増幅に使用されるプライマー対の数（したがって、Ｘ染色体の選択核酸領域の数）は８対以上、例えば１６対以上、３２対以上、４８対以上、又は９６対以上であり得る。同様に、Ｙ染色体特異的配列の初期増幅に使用されるプライマー対の数（したがって、Ｙ染色体の選択核酸領域の数）及び１つ又は複数の常染色体参照染色体の各々の初期増幅に使用されるプライマー対の数は８対以上、例えば１６対以上、３２対以上、４８対以上、又は９６対以上であり得る。プライマー対の各々は、単一の選択核酸領域に対応し、プライマー対には、任意選択で、識別用の（例えば、上記に記載のインデックスを使用することにより）及び／又は分離用の（例えば、捕捉のために使用される核酸配列又は化学部分を含む）タグが付加されている。限定数の、好ましくは１０サイクル以下の増幅サイクルが実施される。その後、増幅産物（増幅された選択核酸領域）は、任意選択で、当技術分野で公知の方法により単離される。例えば、プライマーがビオチン分子に結合されている場合、増幅産物は、固体基材上のアビジン又はストレプトアビジンと結合させることにより単離することができる。その後、増幅産物を、他のプライマー（例えば、ユニバーサルプライマー）及び／又は配列決定及びハイブリダイゼーション等の検出技法を用いた更なる増幅等の、更なる生化学的プロセスに供してもよい。

ある系では、正規化（下記に記載のような）を使用して、選択核酸領域の増幅に由来する産物が試料の核酸含有量を正確に示すことができるため、増幅の効率は選択核酸領域間で及びサイクル間で変動してもよい。本発明の方法の１つの実施では、増幅産物の相対頻度に関するデータを利用し、試料内の選択核酸領域における変動、及び／又は異なる試料（特に、異なる試料中の同じ選択核酸領域に由来する）の選択核酸領域間の変動を含む、選択核酸領域における変動を決定して、データを正規化することができる。

選択的増幅の代わりとして、ハイブリダイゼーション技法（例えば、捕捉ハイブリダイゼーション又はアレイに対するハイブリダイゼーション）により、選択核酸領域を濃縮し、その後、任意選択で１回又は複数回の増幅を行ってもよい。任意選択で、ハイブリダイズされた又は捕捉された選択核酸領域は、増幅及び配列決定の前に解放される（例えば、変性により）。選択核酸領域は、分析に使用される選択核酸領域の選択的濃縮を可能にする種々の方法を使用して、母体試料から単離することができる。単離は、分析に使用されない母体試料中のＤＮＡを除去すること、及び／又は初期濃縮又は増幅ステップで使用されたあらゆる過剰オリゴヌクレオチドを除去することであってもよい。例えば、選択核酸領域は、ハイブリダイゼーション技法（濃縮）を使用して、母体試料から単離することができ、例えば、ビーズ又はアレイ等の固体基材上の相補的オリゴに選択核酸領域を結合させて捕捉し、その後、未結合核酸を試料から除去することができる。別の例では、プレサークル型プローブ技法が、選択的増幅に使用される（例えば、Ｂａｒａｎｙら、米国特許第６，８５８，４１２号明細書及び第７，５５６，９２４号明細書、及び図７）。環状化された核酸産物は、選択的分解対象の線形核酸から単離することができる。他の有用な単離方法は、当業者であれば、本明細書を読むと明白であろう。

選択核酸領域の選択的に増幅されたコピーは、任意選択で、選択的増幅（又は濃縮ステップ）後、検出ステップ（つまり、配列決定又は他の検出技術）前又は検出ステップ中のいずれかにおいて、ユニバーサル増幅ステップで増幅してもよい。ユニバーサル増幅を実施する場合、選択的増幅ステップで複製された選択核酸領域に付加されたユニバーサルプライマー配列を使用して、選択核酸領域を単一のユニバーサル増幅反応で更に増幅する。記載されているように、ユニバーサルプライマー配列は、実施される場合、選択核酸領域の増幅されたコピーに、ユニバーサルプライミング配列が組み込まれるように、ユニバーサルプライマー配列を有するプライマーを選択的増幅ステップに使用することにより、選択的増幅プロセス中に、複製選択核酸領域に付加することができる。別法として、母体試料からの選択核酸領域の増幅又は濃縮及び実施される場合は単離後に、ユニバーサル増幅配列を含むアダプターを、選択核酸領域の末端にライゲーションすることができる。

バイアス及びばらつきが、ＤＮＡ増幅中に試料に導入される場合がある。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中に起こることが知られている。増幅反応が多重化される場合、所与の選択核酸領域用プライマーの各セットは、プライマー及びテンプレートＤＮＡの塩基組成、緩衝液条件、又は他の条件に基づいて挙動が異なる場合があるため、選択核酸領域が異なる速度又は効率で増幅する可能性がある。多重化アッセイ系のユニバーサルＤＮＡ増幅では、導入されるバイアス及びばらつきは、一般的には少ない。増幅バイアスを最小限に抑える別の技法は、異なる選択核酸領域毎にプライマー濃度を変えて、選択的増幅ステップでの配列特異的増幅サイクルの数を制限することを含む。増幅ステップでは、例えば、実験条件によりバイアス及びばらつきが不用意に導入されないことを保証するために、同じ又は異なる条件（例えば、ポリメラーゼ及び緩衝液等）を使用してもよい。

好ましい態様では、少数のサイクル（例えば、１〜１０回、好ましくは、３〜５回）の選択的増幅又は核酸濃縮を実施し、その後、ユニバーサルプライマーを使用してユニバーサル増幅を行う。ユニバーサルプライマーが使用される増幅サイクルの数は様々であろう。しかし、好ましくは、少なくとも５サイクル、より好ましくは少なくとも１０サイクル、更により好ましくは２０サイクル以上であろう。１回又は少数の選択的増幅サイクル後にユニバーサル増幅に移行することにより、ある選択核酸領域が他のものよりも速い速度で増幅するバイアスが低減される。

任意選択で、本方法は、選択的増幅とユニバーサル増幅との間に、選択的増幅で特異的に増幅されないあらゆる過剰核酸を除去するステップを含む。選択的増幅に由来する産物は、その全体をユニバーサル増幅に使用してもよく、又はそのアリコートを使用してもよい。

本方法で使用されるプライマーのユニバーサル領域は、多数の核酸を１つの容器中の１つの反応で同時分析する従来の多重化法と適合するように設計される。そのような「ユニバーサル」プライミング法は、母体試料中に存在する核酸領域の量の効率的で大規模な分析を可能にし、そのような母体試料内の異数性を決定するための核酸領域の存在の包括的な定量を可能にする。

ユニバーサル増幅法の例には、限定するものではないが、Ｏｌｉｐｈａｎｔらの米国特許第７，５８２，４２０号明細書に記載のもの等の、多様な試料を同時に増幅及び／又は遺伝子型決定するために使用される多重化法が含まれる。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

ある態様では、本発明のアッセイ系は、選択的増幅技法及びユニバーサル増幅技法の以下の組合せのうちの１つを使用する：（１）リガーゼ検出反応（「ＬＤＲ」）とポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）との組合せ；（２）一次ＰＣＲと二次ＰＣＲとＬＤＲの組合せ；及び（３）一次ＰＣＲと二次ＰＣＲの組合せ。これらの組合せの各々は、最適検出に特に有用である。しかしながら、これらの組合せの各々は、アッセイ系の初期相に由来するオリゴヌクレオチドプライマーが、アッセイ系の後期相で使用される配列を含む多重化検出を使用する。

Ｂａｒａｎｙらの米国特許第６，８５２，４８７号明細書、第６，７９７，４７０号明細書、第６，５７６，４５３号明細書、第６，５３４，２９３号明細書、第６，５０６，５９４号明細書、第６，３１２，８９２号明細書、第６，２６８，１４８号明細書、第６，０５４，５６４号明細書、第６，０２７，８８９号明細書、第５，８３０，７１１号明細書、第５，４９４，８１０号明細書には、様々な核酸試料中のヌクレオチドの特定の配列を検出するためのリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アッセイの使用が記載されている。Ｂａｒａｎｙらの米国特許第７，８０７，４３１号明細書、第７，４５５，９６５号明細書、第７，４２９，４５３号明細書、第７，３６４，８５８号明細書、第７，３５８，０４８号明細書、第７，３３２，２８５号明細書、第７，３２０，８６５号明細書、第７，３１２，０３９号明細書、第７，２４４，８３１号明細書、第７，１９８，８９４号明細書、第７，１６６，４３４号明細書、第７，０９７，９８０号明細書、第７，０８３，９１７号明細書、第７，０１４，９９４号明細書、第６，９４９，３７０号明細書、第６，８５２，４８７号明細書、第６，７９７，４７０号明細書、第６，５７６，４５３号明細書、第６，５３４，２９３号明細書、第６，５０６，５９４号明細書、第６，３１２，８９２号明細書、及び第６，２６８，１４８号明細書には、核酸を検出するための、ＬＤＲ及びＰＣＲの組合せの使用が記載されている。Ｂａｒａｎｙらの米国特許第７，５５６，９２４号明細書及び第６，８５８，４１２号明細書には、核酸を検出するための、ＬＤＲ及びＰＣＲと組み合わせたプレサークルプローブ（「錠型（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブ」又は「多反転（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）プローブ」とも呼ばれる）の使用が記載されている。Ｂａｒａｎｙらの米国特許第７，８０７，４３１号明細書、第７，７０９，２０１号明細書、及び第７，１９８，８１４号明細書には、核酸配列を検出するための、エンドヌクレアーゼ切断及びライゲーション反応の組合せの使用が記載されている。Ｗｉｌｌｉｓらの米国特許第７，７００，３２３号明細書及び第６，８５８，４１２号明細書には、多重化核酸増幅、検出、及び遺伝子型決定におけるプレサークルプローブの使用が記載されている。Ｒｏｎａｇｈｉらの米国特許第７，６２２，２８１号明細書には、固有のプライマー及びバーコードを含むアダプターを使用して核酸を標識及び増幅するための増幅技法が記載されている。選択核酸領域を増幅及び／又は検出するのに有用な例示的なプロセスには、限定するものではないが、本明細書に記載の方法が含まれ、それらの各々は、本発明の方法で使用することができる種々の要素を教示するために、それらの全体が参照により組み込まれる。

種々の増幅技法に加えて、数多くの配列決定法が、本発明の方法と適合する。好ましくは、そのような方法には、「次世代」配列決定法が含まれる。例示的な配列決定法には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：ハイブリダイゼーションに基づく方法、例えばＤｒｍａｎａｃの米国特許第６，８６４，０５２号明細書、第６，３０９，８２４号明細書、第６，４０１，２６７号明細書、及び米国特許出願公開第２００５／０１９１６５６号明細書に記載のもの等、これらの文献は全て参照により組み込まれる；合成法による配列決定、例えば、Ｎｙｒｅｎらの米国特許第７，６４８，８２４号明細書、第７，４５９，３１１号明細書、及び第６，２１０，８９１番号明細書；Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎの米国特許第７，２３２，６５６号明細書及び第６，８３３，２４６号明細書；Ｑｕａｋｅの米国特許第６，９１１，３４５号明細書；Ｌｉら、ＰＮＡＳ、１００巻：４１４〜１９頁（２００３年）；ピロリン酸配列決定、Ｒｏｎａｇｈｉら米国特許第７，６４８，８２４号明細書、第７，４５９，３１１号明細書、第６，８２８，１００号明細書、及び第６，２１０，８９１号明細書に記載；及びライゲーションに基づく配列決定法、例えば、Ｄｒｍａｎａｃらの米国特許出願公開第２０１０／０１０５０５２号明細書、及びＣｈｕｒｃｈらの米国特許出願公開第２００７／０２０７４８２号明細書及び第２００９／００１８０２４号明細書。

配列決定は、以下のもの等の、高次多重化で並列配列決定が可能な任意の好適な配列決定装置を使用して実施することができる：ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、及び４５４プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、リアルタイムＳＭＲＴ（登録商標）技術（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、及び好適なナノポア及び／又はナノチャネル配列決定装置等。

別法として、選択核酸領域は、ハイブリダイゼーション技法を使用して選択及び／又は特定することができる。検出用のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実施するための方法は、当技術分野で十分に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイ手順及び条件は、用途に応じて様々であり、以下の文献に引用されているものを含む、既知の一般的な結合方法に従って選択されることになる：Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア、１９８７年）；並びにＹｏｕｎｇ及びＤａｖｉｓ、ＰＮＡＳ、８０巻：１１９４頁（１９８３年）。反復及び制御されたハイブリダイゼーション反応を実施するための方法及び装置は、例えば、米国特許第５，８７１，９２８号明細書、第５，８７４，２１９号明細書、第６，０４５，９９６号明細書、第６，３８６，７４９号明細書、及び第６，３９１，６２３号明細書に記載されている。

また、本発明は、ある好ましい態様では、リガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検出を企図する。以下の文献を参照されたい：米国特許第５，１４３，８５４号明細書、第５，５７８，８３２号明細書、第５，６３１，７３４号明細書、第５，８３４，７５８号明細書、第５，９３６，３２４号明細書、第５，９８１，９５６号明細書、第６，０２５，６０１号明細書、第６，１４１，０９６号明細書、第６，１８５，０３０号明細書、第６，２０１，６３９号明細書、第６，２１８，８０３号明細書、及び第６，２２５，６２５号明細書、米国特許出願第６０／３６４，７３１号明細書、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（国際公開第９９／４７９６４号として公開）。

