CN105979779A - 调整dna甲基化的组合物和方法 - Google Patents

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克莱·布拉登·马什
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Abstract

本文公开了用于调整一种或多种基因启动子DNA甲基化、对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗、降低c‑myc表达、增加桥粒斑蛋白表达以及抑制转移的组合物和方法。

Description

调整DNA甲基化的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年8月16日提交的第61/867,000号美国临时专利申请的申请日期的优先权和权益，其在此全文引入。
发明背景
DNA甲基化通常描述了关闭基因表达的过程。在一些基因的启动子中有着长的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)的延伸(称为“CpG岛”)，这些区域对DNA甲基化——在C的5’位置添加甲基的过程——敏感。甲基在C上的存在抑制了表达基因必需的转录机制。
DNA甲基转移酶(DNMT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)调节甲基化过程。在正常生理下，DNA甲基化是一种瞬时事件，意味着DNMT和HDAC发挥作用对C添加甲基，同时DNA甲基化酶(DNM)和组蛋白甲基转移酶(HAT)发挥作用将其移除。在正常细胞中，DNA甲基化主要发生于重复基因组区域，包括卫星DNA和寄生元件(例如长穿插转位因子(LINES)、短穿插转位因子(SINES)和内源性逆转录病毒)(Yoder等，1997)。CpG岛，特别是那些与启动子相关的，通常是未甲基化的。DNA甲基化通过抑制特异性转录因子的结合直接抑制转录，通过募集甲基-CpG-结合蛋白及其相关抑制染色质重塑活性间接抑制转录。
正确建立和维持的DNA甲基化模式对于哺乳动物发育和成体生物的正常功能以及衰老而言是必需的。DNA甲基化是在面对大量重复DNA时用于沉默基因表达和维持基因组稳定性的强力机制，否则大量重复DNA会介导异常重组事件并导致邻近基因转录失调。
能够有效调节DNA甲基化的组合物和方法仍存在不足。本发明满足了这些需求以及其它需求。
发明概述
本文公开了一种用于调整一种或多种基因启动子DNA甲基化的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种用于对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种用于降低c-Myc表达的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种用于增加桥粒斑蛋白的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种用于抑制转移的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种用于治疗癌症的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐；和一种或多种化疗剂。
本文公开了一种用于治疗癌症的组合物，其包含有效量的下式化合物：
其药学上可接受的盐；和一种或多种抗癌剂。
本文公开了一种调整对象中一种或多种基因启动子DNA甲基化的方法，包括向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种调整对象中一种或多种基因启动子DNA甲基化的方法，包括通过测定一种或多种基因启动子的甲基化状态来鉴定需要治疗的对象；并向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法，包括向对象施用有效量的含有下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种降低对象中c-myc表达的方法，包括向对象施用有效量的含有下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种增加对象中桥粒斑蛋白表达的方法，包括向对象施用有效量的含有下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种抑制对象中的转移的方法，包括向对象施用有效量的含有下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐；并调整一种或多种基因启动子的DNA甲基化状态。
附图简述
包含在本说明书中并构成本说明书一部分的附图描述了本发明的几个方面，并和说明书一起用于解释本发明的原理。
图1A-1E显示了体外和体内的DNA甲基转移酶mRNA表达。图1A显示与DMSO相比，AKB-6899(i)在10μM下显著抑制了DNMT-1，(ii)在25μM下显著抑制了DNMT-1和DNMT-3a和(iii)在50μM下显著抑制了DNMT-1和DNMT-3a。对PyMT肿瘤细胞不处理、用DMSO处理或用AKB-6899(10、25或50μM)处理24小时。对细胞进行Trizol抽提以回收总RNA。合成了cDNA用于DNMT-1和DNMT-3a mRNA表达的RT-PCR。图1B显示与DMSO相比，AKB-6899(25μM)显著减少DNMT-1和DNMT-3a两者的表达。对人MDA-MB-231肿瘤细胞不处理、用DMSO处理或用AKB-6899(25μM)处理24小时。分离总RNA用于RT-PCR。图1C(DNMT-1)、图1D(DNMT-3a)和图1E(DNMT-3b)比较了在不处理(UTX)、DMSO处理、5-AZA处理或AKB-6899(17.5mg/kg)处理的小鼠移植人宫颈肿瘤中由RT-PCR评价的AKB-6899的效果和5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-AZA)的效果。
图2A-2D显示了体外和体内的HDAC表达。图2A(按HDAC分组)和图2B(按处理分组)都显示了人宫颈癌细胞系(HeLa)中HDAC1-HDAC10的表达。对细胞不处理、用DMSO处理或用AKB-6899(5或50μM)处理，或用丁酸苯酯(PBA)处理，后者被认为是HDAC抑制剂的“黄金标准”。图2C显示了DMSO、5-氮杂-2’脱氧胞苷(地西他宾)或AKB-6899处理后小鼠中的人宫颈肿瘤中HDAC1的表达。图2D显示了DMSO、5-AZA或AKB-6899(17.5mg/kg小鼠重量)处理后人宫颈癌肿瘤中的HDAC3表达。
图3A-3E显示了在PyMT乳腺癌细胞(3A)、人MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞(3B)、人C8161.9黑素瘤细胞(3C)和人MCF-7乳腺癌细胞(3D)中AKB-6899(25μM)对桥粒斑蛋白(DSP)基因启动子甲基化的影响。在图3A中，DSP启动子为100％未甲基化(AKB-6899)相对于99.99％甲基化(溶媒)。在图3B中，DSP启动子为99.62％未甲基化(AKB-6899)相对于99.89％甲基化(溶媒)。在图3C中，DSP启动子为99.90％未甲基化(AKB-6899)相对于42.04％甲基化(溶媒)。在图3D中，DSP启动子为92.48％未甲基化(AKB-6899)相对于98.48％甲基化(溶媒)。在图3E中，与溶媒(DMSO)比较，用AKB-6899处理PyMT细胞增加了DSP的表达。
图4A-4B显示了体外和体内的桥粒斑蛋白mRNA表达。图4A显示了用DMSO或AKB-6899(10μM)处理后的培养的PyMT细胞。与DMSO相比，AKB-6899显著增加桥粒斑蛋白mRNA表达。图4B显示了来自PyMT肿瘤(体内)的桥粒斑蛋白表达。与溶媒相比，AKB-6899显著增加桥粒斑蛋白表达。
图5A-5B显示了AKB-6899处理后桥粒斑蛋白的蛋白表达。在图5A中，培养的PyMT肿瘤细胞用DMSO或AKB-6899(10μM)处理24小时。AKB-6899增加桥粒斑蛋白的蛋白表达。在图5B中，在人MDA-MB-231细胞中检测了桥粒斑蛋白的蛋白表达，其不表达桥粒斑蛋白。
图6A-6B显示了各种处理后图6A中的c-Myc启动子和图6B中的DSP启动子的CpG甲基化百分比。对HeLa宫颈癌细胞不处理、用DMSO处理或用AKB-6899(5或25μM)处理，或用PBA(2mM)处理。与DMSO和PBA相比，AKB-6899造成(precipitated)了这两个启动子的去甲基化。
图7A-7B显示了各种体内处理后7A中的c-Myc启动子DNA甲基化百分比和7B中的c-Myc启动子相对拷贝数。对人宫颈肿瘤动物模型不处理、用DMSO处理、用5-AZA处理或用AKB-6899(17.5mg/kg)处理。显示AKB-6899使c-Myc启动子完全脱甲基并抑制c-Myc表达。
图8A-8B显示了AKB-6899的细胞毒性。在图8A中，HeLa细胞用AKB-6899、多西他赛或组合的AKB-6899和多西他赛以不同浓度处理。使用XTT分析测定存活百分率。在图8B中，MDA-MB-231细胞用AKB-6899、多西他赛或组合的AKB-6899和多西他赛以不同浓度处理。使用XTT分析测定存活百分率。
图9显示了不同处理对移植到SCID小鼠中的人A375黑素瘤细胞的影响。在处理中，测定了肿瘤生长。使用下述组合之一处理动物：溶媒/溶媒、溶媒/AKB-6899(17.5mg/kg)、多西他赛(30mg/kg)/溶媒或多西他赛/AKB-6899。明显的肿瘤形成19天后，接受溶媒/AKB-6899组合的小鼠中的肿瘤具有对照74％大小的肿瘤；接受多西他赛/溶媒组合的小鼠中的肿瘤具有对照49％大小的肿瘤；接受多西他赛/AKB-6899组合的小鼠中的肿瘤具有对照13％大小的肿瘤。
图10A-10B显示AKB-6899以剂量依赖的方式抑制DNMT转录。在图10A中，AKB-6899以剂量依赖的方式在体外人鳞状细胞癌肺癌细胞(H1703)中抑制DNMT-1、DNMT-3a和DNMT-3b转录。DMSO处理的DNMT mRNA超过1.0，表示表达水平高于看家对照基因CAP1。在图10B，AKB-6899在人腺癌肺癌细胞(A549)中抑制DNMT-3a和DNMT-3b转录。DMSO处理的DNMT mRNA低于1.0，表示表达水平低于看家对照基因CAP1。
图11A-11D显示了两种类型的人肺癌细胞中23个不同基因启动子的甲基化百分比——图11A和11B对应H1703鳞状细胞癌，图11C和图11D对应A549腺癌。DMSO被用作溶媒并被用作对照。与DMSO处理的对照组相比，AKB-6899(10μM和50μM)以剂量响应方式减少了DNA甲基化的百分比。Dec/PBA条件代表组合的5μM地西他宾(5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-AZA)，其为一种脱甲基化剂)和2mM磷酸丁酸(PBA，HDAC抑制剂)。在所有检测的启动子和两种类型的肺癌中，AKB-6899对基因启动子脱甲基化，从而AKB-6899处理后的％DNA甲基化水平低于DMSO处理的对照细胞(DMSO)的％DNA甲基化水平。
图12A-12D显示了在两种类型的人肺癌(即，图12A的H1703鳞状细胞癌和图12B的A549腺癌)细胞中一系列(panel)14种常规肿瘤抑制子基因的mRNA表达水平。AKB-6899和Dec/PBA在H1703鳞状细胞癌中比在A549腺癌中更有效地诱导mRNA表达。除了一种CDKN1C基因，A549腺癌细胞中所有的肿瘤抑制子mRNA都应答AKB-6899发生扩增，其中与标准化为1.0的DMSO相比表达水平为0.1(AKB10)和0.9(AKB50)。在图12A-12B中，以下表示(apply)："1"＝DMSO，"2"＝AKB-6899(10μM)，"3"＝AKB-6899(50μM)和"4"＝组合的地西他宾(5μM)/PBA(2mM)。图12C和12D是这14种基因mRNA表达的原始数据。
图13A-13B显示了应答增加剂量的AKB-6899的正常肺上皮细胞(BEAS-2B)和肺癌细胞(H1703鳞状细胞癌和A549腺癌)的XTT细胞存活分析。在图13A，甚至在最高剂量下也没有检测到BEAS-2B细胞存活率的显著下降。在图13B，随着增加剂量的AKB-6899，存在对两种肺癌细胞的显著毒性。
图14A-14C显示了AKB-6899全身用药的效果。通过腹腔注射(i.p.)AKB-6899或腹腔注射(i.p.)DMSO每周3次处理小鼠，共三周。去除肺部并进行分析以测定DNMT mRNA表达、CpG甲基化百分比和mRNA倍数变化。数据显示AKB-6899下调DNMT的表达并减少DNA甲基化。图14A显示与DMSO相比处理，AKB-6899(17.5mg/kg)抑制正常小鼠肺中的DNMT-1、DNMT-3a和DNMT-3b的表达。图14B显示AKB-6899在这些小鼠肺中使DSP和RASSF1启动子脱甲基化。图14C显示由于图14B中描述的脱甲基化，DSP和RASSF1mRNA表达水平增加。通过各自基因表达的DMSO水平将数据标准化至1.0。(n＝4个肺每个条件)。
图15显示了对MDA-MB-231癌细胞给药AKB-6899后的RNAseq数据(与DMSO处理的MDA-MB-231癌细胞相比)。
本发明另外的优点一部分在随后的说明书中显示，一部分从说明书中是显而易见的或可通过在本发明的实践中学习。应理解下述一般描述和下述详细描述都是示例性的，其对于按照所要求的本发明并不是限制性的。
发明详述
参考下文发明详述及其包含的实施例可以更容易地理解本发明。
在本化合物、组合物、物品(articles)、系统、装置和/或方法被公开和描述前，应理解它们不限于特定合成方法，除非另有说明，也不限于特定试剂，除非另有说明，因为这些显然可以变化。还应该理解本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并不意味着是限制性的。虽然在本发明的实践或测试中可以使用任何与本文描述的相似或相当的方法和材料，目前仍要描述示例性的方法和材料。
本文提及的所有出版物在此引入作为参考以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。提供本文讨论的出版物仅因为它们早于本申请的申请日公开。本文的任何部分都不应被解释为承认本发明由于在先发明而不享有先于这些出版物的权利。
A.定义
在说明书和附加的权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括了复数的指示，除非上下文有清楚规定。
本文中范围可以表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表达这样一个范围时，进一步的方面包括从该一个特定值和/或至该另一特定值。类似的，当数值作为约数表达时，通过使用先行词“约”，将理解该特定值形成了一个进一步的方面。将进一步理解，每个范围的端点在涉及另一端点和独立于另一端点方面都是重要的。也可以理解，有一些本文公开的值，并且每个值在本文中也被公开，如“约”除了该值本身的该特定值。例如，如果公开了值“10”，那么“约10”也被公开。也可以理解，两个特定单位之间的每个单位也被公开。例如，如果10和15被公开，那么11、12、13和14也被公开。
说明书和最后的权利要求书中对组合物中的特定元素或组分的重量分数的引用表示该元素或组分与组合物或物品(article)中表达了重量分数的任何其他元素或组分之间的重量关系。从而，在含有2重量分数的组分X和5重量分数的组分Y的化合物中，X和Y以2:5的重量比存在，并以该比例存在而不考虑化合物中是否含有额外组分。
如本文使用的术语“可选的”或“可选地”表示随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，且该描述包括了所述事件或情况发生及其不发生的例子。例如，在一个方面，公开的组合物包括公开的组合物，诸如，例如，AKB-6899，可以可选地包括一种或多种其它试剂，诸如，例如，抗癌剂或抗-增殖剂或抗-甲基化剂或化疗剂。
如本文使用的术语“类似物”指具有衍生自亲代化合物(例如，本文公开的化合物)的结构的化合物，且其结构与本文公开的那些足够相似，而基于该相似性，其将被本领域技术人员期望会显示与所要求保护的化合物相同或相似的活性和用途或会作为前体诱导与所公开的化合物诸如，例如，ABK-6899相同或相似的活性和用途。
如本文使用的“同系物”或“同源物”指与特定已知序列具有同源性的多肽或核酸。特别公开了与所陈述的或已知的序列具有至少40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99百分比同源性的本文公开的核酸和多肽的变体。在一个方面，特别公开的核酸和多肽包括下述：APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1和VEGF-A。在一个方面，特别公开的核酸和多肽包括下述：HIF、DNMT-1、DNMT-3a、DNMT-3b、PHD1、PHD2、PHD3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7。本领域技术人员理解如何测定两种蛋白或核酸的同源性。例如，可以在对比两条序列从而使得同源性在其最高水平之后计算同源性。应理解定义本文公开的基因和蛋白的任何变体、修饰或衍生物的一种方式是通过根据对特定已知序列的同源性来定义该变体、修饰或衍生物。
如本文所使用的，术语“对象”指的是给药的目标，例如，动物。术语“对象”还包括家养动物(例如，猫，狗等)，家畜(例如，牛，马，猪，绵羊，山羊，等)以及实验室动物(例如，小鼠，兔，大鼠，豚鼠，果蝇等)。因此，本文公开的方法的主体可以是脊椎动物，如哺乳动物，鱼类，鸟类，爬行动物，或两栖动物。另外，本文公开的方法的主体可以是人类，非人类灵长类动物，马，猪，兔，狗，羊，山羊，牛，猫，豚鼠，或啮齿动物。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生儿对象以及胎儿，不论是男性还是女性，旨在被包括在内。
对象可以是不健康的主体。换句话说，对象可以是不健康的。例如，对象也可以受到一种或多种疾病或病症的折磨。疾病或病症可以是特征在于一种或多种基因启动子超甲基化的疾病或病症。在一方面，疾病或病症可以是癌症或肿瘤或异常性细胞生长。在一个方面，肿瘤可以是实体瘤。在一个方面，肿瘤可以不是实体瘤。在公开的方法的一个方面，对象可以在给药步骤之前被诊断为患有需要治疗的一种或多种上述疾病或病症。在公开的方法的一个方面，对象可以被诊断为需要诱导恶性细胞，诸如，例如，恶性癌细胞的凋亡。在公开的方法的一个方面，对象可以被诊断为需要调节一个或多个基因启动子的DNA甲基化。在公开的方法的一个方面，对象可以被诊断为需要改变一个或多个基因的启动子的甲基化状态，诸如，例如，通过降低一种或多种基因启动子的甲基化百分比。在一个方面，对象可以患有不是血管渗漏的疾病或病症。在一个方面，对象可以患有不是视网膜病的疾病或病症。在一个方面，对象可以患有不是严重肢体缺血(CLI)的疾病或病症。
