CN110283889B

CN110283889B - 一种双基因监控反应体系、试剂盒及其应用

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Publication number: CN110283889B
Application number: CN201910660264.2A
Authority: CN
Inventors: 焦晶晶; 秦闯华; 唐四元; 徐根明; 潘艺; 赵谦
Original assignee: Hunan Yearth Biotechnology Co ltd; Central South University
Current assignee: Hunan Yearth Biotechnology Co ltd; Central South University
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: AU2020316528A1; CN110283889A; WO2021013140A1

Abstract

本发明涉及一种提高甲基化基因酶切法检测准确性的方法，具体涉及一种双基因监控反应体系、应用双基因监控反应体系的试剂盒及其在检测人结直肠癌中的应用。本发明采用酶切法处理所需检测样本核酸，与重盐法相比，核酸损失更少，检测灵敏度更高；采用双基因监控反应体系，既能监控检测反应时的样本质量，又能监控酶切反应的酶切效率，使检测的准确性大大提高；该发明方法的应用操作简单，成本低。

Description

一种双基因监控反应体系、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高甲基化基因酶切法检测准确性的方法，具体涉及一种双基因监控反应体系、应用双基因监控反应体系的试剂盒及其在检测人结直肠癌中的应用。

背景技术

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是分散在DNA序列中，另一种呈现高度聚集状态，称之为CpG岛。在正常组织里，70％-90％散在的CpG是被甲基修饰的，而CpG岛往往是非甲基化的。目前，越来越多的研究表明，CpG岛局部的高甲基化是肿瘤发生的一个重要因素，由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测。

目前市面上针对甲基化检测的方法均采用重盐转化法对检测前的样本进行处理，该方法对样本核酸的损伤很大，导致检测的灵敏度不高，而且存在转化不完全而导致的假阳性结果。

与重盐转化法相比，DNA甲基化检测方法--甲基化敏感性限制性内切酶法可以避免对目的核酸的损伤，从而使检测的准确度大大提高，然而，酶切不完全而导致的假阳性结果也是限制该方法准确性的一个主要问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种提高酶切法检测甲基化准确性的方法，通过创造性的双基因监控反应体系及其应用，达到提高检测准确度的目的。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种双基因监控反应体系，体系中包括目的基因引物对和探针，内参基因GAPDH引物对和探针，酶切监控基因引物对和探针，所述目的基因和酶切监控基因ACTB的引物扩增区域包含多个甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点。

优选的，目的基因的探针、内参基因GAPDH的探针和酶切监控基因ACTB的探针分别单独采用FAM、VIC、Cy3、Cy5、ROX、HEX中的一种标记。

优选的，目的基因、内参基因GAPDH、酶切监控基因ACTB采用不同的荧光标记，更优选的，目的基因SFRP1探针采用FAM荧光标记，内参基因GAPDH探针采用VIC荧光标记，酶切监控基因ACTB探针采用Cy5荧光标记。

优选的，目的基因引物探针、内参基因GAPDH引物探针和酶切监控基因ACTB引物探针在1管中进行反应。

一种采用上述的双基因监控反应体系提高酶切法检测甲基化准确性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、采用核酸提取试剂盒提取样本核酸DNA；

步骤二、取10-100ng所提取的核酸用甲基化敏感性限制性内切酶进行酶切处理；

步骤三、对步骤二中得到的酶切产物采用双基因监控反应体系进行检测。

优选的，步骤二中所述的甲基化敏感性限制性内切酶的量为10-100U。

优选的，步骤二中所述的甲基化敏感性限制性内切酶选自以下内切酶中的一种或多种：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。

本发明还提供了一种用于上述提高酶切法检测甲基化准确性方法的DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