シグナルを検出するための及び強度データを処理するための方法及び装置は、以下の文献に開示されている：例えば、米国特許第５，１４３，８５４号明細書、第５，５４７，８３９号明細書、第５，５７８，８３２号明細書、第５，６３１，７３４号明細書、第５，８００，９９２号明細書、第５，８３４，７５８号明細書、第５，８５６，０９２号明細書、第５，９０２，７２３号明細書、第５，９３６，３２４号明細書、第５，９８１，９５６号明細書、第６，０２５，６０１号明細書、第６，０９０，５５５号明細書、第６，１４１，０９６号明細書、第６，１８５，０３０号明細書、第６，２０１，６３９号明細書、第６，２１８，８０３号明細書、及び第６，２２５，６２５号明細書、米国特許出願第６０／３６４，７３１号明細書、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（国際公開第９９／４７９６４号として公開）。

図３では、実質的に同じ配列特異的領域３０５、３０７を含むが、異なるインデックス３２１、３２３を含む、２つのセットの固定配列オリゴヌクレオチドが使用されている。ライゲーション反応は、同じ遺伝子試料３００に由来する材料を用いるが、別々のチューブで、異なる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセットを用いて実施する。各ライゲーション反応において、選択核酸領域中の２つの考え得るＳＮＰ３１３、３３３に対応する架橋オリゴヌクレオチド３１３、３３３を使用して、選択核酸領域を検出する。ＳＮＰを示す２つの対立遺伝子インデックス３２１、３２３を使用して増幅産物を特定することができるため、目的核酸及びＳＮＰの実際の配列の配列決定は必ずしも必要とされないが、これらの配列を更に決定して、対立遺伝子を特定及び／又は対立遺伝子の確認を提供してもよい。固定配列オリゴヌクレオチドの各々は、選択核酸領域に相補的な領域３０５、３０７、及び、初期選択及び／又は単離後に、異なる選択核酸領域を増幅するために使用されるユニバーサルプライマー配列３０９、３１１を含む。ユニバーサルプライマー配列は、固定配列オリゴヌクレオチド３０１、３０３、及び３２３の末端に位置してインデックス及び目的の核酸に相補的な領域に隣接し、したがって、増幅産物中の核酸特異的配列及び対立遺伝子インデックスは保存される。固定配列オリゴヌクレオチド３０１、３０３、３２３を、ステップ３０２で、遺伝子試料３００の一部に導入して、選択核酸領域３１５又は３２５にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドは、遺伝子試料の残りから分離することが好ましい（非表示）。

Ａ／Ｔ ＳＮＰ３１３又はＧ／Ｃ ＳＮＰ３３３に対応する架橋オリゴを、ステップ３０４で導入し、固定配列オリゴヌクレオチドの第１の核酸相補的領域３０５及び固定配列オリゴヌクレオチドの第２の核酸相補的領域３０７間の選択核酸領域３１５又は３２５の領域に結合させる。或いは、架橋オリゴ３１３、３３３を、固定配列オリゴヌクレオチドと同時に試料に導入してもよい。結合オリゴヌクレオチドを、ステップ３０６にて反応混合物中でライゲーションさせ、目的核酸領域にわたって伸長する相補的なひと続きのオリゴヌクレオチドを生成する。また、幾つかのアッセイでは、目的の非多型性（又は多型不可知性）核酸領域及び目的の多型核酸領域を両方とも、単一アッセイで調査することができるため、幾つかの架橋オリゴヌクレオチドは多型特異的であり、幾つかは多型特異的ではない場合があることに留意すべきである。

ライゲーションの後、個々の反応物を、好ましくは、ユニバーサル増幅及び検出ステップのために混合する。ユニバーサルプライマー３１７、３１９を、ステップ３０８で混合反応物に導入して、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを増幅し、ステップ３１０で、選択核酸領域中のＳＮＰを表す目的核酸領域の配列を含む産物３２７、３２９を生成する。産物３２７、３２９は、対立遺伝子インデックスを特定することにより産物又は産物の部分、選択核酸領域に由来するＳＮＰを含有する産物の領域、又はその両方を配列決定することにより検出及び定量される。好ましくは、図３の方法の産物は、対立遺伝子インデックスの次世代配列決定法により検出及び定量され、したがって、選択核酸領域に相補的な産物の領域又は産物全体の実際の配列を決定する必要性が不要になる。しかしながら、他の態様では、選択核酸領域に相補的な産物のインデックス及び領域の両方の配列を決定して、例えば、結果の確認を提供することが望ましい場合がある。

図３の方法では（及び他の図に示されている方法では）、対立遺伝子インデックスが説明されている。しかしながら、３２１及び３２３に示されているインデックスは、対立遺伝子インデックス、試料インデックス、対立遺伝子及び試料インデックス混合物、遺伝子座インデックス、又は本明細書に記載の、若しくは当技術分野において使用されている任意の他のインデックス又はインデックスの組合せであってもよい。

更に、架橋オリゴヌクレオチドの代わりに、固定配列オリゴヌクレオチドに特徴的なヌクレオチドが配置されている方法を使用してもよい。したがって、そのような例示的アッセイ系では、対立遺伝子インデックスは、対立遺伝子特異的固定配列オリゴヌクレオチドと結合し、対立遺伝子検出は、対立遺伝子インデックスの配列決定からもたらされる。対立遺伝子インデックスは、対立遺伝子特異的な第１の配列オリゴヌクレオチド又は第２の固定配列オリゴヌクレオチドのいずれに埋め込まれていてもよい。特定の態様では、対立遺伝子インデックスは、選択核酸領域内の２つ以上の多型を検出するために、第１及び第２の固定配列オリゴヌクレオチドの両方に存在する。そのような態様で使用される固定配列オリゴヌクレオチドの数は、選択核酸領域について評価されている考え得る対立遺伝子の数に対応していてもよく、対立遺伝子インデックスの配列決定は、遺伝子試料中の特定の対立遺伝子の存在、量、又は非存在を検出することができる。

図４には、本発明のこの態様が示されている。図４では、３つの固定配列オリゴヌクレオチド４０１、４０３、及び４２３が使用されている。固定配列オリゴヌクレオチド４０１、４２３の２つは、対立遺伝子特異的であり、例えば、それぞれＡ／Ｔ又はＧ／Ｃ ＳＮＰを含む核酸領域の対立遺伝子に相補的な領域を含む。また、対立遺伝子特異的固定配列オリゴヌクレオチド４０１、４２３の各々は、対応する対立遺伝子インデックス４２１、４３１、及びユニバーサルプライマー配列４０９も含む。第２の固定配列オリゴヌクレオチド４０３は、第２のユニバーサルプライマー配列４１１を有し、これらのユニバーサルプライマー配列は、選択核酸領域を増幅し、オリゴヌクレオチドのセットの遺伝子試料に由来する選択核酸領域のハイブリダイゼーション及びライゲーションに使用される。ユニバーサルプライマー配列は、固定配列オリゴヌクレオチド４０１、４０３、及び４２３の末端に位置して目的選択核酸領域に相補的な固定配列オリゴヌクレオチドのインデックス及び領域に隣接し、したがって、任意のユニバーサル増幅法の産物中の核酸特異的配列及びインデックスを捕捉する。

固定配列オリゴヌクレオチド４０１、４０３、４２３を、ステップ４０２で、遺伝子試料４００に導入し、選択核酸領域４１５、４２５にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドは、遺伝子試料の残りから分離することが好ましい（非表示）。架橋オリゴ４１３を導入して、第１の対立遺伝子特異的固定配列オリゴヌクレオチド領域４０５と他の固定配列オリゴヌクレオチド領域４０７との間の領域の核酸４１５に、又は第２の対立遺伝子特異的固定配列オリゴヌクレオチド領域４３５と他の固定配列オリゴヌクレオチド領域４０７との間の領域に相補的な核酸４２５にハイブリダイズさせる（４０４）。或いは、架橋オリゴヌクレオチド４１３を、固定配列オリゴヌクレオチドのセットと同時に試料に導入してもよい。図３に関連して上述したように、目的の非多型性（又は多型不可知性）核酸領域及び目的の多型核酸領域は両方とも、単一アッセイで調査することができるため、幾つかのアッセイでは、オリゴヌクレオチドの幾つかのセットは多型特異的であり、幾つかは多型特異的ではない場合があることに留意すべきである。

選択核酸領域にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、ステップ４０６でライゲーションさせて、目的選択核酸領域にわたって伸長する相補的なひと続きのオリゴヌクレオチドを生成する。ライゲーションは、主に、対立遺伝子特異的固定配列オリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異的末端が、選択核酸領域中のＳＮＰに相補的である場合にのみ生じる。ライゲーション後、ユニバーサルプライマー４１７、４１９を導入して、ステップ４０８で、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを増幅し、目的核酸領域の配列を含む産物４２７、４２９をステップ４１０で生成する。これらの産物４２７、４２９は、産物の全て又は一部、特に、選択核酸領域及び／又は対立遺伝子インデックスにＳＮＰを含有する産物の領域を配列決定することにより検出及び定量される。ここでは、対立遺伝子特異的ヌクレオチドは、対立遺伝子特異的固定配列オリゴヌクレオチドの末端にあるように示されているが、対立遺伝子特異的ヌクレオチドは、そのように配置されている必要はない。しかしながら、ライゲーションを対立遺伝子特異的にするためには、対立遺伝子を特定するヌクレオチドは、ライゲーション末端付近に存在しなければならない。典型的には、対立遺伝子特異的ヌクレオチドは、ライゲーション末端の５ヌクレオチド以内に存在しなければならない。好ましい態様では、対立遺伝子特異的ヌクレオチドは、最後から二番目か又は最後の（端末の）ヌクレオチドである。

本発明のアッセイの更に別の例では、対立遺伝子検出は、遺伝子座インデックスをアレイにハイブリダイゼーションさせることによりもたらされる。各対立遺伝子は、ユニバーサル増幅中に、対立遺伝子特異的な標識化ステップにより検出され、このステップにおいて、各対立遺伝子は例えば分光法的に特徴的な蛍光標識で標識される。図５には、本発明のこの態様が示されている。図５では、３つの固定配列オリゴヌクレオチド５０１、５０３、及び５２３が使用されている。固定配列オリゴヌクレオチド５０１、５２３の２つは、対立遺伝子特異的であり、各々は、同じ選択核酸領域の異なる対立遺伝子と一致する領域、遺伝子座インデックス５２１、及び対立遺伝子特異的ユニバーサルプライマー配列５０９、５３９を含む。第３の非対立遺伝子特異的固定配列オリゴヌクレオチド５０３は、別のユニバーサルプライマー配列５１１を含む。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びライゲーション後に、ユニバーサルプライマー配列を使用して選択核酸領域を増幅する。各対立遺伝子を識別する標識が、増幅産物に組み込まれる。上記の例と同様に、ユニバーサルプライマー配列は、固定配列オリゴヌクレオチド５０１、５０３、５２３の近位末端に位置し、したがって、任意のユニバーサル増幅法の産物の対立遺伝子特異的配列及びインデックスを捕捉する。固定配列オリゴヌクレオチド５０１、５０３、５２３を、ステップ５０２で、遺伝子試料５００に導入し、選択核酸領域５１５、５２５に特異的に結合させる。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドは、遺伝子試料の残りから分離することが好ましい（非表示）。架橋オリゴ５１３を導入し、ステップ５０４で、第１の（対立遺伝子特異的）固定配列オリゴヌクレオチド５０５及び第２の（非対立遺伝子特異的）固定配列オリゴヌクレオチド５０７間の、及び第１の（対立遺伝子特異的）固定配列オリゴヌクレオチド５３５及び第２の（非対立遺伝子特異的）固定配列オリゴヌクレオチド５０７間の、選択核酸領域５１５、５２５の領域に結合させる。或いは、架橋オリゴ５１３を、固定配列オリゴヌクレオチドと同時に、試料に導入してもよい。

結合オリゴヌクレオチドを、ステップ５０６でライゲーションさせて、目的選択核酸領域にわたって伸長する相補的なひと続きのオリゴヌクレオチドを生成する。ライゲーションは、主に、対立遺伝子特異的末端が一致する場合に生じる。ライゲーション後、ユニバーサルプライマー５１７、５１９、５３７を導入し、ステップ５０８で、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドを増幅し、ステップ５１０で目的選択核酸領域の配列を含む産物５２７、５２９を生成する。ユニバーサルプライマー５１７及び５３７は、分光法的に特徴的な蛍光標識を有しており、そのため対立遺伝子特異的情報が捕捉され、これらの蛍光標識により測定することができる。産物５２７、５２９は、遺伝子座インデックス５２１をアレイにハイブリダイゼーションさせ、画像化することにより検出及び定量される。図４に関して記載されているように、ライゲーション５０６は、好ましくは対立遺伝子に特異的であり、したがって、特徴的ヌクレオチドは、対立遺伝子特異的固定配列オリゴヌクレオチドの末端から少なくとも５ヌクレオチド以内に位置し、好ましくは、最後から二番目又は最後のヌクレオチドとして配置されることに留意することが重要である。遺伝子座インデックスが、アレイに対するハイブリダイゼーションに使用される図５に示される例は、固定配列オリゴヌクレオチド及び架橋オリゴヌクレオチドが隣接してハイブリダイズせず、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰがオリゴヌクレオチド間の「ギャップ」を埋め、その後ライゲーションするために使用される方法等の、本明細書に記載の種々の方法のいずれかで使用することができる。同様に、遺伝子座インデックス／ハイブリダイゼーション法は、固定配列オリゴヌクレオチドのみが使用される、つまり、架橋オリゴヌクレオチドが存在せず、固定配列オリゴヌクレオチドが、隣接してハイブリダイズし、ライゲーションにより結合されるか、又は固定配列オリゴヌクレオチドが、それらの間にギャップが生成させるようにハイブリダイズし、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを使用して結合され、その後ライゲーションされるプロトコールで使用することができる。