如本文使用的"患者"可以是对象，诸如，例如，人类对象。
如本文使用的术语“治疗”指的是与意图治愈、改善、稳定、或预防疾病、病理状态或病症(如，例如，特征在于一个或多个基因启动子DNA超甲基化的疾病或病症)的患者的医疗管理。这个术语包括积极治疗，即，特别指向疾病、病理状况或病症的改善的治疗，并且还包括因果治疗，即，指向去除相关疾病、病理状态或病症的病因的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于症状减缓而非疾病病理状况或病症的治愈；预防性治疗，即指向最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展的治疗；和支持治疗，也就是用于对指向相关疾病或病症、病理状态或病症的改善的另一具体治疗进行补充的治疗。在各方面中，该术语涵盖对对象的任何治疗，包括哺乳动物(例如，人)，并且包括：(i)预防所述疾病或病症在易患所述疾病或病症、但尚未被诊断为患有它的对象中发生；(ii)抑制疾病或病症，即阻止其发展；或(iii)缓解疾病或病症，即，引起疾病或病症的消退，或减轻与疾病或病症相关的症状。
如本文使用的术语“预防”或“防止”是指排除，转移，避免，预防，阻止或阻碍一些事情发生，特别是通过预先的行动。可以理解的是，在本文中使用减少、抑制或防止时，除非另外具体指出，否则也明确公开了其他两个词的使用。在一个方面，旨在防止恶性细胞生长。在一个方面中，公开了抑制或减少或降低一种或多种基因启动子的甲基化百分比。在一个方面，公开了改变或调节一个或多个基因启动子的甲基化状态。
如本文使用的术语“诊断”是指已经由技术人员例如医师进行体检，并发现患有可由本文所公开的化合物、组合物或方法诊断或治疗的病症。例如，“诊断患有癌症”和“患有癌症”的意思是已经由技术人员例如医师进行体检，并发现患有可由能够防止或抑制恶性细胞生长和/或能够在如癌细胞或肿瘤细胞的细胞群中诱导凋亡的化合物或组合物诊断或治疗的病症。作为进一步的例子，“诊断患有以超甲基化为特征的疾病或病症”是指已经由技术人员例如医师进行体检，并发现患有以一种或多种基因启动子超甲基化为特征的病症，其中调节或改变一个或多个基因启动子的甲基化状态对对象是有益的。在一个方面，降低一种或多种基因启动子的甲基化百分比有益于对象。
如本文使用的短语“鉴定为需要对其进行治疗”，或类似短语，是指基于对疾病或病症或病或状况的治疗的需求的对象的选择。鉴定的对象可以是不健康的对象。例如，基于由技术人员进行的早期诊断，对象可以被鉴定为对疾病或病症(例如，其特征在于一个或多个基因启动子的超甲基化的疾病或病症)的治疗存在需求，然后治疗该疾病或病症。例如，基于由技术人员进行的早期诊断，对象可以被鉴定为对病症(例如，癌症或实体瘤或非实体瘤或与恶性细胞生长相关的一些其它病症或需要细胞群凋亡的病症)的治疗存在需求，然后治疗该病症。可以预期的是在一个方面，鉴定可以由与做出诊断的人不同的人进行。还可以设想，在进一步的方面，给药可以由进行检测或评价的人来进行。
如本文使用的“异常”DNA甲基化可以指超甲基化、低甲基化或两者。在一个方面，异常DNA甲基化可以指一种或多种基因启动子的超甲基化。如技术人员所知的，超甲基化可以指当基因启动子在细胞或组织(即，感染的细胞或组织)中相对于正常细胞或组织(即，未感染的细胞或组织)中的甲基化百分比更大程度的甲基化。在一个方面，异常DNA甲基化可以影响一种或多种下述基因启动子：APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1和VEGF-A。在一个方面，异常DNA甲基化可以影响一种或多种下述基因启动子：HIF、DNMT-1、DNMT-3a、DNMT-3b、PHD1、PHD2、PHD3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7。
表1涉及DNA超甲基化的癌症列表
表2涉及DNA低甲基化的癌症列表
阑尾癌
中枢神经癌
胰岛细胞瘤
胸膜肺母细胞瘤
咽喉癌
甲状腺癌
输尿管癌
肾母细胞瘤
表3可能涉及DNA超甲基化的癌症列表
艾滋病相关淋巴瘤
童年视通路及下丘脑癌
颅外生殖细胞肿瘤
性腺外生殖细胞肿瘤
下丘脑和视神经通路胶质瘤
中分化松果体实质肿瘤
原发性中枢神经系统淋巴瘤
涉及15号染色体上的NUT基因的呼吸道癌
睾丸癌
"甲基化特异性PCR"或"MSP"可以指一种分析，其需要通过亚硫酸氢钠进行DNA初始修饰，将所有未甲基化的而非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并随后用甲基化特异性引物相对于未甲基化的DNA进行扩增。本领域已知MSP是一种用于分析CpG岛中几乎任何CpG位点的组的DNA甲基化状态的简单、快速和成本效益好的方法。该技术包括两部分：(1)在甲基化的胞嘧啶保持不变的条件下用亚硫酸氢钠转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，和(2)使用针对未甲基化的和甲基化的DNA两者的特异性引物集通过PCR检测亚硫酸氢盐诱导的序列差异。MSP仅需要少量的DNA，对给定CpG岛基因座的0.1％甲基化的等位基因敏感，并可对从石蜡包被样品中抽提的DNA实施。MSP消除了之前基于依赖差异性限制性内切酶裂解以区分甲基化的和未甲基化的DNA的PCR方法所固有的假阳性结果。(关于更多的MCP信息参见Herman等，1996和Derks等，2004)
如本文使用的术语“施用”和“给药”是指对对象提供所公开的组合物或药物制剂的任何方法。这样的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于：口服给药、经皮给药、吸入给药、鼻腔给药、局部给药、阴道内给药、眼部给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药、舌下给药、颊部给药和肠胃外给药，包括可注射如静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药和皮下给药。给药可以是连续的或间歇性的。在各方面中，制剂可治疗性施用；也就是说，施用以治疗存在的疾病或病症。在进一步的各个方面，制剂可预防性施用；也就是说，施用以预防疾病或病症。
本文所用术语“接触”是指将公开的组合物或化合物(例如，包含AKB-6899的组合物)以某种方式与预定目标(诸如，例如，基因启动子、DNA甲基化中涉及的酶、细胞或细胞群、受体、抗原或其它生物实体)置于一起，所述方式使得公开的组合物或化合物能够影响预定目标(诸如，例如，基因启动子、DNA甲基化中涉及的酶、受体、转录因子、细胞、细胞群，等等)，其可以是直接影响(即，通过与目标自身相互作用)或间接影响(例如，通过与另一基因例如上游基因作用)；分子；酶(例如，HDAC或PHD或DNMT)；辅因子；因子；或目标活性所依赖的蛋白的活性。在一个方面，公开的组合物或化合物可以与细胞或细胞群接触，诸如，例如，癌细胞或肿瘤细胞。
如本文使用的术语“测定”可以指检测或确定在表达和/或在活性水平或在流行病和/或发病率中的活性或事件或数量或总量或变化。例如，测定可以指检测或确定一种或多种基因启动子的甲基化状态。测定可以指检测或确定一种或多种基因启动子的甲基化百分比。在一个方面，测定可以包括利用来自单一对象的样品(对象内测定)或可以包括利用来自多个对象的样品(对象间测定)。检测或确定DNA甲基化的方法是本领域已知的。
在一个方面，如本文使用的测定可以指检测或确定凋亡的数量或总量。测定也可以指检测或确定目标基因或蛋白的活性或表达的数量或总量，诸如，例如，PHD、DNMT、HDAC、HIF，等等。在一个方面，测定也可以指检测或确定微小RNA或核仁小RNA的数量或总量。本文使用的用于测定在表达和/或在活性水平或在流行病和/或发病率中的活性或事件或数量或总量或变化的方法和技术可以指技术人员为了检测或确定一些可量化值而采取的步骤。本领域熟悉用于检测在表达和/或在活性水平或在流行病和/或发病率中的活性或事件或数量或总量或变化的方法。在一个方面，测定可以指检测一种或多种启动子的基因表达或蛋白表达，包括APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1和VEGF-A。在一个方面，测定可以指检测一种或多种启动子的基因表达或蛋白表达，包括HIF、DNMT-1、DNMT-3a、DNMT-3b、PHD1、PHD2、PHD3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7。在一个方面，测定可以在事件前发生，或事件后发生，或事件(例如给药步骤)前后都发生。
如本文使用的术语“有效量”指足以达到期望效果或对不期望的情况具有效果的量。例如，“治疗有效量”指足以达到期望治疗效果或对不期望的症状具有效果、但通常不足以造成不良副作用的量。例如，在一个方面，有效量的公开的组合物或化合物是有效调节一种或多种基因启动子的甲基化状态的量。在一个方面，有效量的公开的组合物是有效减少或最小化一种或多种基因启动子的甲基化百分比的量。在一个方面，有效量的公开的组合物或化合物是在目标细胞或细胞群中有效诱导凋亡的量，诸如，例如，具有一种或多种基因启动子异常DNA甲基化的细胞。
对任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将依赖于多个因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药的时间；给药途径；所采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；药物与所采用的具体化合物组合使用或同时使用和医学领域熟知的相似因素。例如，本领域的技术人员能够在比达到期望治疗效果所需水平的剂量更低的水平开始所公开的组合物或化合物的给药，并逐渐增加剂量，直至获得期望的效果。如果需要，有效日剂量可以分成多个剂量用于给药目的。因此，单剂量组合物可含有这样的量或其约数，以构成日剂量。剂量可在任何禁忌症的情况下由个体医师进行调整。剂量可以变化，并且可以以一个或多个剂量每日给药，共一天或几天。在一个方面中，制剂可以以“预防有效量”来施用；即，有效用于预防疾病或病症的量。
术语“药学上可接受的”描述了不是生物学或其它方面不期望的材料，即，不会引起不可接受水平的不希望的生物效应或以有害的方式相互作用的材料。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指无菌的水性或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及在使用之前用于复溶成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或溶媒的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯例如油酸乙酯。这些组合物也可含有助剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物活动的预防可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。也可以期望包括等渗剂如糖、氯化钠和类似物。注射药物形式的延长吸收可以通过包含如单硬脂酸铝和明胶等延迟吸收的试剂来实现。可注射的储库形式通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成药物的微囊基质来制备。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，药物释放的速率可以得到控制。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中制备贮库注射制剂。注射制剂可以通过例如细菌截留过滤器过滤进行灭菌，或通过在其中包含在使用前可以溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质的无菌固体组合物形式中掺入灭菌剂进行灭菌。合适的惰性载体可以包括糖，如乳糖。
如本文使用的“干扰RNA”或“RNA干扰”(RNAi)技术是本领域已知的。RNA干扰依赖于RNA和它的靶mRNA的互补性促成目标的破坏。在体内，dsRNA的长区段(stretches)可以与DICER内切核糖核酸酶相互作用被分裂为带有3'突出的短(21-23nt)的dsRNA。然后，内源性或人工合成的dsRNA短区段进入含多核酸酶RNA诱导的沉默复合物(RISC)，这些酶导致互补目标的特异性切割。虽然短(<23nt)的RNA片段通常被认为是最适合于基因沉默的，但是还已经表明，较长的(<30个核苷酸)的序列可导致有效，甚至更强的，基因沉默。本领域技术人员熟悉几种不同类型的常用RNAi：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA)，所有这些都可以抑制目标基因产物的表达。所述siRNA和shRNA(通常20-22nt的长度，但它们可以是高达30nt)被设计以克服当更长的RNA序列被用于RNAi的时候观察到的与免疫系统刺激和完整的翻译阻滞(arrest)问题，并优化沉默效果。
“微小RNA”或“miRNA”是一种RNAi诱导剂，指约19至约27个碱基对的单链、非编码RNA分子，其以序列特异性的方式调节基因表达。miRNA是结合到靶信使RNA转录体(mRNA)的互补序列的转录后调节子，通常导致翻译抑制或靶降解和基因沉默。在一个方面，微小RNA可以靶向甲基化调节剂如DNMT和HDAC。在一个方面，包含AKB-6899的公开的组合物可以增加微小RNA的表达。在一个方面，公开的组合物能调节微小RNA的表达。在一个方面，微RNA可引起DNMT、HDAC和/或其他基因，例如肿瘤抑制基因的差异甲基化。在一个方面，微RNA序列可以使用多聚A尾的引物来鉴定。在一个方面，多聚A尾的RNA可以被翻译为蛋白质。
“短干扰RNA”或“siRNA”，也被称为小干扰RNA，是可诱导序列特异性转录后基因沉默、从而降低基因表达的双链RNA。siRNA可以是各种长度，只要它们保持它们的功能。在一些实例中，siRNA分子是大约19-23个核苷酸长度，例如至少21个核苷酸，例如至少23个核苷酸。在一个实例中，在siRNA和靶RNA之间的序列同一性的区域内，siRNA触发同源RNA分子如mRNA的特异性降解。在一个例子中，当具有3'突出端碱基对时siRNA能引起靶mRNA的序列特异性降解。dsRNA处理的方向决定了是有义还是反义靶RNA能够被产生的siRNA核酸内切酶复合物所切割。siRNA可以通过利用例如Invitrogen的BLOCK-ITTM RNAi Designer来产生(rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress)。此外，一旦siRNA分子的核苷酸组合物被确定，即可使用一个可以公开访问的、在线的序列“扰乱器(scrambler)”来确保与人mRNA的最小脱靶结合(即，sirnawizard.com/scrambled.php上的网页)。此外，可以使用可公开访问的，在线序列分析软件确保最小自互补(即，在basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html上的网页)。
在一个方面，siRNA可被用于调节转录或翻译，例如，通过降低一种或多种所公开的基因的表达，诸如，例如，HIF、DNMT-1、DNMT-3a、DNMT-3b、PHD1、PHD2、PHD3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7。在一个方面，siRNA可被用于调节转录或翻译，例如，通过降低一种或多种所公开的基因的表达，诸如，例如，APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1和VEGF-A。
shRNA(短发夹RNA)是可被克隆到表达载体中来表达siRNA(通常19-29nt的RNA双链体)用于RNAi干扰研究的DNA分子。shRNA具有以下结构特征：源自目标基因的约19-29个核苷酸的短核苷酸序列，随后是约4-15个核苷酸的短间隔(即，环)和作为初始靶序列的反向互补序列的约19-29的核苷酸序列。
一般地，术语“反义”是指能够凭借一些序列互补性与一部分RNA序列(如mRNA)杂交的核酸分子。本文所公开的反义核酸可以是双链或单链寡核苷酸，RNA或DNA或其修饰物或衍生物，其可(例如通过对对象施用反义分子)直接施用于细胞，或者其可以在细胞内由外源性的、引入的序列的转录而产生(例如，通过向对象施用包含在启动子控制下的反义分子的载体)。本领域熟知反义寡核苷酸。反义寡核苷酸或分子被设计成通过规范或非规范碱基配对与靶核酸分子(即，所公开的基因启动子)相互作用。反义分子与目标分子的相互作用被设计用于促进靶分子的破坏，例如，通过RNA酶H介导的RNA-DNA杂交降解。可选地，反义分子被设计用于中断通常会在目标分子上发生的处理功能，如转录或复制。反义分子可以基于目标分子的序列进行设计。存在通过发现目标分子的最易进入区域用于使反义效率最优化的多种方法。示例性的方法是体外筛选实验和利用DMS和DEPC的DNA修饰研究。优选反义分子结合靶分子的解离常数(Kd)小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12。反义核酸是多核苷酸，例如长度至少6个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、例如6个核苷酸到100个核苷酸的核酸分子。然而，反义分子可以更长。在具体的实例中，所述核苷酸在一个或多个碱基部分、糖部分或磷酸骨架(或其组合)进行修饰，并且可以包括其他附加基团如促进跨细胞膜或血脑屏障输送的肽或试剂、杂交触发裂解剂或嵌入剂。
在一个方面，反义寡核苷酸可被缀合至另一种分子，如肽、杂交触发的交联剂、转运剂或杂交触发的裂解剂等。反义寡核苷酸可包括增强宿主细胞分子摄入的靶向部分。靶向部分可以是特异性结合分子，例如抗体或其识别宿主细胞表面上存在的分子的片段。反义分子可通过利用Integrated DNATechnologies公司的反义设计算法来生成，可在idtdna.com/Scitools/Applications/AntiSense/Antisense.aspx/获得。
如本文使用的"三阴性乳腺癌"或"TNBC"可以指以缺少雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和HER2/neu受体为特征的癌症。对TNBC的标准治疗是手术，辅助化疗和放疗。
如本文使用的"CpG岛"指具有高G-C含量、富含CpG二核苷酸和通常为低甲基化的的～1kB的基因组区域。
"凋亡"和确认凋亡的方法是本领域已知的并包括但不限于：检测半胱天冬酶-3活性、检测膜联蛋白V/碘化丙啶结合和检测末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记。在一个方面，确认凋亡可以包括下述之一：检测半胱天冬酶-3活性、检测膜联蛋白V/碘化丙啶结合和检测末端脱氧核苷酰转移酶缺dUTP口末端标记。
