KR20120061247A - 자궁경부암 특이적 메틸화 유전자의 ＣｐＧ 섬을 함유하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자궁경부암에서 특이적으로 CpG 섬이 메틸화되는 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 자궁경부암에서 특이적으로 CpG 섬이 메틸화되는 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커 및 상기 바이오마커의 메틸화 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 자궁경부암을 초기 형질전환 단계에서 진단할 수 있어, 조기 진단이 가능하고, 고위험군에 대한 진행을 예측할 수 있어 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 자궁경부암을 스크리닝할 수 있다.

Description

자궁경부암 특이적 메틸화 유전자의 ＣｐＧ 섬을 함유하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오마커 {Biomarker for Diagnosing Cervical Cancer Containing CpG island of Cervical Cancer Specific Methylation Gene}

본 발명은 자궁경부암에서 특이적으로 CpG 섬이 메틸화되는 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 자궁경부암에서 특이적으로 CpG 섬이 메틸화되는 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커 및 상기 바이오마커의 메틸화 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 검출방법에 관한 것이다.

현대 의약분야의 발전에도 불구하고, 인간 암의 대부분을 차지하는 고형암(혈액암외의 암)은 5년 생존율이 50%도 되지 않는다. 모든 암 환자의 3분의 2 가량이 진행된 상태에서 발견되며, 이들 중 대부분이 암 진단을 받은 후 2년 안에 사망한다. 이러한 결과가 나타나는 것은 암 치료 방법의 문제 뿐만아니라, 초기 단계에서 암을 진단하거나 진행된 암을 정확하게 진단하거나, 새로이 개발된 치료제에 대한 예후를 관찰하기가 쉽지 않기 때문이다.

최근 임상에서의 암 진단은 전형적으로 병력 조사, 물리적 검사 및 임상적 평가 후 조직 생검을 수행하여 확인하고 있다. 그러나 임상 실험에 의한 암 진단은 암 세포의 수가 10억개 이상이고 암의 직경이 1cm 이상일 경우에만 가능하다. 이 경우, 상기 암 세포는 이미 전이능력을 가지고 있으며, 적어도 이들 중의 반은 이미 전이된 것이다. 반면, 암으로부터 직접 또는 간접적으로 생산되는 물질을 모니터링하기 위한 종양 마커가 암 스크리닝에 사용되고 있지만, 암이 존재하는 경우에도 반 이상이 정상으로 나타나고, 암이 없는 경우에도 자주 양성으로 나타나기 때문에, 정확성에 한계가 있어 혼란을 초래하고 있다. 게다가, 암 치료에 주로 사용되는 항암물질은 종양의 크기가 작을 때만 효과를 나타낸다는 문제가 있다.

암의 진단 및 치료가 어려운 이유는 암세포가 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암세포는 과도하게 계속적으로 자라고, 주변 조직으로 침투하며, 말단 기관으로 전이하여 결국 죽음에 이르게 한다. 면역 체계나 항암 치료의 공격에도 불구하고, 암세포는 살아남아서, 계속해서 진화하며, 생존하기에 가장 알맞은 세포그룹으로 선택적으로 전파된다. 암세포는 수많은 유전자의 변이에 의하여 발생하는 고도의 생명력을 가지는 살아있는 생명체다. 하나의 세포가 암세포로 형질전환되고, 병원에서 진단가능한 악성의 암 덩어리로 발달하기 위해서는, 수많은 유전자 변이가 일어나야만 한다. 그러므로, 근원에서 암을 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준의 접근이 필요하다.

최근, 유전자 분석이 암 진단에 적극적으로 시도되고 있다. 가장 간단하고 전형적인 방법은 PCR을 이용하여 혈액 내의 ABL:BCR 퓨전 유전자(백혈병의 유전적 특징)의 존재를 검출하는 것이다. 상기 방법은 95% 이상의 정확성을 가지고 있으며, 간단하고 쉬운 이러한 유전자 분석을 이용하여 만성 골수성 백혈병을 치료하고, 결과 평가 및 후속 연구에 사용된다. 그러나 상기 방법은 소수의 혈액 암에만 적용된다는 결점이 있다.

최근에는, 혈청 또는 혈장의 DNA를 이용한 유전자 테스트가 적극적으로 시도되고 있다. 상기 방법은 암세포에서 분리되어 혈액으로 분비되고, 혈청에서 자유 DNA 형태로 존재하는 암 관련 유전자를 검출하는 것이다.