代替的な態様では、対立遺伝子インデックスは、所与の対立遺伝子の各固定配列オリゴヌクレオチドの対応する分光法的に特徴的な蛍光標識を使用して、各固定配列オリゴヌクレオチドの末端で多型を検出するように、第１及び第２の固定配列オリゴヌクレオチドの両方に存在する。この方法では、固定配列オリゴヌクレオチドの数は、選択核酸領域について評価されている考え得る対立遺伝子の数に対応する。上述した図及び例では、固定配列オリゴヌクレオチドは、２つの別個のオリゴヌクレオチドとして表されている。別の態様では、固定配列オリゴヌクレオチドは、同じオリゴヌクレオチドの反対側末端であってもよい（例えば、図７、上記を参照）。

上述の態様では、使用される架橋オリゴは、固定配列及び架橋オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズする際に、ライゲーションのために互いに直接隣接するように、固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域に隣接する目的核酸の領域にハイブリダイズする。しかしながら、他の態様では、架橋オリゴは、固定配列オリゴの１つ又は両方に相補的な領域に直接隣接しない領域にハイブリダイズし、固定配列オリゴの１つ又は複数の伸長に必要な中間ステップが、ライゲーションの前に必要である。例えば、図６に示されているように、オリゴヌクレオチドの各セットは、好ましくは、２つの固定配列オリゴヌクレオチド６０１、６０３、及び１つ又は複数の架橋オリゴヌクレオチド６１３を含有する。固定配列オリゴヌクレオチドの各々は、選択核酸領域に相補的な領域６０５、６０７、及び好ましくはユニバーサルプライマー配列６０９、６１１、つまり、ユニバーサルプライマーに相補的なオリゴヌクレオチド領域を含む。ユニバーサルプライマー配列６０９、６１１は、固定配列オリゴヌクレオチド６０１、６０３の末端に又は末端付近に位置し、したがって、任意のユニバーサル増幅法の産物中の核酸特異的配列を捕捉する。

固定配列オリゴヌクレオチド６０１、６０３を、ステップ６０２で、遺伝子試料６００に導入し、目的選択核酸領域６１５に相補的な部分に特異的に結合させる。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドは、遺伝子試料の残りから分離することが好ましい（非表示）。その後、架橋オリゴヌクレオチドを導入し、ステップ６０４で、第１の固定配列オリゴヌクレオチド６０１及び第２の固定配列オリゴヌクレオチド６０３間の選択核酸領域６１５の領域に結合させる。或いは、架橋オリゴヌクレオチドは、固定配列オリゴヌクレオチドと同時に試料に導入してもよい。ここで示した例示的な態様では、架橋オリゴヌクレオチドは、第１の固定配列オリゴヌクレオチド領域６０５に直接隣接する領域にハイブリダイズするが、第２の固定配列オリゴヌクレオチド６０７の相補的領域とは１つ又は複数のヌクレオチドで隔てられている。固定配列及び架橋オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後、架橋オリゴヌクレオチド６１３を、ステップ６０６で、例えば、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを使用して伸長させ、架橋オリゴヌクレオチド６１３及び第２の固定配列オリゴヌクレオチド６０３間のギャップを埋める。伸長した後、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、ステップ６０８でライゲーションさせて、目的選択核酸領域６１５にわたって伸長する相補的なひと続きのオリゴヌクレオチドを生成する。ライゲーション後、ユニバーサルプライマー６１７、６１９を、ステップ６１０で導入して、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを増幅し、ステップ６１２で目的核酸領域の配列を含む産物６２３を生成する。これらの産物６２３を、単離、検出、及び定量して、遺伝子試料中の選択核酸領域の存在及び量に関する情報を提供する。好ましくは、産物は、対立遺伝子インデックス６２１の次世代配列決定により、又はその代わりに、増幅産物６２３内の目的選択核酸６１５に相補的な増幅産物の部分の配列決定により、検出及び定量される。

図７には、固定配列オリゴヌクレオチドが、どのようにして同一分子の一部であり得るかが示されている。特定の態様では、単一固定配列オリゴヌクレオチド７０１は、両末端が選択核酸領域７１５に相補的である。この単一固定配列オリゴヌクレオチド７０１は、選択核酸領域７１５にハイブリダイズする際に、末端が幾つかのヌクレオチドにより隔てられているプレサークルオリゴヌクレオチド７０３を形成する。その後、架橋オリゴヌクレオチド７１３が、プレサークルオリゴヌクレオチド７０３の相補的領域７０５、７０７間に結合して、このギャップを埋める。その後、遺伝子試料７１５に結合したプレサークルオリゴヌクレオチド７０３のオリゴヌクレオチド領域７０５、７０７は、架橋オリゴヌクレオチド７１３と共にライゲーションされて、完全な環を形成する。本明細書で例示されている他の方法と同様に、架橋オリゴヌクレオチドの使用は必要ではないため、そのような実施形態では、固定配列オリゴヌクレオチドは、隣接してハイブリダイズしてもよく、又は固定配列オリゴヌクレオチドが隣接してハイブリダイズしない場合は、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを使用してギャップを埋めることができる。環状テンプレートは、好ましくは切断され、ユニバーサルプライマー部位の１つ又は複数を使用して増幅される。特定の態様では、Ｌｉｚａｒｄｉらの米国特許第６，５５８，９２８号明細書に開示されているように、単一のユニバーサルプライマー領域を使用し、ローリングサークル複製法等の技法を使用してテンプレートを複製する。

図７に示されているように、固定配列オリゴヌクレオチドは、環状テンプレート上の２つのユニバーサルプライミング部位７０９、７１１、及び任意選択で、選択核酸領域に相補的な構築物の末端間の１つ又は複数のインデックス７２１を有する。ここに示されているように、切断部位７２３は、２つのユニバーサルプライミング部位間に存在する。構築物７０１を、ステップ７０２で遺伝子試料に導入し、目的選択核酸領域にハイブリダイズさせ、架橋オリゴヌクレオチドを、ステップ７０４で導入し、選択核酸領域にハイブリダイズさせる。その後、ステップ７０６で、架橋オリゴ７１３にライゲーションさせることにより構築物を環状化し、ヌクレアーゼを使用して、全て又はほとんどの未環状化オリゴヌクレオチドを除去することができる。未環状化オリゴヌクレオチドを除去した後、環状化オリゴヌクレオチドを切断して、ユニバーサルプライミング部位７０９、７１１を保存し、幾つかの態様では露出させる。ステップ７０８で、ユニバーサルプライマー７１７、７１９を導入し、ユニバーサル増幅を生じさせ（７１０）、目的選択核酸領域の配列を含む増幅産物７２５を生成する（７１２）。例えば、選択核酸領域に又はその代わりにインデックスに相補的な産物の部分の次世代配列決定により、産物７２５を検出及び定量し、それにより、構築物全体を配列決定する必要性を不要にする。しかしながら、他の態様では、インデックスが試料情報を提供し、選択核酸領域に関する情報を提供しない場合は、インデックス及び選択核酸領域の両方の配列を含む産物を決定して、例えば、結果の内部確認を提供することが望ましい。上記で言及されているように、この単一固定配列オリゴヌクレオチド法は、図２〜７の例のいずれにも適用することができる。また、ここでも、幾つかのアッセイでは、目的の非多型性（又は多型不可知性）核酸領域及び目的の多型核酸領域を両方とも、単一アッセイで調査することができるため、幾つかのセットのオリゴヌクレオチドは多型特異的であり、幾つかは多型特異的ではない場合があることに留意すべきである。

本発明の方法におけるインデックスの使用
上記で図２〜７に関して説明されているように、ある態様では、セット中の固定配列オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のインデックスであって、例えば、選択核酸領域を特定する（遺伝子座インデックス）、選択核酸領域内のＳＮＰを特定する（対立遺伝子インデックス）、及び／又は分析されている特定の試料（試料インデックス）を特定するインデックスを含む。例えば、１つ又は複数の遺伝子座インデックスの検出は、下記に記載のように選択核酸領域全体を検出するための代用としての役目を果たすことができるか、又はインデックスの検出は、インデックスの配列、及び核酸領域自体に相補的なオリゴヌクレオチド産物の配列が両方とも決定される場合、特定の選択核酸領域の存在の確認としての役目を果たすことができる。インデックスは、好ましくは、インデックス、及び選択核酸領域に特異的にハイブリダイズする領域（すなわち、選択核酸領域特異的配列）を両方とも含むプライマーを用いた選択的増幅ステップ中に、選択核酸領域に結合する。

インデックスは、典型的には、プライマーを使用して単離及び／又は増幅された選択核酸領域に関連する情報を提供するための、増幅プライマー内で使用される非相補的で固有の配列である。インデックスの順序及び配置並びにインデックスの長さは様々であってもよく、インデックスは、種々の組合せで使用することできる。別法として、初期選択的増幅後に、これらの配列を含むアダプターのライゲーションを使用して、インデックス及び／又はユニバーサル増幅配列を、選択的に増幅された選択核酸領域に付加することができる。インデックスを使用する利点は、選択核酸領域の存在（及び最終的には量又は頻度）を得るために、選択核酸領域の全長を配列決定する必要がないということであるが、ある態様では、そうすることが望ましい場合がある。しかしながら、一般的に、１つ又は複数のインデックスを特定することにより選択核酸領域を特定及び定量する能力は、特に、配列決定プライマーが位置する場所の近位にある単離された選択核酸領域の３’又は５’末端でインデックス配列が捕捉される場合、必要とされる配列決定の長さを減少させるであろう。また、より長い配列決定読取りはエラーをより導入しやすいため、選択核酸領域を特定するための代用としてのインデックスの使用は、配列決定エラーを低減することができる。また、図５に関して上記で説明されているように、遺伝子座インデックスは、例えば蛍光標識と共に使用して、アレイに対するハイブリダイゼーションにより選択核酸領域を特定及び定量することができる。

インデックスの１つの例では、選択核酸領域の選択的増幅に使用されるプライマーは、選択核酸領域に相補的な領域とユニバーサル増幅プライマー部位との間に遺伝子座インデックスを含むように設計されている。遺伝子座インデックスは、典型的には各選択核酸領域に固有であり、そのため、特定の遺伝子座インデックスが試料において生じる回数の定量を、対応する単一核酸領域の相対的コピー数、及び単一核酸領域を含有する特定の染色体と関連付けることができる。一般的に、遺伝子座インデックスは、既知の各単一核酸領域を固有に標識するのに十分な長さを有する。例えば、本方法が、１９２個の既知単一核酸領域を使用する場合、少なくとも１９２個の固有な遺伝子座インデックスが存在し、各々は、染色体の特定の遺伝子座に由来する単一の核酸領域を固有に特定する。本発明の方法で使用される遺伝子座インデックスは、単一染色体に存在する異なる単一核酸領域、並びに試料内の異なる染色体に存在する既知の単一核酸領域を示すことができる。遺伝子座インデックスは、配列決定中の１つ又は複数の塩基の欠失、置換、又は挿入の検出を含む配列決定エラー、並びにオリゴ合成、増幅、又は本方法の任意の他の態様等の、配列決定以外で生じる場合があるヌクレオチド変化の特定及び補正を可能にする追加のヌクレオチドを含有していてもよい。

別の例では、選択核酸領域の増幅に使用されるプライマーは、選択核酸領域に相補的な領域とユニバーサル増幅プライマー部位との間に対立遺伝子インデックス（遺伝子座インデックスの代替）を提供するように設計されていてもよい。対立遺伝子インデックスは選択核酸領域の特定の対立遺伝子に固有であり、そのため、特定の対立遺伝子インデックスが試料において生じる回数の定量を、その対立遺伝子の相対的コピー数と関連付けることができ、特定の選択核酸領域用の対立遺伝子インデックスの合計を、選択核酸領域を含有する特定の染色体のその選択核酸領域の相対的コピー数と関連付けることができる。多型特異的オリゴヌクレオチドセット、及び多型不可知性又はＳＮＰ不可知性オリゴヌクレオチドセットが両方とも単一のアッセイで使用される実施形態では、対立遺伝子インデックス及び遺伝子座インデックスの両方を使用してもよい。

