CN104928249B - 一种小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,属于生物医学技术领域。选用顺铂、氟尿嘧啶和环磷酰胺三种药物体内给药并逐渐增加剂量诱导S180腹水瘤小鼠,成功构建了S180多药耐药细胞株,对阿霉素具有交叉耐药性,耐药强度较高,耐药稳定时间较长。本发明为研究肿瘤多药耐药机制、筛选各类抗肿瘤药物、研发包括中药或天然药物类在内的肿瘤耐药逆转药物提供了小鼠肿瘤多药耐药细胞株与动物模型,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明提供一种小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,属于生物医学技术领域。
背景技术
肿瘤多药耐药性(Multi-drug resistance,MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时,对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物产生交叉耐药性,使抗肿瘤化学治疗达不到预期的临床效果。目前,已有很多研究文献显示,一些药物在体外试验具有很好的MDR逆转作用,但真正可用于临床的逆转剂却很少,其主要原因之一是逆转剂的药效学研究大多采用体外给药方法诱导的MDR细胞株及其动物模型,而癌症患者MDR的形成过程是受机体各种内环境影响的。因此,采用体内给药方法建立肿瘤MDR模型更符合临床特点。目前,采用恒定剂量体内给药方法建立肿瘤MDR细胞株已有一些文献报道,但本发明模拟临床常用联合化疗方案,采用体内给药剂量递增法诱导肉瘤180腹水瘤小鼠,建立了获得性肉瘤180MDR细胞株。
发明内容
本发明是针对目前现有技术存在的不足,其目的是提供一种小鼠肉瘤多药耐药细胞株的体内构建方法。
本发明是这样实现的,一种小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,其特征是包括以下步骤:
(1)常规复苏冻存的小鼠肉瘤180(以下简称S180)细胞株,用含牛血清的1640培养液,于37℃、5%CO2培养箱中常规体外培养、传代,以扩增细胞;取体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,调整细胞浓度为6-8×106/ml,取此细胞悬液0.15-0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内,建立S180腹水瘤小鼠模型;
(2)常规饲养S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到S180腹水瘤小鼠腹部明显膨隆后2-3天抽取腹水,用无菌生理盐水稀释,调整细胞浓度为4-6×106/ml,取此细胞悬液0.15-0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内,反复重复步骤(2)进行反复传代,建立稳定生长的S180腹水瘤小鼠模型;
(3)取稳定生长的S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到稳定生长的S180腹水瘤小鼠腹部明显膨隆后2-3天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为1-3×106/mL,取此细胞悬液0.15-0.3mL注入ICR小鼠腹腔内进行传代,传代18-24小时后给予DDP(顺铂)、FU(氟尿嘧啶)和CPA(环磷酰胺)3种药物;
其中,DDP、ip(ip为腹腔注射给药的英文Intraperitoneal injection的缩写)每周一次;FU、ig(ig为灌胃给药的英文Intragastric administration的缩写)每天一次;CPA、ig每天一次;3种药物的剂量按小、中、大递增的方法连续给药,小剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为3mg、3mg、3mg,给药时间为第1代和第2代;中剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为4mg、6mg、6mg,给药时间为第3代和第4代;大剂量为在1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为5mg、12mg、12mg,给药时间为第5代和第6代;
在6代的传代中,皆待肉眼看到ICR小鼠腹部明显膨隆后3-5天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为1-3×106/mL,取此细胞悬液0.15-0.3mL注入ICR小鼠腹腔内进行下一代的传代,直至传到第6代看到ICR小鼠腹部明显膨隆后3-5天抽取腹水,得到的第6代腹水瘤小鼠的腹水瘤细胞,即耐药强度较高、耐药稳定时间较长的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株。
所述步骤(1)中,含牛血清的1640培养液指的是含5-10%胎牛血清的1640培养液。