1)SFRP1基因的引物对和探针；

2)VIM基因的引物对和探针；

3)TWIST1基因的引物对和探针；

4)GAPDH的引物对和探针；

5)ACTB的引物对和探针；

6)阴性和阳性质控品；

7)PCR反应液。

每次检测时，阴性质控品，阳性质控品都需要和样本一起同步参与检测，以保证实验的准确性和有效性；

所述针对SFRP1基因的引物对的序列为：

SFRP1-F：GTTGGATCCCAGGAAGAGCG(SEQ ID NO.2)；

SFRP1-R：CATGCTGTGCACGTGATTCC(SEQ ID NO.3)；

所述针对SFRP1的探针序列为：

SFRP1-P：CGCGAGGGGCGCTGAGCGATACC(SEQ ID NO.4)；

所述针对VIM的引物对序列为：

VIM-F：GCTCCTCTGCCGTGCG(SEQ ID NO.14)；

VIM-R：TAGTTGGCGAAGCGGTCATT(SEQ ID NO.15)；

所述针对VIM的探针序列为：

VIM-P：CAGGACTCGGTGGACTTCTCGCTGGCCG(SEQ ID NO.16)；

所述针对TWIST1的引物对序列为：

TWIST1-F：GCACATTCGTGGGCTCTCAA(SEQ ID NO.17)；

TWIST1-R：ATGTCGTAAAGAGTGCGCCG(SEQ ID NO.18)；

所述针对TWIST1的探针序列为：

TWIST1-P：CCGATTTCTCCTTCCACTTTGCCAGTGCAC(SEQ ID NO.19)；

优选的，上述引物对中各引物的浓度为0.1-10uM。

优选的，上述探针的浓度为0.1-10uM。

上述的试剂盒的具体使用步骤包括如下步骤：

步骤一、样本DNA提取；

步骤二、纯化步骤一中提取的DNA，去除抑制成分；

步骤三、取1-20ug纯化后DNA用甲基化敏感性限制性内切酶进行酶切处理；

步骤四、采用双基因监控反应体系分别检测SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因的甲基化。

本发明还提供了一种基于上述试剂盒在检测人结直肠癌中的应用。

本发明设计引物的扩增区域包含多个甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点，野生型的序列在甲基化敏感性限制性内切酶的作用下被酶切为片段，后续PCR反应时无法扩增，而甲基化序列在甲基化敏感性限制性内切酶的作用下能保持完整，后续PCR反应时可以扩增。具体过程如图1所示。

目的基因扩增区域含有n个所选取的甲基化敏感的限制性内切酶酶切位点，内参基因GAPDH扩增区域不含有限制性所选取的甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点，酶切监控基因ACTB扩增区域含有m个所选取的甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点，且m≦n，因为酶切检测基因ACTB的甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点个数m小于或等于目的基因的甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点个数n，目的基因，内参基因GAPDH，酶切监控基因ACTB均在一个反应管中进行反应，当酶切监控基因ACTB酶切完全时，则说明目的基因也能酶切完全，当酶切监控基因ACTB酶切不完全，则说明反应体系酶切受到影响，目的基因酶切不完全。内参基因GAPDH扩增区域不含甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点，不受酶切的影响，可以监控反应体系中的人基因组含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、采用酶切法处理所需检测样本核酸，与重盐法相比，核酸损失更少，检测灵敏度更高；

2、采用双基因监控反应体系，既能监控检测反应时的样本质量，又能监控酶切反应的酶切效率，使检测的准确性大大提高；

3、该发明方法的应用操作简单，成本低。

附图说明

图1是本发明的甲基化序列和野生型序列在甲基化敏感性限制性内切酶作用下的切割过程；

图2是按照表2检测体系检测50ng，40ng，30ng，20ng，10ng Human Non-MethylatedDNA酶切后SFRP1基因的结果；

图3是按照表3检测体系检测50ng，40ng，30ng，20ng，10ng Human Non-MethylatedDNA酶切后SFRP1基因的结果；

图4是按照表3检测体系检测50ng，40ng，30ng，20ng，10ng Human Non-MethylatedDNA酶切后ACTB基因的结果；

图5是S1,S2,S3,S4,S5,S6酶切法FAM通道检测结果；

图6是S1,S2,S3,S4,S5,S6重盐处理法FAM通道检测结果；

图7是SFRP1野生型序列图；

图8是SFRP1甲基化序列图；

图9是VIM野生型序列图；

图10是VIM甲基化序列图；

图11是TWIST1野生型序列图；

图12是TWIST1甲基化序列图；

图13是结直肠癌阴性样本SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因扩增曲线图；

图14是结直肠癌阴性样本在检测SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因时内参基因GAPDH扩增曲线图；

图15是结直肠癌阳性样本SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因扩增曲线图；

图16是结直肠癌阳性样本在检测SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因时内参基因GAPDH扩增曲线图。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