更に別の例では、選択核酸領域の増幅に使用されるプライマーは、選択核酸領域に相補的な領域とユニバーサル増幅プライマー部位との間に識別インデックスを提供するように設計されていてもよい。そのような態様では、試料中の各増幅分子を固有に特定するのに十分な数の識別インデックスが存在する。識別インデックス配列は、好ましくは、６ヌクレオチド長以上である。好ましい態様では、識別インデックスは、各分子を単一核酸領域特異的に標識する統計的確率を有する十分な長さを有する。例えば、特定の単一核酸領域が３０００コピーある場合、特定の単一核酸領域の各コピーが、固有の識別インデックスで標識される可能性が高くなるように、３０００個を大幅に超える識別インデックスが存在する。他のインデックスの場合と同様に、識別インデックスは、配列決定中の１つ又は複数の塩基の欠失、置換、又は挿入の検出を含む配列決定エラー、並びにオリゴ合成、増幅、及びアッセイの任意の他の態様等の、配列決定以外で生じる場合があるヌクレオチド変化の特定及び補正を可能にする追加のヌクレオチドを含有していてもよい。

識別インデックスを任意の他のインデックスと組み合わせて、２つの特性に関する情報を提供する１つのインデックスを生成してもよい。また、識別遺伝子座を使用して、試料に由来する選択核酸領域の初期単離の下流で生じる増幅バイアスを検出及び定量することができ、このデータは、試料データの正規化に使用することができる。

本明細書に記載の他のインデックスに加えて、補正インデックスを使用してもよい。補正インデックスとは、配列決定中の１つ又は複数の塩基の欠失、置換、又は挿入の検出、並びにオリゴヌクレオチド合成、増幅、又はアッセイの他の態様等の、配列決定以外で生じる場合があるヌクレオチド変化の検出を含む、増幅エラー、配列決定エラー、又は他の実験エラーの補正を可能にする短いヌクレオチド配列である。補正インデックスは、別々の配列である独立型インデックスであってもよく、又は使用される実験技法の精度の確認を支援するために、他のインデックス内に埋め込まれていてもよく、例えば、補正インデックスは、遺伝子座インデックス又は識別インデックスの配列のサブセットであってもよい。

幾つかの態様では、選択核酸領域が単離される試料を示すインデックスを使用して、多重化アッセイ系で選択核酸領域の供給源を特定する。そのような態様では、１つの個体に由来する選択核酸領域は、特定の固有な試料インデックスに割り当てられ、関連付けられる。したがって、試料インデックスを使用して、単一反応容器中で（つまり、試料をプールした場合）異なる試料を多重化するための核酸領域特定を支援することができ、各試料をその試料インデックスに基づいて特定することができる。好ましい態様では、一連の試料中の各試料に固有な試料インデックスが存在し、試料は、配列決定中にプールされる。例えば、１２個の試料が、単一配列決定反応のためにプールされる場合、少なくとも１２個の固有な試料インデックスが存在し、各試料は固有に標識される。配列決定ステップを実施した後、各試料の各選択核酸領域の頻度を決定する前に、及び各試料に染色体異常が存在するか否かを決定する前に、まず、配列決定データは、好ましくは試料インデックスにより分別される。

試料内変動最小化
混合試料中の染色体異常を検出することに伴う１つの困難は、多くの場合、染色体異常を有する細胞タイプに由来するＤＮＡ（つまり、胎児ＤＮＡ）が、正倍数性細胞タイプに由来するＤＮＡ（つまり、母体ＤＮＡ）よりもはるかに少量で存在するということである。胎児無細胞ＤＮＡ及び母体無細胞ＤＮＡを含有する母体試料の場合、全無細胞ＤＮＡに対する無細胞胎児ＤＮＡの割合は、１パーセント未満〜４０パーセントと様々であり得、最も一般的には２０パーセント以下で、多くの場合は１０パーセント以下の頻度で存在する。例えば、そのような混合母体試料の胎児ＤＮＡにおけるＹ染色体異数性の検出では、Ｙ染色体配列の相対的増加は、胎児が正常な男性であればＹ配列の推定割合の倍数であり、したがって、一例として胎児ＤＮＡが全体の５％である混合試料中の全ＤＮＡの割合としては、全体に対するＹ染色体寄与の増加の割合は５％の１／４７である（試料中の全ＤＮＡ割合の０．１１％）。本明細書に記載の方法によりこの差異を確実に検出しようとする場合、Ｙ染色体の測定における変動は、Ｙ染色体の増加割合よりもはるかに小さくなければならない。

幾つかの態様では、染色体の１つ又は複数の選択核酸領域の測定量は、アッセイ系の変動（例えば、温度差及び試薬ロット差）、試料の基本的生物学的特徴変動（例えば、核酸含有量）、作業者間の差の変動、又は任意の他の変数の変動等の、供給源に由来する既知の変動を考慮するために正規化される。更に、選択核酸領域の頻度を決定するために使用するデータは、実験エラーによると考えられる異常値データ、又は特定の試料内の特発性遺伝子バイアスに基づきレベルが上昇又は低下した異常値データを除外してもよい。１つの例では、合計に使用されるデータは、１つ又は複数の試料中の特に高い頻度を有する核酸領域を除外してもよい。別の例では、合計に使用されるデータは、１つ又は複数の試料で特に存在量が低いことが見出された選択核酸領域を除外してもよい。

試料間の、及び／又は試料内の選択核酸領域の変動は、分析方法の組合せを使用して最小限に抑えることができる。例えば、変動は、アッセイに内部標準を使用することにより減少する。内部標準の一例は、「正常な」存在量で存在する染色体（例えば、常染色体の二染色体）を使用して、異常な存在量で同じ試料中に存在する場合があるＸ及びＹ染色体、つまり異数性又は微量夾雑物を比較することである。単一のそのような「正常」染色体を標準染色体として使用することが十分な場合もあるが、定量の統計能力を高めるために、２個〜数個の常染色体を内部標準染色体として使用することが望ましい。

内部標準の１つの使用は、染色体比と呼ばれる、試料中の常染色体の存在量に対する、異常であると推定されるＸ及び／又はＹ染色体頻度の存在量の比を計算することである。染色体比を計算する場合、各染色体の選択核酸領域の各々の存在量又は計数を共に合計して、各染色体の総計数を計算する。その後、一個の染色体の総計数を、異なる染色体の総計数で除算して、それら２つの染色体の染色体比を生成する。

別法として、各染色体の染色体比は、まず、各染色体の選択核酸領域の各々の計数を合計し、次に、１つの染色体について、その合計を２つ以上の染色体についての総計で除算することにより計算してもよい。計算したら、次に、染色体比を、正倍数性集団の平均染色体比と比較する。

平均は、相加平均、中央値、最頻値、又は他の平均であってもよく、正規化又は異常値データ除外が行われていてもよく又は行われていなくともよい。好ましい態様では、相加平均が使用される。正倍数性集団の染色体比のデータセットを開発する場合、測定した染色体の通常の変動を計算する。この変動は、幾つかの様式で、最も典型的には、変動係数（ＣＶ）として表される。試料のＸ染色体比を、正倍数性集団の平均染色体比と比較した時、試料のＸ染色体比が、統計的に、正倍数性集団の平均染色体比から外れる場合、試料は、例えばＸ異数性及び／又はＸ染色体モザイク現象を示すＸ染色体異常を含む。同様に、試料のＹ染色体比を、正倍数性集団の平均染色体比と比較した時、試料のＹ染色体比が、統計的に、正倍数性集団の平均染色体比から外れる場合、試料は、例えばＹ異数性及び／又はＹ染色体モザイク現象を示すＹ染色体異常を含む。

異数性を宣言するための統計的閾値を設定するための基準は、所望の方法の染色体比並びに許容される偽陽性率及び偽陰性率の測定における変動に依存する。一般的に、この閾値は、染色体比で観察される変動の倍数であってもよい。１つの例では、この閾値は、染色体比の変動の３倍以上である。別の例では、この閾値は、染色体比の変動の４倍以上である。別の例では、この閾値は、染色体比の変動の５倍以上である。別の例では、この閾値は、染色体比の変動の６倍以上である。上記の例では、染色体比は、染色体による選択核酸領域の計数を合計することにより決定される。典型的には、各染色体について同数の選択核酸領域が使用される。

染色体比を生成するための代替的な方法は、各染色体又は各染色体領域の選択核酸領域の平均計数を計算することであろう。典型的には平均が使用されるが、平均は、相加平均値、中央値、又は最頻値の任意の推定値であってよい。平均は、全計数の相加平均であってもよく、又はトリム平均又は加重平均等の幾つかの変法であってもよい。各染色体の平均計数が計算されたら、各染色体の平均計数を他方で除算して、２つの染色体間の染色体比を得る。各染色体の平均計数を、上述のように、測定された染色体全ての平均値の合計で除算して、各染色体の染色体比を得る。上記で強調したように、胎児ＤＮＡの相対存在量が少ない母体試料のＸ染色体、Ｘ染色体頻度、Ｙ染色体、又はＹ染色体頻度を検出する能力は、アッセイにおいて異なる選択核酸領域を測定する際の変動に大きく依存する。この変動を低減させ、したがって本方法の異数性検出感度を向上させる多数の分析法を使用することができる。

アッセイのばらつきを低減させる１つの方法は、染色体の存在量を計算するために使用する選択核酸領域の数を増やすことである。一般的に、染色体の単一選択核酸領域の測定変動がＢ％であり、Ｃ個の異なる選択核酸領域が、同じ染色体で測定される場合、その染色体の各選択核酸領域の存在量の合計又は平均により計算される染色体存在量の測定値の変動は、およそＢ％÷Ｃ^１／２になるであろう。言い換えると、染色体存在量の測定値の変動は、おおよそ、選択核酸領域数の平方根で除算された各選択核酸領域の存在量の測定値の平均変動になるであろう。

本発明の好ましい態様では、各染色体（Ｘ染色体、Ｙ染色体、及び１つ又は複数の常染色体）で測定される選択核酸領域の数は、少なくとも８個である。本発明の別の好ましい態様では、各染色体で測定される選択核酸領域の数は、少なくとも２４個である。本発明の更に別の好ましい態様では、各染色体で測定される選択核酸領域の数は、少なくとも３２個である。本発明の別の好ましい態様では、各染色体で測定される選択核酸領域の数は、少なくとも１００個である。本発明の別の好ましい態様では、各染色体で測定される選択核酸領域の数は、少なくとも２００個である。各選択核酸領域の測定には増分原価の増加があるため、選択核酸領域の数を最小限に抑えつつ、それでも統計的にしっかりしたデータを生成することが重要である。本発明の好ましい態様では、各染色体で測定される選択核酸領域の数は、２０００個未満である。本発明の好ましい態様では、各染色体で測定される選択核酸領域の数は、１０００個未満である。本発明の最も好ましい態様では、各染色体で測定される選択核酸領域の数は、少なくとも３２個かつ１０００個未満である。

１つの態様では、各選択核酸領域の存在量を測定した後、選択核酸領域のサブセットを使用して、Ｘ又はＹ染色体異常の存在又は非存在を決定することができる。選択核酸領域のサブセットを選択するための多くの標準的方法が存在する。それらには排除が含まれ、ここでは、ある百分位数未満及び／又はある百分位数を超える検出レベルを有する選択核酸領域が分析から除外される。１つの態様では、百分位数は、測定された頻度の下位及び上位５％であってもよい。別の態様では、除外の百分位数は、測定された頻度の下位及び上位１０％であってもよい。別の態様では、除外の百分位数は、測定された頻度の下位及び上位２５％であってもよい。

選択核酸領域のサブセットを選択するための別の方法には、ある統計範囲から外れる領域を除外することが含まれる。例えば、平均存在量の１以上の標準偏差から外れる領域を、分析から除外してもよい。選択核酸領域のサブセットを選択するための別の方法は、選択核酸領域の相対存在量を、健常集団の同じ選択核酸領域の予想存在量と比較し、期待基準を満たさないあらゆる選択核酸領域を除外することであってもよい。アッセイにおける変動を更に最小化するために、各選択核酸領域が測定される回数を増加させてもよい。考察されているように、ゲノムが平均して１回未満しか測定されない、Ｘ及びＹ染色体頻度異常を検出するランダム法とは対照的に、本発明の方法では、各選択核酸領域が意図的に複数回測定される。一般的に、事象を計数する場合、計数における変動はポアソン統計により決定され、計数変動は、典型的には、計数の数の平方根で除算したものと等しい。本発明の好ましい態様では、選択核酸領域は、各々平均で少なくとも５回測定される。本発明のある態様では、選択核酸領域は、各々平均で少なくとも１０、５０、又は１００回測定される。本発明のある態様では、選択核酸領域は、各々平均で少なくとも２５０回測定される。本発明のある態様では、選択核酸領域は、各々平均で少なくとも５００回測定される。本発明のある態様では、選択核酸領域は、各々平均で少なくとも１０００回、又は少なくとも５，０００回、又は少なくとも１０，０００回測定される。

別の態様では、選択核酸領域のサブセットは、染色体異常が存在するか否かを決定する際に、統計的に有意な結果を得るのに十分な数を使用して、無作為に選択することができる。選択核酸領域の異なるサブセットの複合分析を母体試料内で実施して、より高い統計能力を得ることができる。この例では、ランダム分析の前に、任意の選択核酸領域を除去又は排除することが必要な場合もあり、そうでない場合もある。例えば、Ｙ染色体に１００個の選択核酸領域があり、例えば、２番染色体に１００個の選択核酸領域がある場合、上記各染色体の１００個未満の領域を評価する一連の分析を実施してもよい。