本文使用的"甲基化状态"指基因启动子的甲基化程度或水平。在一个方面，基因启动子的甲基化程度或水平可以是正常的。在一个方面，基因启动子的甲基化程度或水平可以是异常的。在一个方面，基因启动子的异常甲基化状态可以表明基因启动子是超甲基化的。在一个方面，基因启动子的异常甲基化状态可以表明基因启动子是低甲基化的。如上所述，甲基化状态可通过甲基化特异性PCR测定，其包括两部分：(1)在甲基化的胞嘧啶保持不变的条件下用亚硫酸氢钠转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，和(2)使用针对未甲基化的和甲基化的DNA两者的特异性引物集通过PCR检测亚硫酸氢盐诱导的序列差异。(对于更多关于MCP的信息参见Herman等，1996和Derks等，2004)
"甲基化百分比"可以指基因启动子的甲基化的可量化的数量。可量化的数量可通过检测受感染组织中基因启动子的甲基化数量并将其与未感染组织中相同基因启动子的甲基化数量进行比较来获得。在一个方面，可量化的数量可通过检测对象(例如，患有癌症的对象或经诊断患有或疑似患有以一种或多种基因启动子的超甲基化为特征的疾病或病症的对象)中基因启动子的甲基化数量并将其与一名或多名其它对象(例如，没有患癌症的一名或多名其它对象或经诊断未患或不疑似患有以一种或多种基因启动子的超甲基化为特征的疾病或病症的对象)中相同基因启动子的甲基化数量进行比较来获得。
B.组合物
本文公开了一种用于调整一种或多种基因启动子DNA甲基化的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种用于对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。在一个方面，公开的用于对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的组合物可以包括一种或多种抗癌剂或一种或多种化疗剂。
本文公开了一种用于降低c-Myc表达的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种用于增加桥粒斑蛋白表达的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。
本文公开了一种用于治疗癌症的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐。在一个方面，公开的用于抑制metises的组合物可以包括一种或多种抗癌剂或一种或多种化疗剂。
本文公开了一种用于治疗癌症的组合物，其包含有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐；和一种或多种化疗剂。
本文公开了一种用于治疗癌症的组合物，其包含有效量的下式化合物：
其药学上可接受的盐；和一种或多种抗癌剂。
本文公开了含有包含有效量的下式化合物的公开的组合物的药物组合物：
或其药学上可接受的盐。
在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种DNA甲基转移酶的表达。DNA甲基转移酶(DNA MT)，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，DNA甲基转移酶可以包括人DNA甲基转移酶。在一个方面，DNA甲基转移酶可以包括DNMT-1、DNMT-3A或DNMT-3B。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-1的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-3A的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-3B的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-1、DNMT-3A和DNMT-3B的表达。
在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶的表达。组蛋白脱乙酰酶，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括人组蛋白脱乙酰酶。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括任何已知的HDAC，诸如，例如，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10或HDAC11。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11每一种的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种的SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种HDAC的表达并能抑制一种或多种SIRT的表达。
在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。脯氨酰羟化酶，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，脯氨酰羟化酶可以包括人脯氨酰羟化酶。在一个方面，脯氨酰羟化酶可以包括任何已知的脯氨酰羟化酶，诸如，例如，PHD1、PHD2和PHD3。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD1的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD2的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD3的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的PHD1、PHD2和PHD3的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD1、PHD2和PHD3每一种的表达。
在一个方面，公开的组合物在公开的方法中能抑制一种或多种公开的DNMT、HDAC、SIRT或PHD。
本文公开了包含所公开的组合物和化合物(包括其药学上可接受的盐)作为有效成分、药学上可接受的载体、和可选的其它治疗成分或佐剂的药物组合物。使用的可药用载体可以是，例如，固体、液体或气体。固体载体的实例包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的实例是糖浆、花生油、橄榄油和水。气态载体的例子包括二氧化碳和氮气。在制备用于口服剂型的组合物中，任何方便的药物介质都可以使用。例如，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等可以用于形成口服液体制剂如悬浮液、酏剂和溶液；而载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等可用于形成口服固体制剂如粉剂、胶囊和片剂。片剂和胶囊是优选的口服剂量单位，其中使用固体药物载体。可选地，片剂可以通过标准水性或非水性技术进行包衣。含有本文所公开的组合物或化合物的片剂可以通过与可选的一种或多种辅助成分或佐剂进行压制或模制来制备。普通片可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式如粉末或颗粒的，可选地混合粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂的公开的组合物或公开的化合物来制备。模制片可通过在合适的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物模制来制备。
应理解所公开的组合物可由公开的化合物制备。还应理解公开的组合物可被用于所公开的使用方法。
C.方法
i)调整DNA甲基化的方法
本文公开了一种调整对象中一种或多种基因启动子DNA甲基化的方法，包括向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。在一个方面，公开的调整DNA甲基化的方法可以包括测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
本文公开了一种调整对象中一种或多种基因启动子DNA甲基化的方法，包括：通过测定一种或多种基因启动子的甲基化状态对需要治疗的患者进行鉴定；并向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
检测或确定一种或多种基因启动子的甲基化状态的方法是本领域已知的。例如，可以使用甲基化特异性PCR，其是本领域已知的。在一个方面，测定一种或多种基因启动子的甲基化状态可以包括将对象的受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态与对象的未受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态进行比较。在一个方面，受感染组织可以是肿瘤或癌，未受感染组织可以是除肿瘤或癌之外的一些组织。在一个方面，测定一种或多种基因启动子的甲基化状态可以包括检测该一种或多种启动子的甲基化百分比。
在公开的调整DNA甲基化的方法的一个方面，对象可以是不健康的对象。在一个方面，不健康的对象可以是患有或罹患疾病、病况、病症或病的对象。
在公开的调整DNA甲基化的方法的一个方面，在给药步骤前，该一种或多种基因启动子是超甲基化的。换言之，该一种或多种目标基因启动子具有更高水平的甲基化百分比。甲基化百分比的水平可以在两名对象之间比较，诸如，例如，比较一名诊断患有或疑似患有一种具体疾病或病症的对象和一名诊断不患有或不疑似患有一种具体疾病或病症的对象。甲基化百分比的水平可以在一名对象中比较，诸如，例如，比较受感染的组织或器官或细胞和未受感染的组织或器官或细胞。在一个方面，受感染的组织或器官或细胞可以是癌性或肿瘤性组织或器官或细胞。
在公开的调整DNA甲基化的方法的一个方面，该方法可以包括在给药步骤前鉴定有需要的对象。
在公开的调整DNA甲基化的方法的一个方面，在给药步骤后，一种或多种基因启动子的甲基化状态可以发生变化。例如，在一个方面，甲基化状态的变化可以包括一种或多种基因启动子的甲基化百分比的减少。如果在给药步骤后，没有达到期望的甲基化状态，那么该方法可以包括重复给药有效量的组合物。在一个方面，期望的甲基化状态可以是一种或多种基因启动子的甲基化百分比的减少。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之前和之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以重复一次或多次，诸如，例如，2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多次。在一个方面，给药步骤可以每小时、每3小时、每6小时、每12小时、每18小时、每天、每周、每两周、每月、每两月、每年、每两年、每5年或在对象一生中每10年发生一次。在一个方面，公开的方法可以包括在单一给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的调整DNA甲基化的方法可以包括在一些给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的方法可以包括在每个给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。在公开的调整DNA甲基化的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种DNA甲基转移酶的表达。DNA甲基转移酶(DNA MT)，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，DNA甲基转移酶可以包括人DNA甲基转移酶。在一个方面，DNA甲基转移酶可以包括DNMT-1、DNMT-3A或DNMT-3B。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-1的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-3A的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-3B的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-1、DNMT-3A和DNMT-3B的表达。
在公开的调整DNA甲基化的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶的表达。组蛋白脱乙酰酶，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括人组蛋白脱乙酰酶。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括任何已知的HDAC，诸如，例如，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10或HDAC11。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11每一种的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种的SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种HDAC的表达并能抑制一种或多种SIRT的表达。
在公开的调整DNA甲基化的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。脯氨酰羟化酶，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，脯氨酰羟化酶可以包括人脯氨酰羟化酶。在一个方面，脯氨酰羟化酶可以包括任何已知的脯氨酰羟化酶，诸如，例如，PHD1、PHD2和PHD3。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD1的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD2的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD3的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的PHD1、PHD2和PHD3的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD1、PHD2和PHD3的每一种的表达和/或活性。
公开的调整DNA甲基化的方法的给药步骤可以包括本领域已知的任何给药途径。例如，在一个方面，给药步骤可以包括腹腔注射。例如，在一个方面，给药步骤可以包括口服给药。例如，在一个方面，给药步骤可以包括静脉内给药。
在公开的调整DNA甲基化的方法中，基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)基因启动子、c-Myc基因启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员1(RASSF1)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、β淀粉样A4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、mutL同系物1启动子、2型非息肉病(MLH1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子、转录因子21(TCF21)启动子或血管内皮生长因子-A(VEGF-A)启动子。
公开的调整DNA甲基化的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：DSP、C-MYC、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CYP1B1、DLC1、CDH1、FHIT、CDH13、MGMT、OPCML、PAX5、PRDM2、RASSF1、APC、APBA1、CADM1、CXCL12、MTHFR、MLH1、RASSF2、SFRP1、TCF21和VEGF-A。
在一个方面，公开的调整DNA甲基化的方法可以包括本领域已知的一种或多种肿瘤抑制基因(TSG)的一种或多种基因启动子。
在公开的调整DNA甲基化的方法中，基因启动子可以包括雌激素受体基因(ER)启动子、乳腺癌1基因(BRCA1)启动子、上皮钙黏蛋白基因(E-cad)启动子、TMS1基因启动子、胰岛素样生长因子结合蛋白7基因(IGFBP7)启动子、p16启动子、视黄酸受体基因(RARβ2)启动子或Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员1基因(RASSF1A)启动子。
公开的调整DNA甲基化的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：ER、BRCA1、E-cad、TMS1、IGFBP7、RARβ2和RASSF1A。
公开的调整DNA甲基化的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1和VEGF-A。
在公开的调整DNA甲基化的方法中，对象可以患有非血管渗漏的疾病或病症。在公开的调整DNA甲基化的方法中，对象可以患有非视网膜病的疾病或病症。在公开的调整DNA甲基化的方法中，对象可以患有非严重肢体缺血(CLI)的疾病或病症。
在公开的调整DNA甲基化的方法中，对象可以患有癌症。在一个方面，癌症可以是由一种或多种基因启动子超甲基化导致的癌症。例如，癌症可以是表1中指定的任何癌症。在一个方面，公开的方法可以包括向对象施用一种或多种抗癌剂。在一个方面，对象可以患有乳腺癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。在一个方面，乳腺癌可以是三阴性乳腺癌。在一个方面，对象可以患有黑素瘤且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。在公开的方法的一个方面，对象可以患有宫颈癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子或c-Myc启动子。在一个方面，对象可以患有肺癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、mutL同系物1、结肠癌、2型非息肉病(MLH1)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子或转录因子21(TCF21)启动子。