혈청에 존재하는 DNA의 농도는 정상인보다 실제 암 환자에서 5~10배 높게 나타난다는 것이 확인되었으며, 이러한 증가된 DNA는 대부분 암 세포에서 유래된 것이다. 암 세포로부터 분리된 DNA 등을 이용한, 돌연변이, 삭제 또는 종양유전자 및 종양-억제 유전자의 기능적 소실과 같은 암-특이적 유전자 이상을 분석하여 암을 진단할 수 있다.

혈청 내의 변이된 K-Ras 종양유전자, p53 종양-억제 유전자 및 p-16 유전자의 프로모터 메틸화와 마이크로세틀라이트의 표지 및 불안정성을 검토하여 폐암, 두경부암, 유방암, 대장암 및 간암을 진단하려는 적극적 시도가 있었다 (Chen, X. et al., Clin. Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes. M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin. Cancer Res., 5:2689, 1999).

혈액 외의 샘플에서도 암세포의 DNA는 검출될 수 있다. 폐암 환자의 객담 또는 기관지폐포 세척액에서 유전자 또는 항체 테스트를 이용하여 암세포의 존재를 검출하는 방법이 시도되었다 (Palmisano, W. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999). 덧붙여, 암 환자의 대장 및 직장 배설물에서 종양유전자의 존재를 검출하는 방법(ahlquist, D. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000) 및 뇨 및 전립선 액에서 프로모터 메틸화 이상을 검출하는 방법(Goessl, C. et al., Cancer Res., 60L:5941, 2000)이 시도되었다. 그러나, 수많은 유전자의 이상을 초래하고, 각 유전자의 다양한 변이 특징을 보여주는 암을 정학하게 진단하기 위해서는, 많은 수의 유전자를 정확하고 자동화된 방식으로 동시에 분석하는 방법이 요구되지만, 이러한 방법은 아직까지 수립되어 있지 않다.

따라서, DNA 메틸화의 측정을 통하여 암을 진단하는 방법을 제안하고자 한다. 특정 유전자의 프로모터 CpG 섬이 하이퍼-메틸화되면, 상기 유전자는 발현이 억제된다. 비록 생체에서 유전자의 단백질-코딩 서열에서 변이가 없더라도 상기 유전자의 기능이 손실되어 주된 메카니즘이 방해받게 된다. 또한, 인간 암에서 수많은 종양 억제 유전자가 기능을 잃는 것 또한 한 인자로 분석된다. 그러므로, 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검출하는 것이 암 연구에 있어서 절실히 요구된다. 최근에는, 암 진단 및 스크리닝을 위한 메틸화 특이적 PCR(이후, MSR이라고 함) 또는 자동 DNA 시퀀싱과 같은 방법에 의하여 프로모터 메틸화를 결정하는 방법이 적극적으로 시도되고 있다.

수많은 병들이 유전자 이상에 의하여 발생하고, 유전자 이상의 가장 빈번한 형태가 유전자 코드 서열의 변화이다. 이러한 유전자 변화를 돌연변이라고 한다. 어떠한 유전자에 돌연변이가 있으면, 상기 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 구조 및 기능이 변화하고, 이상 및 절단이 발생하며, 이러한 변이된 단백질은 질병을 일으킨다. 그러나, 특정 유전자에 변이가 없어도, 상기 유전자의 발현에 이상이 생겨 병을 유발할 수 있다. 전형적인 예가 유전자 전사조절부위, 예를 들면, CpG 섬의 시토신 염기 부위에 메틸 그룹이 부착되는 메틸화이다. 이를 후생유전학적(epigenetic) 변화라고 하며, 돌연변이와 비슷한 방식으로 자손 세포에 전이되고, 예를 들면, 대응하는 단백질의 발현이 소실되는 것과 같은 동일한 효과를 나타낸다. 가장 전형적인 변화는 암 세포에서 종양 억제 유전자의 발현이 프로모터 CpG 섬의 메틸화에 의하여 억제되고, 이러한 억제된 발현은 암을 유발하는 중요한 메카니즘이다 (Robertson, K. and Jones, P., Carcinogen, 21, 461, 2000).