また、配列計数は、対数変換された計数の中央値洗練法（ｍｅｄｉａｎ ｐｏｌｉｓｈ）を使用することにより試料及びアッセイのバイアスを系統的に除外することによって正規化することができる。計量は、各試料について、特定の染色体の選択核酸領域の計数の平均、及び異なる染色体の選択核酸領域の計数の平均の合計で除算した選択核酸領域の計数の平均として計算することができる。割合についての標準的なＺ検定を使用して、Ｚ統計量を計算することができる。

式中、ｐ_ｊは、所与の試料ｊの所与の目的染色体について観察された割合であり、ｐ_０は、中央値ｐ_ｊとして計算された所与の試験染色体の期待割合であり、ｎ_ｊは割合計量値の分母である。Ｚ統計正規化は、反復打ち切りを使用して実施してもよい。各反復では、例えば３中央絶対偏差から外れる試料が除外される。１０回の反復後、平均及び標準偏差を、非打ち切り試料のみを使用して計算した。その後、試料は全て、この平均及び標準偏差に対して正規化される。コルモゴロフ−スミルノフ検定（Ｃｏｎｏｖｅｒ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２９５〜３０１頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９７１年）を参照）及びシャピロ−ウイルク検定（Ｒｏｙｓｔｏｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、３１巻：１１５〜１２４頁（１９８２年）を参照）を、正倍数性試料のＺ統計量を正規化するための検定に使用してもよい。

アッセイにおける変動を低減するための上記の方法に加えて、他の分析技法を組み合わせて使用してもよく、それらの多くは本願で上述されている。例えば、各試料の選択核酸領域の全てを、単一容器中の単一反応で調査すると、アッセイにおける変動を低減させることができる。同様に、アッセイにおける変動は、ユニバーサル増幅系を使用すると、低減させることができる。更に、アッセイの変動は、増幅のサイクル数を制限すると、低減させることができる。

母体試料中の胎児ＤＮＡ含有量の測定
胎児寄与についての知識は、Ｘ及びＹ染色体に由来する選択核酸領域の予想される統計的存在に関する重要な情報を提供するため、母体試料中の胎児ＤＮＡの割合を決定することは、選択核酸領域の頻度計算の精度を増加させる。胎児寄与割合は、試料中のＸ及びＹ染色体配列の定量的な統計的有意性を決定するために使用されるため、胎児割合を考慮に入れることは、母体試料中の胎児ＤＮＡのレベルが低い場合、特に重要である。Ｘ染色体異数性、Ｙ染色体異数性、又は性染色体モザイク現象の存在を評価する場合、及び／又は試料汚染が存在するか否かを決定する場合、胎児割合を考慮に入れることが重要である。

目的対立遺伝子での母体ＤＮＡの相対的母体寄与を、その対立遺伝子での非母体寄与と比較して、試料中のおおよその胎児ＤＮＡ濃度を決定することができる。好ましい態様では、専ら父性由来配列、例えば、常染色体の父性特異的多型の相対量を使用して、母体試料中の胎児ＤＮＡの相対的濃度が決定される。母体試料中の胎児寄与割合を決定するための別の例示的な手法は、胎児ＤＮＡ及び母体ＤＮＡ間で異なるパターンのＤＮＡメチル化を有するＤＮＡ断片を分析することによる。

本方法では、典型的には、胎児割合の計算にＸ及びＹ染色体配列を使用しないため、胎児多型の決定には、標的ＳＮＰ及び／又は突然変異を分析して、母体試料中の胎児ＤＮＡの存在を特定することが必要である。各母体由来試料では、胎児由来ＤＮＡは、母体から受け継いだその遺伝子座の約５０％、及び父体から受け継いだ遺伝子座の５０％を有するであろう。父体供給源に由来する胎児に寄与した遺伝子座を決定することにより、母体試料中の胎児ＤＮＡの推定が可能になり、したがって、目的染色体の染色体頻度の統計的有意性を計算するために使用される情報が提供される。幾つかの態様では、父体及び母体の先行遺伝子型決定の使用を実施することができる。例えば、親は、疾患マーカーの遺伝子型決定、例えば、嚢胞性線維症、脊髄性筋萎縮症、筋ジストロフィー、又は更にＲｈＤ遺伝子の状態等の、障害の遺伝子型の決定を受けていてもよい。その場合、多型、コピー数変異体、又は突然変異における差異を使用して、母体試料中の胎児寄与割合を決定することができる。

代替的な好ましい態様では、母体試料中の胎児無細胞ＤＮＡ割合は、母体又は父体遺伝子型の予備的知識を用いずに、多重化ＳＮＰ検出法を使用して定量することができる。この態様では、各領域に１つ又は複数の既知ＳＮＰを有する選択多型核酸領域が使用される。好ましい態様では、選択多型核酸領域は、異数体である可能性が低い常染色体、例えば、６番染色体に位置する。また、好ましい態様では、選択多型核酸領域は、１つの容器中の１つの反応で増幅される。母体試料中の選択多型核酸領域の各対立遺伝子は、例えば、ハイスループット配列決定法を使用して決定及び定量される。配列決定後、母体遺伝子型及び胎児遺伝子型が異なる、例えば、母体遺伝子型がホモ接合性であり、胎児遺伝子型がヘテロ接合型である遺伝子座が特定される。父体から受け継いだ配列は、低頻度であるが、統計的に関連性のある頻度で生じる多型の検出により特定することができる。特定は、特定の選択核酸領域の１つの対立遺伝子の相対頻度が高く（＞６０％）、他方の対立遺伝子の相対頻度が低い（＜２０％かつ＞０．１５％）ことを観察することにより達成される。複数の遺伝子座の使用は、対立遺伝子の存在量の測定における変動の量を低減するため、特に有利である。この要求を満たす遺伝子座の全て又はサブセットを使用して、統計分析により胎児濃度が決定される。

１つの態様では、胎児濃度は、２つ以上の遺伝子座の低頻度対立遺伝子を共に合計し、高頻度対立遺伝子及び低頻度対立遺伝子の合計で除算し、２をかけることにより決定される。別の態様では、胎児無細胞ＤＮＡ割合は、２つ以上の遺伝子座の低頻度対立遺伝子を平均し、高頻度対立遺伝子及び低頻度対立遺伝子の平均で除算し、２をかけることにより決定される。

多くの対立遺伝子の場合、母体配列及び胎児配列は、ホモ接合性であり同一である場合があり、この情報は母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡを区別しないため、母体試料中の胎児ＤＮＡ割合の決定に有用ではない。本方法では、胎児ＤＮＡ及び母体ＤＮＡ間に差異がある対立遺伝子情報（例えば、母体対立遺伝子と異なる少なくとも１つの対立遺伝子を含有する胎児対立遺伝子）を、胎児割合の計算に使用する。したがって、母体ＤＮＡ及び胎児ＤＮＡで同じである対立遺伝子領域に関するデータは、分析用に選択しないか、又は有用なデータを圧倒しないように胎児ＤＮＡ割合を測定する前に適切なデータから除外される。母体血漿中の胎児ＤＮＡを定量するための例示的な方法は、例えば、Ｃｈｕら、Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ（３０巻：１２２６〜２９頁（２０１０年）に見出すことができる。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

１つの態様では、選択核酸領域は、領域の量又は頻度が、実験エラーによるか、又は特定の試料内の特発性遺伝子バイアスに由来する異常値と考えられる場合、除外してもよい。別の態様では、選択核酸は、例えば、当技術分野で知られているように又は上記に記載されているように合計又は平均する前に、正規化、標準化、クラスター化、又は変換等の統計的又は数学的な調整を受けてもよい。別の態様では、選択核酸は、合計又は平均する前に、正規化及び実験エラーデータ排除の両方を受けてもよい。好ましい態様では、１２個以上の遺伝子座が分析に使用される。別の好ましい態様では、２４個以上の遺伝子座が分析に使用される。別の好ましい態様では、３２個以上の遺伝子座、４８個以上の遺伝子座、７２個以上の遺伝子座、９６個以上の遺伝子座、１００個以上の遺伝子座、又は２００個以上の遺伝子座が分析に使用される。

１つの好ましい態様では、母体試料中の胎児寄与割合は、母体対立遺伝子及び胎児対立遺伝子のタンデムＳＮＰ検出を使用して定量することができる。母体試料から抽出されたＤＮＡのタンデムＳＮＰを特定するための技法は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌらの米国特許第７，７９９，５３１号明細書、及び米国特許出願第１２／５８１，０７０号明細書、第１２／５８１，０８３号明細書、第１２／６８９，９２４号明細書、及び第１２／８５０，５８８号明細書に開示されている。これらの参考文献には、胎児ゲノム及び母体ゲノム間で異なるハプロタイプを有する母体試料の少なくとも１つのタンデム一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することによる胎児遺伝子座及び母体遺伝子座の区別が記載されている。これらのハプロタイプの特定及び定量は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌらの開示に記載のように、母体試料で直接実施することができ、母体試料中の胎児寄与割合を決定するために使用することができる。

また別の代案では、ある遺伝子が、母体遺伝子コピーと胎児遺伝子コピーとの間に後成的差異を有すると特定されたら、そのような遺伝子は、母体試料中の胎児ＤＮＡマーカーの候補遺伝子座である。例えば、Ｃｈｉｍら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１０２巻：１４７５３〜５８頁（２００５年）を参照されたい。これらの遺伝子座は、胎児ＤＮＡではメチル化されているが母体ＤＮＡではメチル化されていない場合があり（又は、その逆）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を使用することにより、そのような胎児ＤＮＡ分子が、母体由来の過剰なバックグラウンド血漿ＤＮＡ中に存在していた場合でさえ、非常に特異的に直接検出することができる。母体試料中のメチル化増幅産物及び非メチル化増幅産物の比較を使用し、母体ＤＮＡと比較して胎児ＤＮＡのメチル化により異なって調節されることが知られている配列の１つ又は複数の後成的対立遺伝子比を計算することにより、母体試料に対する胎児ＤＮＡ割合寄与を定量することができる。

母体試料中の核酸のメチル化状態を決定するためには、試料の核酸を、試料の亜硫酸水素塩変換にかけ、その後ＭＳＰにかけてから、対立遺伝子特異的プライマー伸長を行う。そのような亜硫酸水素塩変換の従来方式には、限定するものではないが、Ｍｅｔｈｙｌａｍｐ（商標）ＤＮＡ修飾キット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ社、ニューヨーク州ブルックリン）等の市販キットの使用が含まれる。対立遺伝子頻度及び対立遺伝子比を、データから直接計算し、エクスポートして、母体試料中の胎児ＤＮＡの相対割合を決定することができる。

Ｘ及びＹ染色体頻度分析における胎児無細胞ＤＮＡ割合の使用
胎児無細胞ＤＮＡ割合を計算したら、このデータを、Ｘ及びＹ染色体配列を検出及び定量するための方法と組み合わせて、胎児が女性、男性、Ｘ染色体の異数体、Ｙ染色体の異数体、Ｘ染色体モザイク、Ｙ染色体モザイクであり得る尤度を決定する。また、このデータは、モザイク現象を含む母体異数性の決定に、又は試験している母体試料が汚染されているか否かを特定するために使用することができる。

例えば、１０％胎児ＤＮＡである母体試料では、各染色体は、正倍数性胎児では、１０％の１／４６（又はおよそ０．２２％）の寄与であろう。したがって、正倍数性の男性胎児では、Ｙ染色体は、１０％の１／４６（０．２２％）の寄与であろう。Ｘ染色体は、１０％の１／４６（０．２２％）の寄与であろう。常染色体対は、１０％の２／４６、すなわち１／２３（０．４４％。各常染色体は２つ存在するため）の寄与であろう。したがって、胎児が正倍数性の男性胎児か否かを決定する場合、１０％胎児である試料中のＹ染色体特異的配列の頻度は、０．２２％であるはずであり、例えば、３番染色体特異的配列の頻度は、男性胎児が２つの３番染色体を有するため、０．４４％であるはずである。Ｙ染色体異数性（すなわち、２つ以上のＹ染色体）が存在するか否かを決定する場合、Ｙ染色体特異的配列の頻度は、２つのＹ染色体の場合はおよそ０．４４％であり、３つのＹ染色体の場合はおよそ０．６６％になるであろう。胎児がＹ染色体モザイクであり得るか否かを決定する場合、Ｙ染色体特異的配列の頻度は、より少ないはずであり、ＸＸ／ＸＹモザイクの場合は０．２２％よりもかなり少ない場合があり、男性胎児に由来する核酸を有する母体試料により汚染された女性胎児に由来する核酸を有する母体試料の試料汚染の尤度を評価する場合も同じことが言える。ＸＹ／ＸＹＹモザイクでは、Ｙ染色体特異的配列の頻度は、０．２２％〜０．４４％であるはずである。別の例では、５％胎児ＤＮＡである母体試料では、各染色体は、正倍数性胎児では５％の１／４６（又はおよそ０．１１％）の寄与であろう。したがって、正倍数性の男性胎児では、Ｙ染色体は、５％の１／４６（０．１１％）の寄与であろう。常染色体対は、５％の２／４６すなわち１／２３（０．２２％。各常染色体は２つ存在するため）の寄与であろう。