检测SFRP1基因甲基化

SFRP1基因启动子区域CpG岛序列为：

5’-GCTCCAAGCATTCTCTCGGCCTTTCTGAACTTTCTACGCTTTGGGTTTTTGTTTTTTCCTCCCGTCTCAGAGGTTAAAAACTTCGATAGGGACTCGGAGTCCTCCTAGAGGAGAGGGAAGCTCCCCTGTTATTTAAAGCGCAAGGCTTTGTTTCAGGTATGGGAAAGGCGAAGTTGGATCCCAGGAAGAGCGGCTCCGGGGACCACAGCGAGTCCCTGCGAGGCCAAGGCGCAGAGCTGCCGCTCCCGGGCCAGCCCCGCCGTGCACCTGGGTCGCGAGGGGCGCTGAGCGATACCTGGGACAGACCAGACGCGCTTAGGAATCACGTGCACAGCATGCGAGCAACCTCGGGCCCTCAGTCCCCAGCACCGGGACCCAGCGGCGGGCGGGCGTAGGGTGGCGCGGGTTCTCCTGCAGCTCCGGCCGGGGGATGGAGGGGGCGGCTCGCGCACGTGGGAGGAGGCAGCCTTACCTTGGGGCTTGGAGGCTTCGGTGGCATTGGGCGGCGTCATGGCGATGCAGACGTCCCCCTCGGGGAACTTGTCACACTTAAGCATCTCGGGCCAGTAGAAGCCGAAGAACTGCATGACCGGCTCGCACGAGTCGCGCACGGCCTCGCAGAGCCAGCGACACGGGTAGATGGGCCGGTCCAGGCAGACGGGCGCGAAGAGCGAGCAGAGGAAGACCTGGGTGCCGGCGTGGCAGTTCTTGTTGAGCAGGGGCACCCAGCTGCTGGCCTGCTGCTTCACCTCCGCCATGGTCTCGTGCTCCAGCAGGTTGGGCAGCACCATCTTCTTGTAGCCCACGTTGTGGCACAGCCGCAGGTCCGCGGGGATGTCCACGCACTGAGGTGGCTTGGTGTAGAAGCGCCCGCTCTGGTACGGGCCGATGTCCGACTGGAAGCTCACGTAGTCGTACTCGCTGGCCGAGCCCACGGCCAGAAGCGCCGCGCCCAGCGCCAGCAGCACGCCCAGGGCTGCCCCGCGGCGGCCCCCCTCGCTGCGCCCGATGCCCATGCCGGCTCTGCGCCCTGTTCTCCGCGACGTCGGGGCTGCCTCCGCCGCCTCCCCGCGCGCGTCCTGCCGCAAACTTCCAGGGACCTCCGGGGACAAAAGGCGCAGTCCCCAGCGTTGCCCGGCTCCGCGGCCGCAAGCTGCTGCCCGGTCCCCCCGGCCAGTGGCGGCCCTCGGCCTGCGGTCGGAGGCGGCGCGGGCGGGGAGGCGGCGCTGCGGGCTGGGTGCGCCCCGGCTCCCGGAGGTGCGGCGAGCAGGAAGGCGCGGGGCGGCGGGCGCGCGGCACTGACTCCGGAGGCTGCAGGGCTGGAGTGCGCGGGGCTCCTACGGCCGAGCCCTCGGAGCCGCCCCGCGCAGCCAATCAGCTCCCGGCGGGGCGAGCCGCACTCGTTACCACGTCCGTCACCGGCGCGGGAGCCAATCGCCTCCCTCGCGAGCGGGTTCGGTTTACTAGAACCAGACGCGGCTCAACACCCCTTAAAAAACAAAACCAAAAATACATAAATAAAAGGGGGAGGAGGAAAGAGACAAGGGGAGAAAAAGAAGGGGAATGGATCACGGCGTGGGGTGGAGAGAGACCAGGGCGGACGCTGTAATTAACTCGCATTGGCTTGCAGAGAAGCGGGGAGCCTGGATCATACTTGCAAACCCATGAAATTATGAAGACTTTTTTTTTTTGAGACAGTTTCGCTCTTGTTGCCTAAGCTGGAGTGCAATGGCGCTATCTCCGCTGACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGATTACAGCCGCGTGCCACCATGCCCCCGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTAGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATGCTCCTGCCTTGGCCTCCCAAACTTTTTTTTTCTTTTTCTTTACACTGCT-3’(SEQ ID NO.1)

针对SFRP1基因启动子区域设计的引物对和探针序列为：

SFRP1-F：GTTGGATCCCAGGAAGAGCG(SEQ ID NO.2)；

SFRP1-R：CATGCTGTGCACGTGATTCC(SEQ ID NO.3)；

SFRP1-P：FAM-CGCGAGGGGCGCTGAGCGATACC(SEQ ID NO.4)；

该引物对扩增区域序列为：

5’-GTTGGATCCCAGGAAGAGCGGCTCCGGGGACCACAGCGAGTCCCTGCGAGGCCAAGGCGCAGAGCTGCCGCTCCCGGGCCAGCCCCGCCGTGCACCTGGGTCGCGAGGGGCGCTGAGCGATACCTGGGACAGACCAGACGCGCTTAGGAATCACGTGCACAGCATG-3’(SEQ ID NO.5)

该序列包含2个甲基化敏感性限制性内切酶HpaII的酶切位点，当用甲基化敏感性限制性内切酶对样本核酸进行酶切处理时，野生型样本模板序列会被酶切为3段，做荧光定量PCR检测时无法完成扩增。

同时还设计了内参基因GAPDH的引物对和探针序列：

GAPDH-F：GCAACTAGGATGGTGTGGCT(SEQ ID NO.6)；

GAPDH-R：TCGCCCCACTTGATTTTGGA(SEQ ID NO.7)；

GAPDH-P：VIC-ACCTTGTGTCCCTCAATATGGTCCTGT(SEQ ID NO.8)；

该引物对扩增区域序列为：

5’-GCAACTAGGATGGTGTGGCTCCCTTGGGTATATGGTAACCTTGTGTCCCTCAATATGGTCCTGTCCCCATCTCCCCCCCACCCCCATAGGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3’(SEQ ID NO.9)

该序列包含0个甲基化敏感性限制性内切酶HpaII的酶切位点，当用甲基化敏感性限制性内切酶对样本核酸进行酶切处理时，样本模板序列不会被酶切，做荧光定量PCR检测是可以完成扩增，由于不受酶切的的影响，且GAPDH作为管家基因，可以监控样本里面的人源核酸含量。