所述步骤(1)中,对体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,用无菌生理盐水离心、洗涤2-3次。
所述步骤(2)中,细胞悬液0.15-0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内并反复传代3-5代以后建立的稳定生长的腹水瘤小鼠模型。
所述小鼠肉瘤180多药耐药细胞株在小剂量、中剂量和大剂量给药分别停药后的稳定耐药时间分别为不少于1周、2周和3周。
所述小鼠肉瘤180多药耐药细胞株不但对诱导的药物DDP和FU耐药,对从未接触过的作用机制不同的阿霉素也耐药。
本发明设计科学,简单易行。选用顺铂、氟尿嘧啶和环磷酰胺3种临床常用化疗药物体内给药并逐渐增加剂量所建立的肉瘤180耐药细胞株,其耐药强度较高,在给药诱导后传代第二代时其细胞即具有耐药性,在所设计的剂量范围内,对化疗药物的耐药倍数随着给药剂量增大与给药时间延长而增大。该细胞模型的耐药稳定时间较长,在小剂量、中剂量和大剂量给药分别停药后的稳定耐药时间分别为不少于1周、2周和3周。该方法所建立的耐药细胞株不但对所诱导的药物具有耐药性,而且对没有接触过的、化学结构不同的其它抗肿瘤化学药阿霉素(Adriamycin,ADR)也具有交叉耐药性,具有多药耐药的特点。本发明为研究肿瘤多药耐药机制、筛选各类抗肿瘤药物、研发包括中药或天然药物类在内的肿瘤耐药逆转药物提供了小鼠肿瘤多药耐药细胞株与动物模型,应用范围较广。
本发明采用MTT法和流式细胞术,检测低、中、高剂量所诱导细胞对化疗药物的体外耐药倍数、细胞内ADR积累量,验证所诱导细胞的耐药强度。将不同剂量诱导的小鼠腹水瘤细胞末次传代后,停止给予化疗药物,正常饲养、传代,分别在停药1、2或3周后的不同时间,取所诱导的腹水瘤细胞,按上述方法测定细胞对各化疗药物体外的耐药倍数和细胞内ADR积累量,以检测所诱导细胞在不同阶段停止给药后的耐药稳定时间。此外,取诱导并传代第6代的腹水瘤细胞接种于小鼠腋下,制备移植性实体瘤耐药模型,观察化疗药物体内给药对耐药肿瘤移植瘤的影响。
具体实验方法与结果如下:
1.耐药倍数测定
取亲本S180细胞和DDP/FU/CPA低、中、高不同剂量所诱导的S180腹水瘤细胞,制备细胞悬液,以1×l05/mL浓度接种于96孔培养板,100μL/孔,分别给予5个不同浓度的DDP、FU和ADR,每种浓度各设6个复孔,另设空白对照组、亲本细胞对照组、诱导细胞对照组,37℃、5%CO2恒温箱培养44h后,吸取上清100μL弃之,每孔加MTT(5mg/mL)溶液10μL,继续孵育4h后,每孔加酸化异丙醇100μL,振荡10min,吹打均匀后于自动酶标仪490nm波长下测定OD值,计算细胞生长抑制率、半数抑制浓度(IC50)及耐药倍数。耐药程度判断参考Sonw标准(SnowK,Judd W.Characteristics of adriamycinand amsacrine-resistant humanleukaemicTcell lines[J].BrJCancer,1991,63(1):17-28),即:耐药倍数<5为低度耐药,5-15为中度耐药,>15为高度耐药。
计算公式:细胞生长抑制率=(1-实验组吸光度OD/对照组吸光度OD)×100%;
耐药倍数=诱导细胞IC50/亲本细胞IC50。
结果见表1、表2。
表1结果显示,随着诱导剂量增加,所诱导的S180细胞对各化疗药物的耐药倍数逐渐增大,其中低剂量诱导的细胞其耐药强度为低度耐药,中、高剂量诱导的细胞可达到中度耐药,提示所诱导的MDR模型其耐药强度随着诱导时间延长和诱导剂量的递增而逐渐增强。结果还显示,所诱导的S180细胞对ADR具有一定的耐药性,提示其对结构不同的其他化疗药物也产生了耐药性,具有MDR的特点。
表2结果显示,低剂量所诱导的S180细胞停药1周时对各化疗药物仍具有一定的耐药性,但停药2周后其耐药倍数大多低于1.0,提示其耐药稳定时间大于1周,但小于2周;中剂量所诱导的S180细胞停药2周后其各耐药倍数均大于2.50,而停药3周后的耐药倍数接已近于1.0,提示其耐药稳定时间大于2周,但小于3周;从高剂量所诱导的细胞停药2和3周后其对化疗药物的耐药倍数结果可看出,经高剂量诱导后细胞的耐药稳定期不小于3周。与低剂量停药1周后细胞各耐药倍数比较,中、高剂量诱导细胞停药2周后其各耐药倍数均比较高,且停药2周后,高剂量诱导细胞的耐药倍数均比中剂量诱导细胞高,提示随着诱导剂量的增加,所诱导细胞耐药稳定性更好。
表1不同剂量诱导的S180细胞对各化疗药物的耐药倍数(n=6,)
表2不同剂量诱导细胞停止给药后耐药倍数测定
2.ADR积累量测定
收集亲本S180细胞和所诱导的S180细胞,用含5μg/mL ADR的RPMI 1640完全培养基调整细胞至细胞数1×106/mL,分别接种于24孔板,每孔终体积为2.0mL,每组3个平行样品。37℃、5%CO2恒温培养箱中温育3h后将细胞转移到流式细胞管内,用适量冷PBS吹洗,离心,反复3次。最后用1.0mL冷PBS重悬细胞后用流式细胞仪检测10000个细胞内ADR的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。激发波长488nm,发射波长575nm。结果以MFI反映细胞内ADR浓度。