別の例では、正倍数性の女性胎児では、Ｘ染色体は、１０％の２／４６（つまり、１／２３）（０．４４％。正倍数性の女性胎児には２つのＸ染色体があるため）の寄与であろう。常染色体対は、１０％の２／４６すなわち１／２３（０．４４％。各常染色体は２つ存在するため）の寄与であろう。したがって、胎児が正倍数性の女性胎児であるか否かを決定する場合、１０％胎児である試料中のＸ染色体特異的配列の頻度は、０．４４％であるはずであり、例えば、３番染色体特異的配列の頻度は、女性胎児が２つの３番染色体を有するため、０．４４％であるはずである。Ｘ染色体異数性（すなわち、１つ、３つ又はそれ以上のＸ染色体）が存在するか否かを決定する場合、Ｘ染色体特異的配列の頻度は、１つのＸ染色体の場合はおよそ０．２２％であり、３つのＸ染色体の場合は０．６６％であり、４つのＹ染色体の場合はおよそ０．８８％になるであろう。胎児がＸ染色体モザイクであり得るか否かを決定する場合、Ｘ染色体特異的配列の頻度は、より少ないはずであり、ＸＸ／Ｘ０モザイクの場合は０．４４％よりもかなり少なく、ＸＸ／ＸＸＸモザイクの場合は０．４４％〜０．６６％となり得る。別の例では、５％胎児ＤＮＡである母体試料では、各染色体は、正倍数性胎児では５％の１／４６（すなわちおよそ０．１１％）の寄与であろう。正倍数性の女性胎児では、Ｘ染色体は、５％の２／４６すなわち１／２３（０．２２％）の寄与であろう。常染色体対は、５％の２／４６すなわち１／２３（０．２２％。各常染色体は２つ存在するため）の寄与であろう。

図８は、本発明による統計分析を実施するための例示的な方法８００の単純化されたフローチャートである。方法８００のステップ８０１では、Ｘ及びＹ染色体並びに少なくとも１つの常染色体の遺伝子座が調査される。ステップ８０３では、ステップ８０１で調査された染色体の各々の染色体頻度が推定される。ステップ８０５では、Ｙ染色体が、０コピー、１つのコピー、又は２つ以上のコピーで存在する尤度の値が計算され、ステップ８０７では、計算された尤度の値を、Ｙ染色体が０、１、又は２つ以上のコピーで存在すると仮定した数学モデルと比較することにより、Ｙ異数性のリスクが計算される。同様に、ステップ８０９では、Ｘ染色体が１つのコピー、２つのコピー、又は３つ以上のコピーで存在する尤度の値が計算され、ステップ８１１では、計算された尤度の値を、Ｘ染色体が１、２、又は３つ以上のコピーで存在すると仮定した数学モデルと比較することにより、Ｘ異数性のリスクが計算される。

図９は、本発明による統計分析を実施するための例示的な方法９００の別の実施形態の単純化されたフローチャートである。方法９００では、母体試料の胎児割合が決定され、胎児Ｘ及びＹ異数体リスクが計算される。ステップ９０１では、少なくとも１つの常染色体の少なくとも１つの多型性遺伝子座が調査される。本発明のほとんどの実施形態では、少なくとも２つの、及び多くの場合２つを超える常染色体における数個から多数個の多型性遺伝子座が調査される。ステップ９０３で、母体試料の胎児核酸割合（胎児割合）が、多型性遺伝子座に関する情報を使用して計算される。ステップ９０５では、母体試料の胎児核酸割合が、更なる分析の実施に適切か否かに関しての決定がなされる。ステップ９０７では、Ｙ染色体の遺伝子座（多型性又は非多型性）が調査される。ほとんどの実施形態では、Ｙ染色体及びＸ染色体の遺伝子座の調査は、少なくとも１つの常染色体の遺伝子座の調査と同時に、かつ好ましくは同じ容器中で実施される。ステップ９０９では、計算された胎児核酸割合を使用して、Ｙ染色体が、０コピー、１つのコピー、又は２つ以上のコピーで存在する尤度の値が計算され、ステップ９１１では、計算された尤度の値を、Ｙ染色体の０、１、又は２以上のコピーを仮定した数学モデルと比較することにより、Ｙ胎児異数性のリスクが計算される。ステップ９１３では、Ｘ染色体の遺伝子座（多型性又は非多型性）が調査され、上記に記載のように、Ｘ染色体及びＹ染色体の遺伝子座の調査は、少なくとも１つの常染色体の遺伝子座の調査と同時に、かつ好ましくは同じ容器中で実施される。ステップ９１５では、計算された胎児核酸割合を使用して、Ｘ染色体が１つのコピー、２つのコピー、又は３つ以上のコピーで存在する尤度の値が計算され、ステップ９１７１では、計算された尤度の値を、Ｘ染色体の１、２、又は３以上のコピーを仮定した数学モデルと比較することにより、Ｘ胎児異数性のリスクが計算される。

上述のように、好ましい態様では、試料中の胎児ＤＮＡ割合を決定するための選択多型核酸領域、並びにＸ及びＹ染色体に由来する選択核酸領域を両方とも調査するための反応が、単一反応で（つまり、単一の容器中で）実施される。アッセイ系の様々なステップの最中に導入され得る夾雑物又はバイアスは、染色体異常の有無の決定を支援するのに胎児ＤＮＡ含有量を使用する場合に結果を歪める可能性があるが、単一の反応はそのような夾雑物又はバイアスのリスクを最小化するのを支援する。したがって、アッセイを説明した際に言及したように、選択核酸領域の調査に使用されるオリゴヌクレオチドの幾つかのセットは、胎児割合を測定するために多型特異的であり、選択核酸領域の調査に使用されるオリゴヌクレオチドの幾つかのセットは、胎児の性別、又はＸ及びＹ染色体の異数性を決定するために、多型不可知性又はＳＮＰ不可知性であり得る。

他の態様では、１つ又は複数の選択核酸領域を、胎児ＤＮＡ含有量割合の決定、並びにＸ及びＹ染色体異常の検出の両方に使用することができる。選択核酸領域の対立遺伝子を使用して、胎児ＤＮＡ含有量を決定することができ、その後、これらの同じ選択核酸領域を使用して、対立遺伝子特異的又はＳＮＰ特異的情報を無視することで胎児染色体異常を検出することができる。胎児ＤＮＡ含有量及び染色体異常検出の両方に同じ選択核酸領域を使用することにより、実験エラー又は汚染によるあらゆるバイアスを最小限に抑えるのが更に支援される。

１つの実施形態では、母体試料中の胎児供給源寄与は、胎児の性別に関わらず、常染色体ＳＮＰを使用して測定される（Ｓｐａｒｋｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ＆Ｇｙｎ、２０６巻：３１９．ｅ１〜９（２０１２年）を参照）。本方法では、非母体対立遺伝子が父性遺伝の知識を問わずに特定されるため、使用されるプロセスは、父性遺伝子型の予備的知識を必要としない。二項分布が使用される最尤推定量を使用して、各母体試料中の幾つかの有益な遺伝子座にわたって推定胎児核酸寄与を計算してもよい。使用される胎児核酸寄与の計算プロセスは、例えば、２０１２年７月１９日に出願された米国特許出願第１３／５５３，０１２号明細書に記載されている。この文献は、参照により組み込まれる。胎児寄与の決定に使用される多型性領域は、１〜１２番染色体に由来していてもよく、好ましくは、血液型抗原を標的としない。

ある態様では、胎児ＤＮＡのＹ染色体の数の決定は、胎児ＤＮＡのＸ染色体の数の決定とは独立して実施してもよい。
ある態様では、多型アッセイからの胎児寄与の推定を使用して、Ｙ染色体胎児頻度（ＹＦＦ）値が決定される。例えば、ある態様では、胎児頻度は、以下のように規定することができる：

式中、ＰＦ＿Ｐｏｌｙは、多型アッセイからの胎児寄与割合の推定値であり、ＰＦ＿ＣｈｒＹは、Ｙ染色体計数の正規化割合であり、ＰＦ＿ＣｈｒＹは、例えば、Ｙ染色体アッセイ毎の計数中央値と、各常染色体又は参照染色体アッセイ毎の計数中央値との比率を計算することにより決定することができる。ＹＦＦ値が０に近い場合、胎児ＤＮＡは、Ｙ染色体を含まない可能性が高い。ＹＦＦ値が１に近い場合、胎児ＤＮＡは、単一のＹ染色体を含む可能性が高い。ＹＦＦ値が２に近い場合、胎児ＤＮＡは、Ｙ染色体の２つのコピーを含む可能性が高く、Ｙのコピーが更にある場合も同様である。ある態様では、ＹＦＦ値を使用して、３、４、又は５つのコピー等の、試料の胎児ＤＮＡのＹ染色体の２つを超えるコピーの存在が決定される。

ある態様では、ＰＦ＿Ｐｏｌｙの推定値を使用して、Ｘ染色体胎児頻度（ＸＦＦ）値を決定する。ある態様では、ＸＦＦは、試料中の潜在的なＸ染色体組成の各々について異なる定義を使用して、規定されてもよい。例えば、ある態様では、試料ｊのＸ胎児確率

は、単一のＸ染色体を含む胎児ＤＮＡの場合、以下の様に規定してもよい：

式中、

は、胎児ＤＮＡが単一のＸ染色体を含む確率であり、ｐ_０は常染色体の参照割合であり、ｆ_ｊは試料の胎児割合である。好ましくは、使用される胎児割合は、ＰＦ＿Ｐｏｌｙである。

ある態様では、Ｘ胎児確率

は、２つのＸ染色体を含む胎児ＤＮＡの場合、以下の様に規定してもよい：

式中、

は、胎児ＤＮＡが２つのＸ染色体を含む確率であり、ｐ_０は、所与の染色体の参照割合である。
ある態様では、試料ｊのＸ胎児確率

は、３つのＸ染色体を含む胎児ＤＮＡの場合、以下の様に規定してもよい：

式中、

は、胎児ＤＮＡが、３つのＸ染色体を含む確率であり、ｐ_０は、所与の染色体の参照割合であり、ｆ_ｊは、試料の胎児割合である。
ある態様では、胎児ＤＮＡのＸ染色体の数は、

の各々の正規化確率値を比較することにより推定してもよく、この正規化確率値は、ある態様では、上記で算出した確率値を確率値の総計で除算することにより算出される：

ある態様では、最も高い正規化確率は、胎児ＤＮＡのＸ染色体の推定数に相当する。例えば、ｐ２が、ｐ１及びｐ３よりも高い場合、胎児ＤＮＡは、２つのＸ染色体を含む可能性が高い。ある態様では、Ｘ正規化確率値計算を使用して、４つ、５つ又は６つのコピー等の、試料中の胎児ＤＮＡのＸ染色体の３つを超えるコピーの存在が決定される。

測定されたＸＦＦ及びＹＦＦ値は、アッセイ系、作業者間の差、又は他の変数に由来する変動等の、分析中に生じる変動により影響を受ける場合がある。ある態様では、特定の範囲の胎児差分値を、結果報告の目的のための確実性の基準レベルの外側として除外してもよい。幾つかの態様では、０より低いＹＦＦ値は、胎児がＹ染色体を持たないことを明白に示すものと見なされるであろう。幾つかの態様では、０〜１のＹＦＦ値は、Ｙ染色体の存在又は非存在を決定するために必要なレベルの確実性を提供しない。したがって、ある態様では、０〜１等のある範囲に入るＹＦＦ値は、０．１〜０．９（例えば０．２〜０．８）の範囲の胎児差分値のように、確実性範囲に入らないとみなされる。そのような決定は、最終的であるか否かに関わらず、上記で示したような確率値に基づいてリスクスコアを計算するために使用することができる。そのようなリスクスコアは、例えば、母体及び／又は胎児の臨床ケアの助言に使用することができる。

本発明の方法のコンピュータ実施
本発明の方法は、コンピュータ又はコンピュータシステムにより実行することができる。例えば、本方法の「読み取り」、つまり増幅産物のハイスループット配列決定又はアレイに対するハイブリダイゼーションからの生データは、コンピュータ又はプロセッサに伝達され、コンピュータは、例えば、種々の目的配列の出現頻度を「計数」又は「集計」し、頻度を比較し、頻度を正規化し、品質管理及び／又は統計分析を実施し、母体試料の胎児割合又はパーセントを計算し、胎児核酸割合を考慮してゲノムの領域及び／又は染色体の量又は頻度を計算し、リスク確率を決定し、又は他の計算を実施して染色体異常を決定するソフトウェアを実行することができる。１つの実施形態では、コンピュータは、パソコンを含み得るが、コンピュータは、少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含む任意のタイプの機械を含むことができる。