本发明还设计了酶切监控基因ACTB的引物对和探针序列：

ACTB-F：AATGAGGGCAGGACTTAGCTT(SEQ ID NO.10)；

ACTB-R：TTCCTTCCTGGGTGAGTGGAG(SEQ ID NO.11)；

ACTB-P：Cy5-CAGCCCCGAGGGGTAACCCTCATGTCA(SEQ ID NO.12)；

该引物对扩增区域序列为：

5’-AATGAGGGCAGGACTTAGCTTCCACAGCACAGCCCCGAGGGGTAACCCTCATGTCAGGCAGAGCCGGGAGACAGTCTCCACTCACCCAGGAAGGAA-3’(SEQ ID NO.13)

该序列包含1个甲基化敏感性限制性内切酶HpaII的酶切位点，当用甲基化敏感性限制性内切酶对样本核酸进行酶切处理时，样本模板序列会被酶切为2段，做荧光定量PCR检测时无法完成扩增。

目的基因SFRP1探针采用FAM荧光标记，内参基因GAPDH探针采用VIC荧光标记，酶切监控基因ACTB探针采用Cy5荧光标记，因此可以在1管中完成检测。

由于酶切监控基因ACTB扩增区域酶切位点个数(1个)小于目的基因SFRP1扩增区域酶切位点个数(2个)，而ACTB基因数目与SFRP1基因数目相同，因此当ACTB基因酶切完全时，则说明SFRP1也能酶切完全，可以达到监控酶切体系的目的，防止由于酶切不完全而导致的假阳性结果。

本方法的实施包括以下几个步骤：

1、取10ng,20ng,30ng,40ng,50ng的Human Non-Methylated DNA用10U的HpaII进行酶切处理，按照下表1配置酶切体系，在PCR仪上37℃酶切16h；

表1

2、分别按照下表2和下表3配置检测体系，其中表2的检测体系里面只加了目的基因SFRP1的引物对和探针，内参基因GAPDH的引物对和探针；表3的检测体系里面加了目的基因SFRP1的引物对和探针，内参基因GAPDH的引物对和探针，酶切监控基因ACTB引物对和探针；

表2

组分	体积(ul)
		上一步酶切产物	10
2x TaqMan<sup>TM</sup>Universal Master Mix II,with UNG	25
		SFRP1-F(10uM)	1
SFRP1-R(10uM)	1
		SFRP1-P(10uM)	1
GAPDH-F(10uM)	1
		GAPDH-R(10uM)	1
GAPDH-P(10uM)	1
		ddH<sub>2</sub>O	9

表3

3、分别按照上述表2和表3中的体系将样本加入

MultiwellPlate 96,white中，封上膜后置于

仪器上进行荧光定量qPCR检测。

qPCR反应程序为表4：

表4

4、检测结果分析

按照下表5进行判定，检测出SFRP1基因该启动子CpG岛扩增区域是否甲基化。

表5

图2为按照表2检测体系检测50ng，40ng，30ng，20ng，10ng Human Non-MethylatedDNA酶切后SFRP1基因的结果，图3为按照表3检测体系检测50ng，40ng，30ng，20ng，10ngHuman Non-Methylated DNA酶切后SFRP1基因的结果。由图2，图3可以看出，50ng，40ng的Human Non-Methylated DNA酶切后检测SFRP1甲基化时，均有扩增，说明50ng，40ng的HumanNon-Methylated DNA没有被酶切干净。当我们按照表2中的检测体系进行检测时，由于没有酶切监控基因ACTB监测酶切体系，我们只能判定这2个样本(50ng Human Non-MethylatedDNA，40ng Human Non-Methylated DNA)为阳性样本，导致假阳性的发生；然而，当我们按照表3中的检测体系进行检测时，由于加入了酶切监控基因ACTB监测酶切体系，如图4所示，50ng，40ng的Human Non-Methylated DNA酶切后检测时ACTB基因均有扩增，说明50ng，40ng的Human Non-Methylated DNA没有被酶切干净，因此可以判定这2个样本(50ng HumanNon-Methylated DNA，40ng Human Non-Methylated DNA)是由于酶切不完全导致的假阳性样本。

通过以上结果分析可以看出，本发明方法可以提高甲基化检测的准确性，防止假阳性结果的发生。

实施例2

本发明方法与重盐法在检测基因甲基化灵敏性方面的对比

本实施例使用甲基化和非甲基化标准品DNA(Human Methylated&Non-MethylatedDNASet，Catalog#D5014，ZYMO RESEARCH)进行掺和，掺和10ng的不同突变频率的样本DNA，如表6所示：