在一个方面，公开的调整DNA甲基化的方法可以包括缓解与异常DNA甲基化(诸如，例如，一种或多种基因启动子的超甲基化)相关的一种或多种症状。
ii)治疗诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象的方法
本文公开了一种对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法，包括向对象施用有效量的含有下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
在一个方面，所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法可以包括测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。检测或确定一种或多种基因启动子的甲基化状态的方法是本领域已知的且在上文进行了讨论。在一个方面，测定一种或多种基因启动子的甲基化状态可以包括将对象的受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态与对象的未受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态进行比较。在一个方面，受感染组织可以是肿瘤或癌，未受感染组织可以是除肿瘤或癌之外的一些组织(即，非癌性组织或细胞或样品)。在一个方面，测定一种或多种基因启动子的甲基化状态可以包括检测该一种或多种启动子的甲基化百分比。
在对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法的一个方面，对象可以是不健康的对象。在一个方面，不健康的对象可以是患有或罹患疾病、病况、病症或病的对象，诸如，例如，以DNA超甲基化为特征的一种疾病。
在所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法的一个方面，在给药步骤前，该一种或多种基因启动子是超甲基化的。换言之，该一种或多种目标基因启动子具有更高水平的甲基化百分比。甲基化百分比的水平可以在两名对象之间比较，诸如，例如，比较一名诊断患有或疑似患有一种具体的以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象和一名诊断不患有或不疑似患有一种具体的以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象。甲基化百分比的水平可以在一名对象中比较，诸如，例如，比较受感染的组织或器官或细胞和未受感染的组织或器官或细胞。在一个方面，受感染的组织或器官或细胞可以是癌性或肿瘤性组织或器官或细胞。
在所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法的一个方面，该方法可以包括在给药步骤前鉴定有需要的对象。
在一个方面，可以被DNA超甲基化调节的疾病可以是如下所示：Beckwith-Wiedemann综合征(即，CDKN1C和/或H19基因的超甲基化)；Prader-Willi综合征(即，MKRN3、MAGEL2、NDN、SNURF/SNRPN和/或IPW基因的超甲基化)；Angelman综合征(即，UBE3A和/或ATPC10C基因的超甲基化)；Fragile X综合征(即，FMR1基因的超甲基化)；强直性肌营养不良(即，DMPK、SIX5和/或其它基因的超甲基化)；ATRX综合征(即，ATRX基因的超甲基化)；发展(即，一种或多种调节发展的基因的超甲基化)；败血症(即，DNMT-1、DNMT-3A和/或DNMT-3B基因的超甲基化)；和衰老过程中涉及的一种或多种基因。
在所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法的一个方面，在给药步骤后，一种或多种基因启动子的甲基化状态可以存在变化。例如，在一个方面，甲基化状态的变化可以包括一种或多种基因启动子的甲基化百分比的减少。如果，在给药步骤后，没有达到期望的甲基化状态，那么该方法可以包括重复给药有效量的组合物。在一个方面，期望的甲基化状态可以是一种或多种基因启动子的甲基化百分比的减少。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之前和之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以重复一次或多次，诸如，例如，2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多次。在一个方面，给药步骤可以每小时、每3小时、每6小时、每12小时、每18小时、每天、每周、每两周、每月、每两月、每年、每两年、每5年或在对象一生中每10年发生一次。在一个方面，公开的方法可以包括在单一给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的方法可以包括在一些给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的方法可以包括在每个给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
在所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种DNA甲基转移酶的表达。DNA甲基转移酶是本领域已知的且在上文进行了讨论。在一个方面，DNA甲基转移酶可以包括人DNA甲基转移酶。在一个方面，DNA甲基转移酶可以包括DNMT-1、DNMT-3A或DNMT-3B。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-1的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-3A的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-3B的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-1、DNMT-3A和DNMT-3B的表达。
在所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶的表达。组蛋白脱乙酰酶是本领域已知的并在上文进行了讨论。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括人组蛋白脱乙酰酶。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括任何已知的HDAC，诸如，例如，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10或HDAC11。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11每一种的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种的SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种HDAC的表达并能抑制一种或多种SIRT的表达。
在所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。脯氨酰羟化酶，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的并在上文进行了讨论。在一个方面，脯氨酰羟化酶可以包括人脯氨酰羟化酶。在一个方面，脯氨酰羟化酶可以包括任何已知的脯氨酰羟化酶，诸如，例如，PHD1、PHD2和PHD3。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD1的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD2的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD3的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的PHD1、PHD2和PHD3的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD1、PHD2和PHD3的每一种的表达和/或活性。
公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法给药步骤可以包括本领域已知的任何给药途径。例如，在一个方面，给药步骤可以包括腹腔注射。例如，在一个方面，给药步骤可以包括口服给药。例如，在一个方面，给药步骤可以包括静脉内给药。在一个方面，对象不患有血管渗漏、视网膜病或严重肢体缺血(CLI)。
在公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法中，基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)基因启动子、c-Myc基因启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、mutL同系物1启动子、2型非息肉病(MLH1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子、转录因子21(TCF21)启动子或血管内皮生长因子-A(VEGF-A)启动子。
在一个方面，所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：DSP、C-MYC、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CYP1B1、DLC1、CDH1、FHIT、CDH13、MGMT、OPCML、PAX5、PRDM2、RASSF1、APC、APBA1、CADM1、CXCL12、MTHFR、MLH1、RASSF2、SFRP1、TCF21和VEGF-A。
在一个方面，所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法可以包括本领域已知的一种或多种肿瘤抑制基因(TSG)的一种或多种基因启动子。
在公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法中，基因启动子可以包括雌激素受体基因(ER)启动子、乳腺癌1基因(BRCA1)启动子、上皮钙黏蛋白基因(E-cad)启动子、TMS1基因启动子、胰岛素样生长因子结合蛋白7基因(IGFBP7)启动子、p16启动子、视黄酸受体基因(RARβ2)启动子或Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员1基因(RASSF1A)启动子。
在一个方面，所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：ER、BRCA1、E-cad、TMS1、IGFBP7、RARβ2和RASSF1A。
在一个方面，所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1和VEGF-A。
在公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法中，该以DNA超甲基化为特征的疾病或病症可以是除癌症之外的其它疾病。
在公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法中，对象可以患有癌症。在一个方面，癌症可以是由一种或多种基因启动子的超甲基化导致的癌症。例如，癌症可以是表1指示的任何癌症。在一个方面，公开的方法可以包括向对象施用一种或多种抗癌剂。在一个方面，对象可以患有乳腺癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。在一个方面，乳腺癌可以是三阴性乳腺癌。在一个方面，对象可以患有黑素瘤且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。在一个方面，对象可以患有宫颈癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子或c-Myc启动子。在一个方面，对象可以患有肺癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、mutL同系物1、结肠癌、2型非息肉病(MLH1)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子或转录因子21(TCF21)启动子。
在一个方面，所公开的对诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象进行治疗的方法可以包括缓解与一种或多种基因启动子DNA超甲基化有关的一种或多种症状。
iii)降低C-MYC表达的方法
本文公开了一种降低对象中c-myc表达的方法，包括向对象施用有效量的含有下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。在一个方面，公开的降低c-myc表达的方法可以包括改变c-myc启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的降低c-myc表达的方法可以包括测定c-myc启动子的甲基化状态。检测或确定启动子诸如c-myc启动子的甲基化状态的方法是本领域已知的并在上文进行了讨论。在一个方面，测定c-myc启动子的甲基化状态可以包括将对象的受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态与对象的未受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态进行比较。在一个方面，受感染组织可以是肿瘤或癌，未受感染组织可以是除肿瘤或癌之外的一些组织(即，非癌性组织或细胞或样品)。在一个方面，测定c-myc启动子的甲基化状态可以包括检测c-myc启动子的甲基化百分比。
在降低对象中c-myc表达的方法的一个方面，对象可以是不健康的对象。在一个方面，不健康的对象可以是患有或罹患疾病、病况、病症或病的对象。
在公开的降低c-myc表达的方法中，对象可以患有不是血管渗漏的疾病或病症。在公开的降低c-myc表达的方法中，对象可以患有不是视网膜病的疾病或病症。在公开的降低c-myc表达的方法中，对象可以患有不是严重肢体缺血(CLI)的疾病或病症。
在公开的降低对象中c-myc表达的方法的一个方面，该方法可以包括在给药步骤前鉴定有需要的对象。
在公开的降低c-myc表达的方法的一个方面，在给药步骤前，c-myc启动子是超甲基化的。换言之，c-myc启动子具有更高水平的甲基化百分比。甲基化百分比水平可以在两名对象间比较，诸如，例如，诊断患有或疑似患有特定疾病或病症的对象和没有诊断患有或疑似患有特定疾病或病症的对象。甲基化百分比的水平可以在一名对象中比较，诸如，例如，比较受感染的组织或器官或细胞和未受感染的组织或器官或细胞。在一个方面，受感染的组织或器官或细胞可以是癌性或肿瘤性组织或器官或细胞。
在公开的降低c-myc表达的方法的一个方面，在给药步骤后，c-myc启动子的甲基化状态可以存在变化。例如，在一个方面，甲基化状态的变化可以包括c-myc启动子的甲基化百分比的减少。如果，在给药步骤后，没有达到期望的c-myc启动子甲基化状态，那么该方法可以包括重复给药有效量的组合物。在一个方面，期望的甲基化状态可以是c-myc启动子甲基化百分比的减少。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之前和之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以重复一次或多次，诸如，例如，2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多次。在一个方面，给药步骤可以每小时、每3小时、每6小时、每12小时、每18小时、每天、每周、每两周、每月、每两月、每年、每两年、每5年或在对象一生中每10年发生一次。在一个方面，公开的方法可以包括在单一给药步骤后测定c-myc启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的调整DNA甲基化的方法可以包括在一些给药步骤后测定c-myc启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的方法可以包括在每个给药步骤后测定c-myc启动子的甲基化状态。
在公开的降低c-myc表达的方法中，对象可以患有癌症。在一个方面，癌症可以是由一种或多种基因启动子的超甲基化导致的癌症。例如，癌症可以是表1指示的任何癌症。在一个方面，c-myc表达的降低可以抑制对象中的转移。在一个方面，公开的降低c-myc表达的方法可以包括向对象施用一种或多种抗癌剂。
在公开的降低c-myc表达的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种DNA甲基转移酶的表达。DNA甲基转移酶(DNA MT)，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，DNA甲基转移酶可以包括人DNA甲基转移酶。在一个方面，DNA甲基转移酶可以包括DNMT-1、DNMT-3A或DNMT-3B。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-1的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-3A的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-3B的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制DNMT-1、DNMT-3A和DNMT-3B的表达。
在公开的降低c-myc表达的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶的表达。组蛋白脱乙酰酶，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括人组蛋白脱乙酰酶。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括任何已知的HDAC，诸如，例如，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10或HDAC11。在一个方面，组蛋白脱乙酰酶可以包括SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10和HDAC11每一种的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种的SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7的表达。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种HDAC的表达并能抑制一种或多种SIRT的表达。