细胞内药物的含量与其发挥生物活性具有正相关关系。而耐药细胞的细胞内药物含量会减少。因此,耐药细胞需要增加剂量才能达到原来的疗效。表3实验结果表明,不同剂量所诱导的S180细胞内ADR的积累量随着诱导时间延长、剂量增大而逐渐减少,与相应亲本细胞的比较具有显著性差异(P<0.001)。
表4实验结果显示,小剂量、中剂量、高剂量所诱导的细胞分别在停药后1周、2周、3周的细胞内ADR积累量显著低于亲本细胞的。
表3不同剂量诱导细胞内ADR的积累量(n=3,)
P<0.05*,P<0.01**,P<0.001***vs亲本细胞
表4停药不同时间后细胞内ADR的积累量
P<0.05*,P<0.01**,P<0.001***vs亲本细胞
3.化疗药物体内给药对S180肿瘤移植瘤耐药模型的影响
取高剂量所诱导的第6代传代的S180MDR腹水瘤细胞株,用无菌生理盐水稀释制成肿瘤细胞悬液,计数并调整细胞浓度至1×106/mL。分别取0.2mL细胞悬液接种于ICR小鼠的右前肢腋下方,建立小鼠S180移植性实体瘤耐药模型。将接种瘤细胞24h后的小鼠随机分为6组,每组10只,即亲本细胞对照组,亲本细胞DDP组,亲本细胞ADR组,诱导细胞对照组,诱导细胞DDP组和诱导细胞ADR组。DDP为腹腔注射,3mg/kg,隔天1次;ADR为灌胃给药,每天一次。给药时间皆为一周。14d后脱颈椎处死小鼠,剥离瘤块并称取瘤质量,计算抑瘤率。计算公式:抑瘤率=(对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%
结果显示,相同剂量下,DDP对S180亲本细胞组的抑瘤率为29.40%,而对诱导细胞组的抑瘤率仅为19.92%,显示了用本发明方法所诱导的S180细胞株建立的动物模型在整体给药时也具有耐药特点。同样,相同剂量下,ADR对S180亲本细胞组的抑瘤率为27.87%,而对诱导细胞组的抑瘤率仅为16.33%,显示了用该方法所构建的S180细胞不但对所诱导的药物具有耐药性,而且对作用机制不同的从未接触过的其他化疗药物也产生了耐药性,具有多药耐药的特点。见表5。
表5化疗药物体内给药对S180肿瘤移植瘤耐药模型的影响(n=10)
具体实施方式
下面对本发明做进一步的说明:
实施例1
常规复苏冻存的小鼠肉瘤180(以下简称S180)细胞株,用含5%胎牛血清的1640培养液,于37℃、5%CO2培养箱中常规体外培养、传代,以扩增细胞;取体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,用无菌生理盐水洗涤、离心2次后重悬,调整细胞浓度为6×106/ml,取此细胞悬液0.15ml接种于ICR小鼠腹腔内,建立S180腹水瘤小鼠模型;常规饲养S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后2天抽取腹水,用无菌生理盐水稀释,调整细胞浓度为4×106/ml,取此细胞悬液0.15ml接种于ICR小鼠腹腔内,反复传代3代,建立稳定生长的S180腹水瘤小鼠模型。
取稳定生长的S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后2天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度至1×106/mL,吸取0.3mL细胞悬液注入小鼠腹腔内进行传代,常规饲养。传代18小时后给予DDP(顺铂)、FU(氟尿嘧啶)和CPA(环磷酰胺)3种药物。DDP,ip,每周一次;FU,ig,每天一次;CPA,ig,每天一次。3种药物剂量按小、中、大递增的方法连续给药,即:小剂量为DDP/FU/CPA 3/3/3(mg/kg),也就是小剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为3mg、3mg、3mg,给药时间为第1代和第2代;中剂量为DDP/FU/CPA 4/6/6(mg/kg),也就是中剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为4mg、6mg、6mg,给药时间为第3代和第4代;大剂量为DDP/FU/CPA5/12/12(mg/kg),也就是大剂量为在1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为5mg、12mg、12mg,给药时间为第5代和第6代。在6代的传代中,皆待肉眼看到ICR小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为1×106/mL,取此细胞悬液0.3mL注入ICR小鼠腹腔内进行下一代的传代,直至传到第6代看到ICR小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,得到的第6代腹水瘤小鼠的腹水瘤细胞,即耐药强度较高、耐药稳定时间较长的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株。
实施例2