表6

本发明方法酶切法检测步骤为：

1)取10U的HpaI按照实施例1的步骤对S1,S2,S3,S4,S5,S6进行酶切处理，37℃酶切16h；

2)按照实施例1的步骤对酶切后的产物进行检测，检测结果如图5所示。

重盐法检测步骤：

1)取S1,S2,S3,S4,S5,S6用EZ DNA Methylation-Gold Kits进行硫化；

2)用设计的SFRP1基因重盐法检测的引物检测，检测结果如图6所示。

通过对比可以看出，本发明(酶切法)最低能检出10ng核酸中0.5％甲基化，而重盐法最底只能检出10ng核酸中1％甲基化，本发明(酶切法)方法检测甲基化灵敏度要远高于重盐法。

实施例3

基于本发明方法开发的粪便样本结直肠癌早筛甲基化检测试剂盒

本实施例基于粪便样本结直肠癌早筛甲基化检测试剂盒主要成分如表7所示：

表7

该甲基化检测试剂盒包括：针对SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因启动子区域设计的引物对和探针。

所述针对SFRP1基因的引物对的序列为：

SFRP1-F：GTTGGATCCCAGGAAGAGCG(SEQ ID NO.2)；

SFRP1-R：CATGCTGTGCACGTGATTCC(SEQ ID NO.3)；

所述针对SFRP1的探针序列为：

SFRP1-P：CGCGAGGGGCGCTGAGCGATACC(SEQ ID NO.4)；

所述针对VIM的引物对序列为：

VIM-F：GCTCCTCTGCCGTGCG(SEQ ID NO.14)；

VIM-R：TAGTTGGCGAAGCGGTCATT(SEQ ID NO.15)；

所述针对VIM的探针序列为：

VIM-P：CAGGACTCGGTGGACTTCTCGCTGGCCG(SEQ ID NO.16)；

所述针对TWIST1的引物对序列为：

TWIST1-F：GCACATTCGTGGGCTCTCAA(SEQ ID NO.17)；

TWIST1-R：ATGTCGTAAAGAGTGCGCCG(SEQ ID NO.18)；

所述针对TWIST1的探针序列为：

TWIST1-P：CCGATTTCTCCTTCCACTTTGCCAGTGCAC(SEQ ID NO.19)；

上面所述引物对中各引物的浓度为0.1-10uM；

上面所述探针的浓度为0.1-10uM。

本发明试剂盒具体操作步骤如下：

1、粪便样本DNA提取

采用QiaGen粪便DNA提取试剂盒提取正常人或肠癌患者粪便样本里面的人基因组DNA(具体提取方法参照QiaGen粪便DNA提取试剂盒说明书)。

2、纯化1中提取的人基因组DNA

采用ZYMO RESEARCH公司的DNA Clean&Concentrator纯化试剂盒纯化1中提取的人基因组DNA，以进一步去除抑制成分。

3、酶切处理

取1-20ug纯化后的人基因组DNA进行酶切，酶切时间为37℃16h；酶切体系如下表8所示(所选内切酶购买于NEB公司，酶切体系参照所购内切酶说明书)

表8

组成	体积
		10x甲基化敏感性限制性内切酶Buffer	5ul
人基因组DNA/阴性质控品/阳性质控品	1-10ug
		甲基化敏感性限制性内切酶HpaII	5-20U
无核酶水	补足至50ul

所选靶基因SFRP1，VIM，TWIST1的扩增区域序列和酶切原理如下：

SFRP1野生型序列为图7所示。

SFRP1野生型序列有2个酶切位点，甲基化敏感限制性内切酶HpaII特异性的将其酶切为3段，酶切后序列为：

5’-GTTGGATCCCAGGAAGAGCGGCTC-3’(SEQ ID NO.20)

5’-CGGGGACCACAGCGAGTCCCTGCGAGGCCAAGGCGCAGAGCTGCCGCTCC-3’(SEQ IDNO.21)

5’-CGGGCCAGCCCCGCCGTGCACCTGGGTCGCGAGGGGCGCTGAGCGATACCTGGGACAGACCAGACGCGCTTAGGAATCACGTGCACAGCATG-3’(SEQ ID NO.22)

SFRP1甲基化序列为图8所示。由于序列中CG中的C为甲基化，而HpaII为甲基化敏感的限制性内切酶，经过酶切后，SFRP1甲基化序列不会被酶切为片段，酶切后序列为：

5’-GTTGGATCCCAGGAAGAGCGGCTCCGGGGACCACAGCGAGTCCCTGCGAGGCCAAGGCGCAGAGCTGCCGCTCCCGGGCCAGCCCCGCCGTGCACCTGGGTCGCGAGGGGCGCTGAGCGATACCTGGGACAGACCAGACGCGCTTAGGAATCACGTGCACAGCATG-3’(SEQ ID NO.23)

VIM野生型序列为图9所示。

VIM野生型序列有1个酶切位点，甲基化敏感限制性内切酶HpaII特异性的将其酶切为2段，酶切后序列为：

5’-GCTCCTCTGCCGTGCGCCTGCGGAGCAGCGTGCC-3’(SEQ ID NO.24)

5’-CGGGGTGCGGCTCCTGCAGGACTCGGTGGACTTCTCGCTGGCCGACGCCATCAACACCGAGTTCAAGAACACCCGCACCAACGAGAAGGTGGAGCTGCAGGAGCTGAATGACCGCTTCGCCAACTA-3’(SEQ IDNO.25)