在公开的降低c-myc表达的方法的一个方面，包含下式的化合物：
或其药学上可接受的盐的公开的组合物能抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。脯氨酰羟化酶，包括非哺乳动物同系物，是本领域已知的。在一个方面，脯氨酰羟化酶可以包括人脯氨酰羟化酶。在一个方面，脯氨酰羟化酶可以包括任何已知的脯氨酰羟化酶，诸如，例如，PHD1、PHD2和PHD3。在一个方面，公开的组合物能抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD1的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD2的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD3的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制组合的PHD1、PHD2和PHD3的表达和/或活性。在一个方面，公开的组合物能抑制PHD1、PHD2和PHD3的每一种的表达和/或活性。
公开的降低c-myc表达的方法的给药步骤可以包括本领域已知的任何给药途径。例如，在一个方面，给药步骤可以包括腹腔注射。例如，在一个方面，给药步骤可以包括口服给药。例如，在一个方面，给药步骤可以包括静脉内给药。
在一个方面，公开的降低c-myc表达的方法可以包括缓解与异常DNA甲基化(诸如，例如，一种或多种基因启动子的超甲基化)相关的一种或多种症状。
iv)增加桥粒斑蛋白表达的方法
本文公开了一种增加对象中桥粒斑蛋白表达的方法，包括向对象施用有效量的含有下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。在一个方面，公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法可以包括改变桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法可以包括测定桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态。检测或确定诸如桥粒斑蛋白启动子的启动子甲基化状态的方法是本领域已知的并在上文进行了讨论。在一个方面，测定桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态可以包括比较对象受感染组织中桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态和对象未受感染组织中桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态。在一个方面，受感染组织可以是肿瘤或癌，未受感染组织可以是除肿瘤或癌之外的一些组织(即，非癌性组织或细胞或样品)。在一个方面，测定桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态可以包括检测桥粒斑蛋白启动子的甲基化百分比。
在增加对象中桥粒斑蛋白表达的方法的一个方面，对象可以是不健康的对象。在一个方面，不健康的对象可以是患有或罹患疾病、病况、病症或病的对象。
在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法中，对象可以患有不是血管渗漏的疾病或病症。在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法中，对象可以患有不是视网膜病的疾病或病症。在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法中，对象可以患有不是严重肢体缺血(CLI)的疾病或病症。
在公开的增加对象中桥粒斑蛋白表达的方法的一个方面，该方法可以包括在给药步骤前鉴定有需要的对象。
在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法的一个方面，在给药步骤前，桥粒斑蛋白启动子是超甲基化的。换言之，c-myc启动子具有更高水平的甲基化百分比。甲基化百分比的水平可以在两名对象间比较，诸如，例如，诊断患有或疑似患有特定疾病或病症的对象和没有诊断患有或疑似患有特定疾病或病症的对象。甲基化百分比的水平可以在一名对象中比较，诸如，例如，比较受感染的组织或器官或细胞和未受感染的组织或器官或细胞。在一个方面，受感染的组织或器官或细胞可以是癌性或肿瘤性组织或器官或细胞。
在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法的一个方面，在给药步骤后，桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态可以存在变化。例如，在一个方面，甲基化状态的变化可以包括桥粒斑蛋白启动子的甲基化百分比的减少。如果，在给药步骤后，没有达到期望的桥粒斑蛋白启动子甲基化状态，那么该方法可以包括重复给药有效量的组合物。在一个方面，期望的甲基化状态可以是桥粒斑蛋白启动子甲基化百分比的减少。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之前和之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以重复一次或多次，诸如，例如，2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多次。在一个方面，给药步骤可以每小时、每3小时、每6小时、每12小时、每18小时、每天、每周、每两周、每月、每两月、每年、每两年、每5年或在对象一生中每10年发生一次。在一个方面，公开的方法可以包括在单一给药步骤后测定桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的调整DNA甲基化的方法可以包括在一些给药步骤后测定桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的方法可以包括在每个给药步骤后测定桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态。
在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法中，对象可以患有癌症。在一个方面，癌症可以是由一种或多种基因启动子的超甲基化导致的癌症。例如，癌症可以是表1指示的任何癌症。在一个方面，对象可以患有乳腺癌、三阴性乳腺癌、黑素瘤、宫颈癌或肺癌。在一个方面，对象可以患有一种或多种的乳腺癌、三阴性乳腺癌、黑素瘤、宫颈癌和肺癌。在一个方面，公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法可以包括向对象施用一种或多种抗癌剂。
在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法中，桥粒斑蛋白基因表达可以增加。在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法中，桥粒斑蛋白的蛋白表达可以增加。在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法中，桥粒斑蛋白基因表达和桥粒斑蛋白的蛋白表达可以增加。在公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法中，桥粒斑蛋白基因和/或蛋白表达的增加，例如，能够抑制对象中的转移。
在一个方面，公开的增加桥粒斑蛋白表达的方法可以包括缓解与异常DNA甲基化(诸如，例如，一种或多种基因启动子的超甲基化)相关的一种或多种症状。
v)抑制转移的方法
本文公开了一种抑制对象中转移的方法，包括向对象施用有效量的含有下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐；并调整一种或多种基因启动子的DNA甲基化状态。在抑制转移的一个方面，一种或多种基因DNA甲基化状态的调整可以包括改变一种或多种基因启动子的甲基化状态。在抑制转移的一个方面，公开的方法可以包括测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
在抑制对象中转移的方法的一个方面，对象可以是不健康的对象。在一个方面，不健康的对象可以是患有或罹患疾病、病况、病症或病的对象。
在公开的抑制转移的方法中，对象可以患有不是血管渗漏的疾病或病症。在公开的抑制转移的方法中，对象可以患有不是视网膜病的疾病或病症。在公开的抑制转移的方法中，对象可以患有不是严重肢体缺血(CLI)的疾病或病症。
检测或确定一种或多种基因启动子的甲基化状态的方法是本领域已知的。在一个方面，测定一种或多种基因启动子的甲基化状态可以包括将对象的受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态与对象的未受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态进行比较。在一个方面，受感染组织可以是肿瘤或癌，未受感染组织可以是除肿瘤或癌之外的一些组织(即，非癌性组织或细胞或样品)。在一个方面，测定一种或多种基因启动子的甲基化状态可以包括检测该一种或多种启动子的甲基化百分比。
在公开的抑制对象中的转移的方法的一个方面，在给药步骤前，该一种或多种基因启动子是超甲基化的。换言之，该一种或多种目标基因启动子具有更高水平的甲基化百分比。甲基化百分比的水平可以在两名对象间比较，诸如，例如，诊断患有或疑似患有特定疾病或病症的对象和没有诊断患有或疑似患有特定疾病或病症的对象。甲基化百分比的水平可以在一名对象中比较，诸如，例如，比较受感染的组织或器官或细胞和未受感染的组织或器官或细胞。
在公开的抑制对象中转移的方法的一个方面，该方法可以包括在给药步骤前鉴定有需要的对象。
在公开的抑制对象中转移的方法的一个方面，在给药步骤后，一种或多种基因启动子的甲基化状态可以存在变化。例如，在一个方面，甲基化状态的变化可以包括一种或多种基因启动子的甲基化百分比的减少。如果，在给药步骤后，没有达到期望的甲基化状态，那么该方法可以包括重复给药有效量的组合物。在一个方面，期望的甲基化状态可以是一种或多种基因启动子的甲基化百分比的减少。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之前和之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以在测定甲基化状态之后进行重复。在一个方面，给药步骤可以重复一次或多次，诸如，例如，2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多次。在一个方面，给药步骤可以每小时、每3小时、每6小时、每12小时、每18小时、每天、每周、每两周、每月、每两月、每年、每两年、每5年或在对象一生中每10年发生一次。在一个方面，公开的方法可以包括在单一给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的调整DNA甲基化的方法可以包括在一些给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。在一个方面，公开的方法可以包括在每个给药步骤后测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
在公开的抑制对象中转移的方法中，基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)基因启动子、c-Myc基因启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、mutL同系物1启动子、2型非息肉病(MLH1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子、转录因子21(TCF21)启动子或血管内皮生长因子-A(VEGF-A)启动子。
公开的抑制对象中转移的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：DSP、C-MYC、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CYP1B1、DLC1、CDH1、FHIT、CDH13、MGMT、OPCML、PAX5、PRDM2、RASSF1、APC、APBA1、CADM1、CXCL12、MTHFR、MLH1、RASSF2、SFRP1、TCF21和VEGF-A。
在一个方面，公开的抑制转移的方法可以包括本领域已知的一种或多种肿瘤抑制基因(TSG)的一种或多种基因启动子。
在公开的抑制对象中转移的方法中，基因启动子可以包括雌激素受体基因(ER)启动子、乳腺癌1基因(BRCA1)启动子、上皮钙黏蛋白基因(E-cad)启动子、TMS1基因启动子、胰岛素样生长因子结合蛋白7基因(IGFBP7)启动子、p16启动子、视黄酸受体基因(RARβ2)启动子或Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员1基因(RASSF1A)启动子。
公开的抑制对象中转移的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：ER、BRCA1、E-cad、TMS1、IGFBP7、RARβ2和RASSF1A。
公开的调整DNA甲基化的方法可以包括一种或多种下述基因启动子：APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1和VEGF-A。
在公开的抑制转移的方法中，对象可以患有癌症。在一个方面，癌症可以是由一种或多种基因启动子的超甲基化导致的癌症。例如，癌症可以是表1指示的任何癌症。在一个方面，公开的方法可以包括向对象施用一种或多种抗癌剂。在一个方面，对象可以患有乳腺癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。在一个方面，乳腺癌可以是三阴性乳腺癌。在一个方面，对象可以患有黑素瘤且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。在公开的方法的一个方面，对象可以患有宫颈癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子或c-Myc启动子。在一个方面，对象可以患有肺癌且该一种或多种基因启动子可以包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、mutL同系物1、结肠癌、2型非息肉病(MLH1)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子或转录因子21(TCF21)启动子。
在一个方面，公开的抑制转移的方法可以包括缓解与异常DNA甲基化(诸如，例如，一种或多种基因启动子的超甲基化)相关的一种或多种症状。
vi)合成所公开化合物的方法
公开的化合物，6，其也可以被称为AKB-6899，和酯前药，例如，化合物5，可通过方案I中概括的过程进行制备，并进一步在下文实施例1中描述。
方案I
试剂和条件：(a)H2：Pd/C，EtOH，室温，16hr。
试剂和条件：(b)(CF3O2S)2O，Et3N，CH2Cl2；，室温，16hr。
试剂和条件：(c)Et3N，Na2CO3，EtOH，室温，16hr。
试剂和条件：(d)Pd(dppf)Cl2，K3PO4,H2O，二氧六环；85℃，16hr。
试剂和条件：(e)(i)NaOH，THF；30min。(ii)HCl，THF，H2O；85℃，16hr。
a.实施例1
{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]氨基}乙酸(6)，其也可被称为AKB-699。
在下文描述的反应中，除非另有说明，否则温度以摄氏度(℃)给出；操作在室温或环境温度、“室温”、“rt”或“RT”(通常范围为约18℃至约25℃下进行；溶剂的蒸发在减压下使用旋转蒸发器(通常，4.5-30mm Hg)以高达60℃的浴温进行；反应过程后通常使用薄层色谱法(TLC)；产品显示出满意的1H NMR、HPLC和/或LC-MS(GC-MS)数据；且也使用以下的常规缩写：L(升)、mL(毫升)、mmol(毫摩尔)、g(克)和mg(毫克)。除非另有说明，所有的溶剂和试剂购自供应商处，并无需进一步纯化即使用。反应在氮气保护下进行，除非另有说明。化合物在紫外灯(254nm)下可视化。在300MHz的NMR上记录1H NMR光谱。
[(3,5-二羟基吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸乙酯(2)的制备：在20L圆底烧瓶中加入氮气和钯碳(10％Pd/C)(100g，60％湿膏)和乙醇(12L)，然后加入[(3,5-双-苯羟吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸乙酯，1，(1000g，2.378mol)。得到的混合物进行真空氮吹扫循环三次和真空氢吹扫循环三次。引入氢气氛并在1-25℃下搅拌反应混合物直至通过TLC分析反应完成。反应通常持续2-3小时且剧烈搅拌对于完成反应是重要的。然后对反应体系进行真空氮吹扫循环以从系统中去除氢气。过滤反应混合物并用乙醇(2L)洗涤滤饼。在旋转蒸发器上高达45℃浴温下浓缩合并的滤液至恒重，得到558g(97.7％得率)类白色固体的期望产物。MP：138-140℃；MS(ESI+)：m/z 241(M+1)；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)<12.28(s，1H)，10.79(s，1H)，9.09-9.05(t，J＝6Hz，1H)，7.76-7.71(d，J＝2.4Hz，1H)，6.68-6.67(d，J＝2.1Hz，1H)，4.15-4.08(q，J＝6.9Hz，2H)，4.02-4.00(d，J＝6.3Hz，2H)，1.22-1.17(t，J＝6.9Hz，2H)。