ソフトウェア要素の出力は、例えば、ゲノム領域及び／又は染色体（この場合、Ｘ及び／又はＹ染色体等）が量的異常を有する確率の値のレポートを含む。幾つかの態様では、このレポートは、領域又は染色体が、２つのコピーを有する（例えば、二染色体性）尤度の値、及び領域又は染色体が、より多くのコピーを有するか（例えば、三染色体性）又はより少ないコピーを有する（例えば、一染色体性）尤度の値である。レポートは、紙に印刷されてもよく、又は電子的に、モニターに表示されてもよく、及び／又は電子メール、ＦＴＰ、テキストメッセージ、サーバへの投稿等により電子的にユーザに伝達されてもよい。本発明の正規化プロセスは、ソフトウェアとして実装されると記載したが、ハードウェア及びソフトウェアの組合せとして実装することもできる。加えて、正規化用のソフトウェアは、同一の又は異なるコンピュータで作動する複数の要素として実装されていてもよい。サーバ（あれば）、及びコンピュータは両方とも、プロセッサ、入力デバイス（例えば、キーボード、ポインティングデバイス、音声コマンド用マイクロホン、ボタン、タッチスクリーン等）及び出力デバイス（例えば、表示デバイス、スピーカ等）を含む、典型的な計算デバイスのハードウェア要素（非表示）を含んでいてもよい。サーバ及びコンピュータは、プロセッサにより実行される際に開示される機能を実施するコンピュータ命令を含むコンピュータ読取り可能な媒体、例えばメモリ及び記憶装置（例えば、フラッシュメモリ、ハードドライブ、光ディスクドライブ、磁気ディスクドライブ等）を含んでいてもよい。サーバ及びコンピュータは、通信用の有線又は無線ネットワーク通信インタフェースを更に含んでいてもよい。

実施例
以下の例は、本発明を実施及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために示されており、本発明者らが自らの発明であるとするものの範囲を限定するためのものではなく、下記の実験が、実施された実験の全てであること又は実施した唯一の実験であることを示し又は示唆するためのものでもない。広く記載されている本発明の趣旨又は範囲から逸脱せずに、特定の態様で示されている本発明に、数々の変更及び／又は改変をなすことができることは、当業者であれば理解するであろう。したがって、本態様は、あらゆる点で例示的なものであり、限定的ではないとみなされるべきである。

使用した数値（例えば、量、温度等）に関する正確性を確保する努力がなされているが、幾らかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別様の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。

実施例１：タンデムライゲーション手順で使用されるＤＮＡの調製
被験者のゲノムＤＮＡは、コーリエル・セル・リポジトリーズ（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）（ニュージャージー州カムデン）から取得し、音響剪断（Ｃｏｖａｒｉｓ社、マサチューセッツ州ウーバン）により、およそ２００ｂｐの平均断片サイズに断片化した。

ＤＮＡを、標準的手順を使用してビオチン化した。簡潔に述べると、Ｃｏｖａｒｉｓで断片化したＤＮＡは、１．５ｍｌマイクロチューブ中で以下の反応を起こすことにより末端を修復した：５ｕｇのＤＮＡ、１２μｌの１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社、マサチューセッツ州ビバリー）、５０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社、マサチューセッツ州ビバリー）、及びＨ２０で１２０μｌにした。これを３０分間３７℃でインキュベートした。ＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．５を使用して、約０．５ｎｇ／μｌの所望の終濃度に希釈した。

５μｌのＤＮＡを、９６ウェルプレートの各ウェルに配置し、プレートを粘着性プレートシーラで密封し、２５０×ｇで１０秒間遠心した。その後、プレートを３分間９５℃でインキュベートし、２５℃に冷却し、２５０×ｇで１０秒間再び遠心した。ビオチン化マスター混合物を、１．５ｍｌのマイクロチューブで以下の終濃度に調製した：１×ＴｄＴ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社、マサチューセッツ州ビバリー）、８Ｕ ＴｄＴ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社、マサチューセッツ州ビバリー）、２５０μＭ ＣｏＣｌ_２、０．０１ｎｍｏｌ／μｌビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社、ニュージャージー州ナットレー）、及びＨ２０で１．５ｍｌにした。１５μｌのマスター混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに等分し、プレートを粘着性プレートシーラで密封した。プレートを２５０×ｇで１０秒間遠心し、６０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを、２５０×ｇで１０秒間再び遠心し、７．５μｌ析出混合物（１ｎｇ／μｌデキストランブルー、３ｍＭ ＮａＯＡｃ）を各ウェルに添加した。

プレートを粘着性プレートシーラで密封し、ＩＫＡプレートボルテックスミキサーを使用して、３０００ｒｐｍで２分間混合した。２７．５μｌのイソプロパノールを各ウェルに添加し、プレートを粘着性プレートシーラで密封し、３０００ｒｐｍで５分間ボルテックスした。プレートを３０００×ｇで２０分間遠心し、上清をデカントし、プレートを逆さにして、吸収性ワイプに向けて１０×ｇで１分間遠心した。プレートを５分間空気乾燥させ、ペレットを１０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。等モルプール（各４０ｎＭ）の第１及び第２の遺伝子座特異的固定オリゴヌクレオチドのセットを、上記のように調製したオリゴから生成した。同様に、架橋オリゴヌクレオチドの別々の等モルプール（各２０μＭ）を、選択ゲノム遺伝子座の配列に基づくアッセイプロセス用に生成した。

１０μｇのストレプアビジンビーズを、９６ウェルプレートのウェルに移し、上清を除去した。６０μｌの結合緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ_２、５８％ホルムアミド、０．１７％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０）、１０μＬの４０ｎＭ固定配列オリゴプール、及び実施例２で調製したビオチン化テンプレートＤＮＡの３０μＬをビーズに添加した。プレートを粘着性プレートシーラで密封し、ビーズが再懸濁されるまで３０００ｒｐｍでボルテックスした。５分間７０℃でインキュベーションすることにより、オリゴをテンプレートＤＮＡにアニーリングさせ、その後３０℃に徐冷した。

プレートを、バー隆起型（ｒａｉｓｅｄ ｂａｒ）磁気プレートに２分間設置して、磁気ビーズ及び結合ＤＮＡを、ウェルの側壁に引き寄せた。上清をピペット操作により除去し、５０μＬの６０％結合緩衝液（ｖ／ｖ水溶液）に置換した。ボルテックスによりビーズを再懸濁し、再び磁石に設置し、上清を除去した。このビーズ洗浄手順を、５０ｕＬの６０％結合緩衝液を使用して１回繰り返し、５０μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ_２）を使用して更に２回繰り返した。

ビーズを、１Ｘ Ｔａｑリガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社、マサチューセッツ州ビバリー）、１０Ｕ Ｔａｑリガーゼ、及び２ｕＭ架橋オリゴプール（アッセイ形式に応じて）を含む３７μｌライゲーション反応混合液に再懸濁し、１時間３７℃でインキュベートした。適切な場合、アッセイ形式に応じて、非プルーフリーディング熱安定性ポリメラーゼ及び２００ｎＭの各ｄＮＴＰが、この混合液に含まれていた。プレートを、バー隆起型磁気プレートに２分間設置して、磁気ビーズ及び結合ＤＮＡを、ウェルの側壁に引き寄せた。上清をピペット操作により除去し、５０μＬの洗浄緩衝液に置換した。ボルテックスによりビーズを再懸濁し、再び磁石に設置し、上清を除去した。洗浄手順を１回繰り返した。

ストレプアビジンビーズから産物を溶出するために、３０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ １ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを密封し、ＩＫＡボルテックスミキサーを使用して、３０００ｒｐｍで２分間混合して、ビーズを再懸濁した。プレートを、１分間９５℃でインキュベートし、８チャネルピペッターを使用して上清を吸引した。各ウェルの２５μｌ上清を、ユニバーサル増幅用に、新しい９６ウェルプレートに移した。

実施例２：ライゲーション産物のユニバーサル増幅
重合された及び／又はライゲーションされた核酸を、目的核酸領域にハイブリダイズされた第１及び第２の固定配列オリゴに存在するユニバーサル配列に相補的なユニバーサルＰＣＲプライマーを使用して増幅した。実施例３の各反応混合物の２５μｌを、各増幅反応に使用した。５０μＬのユニバーサルＰＣＲ反応は、２５μＬの溶出したライゲーション産物及び１×Ｐｆｕｓｉｏｎ緩衝液（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、フィンランド）、１Ｍベタイン、４００ｎＭの各ｄＮＴＰ、１Ｕ Ｐｆｕｓｉｏｎエラー修正型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びプール及び配列決定する前に個々の試料を固有に特定するために使用される試料タグを有するプライマー対を含んでいた。ＢｉｏＲａｄ Ｔｅｔｒａｄ（商標）サーモサイクラーを使用して、ストリンジェントな条件下で、ＰＣＲを実施した。

試料の各々に由来するユニバーサルＰＣＲ産物の１０μｌをプールし、プールしたＰＣＲ産物を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して、精製及び定量した。精製したＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００のスライドの単一レーンで配列決定した。配列決定では、典型的には約１００Ｍの生読取りが生じ、そのうち約８５Ｍ（８５％）が、予想アッセイ構造にマッピングされる。これは、実験全体の平均値が約８８５Ｋ読取り／試料、（９６個の遺伝子座を使用する実験の場合）９６個の選択核酸領域全体で９．２Ｋ読取り／複製／遺伝子座に換算される。

実施例３：胎児寄与割合を評価するための多型性遺伝子座の分析
母体試料中の胎児核酸割合を評価するために、１〜１２番染色体の１セットのＳＮＰ含有遺伝子座に対して、１つの塩基が異なる２つの架橋オリゴを使用して各ＳＮＰを調査したアッセイを設計した（例えば、図３を参照）。ＳＮＰは、ＨａｐＭａｐ３データセットの少数対立遺伝子頻度用に最適化した。Ｄｕａｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、３巻（３号）：１３９〜４１頁（２００８年）；Ｅｐｕｂ ２００８年１１月９日。

オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴ（アイオワ州コーラルビル）が合成し、一緒にプールして、単一の多重化アッセイプールを生成した。ＰＣＲ産物を、以前に記載されているように各被験者試料から生成した。有益な多型性遺伝子座は、胎児対立遺伝子が母体対立遺伝子と異なる遺伝子座と定義した。アッセイは９９％を超える対立遺伝子特異性を示すため、遺伝子座の胎児対立遺伝子割合が１〜２０％であると測定された場合、有益な遺伝子座は容易に特定された。最大尤度は、幾つかの有益な遺伝子座の測定値に基づいて、２０１２年７月１９日に出願された同時係属出願の米国特許出願第１３／５５３，０１２号明細書に記載のもの等の二項分布を使用して推定し、最も確実な胎児割合を決定した。結果は、Ｃｈｕ及び同僚ら（Ｃｈｕら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ、３０巻：１２２６〜２９頁（２０１０年）を参照）により示された加重平均手法と良好に相関した（Ｒ２＞０．９９）。

実施例４：染色体特異的ゲノム領域の非多型性部位を使用したＹ染色体頻度異常の検出
第１の実施形態では、Ｙ染色体の特定のゲノム領域に対するアッセイを使用して、Ｙ染色体頻度異常の存在又は非存在を特定した。本アッセイ系は、高度に多重化された系を使用して、複数の個体のＤＮＡにおけるそのような異常の存在又は非存在を特定することを可能にした。

Ｙ染色体（ｃｈｒＹ）、１３、１８、及び２１番染色体（ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１８、及びｃｈｒ２１）に相補的又は由来するオリゴヌクレオチドを使用して、複数の調査を準備した。タンデムライゲーション形式で使用したオリゴヌクレオチドは全て、従来の固相化学を使用して合成した。第１の固定セットのオリゴ及び架橋オリゴヌクレオチドは、５’リン酸部分が、隣接するオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル末端にライゲーション可能なように合成した。ｃｈｒＹに対する３２の非多型アッセイを開発し、ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１８、及びｃｈｒ２１用に開発したアッセイと比較した（例えば、Ｓｐａｒｋｓら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ、３２巻（１号）：３〜９頁（２０１２年）、及びＳｐａｒｋｓら、Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．（２０１２年）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｏｇ．２０１２．０１．０３０を参照）。１〜１２番染色体又はｃｈｒ１３、ｃｈｒ１８、及びｃｈｒ２１の１セットのＳＮＰ含有遺伝子座を使用して、胎児割合を測定した。これらの染色体に由来する胎児割合推定を、２０１１年１２月９日に出願された米国特許出願第１３／３１６，１５４号明細書、及び２０１１年１２月２８日に出願された第１３／３３８，９６３号明細書に記載の多型検出及び確率アルゴリズムを使用して計算した。

Ｙ染色体計数の割合を検出及び計算して、ＰＦ＿ＣｈｒＹを決定した。ＰＦ＿ＣｈｒＹを、算出したＰＦ＿Ｐｏｌｙで除算した。その結果を、１から差し引いてＹＦＦを得た。

ＹＦＦの分散は、この場合、Ｙアッセイ計数、常染色体アッセイ計数、及び算出したＰＦ＿Ｐｏｌｙのブートストラップサンプリングにより計算した。０コピーのＹ、１コピーのＹ、及び２コピー以上のＹのモデルを使用し、ベイズ分析を実施して、０、１、又は２コピー以上を有する確率を評価した。１つの実施では、前のステップで実施された標準偏差を使用して、０コピーの場合は打ち切り正規モデル、及び１コピー又は２コピー以上の場合は正規分布モデルを使用した。差異が０に近い場合、胎児は女性である可能性が高く、差異が１に近い場合、胎児は男性である可能性が高い。本例では、ＹＦＦの結果が、０．２５〜０．６５であるか、又は３．５を超えた場合、その結果は、報告可能な範囲外であるとみなした。しかしながら、観察から導き出した他の閾値を使用して、何が報告可能であるかを確立してもよいと考えられる。