VIM甲基化序列为图10所示。

由于序列中CG中的C为甲基化，而HpaII为甲基化敏感的限制性内切酶，经过酶切后，SFRP1甲基化序列不会被酶切为片段，酶切后序列为：

5’-GCTCCTCTGCCGTGCGCCTGCGGAGCAGCGTGCCCGGGGTGCGGCTCCTGCAGGACTCGGTGGACTTCTCGCTGGCCGACGCCATCAACACCGAGTTCAAGAACACCCGCACCAACGAGAAGGTGGAGCTGCAGGAGCTGAATGACCGCTTCGCCAACTA-3’(SEQ ID NO.26)

TWIST1野生型序列为图11所示。

TWIST1野生型序列有1个酶切位点，甲基化敏感限制性内切酶HpaII特异性的将其酶切为2段，酶切后序列为：

5’-GCACATTCGTGGGCTCTCAAAGAGTTGGAAGGTTTCTGAGAAATAGTGGGATTGC-3’(SEQ IDNO.27)

5’-CGGCTTTGAGAAAATATGAAGAAACCGATTTCTCCTTCCACTTTGCCAGTGCACTTTCCTTCCACTTTCACTGGTGCTGGGGGCGGCGCACTCTTTACGACAT-3’(SEQ ID NO.28)

TWIST1甲基化序列为图12所示。

由于序列中CG中的C为甲基化，而HpaII为甲基化敏感的限制性内切酶，经过酶切后，TWIST1甲基化序列不会被酶切为片段，酶切后序列为：

5’-GCACATTCGTGGGCTCTCAAAGAGTTGGAAGGTTTCTGAGAAATAGTGGGATTGCCGGCTTTGAGAAAATATGAAGAAACCGATTTCTCCTTCCACTTTGCCAGTGCACTTTCCTTCCACTTTCACTGGTGCTGGGGGCGGCGCACTCTTTACGACAT-3’(SEQ ID NO.29)

由上可知，靶基因SFRP1，VIM，TWIST1野生型序列会被甲基化敏感性限制性内切酶酶切为片段，在qPCR检测时无法完成扩增，而甲基化序列不会被甲基化敏感性限制性内切酶酶切，在qPCR检测时可以完成扩增，从而达到检测甲基化的目的。

4、实时定量qPCR检测

取10ul步骤3中酶切后的产物进行实时定量qPCR检测，分别检测SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因的甲基化，qPCR检测的体系如下表9所示

表9

每个样本做三个孔，分别检测SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因的甲基化情况，检测时的推荐布局如下表10所示：

表10

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

PC1

PC2

PC3

S7-S

S7-D

S7-N

B

NC1

NC2

NC3

S…

C

S1-S

S1-D

S1-N

NTC

D

S2-S

S2-D

S2-N

E

S3-S

S3-D

S3-N

F

S4-S

S4-D

S4-N

G

S5-S

S5-D

S5-N

H

S6-S

S6-D

S6-N

注：S为检测SFRP1基因，D为检测VIM基因，N为检测TWIST1基因，PC为阳性质控品，NC为阴性质控品，NTC为空白对照

将点好样后覆好膜的96孔板瞬时离心，置于Lightcycler480Ⅱ上进行qPCR检测，反应程序如表11所示：

表11

5、检测结果的判读(以Lightcycler 480II为例)

判读前，在Noise Band界面将Noiseband(Auto)改为Noiseband(Fluoresc)，将Noiseband后面方框中的数字改成2.0000，阴性质控品，阳性质控品的Cp值按下表12进行判读时，满足表12中所示，则说明qPCR反应有效。

表12

接下来可以对单个样本进行判读，如果样本检测SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因时内参基因GAPDH(VIC通道)的Cp值均小于或等于40，酶切监控基因ACTB(Cy5通道)的Cp值均等于50，则说明检测时样本DNA的投入量足够且酶切完全，可以对单个样本按下表13所示进行判读：

表13

实施例4

基于本发明方法所开发的试剂盒在检测人结直肠癌中的应用

收集下面三种粪便样本：

(1)30例肠镜确诊为正常人的粪便样本；

(2)20例肠镜及病理检查确诊为癌前腺瘤患者的粪便样本；

(3)30例肠镜及病理检查确诊为肠癌患者的粪便样本。

按照实施例3中试剂盒的使用方法，对上面收集的粪便样本进行检测及判读，在30例正常人中均未检出三个基因的甲基化，20例癌前腺瘤患者按照本试剂盒判读方法检出阳性18例(占90％)，30例肠癌患者按照本试剂盒判读方法检出阳性28例(占93.3％)。

本实施例的具体实验数据如图13-图16所示，其中图13为结直肠癌阴性样本SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因扩增曲线图；图14结直肠癌阴性样本在检测SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因时内参基因GAPDH扩增曲线图；图15为结直肠癌阳性样本SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因扩增曲线图；图16为结直肠癌阳性样本在检测SFRP1基因，VIM基因，TWIST1基因时内参基因GAPDH扩增曲线图。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> 一种双基因监控反应体系、试剂盒及其应用