N-苯基双(三氟甲烷-亚磺酰胺)(3)的制备：在10L平底(found-bottomed)烧瓶中加入苯胺(232.5g，2.5mol)、三乙胺(505g，5mol)和二氯甲烷(5L)。得到的混合物用冰浴冷却。滴加三氟甲烷磺酸酐(1410g，5mol)的二氯甲烷溶液(1L)。将反应混合物加温至室温并搅拌过夜。然后将反应加至碎冰(4kg)并同时搅拌。分离得到的两相混合物。用盐水(2L x 2)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩以形成粗品固体产物。用乙醇洗涤粗品固体产生767g(86％得率)白色固体的期望的产物。MP：96-98℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)7.64-7.51(m，3H)，7.44-7.42(m，2H)。
[(3-羟基-5-三氟甲烷磺酰羟吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸乙酯钠盐(4)的制备：在20L圆底烧瓶中加入[(3,5-二羟基-吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸乙酯，2，(860g，3.58mol)和乙醇(11L)。在10-20℃下搅拌混合物形成溶液。加入三乙胺(602mL，4.3mol)。得到的混合物冷却至0-5℃并加入N-苯基双(三氟甲烷-亚磺酰胺)，3，(1406g，3.94mol)。加入后，将反应混合物升温至35-40℃并搅拌过夜。TLC分析表明反应完全。然后在旋转蒸发器上高达45℃浴温下浓缩反应混合物。用甲苯(4.5L)处理剩余物(油状固体)并浓缩至约4.5L。重复甲苯溶剂置换直至通过1H NMR分析剩余乙醇水平变为少于0.5％。用10％w/w水性Na2CO3溶液(5.5L，1.3eq.)处理甲苯溶液。过滤得到的浆液并用水(2x 2L)洗涤滤饼，然后用甲苯/TBME(1:2)(2x 2L)混合物洗涤滤饼。干燥固体产物得到1156g(82％得率)白色固体的期望的产物。MS(ESI+)：m/z 373(M+1)；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)<12.13(1H，s)，7.43-7.42(d，J＝2.1Hz，1H)，6.72-6.71(d，J＝2.1Hz，2H)，4.12-4.05(m，4H)，1.21-1.15(t，J＝6.9Hz，3)。
{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]氨基}乙酸乙酯(5)的制备：在5L圆底烧瓶中加入[(3-羟基-5-三氟甲烷磺酰羟吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸乙酯钠盐，4，(310g，0.78mol)，1,4-二氧六环(3L)和水(150mL)。对溶液进行真空氮吹扫循环，然后加入磷酸钾(50g，0.234mol)和3-氟苯基硼酸(163g，1.17mol)。加入后，重复一次真空氮吹扫循环。然后加入1,1-双(二苯基-膦基)二茂铁钯(II)氯化物CH2Cl2复合物(72g，0.088mol，0.11eq.)。在另一次真空氮吹扫循环后，随后将反应混合物加热至75-85℃。反应进程用TLC监控。14-16小时后反应完成。将反应物冷却至15-25℃并在旋转蒸发器上高达45℃浴温下浓缩直至溶剂收集停止。用HCl(1M，1.5L)和乙酸乙酯(1.5L)的水溶液处理剩余物并在室温下搅拌30分钟。然后分离各层。用水(1.5L)、盐水(1.5L)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。用硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯/乙酸vol/vol：3:1:0.01)纯化粗产物得到226g(90％得率)期望的产物。MS(ESI+)：m/z 319(M+1)；1H NMR(300MHz，CDCl3)<11.88(s，1H)，8.44(s，1H)，8.32-.31(d，J＝1.5Hz，1H)，7.51-7.44(m，2H)，7.40-7.37(m，1H)，7.32-7.27(m，1H)，7.17-7.13(t，J＝6.6Hz，1H)，4.33-4.25(m，4H)，1.36-1.31(t，J＝7.2Hz，3H)。
{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]氨基}乙酸(6)的制备：在{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]氨基}乙酸乙酯，5，(226g，0.71mol)的THF(1L)浆液中室温下加入氢氧化钠水溶液(1M，2L)并保持内部温度低于25℃。反应进程用TLC监控。20-30分钟后，反应完成。用浓缩HCl调节反应溶液的pH至5-5.5并保持内部反应温度低于25℃。过滤反应混合物去除不溶物并在旋转蒸发器上高达45℃浴温下浓缩滤液直至去除所有THF。通过真空过滤收集得到的固体，并用水(1L)洗涤。然后将固体在室温下溶解于水(1.5L)和THF(1.5L)的混合物。用浓缩HCl调节pH为约5至约2-2.25。将得到的混合物搅拌30分钟，之后确认pH为2-2.5的范围。在旋转蒸发器上高达45℃浴温下浓缩双相混合物直至停止去除THF。过滤得到的固体，用水(2x 1L)洗涤并干燥获得115g(55.8％得率)白色固体的期望的产物。MP：182-184℃；MS(ESI-)：m/z 289(M-1)；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)12.90(s，1H)，12.38(s，1H)，9.39-9.37(t，J＝6.3Hz，1H)，8.55(s，1H)，7.80-7.67(m，2H)，7.59-7.52(m，1H)，7.34-7.27(m，1H)，4.02-3.99(m，2H)，3.51(s，1H)。
公开的HIF-2稳定剂的酰胺前药可通过方案II中描述的方法进行制备并进一步在下文实施例2中描述。
方案II
试剂和条件：(a)CH3NH2HCl，EDCI，HOBt，DIPEA，DMF；0℃-室温，2天
b.实施例2
5-(3-氟苯基)-N-(2-甲基氨基-2-氧乙基)-3-羟基吡啶-2-基酰胺(7)
5-(3-氟苯基)-N-(2-甲基氨基-2-氧乙基)-3-羟基吡啶-2-基酰胺(7)的制备：在{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]-氨基}乙酸，6，(2.9g，10mmol)的DMF(50mL)溶液中，室温N2下加入1-(3-二甲基氨基-丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)(2.33g，14.4mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(1.35g，10mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(15.65mL，30mmol)。搅拌反应5分钟然后加入甲基胺盐酸盐(0.9g，130mmol)。搅拌2天后，减压去除溶剂并将剩余物在CH2Cl2和H2O间分离。分离有机层，用饱和NaCl洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩。粗产物用硅胶纯化(MeOH:CH2Cl2 1:99)得到期望的化合物。
下文描述了制备公开的HIF-2α稳定剂及其前药的进一步过程。在方案III中制备一种酯前药的例子在实施例3中进行了概括和描述。
方案III
试剂和条件：(a)K2CO3，PdCl2(dppf)，DMF，H2O；45℃，18hr。
试剂和条件：(b)NaOCH3，CH3OH；回流，20hr。
试剂和条件：(c)48％HBr；回流，20hr。
试剂和条件：(d)CDI，DIPEA，DMSO；室温，2.5hr。
c.实施例3
甲基{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]氨基}乙酯(11)
5-(3-氟苯基)-3-氯-2-氰吡啶(8)的制备：在适合磁力搅拌并装备氮气入口的100mL圆底烧瓶中加入(3-氟苯基)硼酸(4.48g，32mmol)、3,5-二氯-2-氰吡啶(5.8g，34mmol)、K2CO3(5.5g，40mmol)、[1,1’-双(联苯膦基)二茂铁]二氯-钯(II)[PdCl2(dppf)](0.1g，0.13mmol)、二甲基甲酰胺(50mL)和水(5mL)。搅拌反应溶液并加热至45℃，并在该温度下保持18小时，之后可通过TLC使用乙酸乙酯/甲醇(4:1)作为流动相和UV 435nm显像任何剩余的起始材料3,5-二氯-2-氰吡啶，测定起始材料的消失来判断反应完全。然后将反应溶液冷却至室温并将内容物在乙酸乙酯(250mL)和饱和NaCl水溶液(100mL)间进行分离。分离有机相并再次用饱和NaCl水溶液(100mL)洗涤。将有机相用MgSO4干燥4小时，过滤去除MgSO4并减压去除溶剂。然后将剩余的残留物室温下悬浮在甲醇(50mL)中20小时。收集得到的固体并用冷甲醇(50mL)洗涤，然后用己烷(60mL)洗涤，并干燥得到期望的产物。
5-(3-氟苯基)-3-甲氧基-2-氰吡啶(9)的制备：在适合磁力搅拌并配有回流冷凝器和氮气入口的500mL圆底烧瓶中加入5-(3-氟苯基)-3-氯-2-氰吡啶，8，(9.28g，40mmol)、甲氧基钠(13.8mL，60mmol)和甲醇(200mL)。伴随着搅拌，将反应溶液加热回流20小时。通过TLC分析使用己烷/乙酸乙酯(6:3)作为流动相和UV 435nm显像反应组分测定5-(3-氟苯基)-3-氯-2-氰吡啶的消失来确定反应完全。将反应混合物冷却至室温并与水(500mL)混合。将混合物冷却至0℃至5℃并搅拌3小时。过滤收集得到的固体并用水洗涤，然后用己烷洗涤。然后在40℃下真空干燥得到的滤饼得到期望的产物。
5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羧酸(10)的制备：在适合磁力搅拌并配有回流冷凝器的50mL圆底烧瓶中加入5-(3-氟苯基)-3-甲氧基-2-氰吡啶，9，(0.912g，4mmol)和48％HBr水溶液(10mL)。在搅拌下，将反应溶液加热回流20小时。通过TLC分析使用己烷/乙酸乙酯(6:3)作为流动相和UV 435nm显像反应组分测定5-(3-氟苯基)-3-甲氧基-2-氰吡啶的消失来确定反应完全。然后将反应搅拌冷却至0℃-5℃并通过缓慢加入50％NaOH水溶液将pH调节至约2。然后在0℃-5℃下继续搅拌3小时。过滤收集得到的固体并用水洗涤，然后用己烷洗涤。然后在40℃下真空干燥得到的滤饼得到期望的产物。
甲基{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]氨基}-乙酯(11)的制备：在适合磁力搅拌并配有氮气入口的50mL圆底烧瓶中加入5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羧酸，10，(0.932gm，4mmol)、N,N’-羰基二咪唑(CDI)(0.97g，6mmol)和二甲亚砜(5mL)。45℃下搅拌反应混合物约1小时，然后冷却至室温。加入甘氨酸甲酯盐酸盐(1.15g，12mmol)，然后滴加二异丙基乙胺(3.2mL，19mmol)。然后在室温下搅拌混合物2.5小时，之后加入水(70mL)。将反应烧瓶内容物冷却至0℃-5℃并加入1N HCl直至溶液pH约为2。用二氯甲烷(100mL)萃取溶液并用MgSO4将有机相干燥16小时。加入硅胶(3g)并使溶液悬浮2小时，之后过滤去除固体。减压浓缩滤液至干燥，得到的剩余物悬浮于甲醇(10mL)中2小时。过滤收集得到的固体并用冷甲醇(20mL)洗涤，然后用己烷洗涤，干燥得到的滤饼得到期望的产物。
通过方案I步骤(e)中概括并在实施例1中描述的流程可以将酯前药甲基{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-基]氨基}乙酯，11，转化为公开的HIF-2稳定剂，{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]氨基}乙酸，6。
下文的方案IV概括且实施例4描述了公开的HIF-2稳定剂的酰胺前药流程的进一步的非限制性实施例。
方案IV
试剂和条件：(a)EDCI，HOBt，DIPEA，DMF；rt。
d.实施例4
5-(3-氟苯基)-N-(2-氨基-2-氧乙基)-3-羟基l吡啶-2-基酰胺(12)
5-(3-氟苯基)-N-(2-氨基-2-氧乙基)-3-羟基l吡啶-2-基酰胺(6)的制备：在5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羧酸，10，(699mg，3mmol)的DMF(20mL)溶液中，室温N2下加入1-(3-二甲基-氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)(0.925g，5.97mmol)和1-羟基笨并-三唑(HOBt)(0.806g，5.97mmol)。得到的溶液搅拌15分钟，然后加入2-氨基乙酰胺盐酸盐(0.66g，5.97mmol)和二异丙基乙胺(1.56ml，8.96mmol)。通过TLC监控反应，当反应完成时减压浓缩反应混合物并加入H2O。期望的产物可以通过常规后处理进行分离。
本公开还包括公开的稳定剂的药学上可接受的盐。下述是一个制备方案V中描述的药学上可接受的盐的非限制性实施例。
方案V
e.实施例5
钠{[5-(3-氟苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]氨基}乙酯(13)。
在含有NaHCO3(41.09mg)的小瓶中加入{[5-(3-氟-苯基)-3-羟基吡啶-2-羰基]-氨基}乙酸(6)的丙酮溶液(0.64mL的400mg样品/5.12mL)。搅拌溶液并真空浓缩分离期望的产物。
D.实验
下述实施例的发表旨在为本领域普通技术人员提供关于本文要求的化合物、组合物、物品、设备和/或方法是如何制备和评价的的完整的公开和描述，且意为本发明的纯粹的示例而并不意味着限制发明人所认为的其发明的范围。然而，本领域技术人员应当理解在本公开的教导下可以对所公开的具体实施方式进行很多改变并仍能获得相像或相似的结果，而不会偏离本发明的精神和范围。为了确保关于数字(例如，数字、温度等)的精确性，已进行了努力，但是应当考虑一些误差和偏差。
i)AKB-6899对桥粒斑蛋白表达和细胞桥粒功能的影响
在这些实验中评价了由AKB-6899处理导致的PHD3的抑制是否增加了MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞(体外)中桥粒斑蛋白的mRNA和蛋白表达。进一步的，评价了由AKB-6899处理导致的PHD3的抑制影响了细胞桥粒功能。
当与对照动物(即，接受DMSO)比较时，用AKB-6899(17.5mg/kg)处理的负载PyMT乳腺肿瘤的小鼠在DSP mRNA表达方面具有显著增加(即，在AKB-6899处理的动物中～118倍的增加)(图4B)。桥粒斑蛋白(DSP)是位于上皮细胞内膜的细胞桥粒的主要蛋白组分，在所述细胞内膜上其结合桥粒钙黏蛋白来维持细胞到细胞的附着。DSP受ER/PR表达调控(Maynadier等，2012；Ahmed等，1995；Pang等，2004)。临床上，DSP的表达在正常乳腺上皮中更高。DSP的损失与较低分化型乳腺肿瘤相关并增加淋巴结转移。DSP的损失与ki-67染色显著负相关(Davies等，1999)。引入细胞桥粒的功能性桥粒斑蛋白在丝氨酸165/166处是非磷酸化的。由蛋白激酶C(PKC)引起的ser165/166磷酸化导致桥粒斑蛋白从细胞桥粒解离。细胞桥粒功能损失和减少的附着连接是能够报告肿瘤分期、预后和治疗方案的标志物，因为该转换消除了治疗有效性并增加了不良临床结果的可能性(Dusek等，2011)。进一步的，DSP损失是上皮至间质转变(EMT)过程中的标志物，因为其结合同样移位至细胞核并激活Wnt/β-连环蛋白途径的附着蛋白(Yang等，2012)。
因为DSP受到ER/PR表达调控，并因为晚期PyMT肿瘤丧失了ER/PR-阳性并大量转移至淋巴结和肺(Lin等，2003)，所以评价了AKB-6899对更多调控基因表达的全局事件的影响。对培养物中的PyMT肿瘤细胞用DMSO或AKB-6899进行处理。在桥粒斑蛋白启动子中进行了用于CpG岛的甲基化特异性PCR。数据显示了在未处理细胞和DMSO处理的(溶媒)细胞(Utx或UTX)中几乎完全的DSP启动子甲基化。相反，用AKB-6899处理的细胞完全没有甲基化(图3A)。台盼蓝确认了与对照细胞相比，在AKB-6899处理的细胞中没有细胞死亡。实验重复进行，RNA从细胞中分离。进行了RT-PCR并评价了DNA甲基转移酶(DNMT)的调节。DNMT-3b的mRNA水平没有差异，但是记录了DNMT-1和DNMT-3a(即，调节甲基化的主要DNMT)的mRNA水平的显著降低(图1A)。DNMT-1和DNMT-3a的mRNA水平的降低增加了DSP的mRNA水平(图4A)，并增加了桥粒斑蛋白的蛋白表达(图5A)。
为了确定DNMT表达的降低和DSP表达的增加是否与人的癌症相关，测定了MDA-MB-231人三阴性乳腺癌中细胞桥粒斑蛋白的表达水平。蛋白质印迹分析表明同样缺少ER/PR的MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞不表达该蛋白(图5B)。评价了MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞的DNA甲基化并确定了这些细胞在DSP CpG岛处是显著超甲基化的。AKB-6899诱导了几乎全部的DSP CpG岛去甲基化。(图3B)。与PyMT肿瘤细胞相似，AKB-6899显著减少了MDA-MB-231人肿瘤细胞中的DNMT-1和DNMT-3a的mRNA水平(图1B)。
接下来，评价了AKB-6899是否增加人乳腺癌细胞中桥粒斑蛋白的mRNA水平和蛋白。培养MDA-MB-231人三阴性乳腺癌(TNBC)细胞并用(i)靶向脯氨酰羟化酶-3(PHD3)的人siRNA或(ii)杂乱的对照siRNA转染24小时(关于siRNA策略参见Eubank等，2011)。转染的细胞或者不处理(Utx)，或者用AKB-6899(1μM、10μM和25μM)或DMSO(溶媒)处理。处理持续24、48或72小时。使用台盼蓝拒染实验评价了毒性效果(例如，细胞死亡)，且如果需要的话调整处理浓度。使用第一样品，将细胞颗粒化(pelleted)用于DNA分离，然后用靶向桥粒斑蛋白启动子的引物进行甲基化特异性PCR。例如，本文公开的实验使用QIAGEN EpiTect Methyl Signature PCR试剂盒。使用第二样品，对细胞进行Trizol均质化、总RNA纯化、cDNA合成和RT-PCR。检测了DSPI和DSPII mRNA的mRNA水平。评价了siPHD3下调(knockdown)之后的PHD3的mRNA水平。使用第三样品，用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液裂解细胞。用桥粒斑蛋白I/II抗体和PHD3抗体免疫染色裂解物进行蛋白质印迹法分析并测定桥粒斑蛋白的表达。确定了PHD3蛋白表达的减少。在处理和未处理的细胞中，将PHD3mRNA的缺失或存在与(i)桥粒斑蛋白CpG岛的DNA甲基化百分比，(ii)桥粒斑蛋白的mRNA表达和(iii)桥粒斑蛋白的蛋白表达进行了比较。