常规复苏冻存的小鼠肉瘤180(以下简称S180)细胞株,用含6%胎牛血清的1640培养液,于37℃、5%CO2培养箱中常规体外培养、传代,以扩增细胞;取体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,用无菌生理盐水反复洗涤、离心3次后重悬,调整细胞浓度为7×106/ml,取此细胞悬液0.2ml接种于ICR小鼠腹腔内,建立S180腹水瘤小鼠模型;饲养S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,用无菌生理盐水稀释,调整细胞浓度为5×106/ml,取此细胞悬液0.2ml接种于ICR小鼠腹腔内并反复传代4代,建立稳定生长的S180腹水瘤小鼠模型。
取S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,用生理盐水调整细胞浓度至1.5×106/mL,吸取0.25mL细胞悬液注入小鼠腹腔内进行传代,常规饲养。传代20小时后给予DDP(顺铂)、FU(氟尿嘧啶)和CPA(环磷酰胺)3种药物。DDP,ip,每周一次;FU,ig,每天一次;CPA,ig,每天一次。3种药物剂量按小、中、大递增的方法连续给药,即:小剂量为DDP/FU/CPA3/3/3(mg/kg),也就是小剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为3mg、3mg、3mg,给药时间为第1代和第2代;中剂量为DDP/FU/CPA 4/6/6(mg/kg),也就是中剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为4mg、6mg、6mg,给药时间为第3代和第4代;大剂量为DDP/FU/CPA 5/12/12(mg/kg),也就是大剂量为在1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为5mg、12mg、12mg,给药时间为第5代和第6代。在6代的传代中,皆待肉眼看到ICR小鼠腹部明显膨隆后4天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为1.5×106/mL,取此细胞悬液0.15mL注入ICR小鼠腹腔内进行下一代的传代,直至传到第6代看到ICR小鼠腹部明显膨隆后4天抽取腹水,得到的第6代腹水瘤小鼠的腹水瘤细胞,即耐药强度较高、耐药稳定时间较长的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株。
实施例3
常规复苏冻存的小鼠肉瘤180(以下简称S180)细胞株,用含7%胎牛血清的1640培养液,于37℃、5%CO2培养箱中常规体外培养、传代,以扩增细胞;取体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,用无菌生理盐水反复洗涤、离心3次后重悬,调整细胞浓度为8×106/ml,取此细胞悬液0.25ml接种于ICR小鼠腹腔内,建立S180腹水瘤小鼠模型;饲养S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,用无菌生理盐水稀释,调整细胞浓度为6×106/ml,取此细胞悬液0.25ml接种于ICR小鼠腹腔内并反复传代4代,建立稳定生长的S180腹水瘤小鼠模型。
取S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后2天抽取腹水,用生理盐水调整细胞浓度至2×106/mL,吸取0.2mL细胞悬液注入小鼠腹腔内进行传代,常规饲养。传代24小时后给予DDP(顺铂)、FU(氟尿嘧啶)和CPA(环磷酰胺)3种药物。DDP,ip,每周一次;FU,ig,每天一次;CPA,ig,每天一次。3种药物剂量按小、中、大递增的方法连续给药,即:小剂量为DDP/FU/CPA3/3/3(mg/kg),也就是小剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为3mg、3mg、3mg,给药时间为第1代和第2代;中剂量为DDP/FU/CPA 4/6/6(mg/kg),也就是中剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为4mg、6mg、6mg,给药时间为第3代和第4代;大剂量为DDP/FU/CPA 5/12/12(mg/kg),也就是大剂量为在1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为5mg、12mg、12mg,给药时间为第5代和第6代。在6代的传代中,皆待肉眼看到ICR小鼠腹部明显膨隆后5天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为2×106/mL,取此细胞悬液0.2mL注入ICR小鼠腹腔内进行下一代的传代,直至传到第6代看到ICR小鼠腹部明显膨隆后5天抽取腹水,得到的第6代腹水瘤小鼠的腹水瘤细胞,即耐药强度较高、耐药稳定时间较长的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株。
实施例4