<130> 1

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1965

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gctccaagca ttctctcggc ctttctgaac tttctacgct ttgggttttt gttttttcct 60

cccgtctcag aggttaaaaa cttcgatagg gactcggagt cctcctagag gagagggaag 120

ctcccctgtt atttaaagcg caaggctttg tttcaggtat gggaaaggcg aagttggatc 180

ccaggaagag cggctccggg gaccacagcg agtccctgcg aggccaaggc gcagagctgc 240

cgctcccggg ccagccccgc cgtgcacctg ggtcgcgagg ggcgctgagc gatacctggg 300

acagaccaga cgcgcttagg aatcacgtgc acagcatgcg agcaacctcg ggccctcagt 360

ccccagcacc gggacccagc ggcgggcggg cgtagggtgg cgcgggttct cctgcagctc 420

cggccggggg atggaggggg cggctcgcgc acgtgggagg aggcagcctt accttggggc 480

ttggaggctt cggtggcatt gggcggcgtc atggcgatgc agacgtcccc ctcggggaac 540

ttgtcacact taagcatctc gggccagtag aagccgaaga actgcatgac cggctcgcac 600

gagtcgcgca cggcctcgca gagccagcga cacgggtaga tgggccggtc caggcagacg 660

ggcgcgaaga gcgagcagag gaagacctgg gtgccggcgt ggcagttctt gttgagcagg 720

ggcacccagc tgctggcctg ctgcttcacc tccgccatgg tctcgtgctc cagcaggttg 780

ggcagcacca tcttcttgta gcccacgttg tggcacagcc gcaggtccgc ggggatgtcc 840

acgcactgag gtggcttggt gtagaagcgc ccgctctggt acgggccgat gtccgactgg 900

aagctcacgt agtcgtactc gctggccgag cccacggcca gaagcgccgc gcccagcgcc 960

agcagcacgc ccagggctgc cccgcggcgg cccccctcgc tgcgcccgat gcccatgccg 1020

gctctgcgcc ctgttctccg cgacgtcggg gctgcctccg ccgcctcccc gcgcgcgtcc 1080

tgccgcaaac ttccagggac ctccggggac aaaaggcgca gtccccagcg ttgcccggct 1140

ccgcggccgc aagctgctgc ccggtccccc cggccagtgg cggccctcgg cctgcggtcg 1200

gaggcggcgc gggcggggag gcggcgctgc gggctgggtg cgccccggct cccggaggtg 1260

cggcgagcag gaaggcgcgg ggcggcgggc gcgcggcact gactccggag gctgcagggc 1320

tggagtgcgc ggggctccta cggccgagcc ctcggagccg ccccgcgcag ccaatcagct 1380

cccggcgggg cgagccgcac tcgttaccac gtccgtcacc ggcgcgggag ccaatcgcct 1440

ccctcgcgag cgggttcggt ttactagaac cagacgcggc tcaacacccc ttaaaaaaca 1500

aaaccaaaaa tacataaata aaagggggag gaggaaagag acaaggggag aaaaagaagg 1560

ggaatggatc acggcgtggg gtggagagag accagggcgg acgctgtaat taactcgcat 1620

tggcttgcag agaagcgggg agcctggatc atacttgcaa acccatgaaa ttatgaagac 1680

tttttttttt tgagacagtt tcgctcttgt tgcctaagct ggagtgcaat ggcgctatct 1740

ccgctgactg caacctccgc ctcccgggtt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag 1800

tagctgggat tacagccgcg tgccaccatg cccccgctaa ttttttgtat ttttagtaga 1860

gacggggttt caccatgtta gccaggctgg tctcgaactc ctgacctcag gtgatgctcc 1920

tgccttggcc tcccaaactt tttttttctt tttctttaca ctgct 1965

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gttggatccc aggaagagcg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

catgctgtgc acgtgattcc 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgcgaggggc gctgagcgat acc 23

<210> 5

<211> 166

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gttggatccc aggaagagcg gctccgggga ccacagcgag tccctgcgag gccaaggcgc 60

agagctgccg ctcccgggcc agccccgccg tgcacctggg tcgcgagggg cgctgagcga 120

tacctgggac agaccagacg cgcttaggaa tcacgtgcac agcatg 166

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcaactagga tggtgtggct 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcgccccact tgattttgga 20

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

accttgtgtc cctcaatatg gtcctgt 27

<210> 9

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gcaactagga tggtgtggct cccttgggta tatggtaacc ttgtgtccct caatatggtc 60

ctgtccccat ctccccccca cccccatagg cgagatccct ccaaaatcaa gtggggcga 119

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

aatgagggca ggacttagct t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ttccttcctg ggtgagtgga g 21

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cagccccg aggggtaacc ctcatgtca 29