评价了AKB-6899是否增强三阴性乳腺癌中的细胞桥粒功能。培养MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞，同时不处理一些细胞。其它细胞用DMSO(溶媒)处理或用AKB-6899(1μM，10μM和25μM)处理(关于浓度最优化的讨论参见Roda等，2012)。处理持续24、48或72小时。使用第一样品，通过在处理前将细胞接种至胶原-1极化层进行了胶原侵袭实验(CIA)(参见，例如，Tselepsis等，1998)。使用第二样品，进行了钙黄绿素-AM染料转移实验(FRAP)(参见，例如，Li等，2010)。使用第三样品，用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液裂解细胞并用DSP I/II抗体免疫染色进行蛋白质印迹分析。在处理和未处理的细胞中，测定了侵袭胶原的肿瘤细胞数量。还测定了能够转移钙黄绿素-AM的肿瘤细胞百分比。将这些测定与作为处理的功能的桥粒斑蛋白的蛋白表达进行了比较。
ii)AKB-6899对桥粒斑蛋白调节和转移抑制的影响
在本系列实验中，评价了AKB-6899对MDA-MB-231人TNBC荷瘤SCID小鼠中的DNA甲基化的影响。进一步的，测定了AKB-6899对DNMT-1和DNMT-3a表达的影响和AKB-6899对桥粒斑蛋白表达的影响。评价了针对血液、淋巴结和肺中肿瘤转移的AKB-6899单独的作用或组合多西他赛的作用。
测定了AKB-6899与标准化疗剂如多西他赛的组合是否能比单独的多西他赛更好地减少A375荷瘤SCID小鼠中人黑素瘤肿瘤生长。图9显示化疗和AKB-6899能够成功地给药至具有人肿瘤的SCID小鼠。图9还显示了多西他赛和AKB-6899二者体内有效剂量的最优化(未观察到对小鼠的毒性)。
接下来，测定了AKB-6899处理是否能增加SCID小鼠中的人乳腺肿瘤的DSP的mRNA水平和增加SP蛋白表达。年龄一致的雌性SCID小鼠在四号乳腺脂肪垫中原位移植1x106MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞。当肿瘤变明显时(约8天)，将小鼠随机分为下述处理组：(i)未处理的(UTX或Utx)；(ii)溶媒(DMSO)；和(iii)AKB-6899(17.5mg/kg每周给药3x)。每个处理都通过腹腔内注射给药100μL总体积。处理持续约10周或直至小鼠或肿瘤达到去除的标准。这些标准之一是肿瘤尺寸达到2cm。每天使用卡尺盲检记录肿瘤检测。每周记录肿瘤体积(即，长x宽x高)和小鼠重量。在每个处理期间，评价了发病率。10周后，对小鼠进行人工安乐死(例如，CO2和颈脱位法)并收集肿瘤。将肿瘤分为几个样品。对第一样品固定并切片用于使用人DSP I/II抗体用于总桥粒斑蛋白表达的免疫组织化学。第二样品立即冷冻用于DNA分离并随后进行对于DSP启动子的甲基化特异性PCR。第三样品用于分离RNA用于DSP mRNA水平的测定。
评价了单独的AKB-6899或联合多西他赛是否能比单独的多西他赛更有效减少肿瘤转移。多西他赛被认为是三阴性乳腺癌的基准疗法。年龄一致的雌性SCID小鼠在四号乳腺脂肪垫中原位移植1x106MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞。当肿瘤变明显时(约8天)，将小鼠随机分为下述处理组：(i)未处理的(UTX或Utx)；(ii)溶媒1(DMSO用于AKB-6899)或溶媒2(PBS用于多西他赛)；(iii)单独的多西他赛(30mg/kg 1x每周)；(iv)单独的AKB-6899(17.5mg/kg 3x每周)；和(v)组合的多西他赛(30mg/kg1x每周)和AKB-6899(17.5mg/kg 3x每周)。每个处理都通过腹腔内注射给药100μL总体积。处理持续约10周或直至小鼠或肿瘤达到去除的标准。这些标准之一是肿瘤尺寸达到2cm。每天使用卡尺盲检记录肿瘤检测。每周记录肿瘤体积(即，长x宽x高)和小鼠重量。在每个处理期间，评价了发病率。10周后，对小鼠进行人工安乐死(例如，CO2和颈脱位法)并收集肿瘤、心房血、淋巴结和肺。将肿瘤分为几个样品。对第一样品固定并切片用于使用人DSP I/II抗体用于测定总DSP表达的免疫组织化学。通过苏木精和曙红染色并进行病理学评估对肿瘤细胞的血管周侵袭进行了评价。第二样品立即冷冻用于DNA分离并随后进行对于桥粒斑蛋白启动子的甲基化特异性PCR。第三样品用于分离RNA用于桥粒斑蛋白mRNA表达。从全血分离总RNA，合成cDNA并进行RT-PCR用于检测MDA-MB-231人肿瘤细胞中人ERVK6A mRNA的存在。将一半肺在液氮中急速冷冻并匀浆用于总RNA分离、cDNA合成和用于ERVK6A mRNA的RT-PCR。为了量化肿瘤转移的发生率，对另一半肺进行平分并喷洒PBS，在福尔马林中固定，用苏木精染色并进行强光显微镜观察。
通过RT-PCR、肿瘤细胞血管周侵袭病理学评分和肺部肿瘤发生率评价了来自五个处理组(即，(i)未处理的小鼠，(ii)DMSO或PBS处理的小鼠(溶媒)，(iii)仅AKB-6899，(iv)仅多西他赛和(v)组合的AKB-6899和多西他赛处理的小鼠)每一个的血液、淋巴结和肺中的人ERVK6A mRNA水平。为了确认DNA低甲基化，进行了几个实验：(i)测定了肿瘤中桥粒斑蛋白mRNA和蛋白的表达，(ii)进行了桥粒斑蛋白启动子的甲基化特异性PCR，(iii)进行了桥粒斑蛋白的RT-PCR和(iv)使用了针对DSP I/II蛋白的免疫染色。
进行了统计分析。例如，使用Holm流程调整多样性。在SAS 9.3(SAS，Inc，Cary，NC)中分析数据。比较了siRNA及其对照在每个处理下的DSP启动子甲基化水平。对每个条件使用n＝3重复产生了80％功效(power)，检测了具有CV＝20％和a＝0.025(1-侧)的2倍差异。将处理的DSP蛋白表达水平和细胞桥粒功能与DMSO相比，需要n＝5重复/条件(对于两个端点和4个对照a＝0.025/8)。使用方差分析(ANOVA)用于假设检验。比较了未处理的小鼠、DMSO处理的小鼠和AKB-6899处理的小鼠的转移。n＝10小鼠每组产生了80％功效(power)，检测了具有CV＝50％和a＝0.025/10(5个端点和2个对照)的2.5倍差异。使用线性混合效应模型分析重复的肿瘤尺寸数据，对其它端点使用ANOVA。比较了未处理的、DMSO处理的或PBS处理的(溶媒)、单独的AKB-6899、单独的多西他赛和组合的AKB-6899+多西他赛的转移。n＝10小鼠每组产生了80％功效(power)，检测了具有CV＝50％和a＝0.025/10(5个端点和2个对照)的2.5倍差异。使用线性混合效应模型分析重复的肿瘤尺寸数据，对其它端点使用ANOVA。
iii)确定AKB-6899导致DNA甲基化逆转的机理
AKB-6899是脯氨酰羟化酶-3(PHD3)的特异性小分子抑制剂，其选择性稳定HIF-2α(而非HIF-1α)。暴露于间断低氧(IH)的肿瘤细胞失去HIF-2α但保留HIF-1α(Nanduri等，2009)。从而，将Bl6F10荷瘤小鼠暴露于IH过程。暴露于IH的那些小鼠与暴露于间断空气(p＝0.013)的那些相比具有增加的肿瘤转移。考察了DNA甲基化是否通过使与氧气获得相关的体内平衡机制正常化的基因的表达和/或抑制来调节低氧事件。
用AKB-6899处理PyMT小鼠乳腺癌细胞和MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞(其分别通常为99.96％和99.86％超甲基化的)分别将桥粒斑蛋白启动子低甲基化至0.0％和0.38％。从而，本文描述的实验目的在于(i)确定AKB-6899-诱导的低甲基化的机理，(ii)增加MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞中的SP表达，(iii)评价PHD3和HIF-2α特异性稳定化的作用，(iv)确定这些途径是如何调节DNMTs的，和(v)考察增加DSP表达对细胞桥粒功能的影响。
进一步的，在本文描述的实验中，考察了AKB-6899导致的HIF-2α稳定化的效果。特别的，通过比较用AKB-6899处理的MDA-MB-231人荷瘤SCID小鼠的肿瘤和用(i)单独的多西他赛和(ii)组合的AKB-6899和多西他赛处理的小鼠肿瘤评价了肿瘤转移。使用同一处理组，还评价了肿瘤中的桥粒斑蛋白表达水平。产生了MethylCap-Seq实验QC以描述(profile)了用(i)单独的AKB-6899，(ii)单独的多西他赛，(iii)单独的地西他宾或(iv)各种包括AKB-6899的组合处理的肿瘤之间的总DNA甲基化变化。对各处理组测定了甲基化谱。
评价了来自用溶媒或AKB-6899处理的PyMT乳腺荷瘤小鼠肿瘤的基因表达标记。与溶媒处理的小鼠相比，用AKB-6899处理的小鼠经历了桥粒斑蛋白基因表达的显著增加(即，AKB-6899动物相对于溶媒动物有118.5倍的增加)(图4A)。进行了桥粒斑蛋白启动子的甲基化特异性PCR。低甲基化水平几乎完全。(图3A(小鼠PyMT乳腺癌细胞)，图3B(人MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞)，图3C(人C8161.9黑素瘤肿瘤细胞)和图3D(人MCF-7乳腺癌细胞)。为了测定AKB-6899是否增加PyMT肿瘤细胞中的桥粒斑蛋白基因表达，在培养中用AKB-6899处理PyMT肿瘤细胞。观察到对桥粒斑蛋白的蛋白表达的上调(图5A)。确认了MDA-MB-231导致的缺失的DSP表达(图5B)。对PyMT肿瘤细胞和MDA-MB-231人肿瘤细胞进行了针对DNMT-1和DNMT-3a的RT-PCR。AKB-6899下调了PyMT肿瘤细胞和MDA-MB-231人肿瘤细胞中的DNMT mRNA表达(图1A(PyMT)和图1B(MDA-MB-231))。
接下来，评价了PHD3抑制和HIF-2α稳定化是否抑制人三阴性乳腺癌细胞中桥粒斑蛋白启动子的DNA甲基化。培养了MDA-MB-231人三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤细胞并用(i)靶向脯氨酰羟化酶-3(PHD3)的人siRNA，(ii)靶向HIF-2α的人siRNA或(iii)杂乱的对照siRNA进行转染。转染发生24小时。(Eubank等，2011)。处理组如下：(i)AKB-6899(0.25μM、2.5μM和25μM)，(ii)DMSO(溶媒)或(iii)5-氮杂-2′-脱氧胞苷(地西他宾)(0.5μM、1μM和2μM)，在0.5％O2或21％O2或单独的CoCl2，21％O2下。处理持续24、48或72小时。使用台盼蓝拒染实验评价了毒性。如果需要(例如，如果一项处理显示了毒性的迹象)，那么调整处理浓度。对第一样品进行Trizol均质化、总RNA纯化、cDNA合成和RT-PCR以确认siRNA沉默(即，通过比较siPHD3和PHD3的si杂乱对照并比较siHIF-2a和HIF-2α的si杂乱对照确定的mRNA下调)。为了确认各蛋白的减少，用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液裂解第二样品并用PHD3或HIF-2a抗体免疫染色裂解物进行蛋白质印迹分析。第三样品进行粒化从而分离得到DNA分离物，随后用靶向桥粒斑蛋白启动子的引物进行甲基化特异性PCR。
研究了HIF-2α稳定化诱导的DNMT转录减少是否导致桥粒斑蛋白启动子的DNA低甲基化。培养MDA-MB-231人三阴性乳腺癌肿瘤细胞并用(i)靶向人DNMT-1的siRNA，(ii)靶向人DNMT-3a的siRNA，(iii)靶向人DNMT-3b的siRNA，(iv)靶向组合的人DNMT-1、DNMT-3a和DNMT-3b的siRNA或(iv)杂乱的对照siRNA转染24小时。已经描述了在CP70人卵巢癌细胞中转染靶向多于一个DNMT的多个siRNA的组合方法。(Leu等，2003)。转染后，肿瘤细胞不进行处理(即，未处理的)或进行下述处理组之一：(i)AKB-6899(0.25μM、2.5μM和25μM)，(ii)DMSO(溶媒)或(iii)地西他宾(0.5μM、1μM和2μM)，在0.5％O2或21％O2或单独的CoCl2，21％O2下。处理持续24、48或72小时。使用台盼蓝拒染实验评价了毒性。如果需要(例如，如果一项处理显示了毒性的迹象)，那么调整处理浓度。对第一样品进行Trizol均质化、总RNA纯化、cDNA合成和RT-PCR以确认siRNA沉默。为了测定下调后的mRNA水平，比较了转染siDNMT-1、siDNMT-3a、siDNMT-3b或组合的靶向DNMTs的siRNAs的肿瘤细胞的mRNA水平和合适的si杂乱对照的mRNA水平。为了确认各蛋白的减少，用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液裂解第二样品并用DNMT抗体和DSP抗体免疫染色裂解物进行蛋白质印迹分析。第三样品进行粒化用于DNA分离，随后用靶向桥粒斑蛋白启动子的引物进行甲基化特异性PCR。对各DNMT和所有DNMTs的mRNA的缺失和/或存在比较了相对于处理条件的桥粒斑蛋白启动子的DNA甲基化百分比。
接下来研究了HIF-2α稳定化是否能增加人三阴性乳腺癌细胞中桥粒斑蛋白的蛋白表达和改进细胞桥粒功能。培养了MDA-MB-231人三阴性乳腺癌肿瘤细胞。在24小时或48小时中，培养的细胞不进行处理(Utx)或用DMSO(溶媒)、AKB-6899(0.25μM、2.5μM和25μM)或地西他宾(0.5μM，1μM和2μM)处理，在0.5％O2或21％O2或单独的CoCl2，21％O2下。对第一样品进行了胶原侵袭实验(CIA)，其中在处理前将细胞接种至胶原-1极化层(Tselepis等，1998)。对第二样品进行钙黄绿素-AM染料转移实验(FRAP)，其按照Li等，2010的描述进行。对第三样品用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液裂解细胞并用桥粒斑蛋白I/II抗体免疫染色进行蛋白质印迹分析。测定了侵袭胶原的肿瘤细胞数量和肿瘤细胞能够转移钙黄绿素-AM的百分比，然后与作为特异性处理的功能的桥粒斑蛋白的蛋白表达进行了比较。
iv)AKB-6899对桥粒斑蛋白调节和转移抑制的效果测定
测定了MDA-MB-231人TNBC荷瘤SCID小鼠中AKB-6899导致的HIF-2α稳定化的效果。评价了AKB-6899、多西他赛和组合的AKB-6899和多西他赛对血液和肺中的肿瘤转移的效力。产生了MethylCap-Seq实验QC以描述(profile)了用AKB-6899、多西他赛、地西他宾及其组合处理的肿瘤之间的总DNA甲基化变化。使用用于基因表达的微阵列确认了这些甲基化谱。
研究了AKB-6899和标准化疗剂如多西他赛的组合是否比单独的多西他赛能更好地减少A375荷瘤SCID小鼠中的人黑素瘤肿瘤生长。图9确认了在SCID小鼠人肿瘤模型中实施化疗和AKB-6899的可行性。图9还显示了多西他赛和AKB-6899二者体内有效剂量的最优化(即，未观察到对小鼠的毒性)。
研究了AKB-6899和标准化疗剂如多西他赛的组合是否比单独的多西他赛能更好地减少肿瘤转移。年龄一致的雌性SCID小鼠在四号乳腺脂肪垫中原位移植1x106MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞。当肿瘤变明显时(约8天)，将小鼠随机分为下述处理组：(i)溶媒(即，PBS用于多西他赛，PBS用于地西他宾，矿物油用于AKB-6899)；(ii)单独的多西他赛(30mg/kg 1x每周)；(iii)单独的AKB-6899(17.5mg/kg 3x每周)；(iv)单独的地西他宾(0.156mg/kg 2x每周)；(v)组合的多西他赛(30mg/kg 1x每周)和AKB-6899(17.5mg/kg 3x每周)；和(vi)组合的多西他赛和地西他宾。
处理持续约10周或直至小鼠或肿瘤达到去除的标准。这些标准之一是肿瘤尺寸达到2cm。每天使用卡尺盲检记录肿瘤检测。每周记录肿瘤体积(即，长x宽x高)和小鼠重量。在每个处理期间，评价了发病率。10周后，对小鼠进行人工安乐死(例如，CO2和颈脱位法)并收集肿瘤、心房血(Roda等，2012)和肺(Eubank等，2009)。将肿瘤分为几个样品。对第一样品固定并切片用于免疫组织化学，其中使用(i)人桥粒斑蛋白I/II抗体用于总桥粒斑蛋白表达，(ii)ki-67抗体用于肿瘤细胞增殖和(iii)半胱天冬酶-3抗体用于肿瘤细胞凋亡。通过苏木精和曙红染色并进行病理学评估对肿瘤细胞的血管周侵袭进行了评价。第二样品立即冷冻用于DNA分离并随后进行对于DSP启动子的甲基化特异性PCR。第三样品用于从全血分离总RNA，后者接下来合成cDNA并用于RT-PCR来检测MDA-MB-231人肿瘤细胞中人ERVK6AmRNA的存在。将一半肺在液氮中急速冷冻并匀浆用于总RNA分离、cDNA合成和用于ERVK6A mRNA的RT-PCR。为了量化肿瘤转移的发生率，对另一半肺进行平分并喷洒PBS，在福尔马林中固定，用苏木精染色并进行强光显微镜观察。
在各种处理后，通过RT-PCR、肿瘤细胞血管周侵袭的病理学评分和肺部肿瘤发生率评价了血液和肺中人ERVK6A mRNA的表达。通过使用桥粒斑蛋白启动子的甲基化特异性PCR和桥粒斑蛋白的蛋白免疫染色确认了肿瘤中cDNA的低甲基化和桥粒斑蛋白的蛋白表达。
接下来将AKB-6899诱导的SCID小鼠三阴性乳腺肿瘤DNA低甲基化与地西他宾诱导的DNA低甲基化进行了比较。用(i)AKB-6899，(ii)组合的AKB-6899和多西他赛以及单独的地西他宾和(iii)组合的AKB-6899和多西他赛进行处理的MDA-MB-231人乳腺荷瘤SCID小鼠的肿瘤DNA和RNA。按照描述(Rodriguez等，2012)进行了Methylcap-seq和人微阵列基因表达分析。按照Rodriguez等，2012的描述对DNA甲基化数据进行了分析。通过使用与人微阵列基因表达相同的肿瘤样品确认了处理组之间的DNA甲基化标记以将DNA超甲基化或低甲基化与功能基因活性进行比较。
在这些实验中，使用Holm流程调整多样性。在SAS 9.3(SAS，Inc，Cary，NC)中分析数据。比较了siRNA及其对照在每个处理下的DSP启动子甲基化水平。对每个条件使用n＝3重复产生了80％功效(power)，检测了具有CV＝20％和a＝0.025(1-侧)的2倍差异。使用n＝5重复/条件(对于两个端点和4个对照a＝0.025/8)将处理的DSP蛋白表达水平和细胞桥粒功能与DMSO相比。使用方差分析(ANOVA)用于假设检验。评价了各处理之间的转移(例如，(i)AKB-6899，(ii)用组合的AKB-6899和多西他赛处理和(iii)用多西他赛处理)。在此评价中，n＝10小鼠每组产生了80％功效(power)，检测了具有CV＝50％和a＝0.025/10(5个端点和2个对照)的2.5倍差异。使用线性混合效应模型分析重复的肿瘤尺寸数据，对其它端点使用ANOVA。使用线性混合效应模型比较了AKB-6899和地西他宾的基因甲基化或表达水平。n＝10小鼠/组允许检测每个基因的2倍差异，假定两组的标准差为0.4，FDR＝0.01(Jung等，2005)。使用回归模型考察甲基化和基因表达的关联。