ブートストラップサンプリングを使用して、この胎児差分値の分布を計算し、ｌｏｇ１０オッズ比を計算して、０、１、又は２以上のｃｈｒＹコピーのモデルに適合し、差異が試料由来である尤度を比較した。

得られた結果は、胎児性別の精度が１００％であり、女性７４５人が正しく特定され、男性７９７人が正しく特定されたことを示す。核型分析と、本明細書に記載のｃｈｒＹ分析の使用との間の一致率は、胎児性別決定及びＹ染色体異数性決定の場合、９９．８％が達成された。表１は、検証セットの胎児Ｙ染色体状態の一致率を示す。

実施例５：胎児のＸＯ、ＸＸ、ＸＹ、ＸＸＸ、ＸＸＹ、ＸＹＹ、及びＸＸＹＹ遺伝子型の決定
胎児Ｘ染色体の分析を可能にするために、Ｙ染色体、並びに１３、１８、及び２１番染色体を調査するためのオリゴヌクレオチドのセットに加えて、固定配列及び架橋オリゴヌクレオチドのセットを記載のように使用して、染色体Ｘ遺伝子座を調査した。胎児に存在するＸ染色体の数の尤度を算出する計算を、ｃｈｒＹ、ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１８、及びｃｈｒ２１の数の尤度を算出する計算、並びにＰＦ＿Ｐｏｌｙを決定する計算に加えた。

この研究では、１セットの４３２個の血漿試料を処理した。被験者は全て、盲検症例対照研究の一部であり、妊婦被験者は全て侵襲的検査を受けた。得られた結果を、侵襲的検査から得られた核型と比較した。核型分析した妊娠個体に由来する血漿試料は全て、上記の実施例１〜４に詳述されているプロトコールに従って処理した。試料を選択するために使用した試料受け入れ基準は、母体年齢が１８歳以上、妊娠期間が１０週以上、及び単胎妊娠であった。卵子提供による妊娠は、自己卵子提供及び遺伝学的に無関係な卵子提供を両方とも許容した。

まず、各試料のＴ２１、Ｔ１８、及びＴ１３のリスクを計算した（例えば、２０１１年１２月９日に出願された米国特許出願第１３／３１６，１５４号明細書、２０１１年１２月２８日に出願された米国特許出願第１３／３３８，９６３号明細書を参照）。リスクスコアは、上限９９％、下限０．０１％までとした。１％を超えるリスクを、Ｔ２１、Ｔ１８、又はＴ１３のリスクが高い被験者として分類した。アッセイを使用して決定したＴ２１、Ｔ１８、及びＴ１３のリスクスコアに基づく分類と、核型分析により決定された遺伝子状態を使用して決定したＴ２１、Ｔ１８、及びＴ１３のリスクスコアに基づく分類は一致することが特定された。

実施例４に記載のように、Ｙ染色体分析を実施した。Ｘ染色体の場合、ｃｈｒＸ計数対ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１８、及びｃｈｒ２１計数の割合を使用した。ｃｈｒＸの１、２、又は３つ以上の胎児コピーのモデルは、試料中の測定ＰＦ＿Ｐｏｌｙに基づく期待損失又は期待利得を使用して導き出した。

試料ｊのＸ胎児確率

は、単一のＸ染色体を含む胎児ＤＮＡの場合、以下の様に規定した：

式中、

は、胎児ＤＮＡが単一Ｘ染色体を含む確率であり、ｐ_０は所与の染色体の参照割合であり、ｆ_ｊは試料の胎児割合である。Ｘ胎児の確率

は、２つのＸ染色体を含む胎児ＤＮＡの場合、以下の様に規定することができる：

式中、

は、胎児ＤＮＡが２つのＸ染色体を含む確率であり、ｐ_０は所与の染色体の参照割合である。試料ｊのＸ胎児確率

は、３つのＸ染色体を含む胎児ＤＮＡの場合、以下の様に規定することができる：

式中、

は、胎児ＤＮＡが３つのＸ染色体を含む確率であり、ｐ_０は所与の染色体の参照割合であり、ｆ_ｊは試料の胎児割合である。その後、胎児ＤＮＡのＸ染色体の数を、

の各々の正規化確率値を比較することにより推定した。これらは、上記で算出した確率値を、確率値の総計で除算することにより算出した：

最も高い正規化確率が、胎児ＤＮＡのＸ染色体の推定数に相当した。
胎児に存在するＸ染色体の数の尤度を決定するためのデータ受け入れ基準は、それぞれ１、２、又は３つ以上の胎児染色体Ｘコピーのモデルに適合する３つの計算を使用して、患者試料のｌｏｇ１０オッズを計算した以外は、Ｙ染色体の基準と本質的に同じであった。胎児Ｙ染色体の数について実施された計算と組み合わせて、胎児に存在するＸ染色体の数の尤度を計算する検定では、ベイズモデルを使用して、Ｘ及びＹ染色体のデータを評価し、遺伝子型ＸＯ、ＸＸ、ＸＹ、ＸＸＸ、ＸＸＹ、ＸＹＹ、及びＸＸＹＹの仮定を比較した。胎児の性別（男性対女性）の確率が＜９９％であった場合、胎児Ｘ及びＹ染色体状態の「無結果」が生成された。ＸＦＦは、欠失又は獲得した胎児Ｘ染色体のおおよその数を表す。

４３２個の血漿試料のうち４１４個は、９５．８％の試料合格率のＱＣ基準に合格した。Ｔ２１、Ｔ１８、及びＴ１３の結果は、核型分析と≧９９％の一致を示し、胎児染色体Ｘ及びＹ状態の報告が「無結果」である割合は＜１％であった。胎児Ｘ及びＹ染色体分析は、試料の各性染色体異数性（ＸＯ、ＸＸ、ＸＹ、ＸＸＸ、ＸＸＹ、ＸＹＹ、及びＸＸＹＹ）に対して≧９９％の特異性を示し、染色体異数性ＸＯ（ターナー症候群と関連する）に対して≧８０％の感度を示し、胎児Ｘ及びＹ染色体分析は、胎児性別（男性／女性）に関して＞９９％の精度を示した。

Ｔ２１分類と非Ｔ２１分類との境界として１％のリスクスコアを使用すると、尤度の計算と核型分析との１００％一致が観察された。Ｔ１８分類と非Ｔ１８分類との境界として１％のリスクスコアを使用すると、尤度の計算と核型分析との１００％一致が観察された。Ｔ１３分類と非Ｔ１３分類との境界として１％のリスクスコアを使用すると、尤度の計算と核型分析との１００％一致が観察された。胎児の性別及び異数性決定の結果は、表２に要約されている。

ＸＦＦ＋ＹＦＦ検定結果は、各ＸＯ及びＸＸＸ異数性試料に対して９９．５％の特異性（９５％ウィルソン信頼区間は、９８．１〜９９．９）、並びに各ＸＸＹ、ＸＹＹ、及びＸＸＹＹ異数性試料に対して、１００％の特異性（９５％ウィルソン信頼区間は、９９〜１００）を示した。ＸＦＦ＋ＹＦＦ検定は、ＸＯ異数性試料に対して、９６．３％の感度（９５％ウィルソン信頼区間は、８２〜９９．８）を示した。これは、≧８０％の受け入れ基準に合格する。ＸＦＦ＋ＸＹＹ検定結果は、胎児性別に関して、１００％の精度（９５％ウィルソン信頼区間は、９９〜１００）を示した。

本発明は、本発明の好ましい態様に関して詳細に記載されているように、多くの異なる形態の態様により条件が満たされる。本開示は、本発明の原理の例示とみなされるべきであり、本発明を、本明細書に例示及び記載されている特定の態様に限定するためのものではないことが理解される。当業者であれば、本発明の趣旨からの逸脱せずに、多数の変更をなすことができる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの同等物により規定される。要約及び発明の名称は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。それらの目的は、関係当局並びに一般公衆が本発明の一般的な性質を迅速に決定することを可能にすることである。下記の特許請求の範囲では、用語「手段」が使用されない限り、そこに列挙されている特徴又は要素はいずれも、米国特許法１１２条６項に記載のミーンズプラスファンクション制限として解釈されるべきでない。

Claims (19)

1. 母体試料中の胎児のＸ又はＹ染色体異数性のリスクを計算する方法であって、前記方法のステップはコンピュータで実施されるとともに、
   Ｙ染色体の１つ又は複数の遺伝子座を調査するステップ、
   Ｘ染色体の１つ又は複数の遺伝子座を調査するステップ、
   少なくとも第１の常染色体の１つ又は複数の多型性遺伝子座を調査するステップ、
   前記少なくとも第１の常染色体における多型の頻度を分析することにより、母体試料中の胎児核酸割合を計算するステップ
   Ｙ染色体、Ｘ染色体、及び前記第１の常染色体について、母体試料中の胎児の染色体の相対頻度を推定するステップ、
   計算された胎児核酸割合を用いて、胎児Ｙ染色体が、母体試料中に１つのコピー又は２つ以上のコピーで存在する尤度の値を計算するステップ、
   前記尤度の値を、胎児Ｙ染色体の１つのコピー又は２つ以上のコピーを仮定した数学モデルと比較することにより、母体試料中の胎児Ｙ染色体の異数性のリスクを計算するステップ、
   計算された胎児核酸割合を用いて、胎児Ｘ染色体が、母体試料中に１つのコピー、２つのコピー、又は３つ以上のコピーで存在する尤度の値を計算するステップ、及び
   前記尤度の値を、胎児Ｘ染色体の１つのコピー、２つのコピー、又は３つ以上のコピーを仮定した数学モデルと比較することにより、母体試料中の胎児Ｘ染色体の異数性のリスクを計算するステップ
   を含む方法。
2. 少なくとも２４個の遺伝子座が、Ｘ染色体、Ｙ染色体及び前記少なくとも１つの常染色体の各々で調査される、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも３２個の遺伝子座が、Ｘ染色体、Ｙ染色体及び前記少なくとも１つの常染色体の各々で調査される、請求項２に記載の方法。
4. 各遺伝子座が少なくとも１００回測定される、請求項３に記載の方法。
5. 胎児Ｙ染色体異数性のリスクが、ＹＦＦを使用して計算される、請求項１に記載の方法。
6. 胎児Ｙ染色体が、母体試料中に１つのコピー又は２つ以上のコピーで存在する尤度の値を計算することが、ブートストラップサンプリングにより実施される、請求項１に記載の方法。
7. 前記リスクを計算するステップが、ｌｏｇ１０オッズ比を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
8. 母体試料中の胎児のＸ染色体異数性のリスクを計算する方法であって、前記方法のステップはコンピュータで実施されるとともに、
   Ｘ染色体の１つ又は複数の遺伝子座を調査するステップ、
   少なくとも第１の常染色体の１つ又は複数の多型性遺伝子座を調査するステップ、
   前記少なくとも第１の常染色体における多型性遺伝子座の頻度を分析することにより、母体試料中の胎児核酸割合を計算するステップ、
   Ｘ染色体及び前記第１の常染色体について、母体試料中の胎児の染色体の相対頻度を推定するステップ、
   計算された胎児核酸割合を用いて、胎児Ｘ染色体が、母体試料中に１つのコピー、２つのコピー又は３つ以上のコピーで存在する尤度の値を計算するステップ、及び
   前記尤度の値を、胎児Ｘ染色体の１つのコピー、２つのコピー又は３つ以上のコピーを仮定した数学モデルと比較することにより、母体試料中の胎児Ｘ染色体の異数性のリスクを計算するステップ
   を含む方法。
9. 少なくとも２４個の遺伝子座が、Ｘ染色体で調査される、請求項８に記載の方法。
10. 少なくとも３２個の遺伝子座が、Ｘ染色体及び前記少なくとも１つの常染色体の各々で調査される、請求項９に記載の方法。
11. 各遺伝子座が少なくとも２０回測定される、請求項９に記載の方法。
12. 母体試料中の胎児核酸割合が、信頼性の高い分析の実施に適切か否かを決定することを更に含む、請求項１又は８に記載の方法。
13. 少なくとも１０個以上の多型性遺伝子座が調査される、請求項１又は８に記載の方法。
14. 少なくとも２つの常染色体における少なくとも１０個以上の多型性遺伝子座が調査される、請求項１３に記載の方法。
15. 少なくとも２つの常染色体に由来する多型性遺伝子座の頻度を分析することにより、母体試料中の胎児核酸割合が計算される、請求項１４に記載の方法。
16. 少なくとも３つの常染色体における少なくとも１０個以上の多型性遺伝子座が調査される、請求項１５に記載の方法。
17. 少なくとも３つの常染色体に由来する多型の頻度を分析することにより、母体試料中の胎児核酸割合が計算される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記胎児核酸割合を計算するために、少なくとも９６個の多型性遺伝子座が測定される、請求項１又は８に記載の方法。
19. 胎児Ｘ染色体異数性のリスクが、ＸＦＦを使用して計算される、請求項１又は８に記載の方法。

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