常规复苏冻存的小鼠肉瘤180(以下简称S180)细胞株,用含8%胎牛血清的1640培养液,于37℃、5%CO2培养箱中常规体外培养、传代,以扩增细胞;取体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,用无菌生理盐水反复洗涤、离心3次后重悬,调整细胞浓度为8×106/ml,取此细胞悬液0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内,建立S180腹水瘤小鼠模型;常规饲养S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,用无菌生理盐水稀释,调整细胞浓度为6×106/ml,取此细胞悬液0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内并反复传代5代,建立稳定生长的S180腹水瘤小鼠模型。
取S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,用生理盐水调整细胞浓度至1×106/mL,吸取0.25mL细胞悬液注入小鼠腹腔内进行传代,常规饲养。传代24小时后给予DDP(顺铂)、FU(氟尿嘧啶)和CPA(环磷酰胺)3种药物。DDP,ip,每周一次;FU,ig,每天一次;CPA,ig,每天一次。3种药物剂量按小、中、大递增的方法连续给药,即:小剂量为DDP/FU/CPA3/3/3(mg/kg),也就是小剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为3mg、3mg、3mg,给药时间为第1代和第2代;中剂量为DDP/FU/CPA 4/6/6(mg/kg),也就是中剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为4mg、6mg、6mg,给药时间为第3代和第4代;大剂量为DDP/FU/CPA 5/12/12(mg/kg),也就是大剂量为在1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为5mg、12mg、12mg,给药时间为第5代和第6代。在6代的传代中,皆待肉眼看到ICR小鼠腹部明显膨隆后4天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为1×106/mL,取此细胞悬液0.25mL注入ICR小鼠腹腔内进行下一代的传代,直至传到第6代看到ICR小鼠腹部明显膨隆后4天抽取腹水,得到的第6代腹水瘤小鼠的腹水瘤细胞,即耐药强度较高、耐药稳定时间较长的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株。
实施例5
常规复苏冻存的小鼠肉瘤180(以下简称S180)细胞株,用含9%胎牛血清的1640培养液,于37℃、5%CO2培养箱中常规体外培养、传代,以扩增细胞;取体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,用无菌生理盐水反复洗涤、离心3次后重悬,调整细胞浓度为6×106/ml,取此细胞悬液0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内,建立S180腹水瘤小鼠模型;常规饲养S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后2天抽取腹水,用无菌生理盐水稀释,调整细胞浓度为5×106/ml,取此细胞悬液0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内并反复传代5代,建立稳定生长的S180腹水瘤小鼠模型。
取S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到小鼠腹部明显膨隆后2天抽取腹水,用生理盐水调整细胞浓度至2×106/mL,吸取0.25mL细胞悬液注入小鼠腹腔内进行传代,常规饲养。传代20小时后给予顺铂(DDP)、氟尿嘧啶(FU)和环磷酰胺(CPA)3种药物。DDP,ip,每周一次;FU,ig,每天一次;CPA,ig,每天一次。3种药物剂量按小、中、大递增的方法连续给药,即:小剂量为DDP/FU/CPA3/3/3(mg/kg),也就是小剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为3mg、3mg、3mg,给药时间为第1代和第2代;中剂量为DDP/FU/CPA 4/6/6(mg/kg),也就是中剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为4mg、6mg、6mg,给药时间为第3代和第4代;大剂量为DDP/FU/CPA 5/12/12(mg/kg),也就是大剂量为在1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为5mg、12mg、12mg,给药时间为第5代和第6代。在6代的传代中,皆待肉眼看到ICR小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为2×106/mL,取此细胞悬液0.25mL注入ICR小鼠腹腔内进行下一代的传代,直至传到第6代看到ICR小鼠腹部明显膨隆后3天抽取腹水,得到的第6代腹水瘤小鼠的腹水瘤细胞,即耐药强度较高、耐药稳定时间较长的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株。