v)AKB-6899对微小RNA和核仁小RNA表达的影响
评价了对MDA-MB-231人乳腺癌细胞给药AKB-6899之后各微小RNA和核仁小RNA的表达。数据显示于图15中。在这些癌细胞中，AKB-6899增加了数个微小RNA的表达，其中一些靶向甲基化调节剂如DNMTs。AKB-6899还调节约20个核仁小RNAs，其中一些已知引导甲基化。最终，该分析在AKB-6899处理的癌细胞中鉴定了超过60个RNA转录，其转录有待注解(anotate)。将AKB-6899处理的乳腺癌细胞与DMSO处理的癌细胞进行了比较。
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Claims (123)

1.调整对象中一种或多种基因启动子DNA甲基化的方法，包括：
向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的方法，进一步包括测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
3.权利要求2的方法，其中测定一种或多种基因启动子的甲基化状态包括将对象的受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态与对象的未受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态进行比较。
4.权利要求2的方法，其中测定一种或多种基因启动子的甲基化状态包括检测该一种或多种启动子的甲基化百分比。
5.权利要求1的方法，其中，在给药步骤前，该一种或多种基因启动子是超甲基化的。
6.权利要求1的方法，其中，在给药步骤后，一种或多种基因启动子的甲基化状态发生变化。
7.权利要求6的方法，其中甲基化状态的变化包括该一种或多种基因启动子的甲基化百分比的降低。
8.权利要求6的方法，如果没有达到期望的甲基化状态，那么该方法进一步包括重复给药有效量的组合物。
9.权利要求6的方法，其中期望的甲基化状态是该一种或多种基因启动子的甲基化百分比的降低。
10.权利要求8的方法，进一步包括测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
11.权利要求1的方法，其中组合物抑制一种或多种DNA甲基转移酶的表达。
12.权利要求1的方法，其中组合物抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶的表达。
13.权利要求1的方法，其中组合物抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。
14.权利要求1的方法，其中给药包括腹腔注射。
15.权利要求1的方法，其中给药包括口服给药。
16.权利要求1的方法，其中给药包括静脉内给药。
17.权利要求1的方法，其中该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)基因启动子、c-Myc基因启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子样(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、mutL同系物1启动子、2型非息肉病(MLH1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子、转录因子21(TCF21)启动子或血管内皮生长因子-A(VEGF-A)启动子。
18.权利要求1的方法，其中该一种或多种基因启动子包括雌激素受体基因(ER)启动子、乳腺癌1基因(BRCA1)启动子、上皮钙黏蛋白基因(E-cad)启动子、TMS1基因启动子、胰岛素样生长因子结合蛋白7基因(IGFBP7)启动子、p16启动子、视黄酸受体基因(RARβ2)启动子或Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员1基因(RASSF1A)启动子。
19.权利要求1的方法，其中对象是不健康的。
20.权利要求1的方法，其中对象患有癌症。
21.权利要求19的方法，其中癌症是乳腺癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。
22.权利要求19的方法，其中乳腺癌是三阴性乳腺癌。
23.权利要求19的方法，其中癌症是黑素瘤且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。
24.权利要求19的方法，其中癌症是宫颈癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子或c-Myc启动子。
25.权利要求19的方法，其中癌症是肺癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、mutL同系物1、结肠癌、2型非息肉病(MLH1)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子或转录因子21(TCF21)启动子。
26.权利要求19的方法，进一步包括给药一种或多种抗癌剂。
27.调整对象中一种或多种基因启动子DNA甲基化的方法，包括：
通过测定一种或多种基因启动子的甲基化状态对需要治疗的对象进行鉴定；并
向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
28.权利要求27的方法，其中测定一种或多种基因启动子的甲基化状态包括将对象的受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态与对象的未受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态进行比较。
29.权利要求27的方法，其中测定一种或多种基因启动子的甲基化状态包括检测该一种或多种启动子的甲基化百分比。
30.权利要求27的方法，其中，在给药步骤前，该一种或多种基因启动子是超甲基化的。
31.权利要求27的方法，其中，在给药步骤后，该一种或多种基因启动子的甲基化状态发生变化。
32.权利要求31的方法，其中甲基化状态的变化是该一种或多种启动子的甲基化百分比的降低。
33.权利要求31的方法，其中如果没有达到期望的甲基化状态，那么该方法进一步包括重复给药有效量的组合物。
34.权利要求33的方法，进一步包括测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
35.权利要求27的方法，其中对象是不健康的。
36.权利要求27的方法，其中对象患有癌症。
37.权利要求35的方法，其中受感染的组织是肿瘤或癌且其中未受感染的组织不是肿瘤或癌。
38.权利要求27的方法，其中组合物抑制一种或多种DNA甲基转移酶的表达。
39.权利要求27的方法，其中组合物抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶的表达。
40.权利要求27的方法，其中组合物抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。
41.权利要求27的方法，其中给药包括腹腔注射。
42.权利要求27的方法，其中给药包括口服给药。
43.权利要求27的方法，其中给药包括静脉内给药。
44.权利要求27的方法，其中该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)基因启动子、c-Myc基因启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子样(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、mutL同系物1、非息肉病2型(MLH1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子、转录因子21(TCF21)启动子或血管内皮生长因子-A(VEGF-A)启动子。
45.权利要求27的方法，其中该一种或多种基因启动子包括雌激素受体基因(ER)启动子、乳腺癌1基因(BRCA1)启动子、上皮钙黏蛋白基因(E-cad)启动子、TMS1基因启动子、胰岛素样生长因子结合蛋白7基因(IGFBP7)启动子、p16启动子、视黄酸受体基因(RARβ2)启动子或Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员1基因(RASSF1A)启动子。
46.权利要求35的方法，其中癌症是乳腺癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。
47.权利要求46的方法，其中癌症是三阴性乳腺癌。
48.权利要求35的方法，其中癌症是黑素瘤且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。
49.权利要求35的方法，其中癌症是宫颈癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子或c-Myc启动子。
50.权利要求35的方法，其中癌症是肺癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、mutL同系物1、结肠癌、2型非息肉病(MLH1)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子或转录因子21(TCF21)启动子。
51.权利要求35的方法，进一步包括给药一种或多种抗癌剂。
52.治疗诊断患有或疑似患有以DNA超甲基化为特征的疾病或病症的对象的方法，包括：
向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
53.权利要求52的方法，进一步包括测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
54.权利要求53的方法，其中测定一种或多种基因启动子的甲基化状态包括检测该一种或多种基因启动子的甲基化百分比。
55.权利要求53的方法，其中测定一种或多种基因启动子的甲基化状态包括将对象受感染组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态与对象未受感染的组织中一种或多种基因启动子的甲基化状态进行比较。
56.权利要求52的方法，其中，在给药步骤前，该一种或多种基因启动子是超甲基化的。
57.权利要求52的方法，其中，在给药步骤后，一种或多种基因启动子的甲基化状态发生变化。
58.权利要求57的方法，其中甲基化状态的变化包括该一种或多种基因启动子的甲基化百分比的降低。
59.权利要求57的方法，其中如果没有达到期望的甲基化状态，那么该方法进一步包括重复给药有效量的组合物。
60.权利要求59的方法，其中期望的甲基化状态包括该一种或多种基因启动子的甲基化百分比的降低。
61.权利要求59的方法，进一步包括测定一种或多种基因启动子的甲基化状态。
62.权利要求52的方法，其中组合物抑制一种或多种DNA甲基转移酶的表达。
63.权利要求52的方法，其中组合物抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶的表达。
64.权利要求52的方法，其中组合物抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。
65.权利要求52的方法，其中给药包括腹腔注射。
66.权利要求52的方法，其中给药包括口服给药。
67.权利要求52的方法，其中给药包括静脉内给药。
68.权利要求52的方法，其中以DNA超甲基化为特征的疾病或病症不是癌。
69.权利要求52的方法，其中对象是不健康的。
70.权利要求52的方法，其中对象患有癌症。
71.权利要求69的方法，其中癌症是乳腺癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。
72.权利要求71的方法，其中癌症是三阴性乳腺癌。
73.权利要求69的方法，其中癌症是黑素瘤且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子。
74.权利要求69的方法，其中癌症是宫颈癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子或c-Myc启动子。
75.权利要求69的方法，其中癌症是肺癌且该一种或多种基因启动子包括桥粒斑蛋白(DSP)启动子、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)启动子、淀粉样βA4前体蛋白结合家族A成员1(APBA1)启动子、细胞粘附分子1(CADM1)启动子、E-钙黏蛋白(CDH1)启动子、H-钙黏蛋白(CDH13)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)启动子、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)启动子、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)启动子、细胞色素P450家族1子族B多肽1(CYP1B1)启动子、肝癌缺失基因1(DLC1)启动子、脆性组氨酸三联体基因(FHIT)启动子、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子、mutL同系物1、结肠癌、2型非息肉病(MLH1)启动子、亚甲基四氢叶酸还原酶(NAD(P)H)(MTHFR)启动子、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样基因(OPCML)启动子、配对盒5(PAX5)启动子、带锌指结构的含PR结构域2基因(PRDM2)启动子、Ras联合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)启动子、Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员2(RASSF2)启动子、分泌性卷曲相关蛋白1(SFRP1)启动子或转录因子21(TCF21)启动子。
76.权利要求69的方法，进一步包括给药一种或多种抗癌剂。
77.降低对象中c-myc表达的方法，包括：
向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
78.权利要求77的方法，进一步包括改变c-myc启动子的甲基化状态。
79.权利要求77的方法，进一步包括测定c-myc启动子的甲基化状态。
80.权利要求79的方法，其中测定c-myc启动子的甲基化状态包括检测c-myc启动子的甲基化百分比。
81.权利要求77的方法，其中，在给药步骤前，c-myc启动子是超甲基化的。
82.权利要求77的方法，其中，在给药步骤后，c-myc启动子的甲基化状态发生变化。
83.权利要求82的方法，其中c-myc启动子的甲基化状态的变化包括c-myc启动子的甲基化百分比降低。
84.权利要求77的方法，其中对象是不健康的。
85.权利要求77的方法，其中对象患有癌症。
86.权利要求84的方法，其中癌症是宫颈癌。
87.权利要求77的方法，其中c-myc表达降低抑制对象中的转移。
88.权利要求77的方法，其中组合物抑制一种或多种DNA甲基转移酶的表达。
89.权利要求77的方法，其中组合物抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶的表达。
90.权利要求77的方法，其中组合物抑制一种或多种脯氨酰羟化酶的表达。
91.增加对象中桥粒斑蛋白表达的方法，包括：
向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐。
92.权利要求91的方法，进一步包括改变桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态。
93.权利要求91的方法，进一步包括测定桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态。
94.权利要求93的方法，其中测定桥粒斑蛋白启动子的甲基化状态包括检测桥粒斑蛋白启动子的甲基化百分比。
95.权利要求91的方法，其中桥粒斑蛋白的基因表达增加。
96.权利要求91的方法，其中桥粒斑蛋白的蛋白表达增加。
97.权利要求91的方法，其中对象是不健康的。
98.权利要求91的方法，其中对象患有癌症。
99.权利要求97的方法，其中癌症是乳腺癌。
100.权利要求99的方法，其中乳腺癌是三阴性乳腺癌。
101.权利要求97的方法，其中癌症是黑素瘤。
102.权利要求97的方法，其中癌症是宫颈癌。
103.权利要求97的方法，其中癌症是肺癌。
104.权利要求97的方法，进一步包括给药一种或多种抗癌剂。
105.权利要求91的方法，其中给药包括腹腔注射。
106.权利要求91的方法，其中给药包括口服给药。
107.权利要求91的方法，其中给药包括静脉内给药。
108.权利要求91的方法，其中桥粒斑蛋白表达的增加抑制对象中的转移。
109.抑制对象中的转移的方法，包括：
向对象施用有效量的包含下式化合物的组合物：
或其药学上可接受的盐；并
调整一种或多种基因启动子的DNA甲基化状态。
110.权利要求109的方法，其中调整一种或多种基因启动子的DNA甲基化状态包括改变一种或多种基因启动子的甲基化状态。
111.权利要求110的方法，其中改变一种或多种基因启动子的甲基化包括降低该一种或多种启动子的甲基化百分比。
112.权利要求109的方法，其中该一种或多种基因包括桥粒斑蛋白基因。
113.权利要求109的方法，其中桥粒斑蛋白的基因表达增加。
114.权利要求109的方法，其中桥粒斑蛋白的蛋白表达增加。
115.权利要求109的方法，其中对象是不健康的。
116.权利要求109的方法，其中对象患有癌症。
117.权利要求115的方法，其中癌症是乳腺癌。
118.权利要求117的方法，其中乳腺癌是三阴性乳腺癌。
119.权利要求115的方法，其中癌症是黑素瘤。
120.权利要求115的方法，其中癌症是宫颈癌。
121.权利要求115的方法，其中癌症是肺癌。
122.权利要求115的方法，进一步包括给药一种或多种抗癌剂。
123.用于治疗癌症的组合物，包括：有效量的下式化合物：
或其药学上可接受的盐；和一种或多种化疗剂。
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