<210> 13

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aatgagggca ggacttagct tccacagcac agccccgagg ggtaaccctc atgtcaggca 60

gagccgggag acagtctcca ctcacccagg aaggaa 96

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gctcctctgc cgtgcg 16

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tagttggcga agcggtcatt 20

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

caggactcgg tggacttctc gctggccg 28

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

gcacattcgt gggctctcaa 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

atgtcgtaaa gagtgcgccg 20

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ccgatttctc cttccacttt gccagtgcac 30

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gttggatccc aggaagagcg gctc 24

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

cggggaccac agcgagtccc tgcgaggcca aggcgcagag ctgccgctcc 50

<210> 22

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

cgggccagcc ccgccgtgca cctgggtcgc gaggggcgct gagcgatacc tgggacagac 60

cagacgcgct taggaatcac gtgcacagca tg 92

<210> 23

<211> 166

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gttggatccc aggaagagcg gctccgggga ccacagcgag tccctgcgag gccaaggcgc 60

agagctgccg ctcccgggcc agccccgccg tgcacctggg tcgcgagggg cgctgagcga 120

tacctgggac agaccagacg cgcttaggaa tcacgtgcac agcatg 166

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

gctcctctgc cgtgcgcctg cggagcagcg tgcc 34

<210> 25

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

cggggtgcgg ctcctgcagg actcggtgga cttctcgctg gccgacgcca tcaacaccga 60

gttcaagaac acccgcacca acgagaaggt ggagctgcag gagctgaatg accgcttcgc 120

caacta 126

<210> 26

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

gctcctctgc cgtgcgcctg cggagcagcg tgcccggggt gcggctcctg caggactcgg 60

tggacttctc gctggccgac gccatcaaca ccgagttcaa gaacacccgc accaacgaga 120

aggtggagct gcaggagctg aatgaccgct tcgccaacta 160

<210> 27

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

gcacattcgt gggctctcaa agagttggaa ggtttctgag aaatagtggg attgc 55

<210> 28

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

cggctttgag aaaatatgaa gaaaccgatt tctccttcca ctttgccagt gcactttcct 60

tccactttca ctggtgctgg gggcggcgca ctctttacga cat 103

<210> 29

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

gcacattcgt gggctctcaa agagttggaa ggtttctgag aaatagtggg attgccggct 60

ttgagaaaat atgaagaaac cgatttctcc ttccactttg ccagtgcact ttccttccac 120

tttcactggt gctgggggcg gcgcactctt tacgacat 158

Claims

1.一种采用双基因监控反应体系提高酶切法检测甲基化准确性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、采用核酸提取试剂盒提取样本核酸DNA；

步骤三、对步骤二中得到的酶切产物采用双基因监控反应体系进行检测；

所述一种双基因监控反应体系，其特征在于，体系中包括目的基因引物对和探针，内参基因GAPDH引物对和探针，酶切监控基因ACTB引物对和探针，所述GAPDH的引物扩增区域未包含甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点；所述目的基因和酶切监控基因ACTB的引物扩增区域包含多个甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点；所述酶切监控基因ACTB的引物扩增区域所包含的甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点个数小于或等于目的基因的引物扩增区域所包含的甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点个数；目的基因引物和探针、内参基因GAPDH引物和探针和酶切监控基因ACTB引物和探针在1管中进行荧光定量PCR反应；

所述目的基因的探针、内参基因GAPDH的探针和酶切监控基因ACTB的探针采用不同的荧光标记，所述荧光标记选自FAM、VIC、Cy3、Cy5、ROX、HEX。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因SFRP1探针采用FAM荧光标记，内参基因GAPDH探针采用VIC荧光标记，酶切监控基因ACTB探针采用Cy5荧光标记。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述的甲基化敏感性限制性内切酶的量为10-100U。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述的甲基化敏感性限制性内切酶选自以下内切酶中的一种或多种：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。

5.一种DNA 甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

1）SFRP1基因的引物和探针，所述SFRP1基因的引物序列为SEQ ID NO.2和3，所述SFRP1基因的探针序列为SEQ ID NO.4；

2）VIM基因的引物和探针，所述VIM基因的引物序列为SEQ ID NO.14和15，所述VIM基因的探针序列为SEQ ID NO.16；

3）TWIST1基因的引物和探针，所述TWIST1基因的引物序列为SEQ ID NO.17和18，所述TWIST1基因的探针序列为SEQ ID NO.19；

4）GAPDH的引物和探针，所述GAPDH的引物序列为SEQ ID NO.6和7，所述GAPDH的探针序列为SEQ ID NO.8；

5）ACTB的引物和探针，所述ACTB的引物序列为SEQ ID NO.10和11，所述ACTB的探针序列为SEQ ID NO.12；

6）阴性和阳性质控品；

7）PCR反应液；

所述阴性质控品为Tris、BSA和人基因组甲基化阴性DNA的混合液；

所述阳性质控品Tris、BSA和人基因组甲基化阳性DNA的混合液；

所述PCR反应液为Tris，氯化镁、EDTA、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq 酶和UNG的混合液。