以上本发明的实施例中,在DDP、FU和CPA3种药物给药诱导后开始进行的6代传代中,当传代到第2代时的小鼠肉瘤180细胞株即具有耐药性,在所设计的剂量范围内,小鼠肉瘤180细胞株的耐药性随着给药时间延长与给药剂量增大而逐渐增强,当传代到第6代末的小鼠肉瘤180细胞株即为我们所需要的耐药强度较高的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株。
Claims (6)
1.一种小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,其特征是包括以下步骤:
(1)常规复苏冻存的小鼠肉瘤180(以下简称S180)细胞株,用含牛血清的1640培养液,于37℃、5%CO2培养箱中常规体外培养、传代,以扩增细胞;取体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,调整细胞浓度为6-8×106/ml,取此细胞悬液0.15-0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内,建立S180腹水瘤小鼠模型;
(2)常规饲养S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到S180腹水瘤小鼠腹部明显膨隆后2-3天抽取腹水,用无菌生理盐水稀释,调整细胞浓度为4-6×106/ml,取此细胞悬液0.15-0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内,反复重复步骤(2)进行反复传代,建立稳定生长的S180腹水瘤小鼠模型;
(3)取稳定生长的S180腹水瘤小鼠,待肉眼观察到稳定生长的S180腹水瘤小鼠腹部明显膨隆后2-3天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为1-3×106/mL,取此细胞悬液0.15-0.3mL注入ICR小鼠腹腔内进行传代,传代18-24小时后给予DDP(顺铂)、FU(氟尿嘧啶)和CPA(环磷酰胺)3种药物;
其中,DDP、ip每周一次;FU、ig每天一次;CPA、ig每天一次;3种药物的剂量按小、中、大递增的方法连续给药,小剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为3mg、3mg、3mg,给药时间为第1代和第2代;中剂量为在每1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为4mg、6mg、6mg,给药时间为第3代和第4代;大剂量为在1kg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分别为5mg、12mg、12mg,给药时间为第5代和第6代;
在6代的传代中,皆待肉眼看到ICR小鼠腹部明显膨隆后3-5天抽取腹水,用无菌生理盐水调整细胞浓度为1-3×106/mL,取此细胞悬液0.15-0.3mL注入ICR小鼠腹腔内进行下一代的传代,直至传到第6代看到ICR小鼠腹部明显膨隆后3-5天抽取腹水,得到的第6代腹水瘤小鼠的腹水瘤细胞,即耐药强度较高、耐药稳定时间较长的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株。
2.根据权利要求1所述的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,其特征是:所述步骤(1)中,含牛血清的1640培养液指的是含5-10%胎牛血清的1640培养液。
3.根据权利要求1所述的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,其特征是:所述步骤(1)中,对体外扩增的对数生长期的S180细胞悬液,用无菌生理盐水离心、洗涤2-3次。
4.根据权利要求1所述的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,其特征是:所述步骤(2)中,细胞悬液0.15-0.3ml接种于ICR小鼠腹腔内并反复传代3-5代以后建立的稳定生长的腹水瘤小鼠模型。
5.根据权利要求1所述的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,其特征是:所述小鼠肉瘤180多药耐药细胞株在小剂量、中剂量和大剂量给药分别停药后的稳定耐药时间分别为不少于1周、2周和3周。
6.根据权利要求1所述的小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法,其特征是:所述小鼠肉瘤180多药耐药细胞株不但对诱导的药物DDP和FU耐药,对从未接触过的作用机制不同的阿霉素也耐药。
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