암의 정확한 진단을 위하여, 변이된 유전자를 검출하는 것뿐만 아니라, 상기 유전자의 변이가 어디서 일어났는지를 판단하는 것 또한 중요하다. 초기 연구가 코딩 서열의 변이, 예를 들면, 점 돌연변이, 삭제, 삽입 또는 거시적인 염색체 이상에 촛점이 맞춰져 있었던 반면, 최근에는 후생유전학적 변화를 상기 변이만큼 중요하게 다루고 있으며, 전형적인 후생유전학적 변이의 예가 프로모터 CpG 섬의 메틸화이다.

포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 시토신 링(5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸시토신(5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에만 부착된다. CpG의 C는 메틸그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다. CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다. 상기 CpG의 5-mC는 자연적으로 탈아미노화하여 T가 되고, 포유동물 게놈의 CpG는 단지 1%의 확율로 나타나는데, 이는 정상적 확율(1/4ㅧ1/4=6.25%)보다 매우 낮은 것이다.

CpG가 예외적으로 모여 있는 부위를 CpG 섬이라 한다. CpG 섬은 C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75% 이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. and Bird, A., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995).

정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다.

암 유발 과정 동안, 프로모터 CpG 섬에서 메틸화가 발견되며, 해당하는 유전자의 발현이 억제된다. 특히, 세포 사이클 또는 세포자살(apoptosis)을 조절하고, DNA를 복구하며, 세포 부착 및 세포간의 상호작용에 관여하고, 세포 친입 및 전이를 억제하는 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬이 메틸화되면, 이러한 메틸화는 코딩 서열의 돌연변이와 같은 방식으로 상기 유전자의 발현과 기능을 억제하게 되고, 이에 의하여 암의 발달과 진행이 촉진되게 된다. 또한, 노화에 의하여 CpG 섬의 부분적 메틸화도 일어난다.

흥미로운 사실은, 유전자의 돌연변이가 선천적 암의 발달에 영향을 미치고, 후천성 암에서는 돌연변이가 발생하지 않은 유전자의 경우, 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 돌연변이 대신에 일어난다는 것이다. 전형적인 예로, 후천적 신장암 VHL(von Hippel Lindau), 유방암 BRCA1, 대장암 MLH1 및 위암 E-CAD가 포함된다. 또한, 모든 암의 반 정도에서 p16의 프로모터 메틸화 또는 Rb의 돌연변이가 발생하며, 나머지 암들에서는 p53의 돌연변이나, p73, p14 등의 프로모터 메틸화가 나타난다.

중요한 사실은 프로모터 메틸화에 의한 후생성 변화가 유전적 변화(예를 들면, 코딩서열의 돌연변이)를 일으키고, 암의 발달이 상기와 같은 유전적 및 후생적 변화의 조합에 의하여 진행된다는 것이다. 한 예로, MLH1 유전자의 경우, 대장암에서 MLH1 유전자의 하나의 대립유전자의 기능은 변이나 삭제에 의하여 손실되고, 나머지 하나의 대립유전자는 프로모터 메틸화에 의하여 기능을 수행하지 못하는 상황이 된 것이다. 또한, DNA 복구 유전자인 MLH1이 프로모터 메틸화에 의하여 기능을 수행하지 못한다면, 다른 중요 유전자에서 돌연변이 발생이 암 발생을 더욱 촉진시킬 수 있는 것이다.

대부분의 암은 CpG에 대하여 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 하이퍼메틸화, 나머지 CpG 염기 부위의 하이퍼메틸화 및 DNMT(DNA cytosine methyltransferase)라 불리는 메틸화 효소의 활성 증가라는 세가지 특징을 나타낸다 (singal, R. and Ginder, G., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. and Jones, P., Carcinogensis, 21:461, 2000; Malik, K. and Brown, K., Brit. J. Cancer, 83:1583, 2000).

프로모터 CpG 섬이 메틸화될때, 해당하는 유전자의 발현이 왜 억제되는 지에 대해서는 아직까지 완전하게 밝혀지지 않았으나, MECP(methyl CpG-binding protein) 또는 MBD(methyl CpG-binding domain protein) 및 히스톤 디아세틸라아제가 메틸화된 시토신에 부착되고, 이에 의하여 염색체의 크로마틴 구조가 변화되어, 히스톤 단백질이 변화되기 때문일 것이라는 가설이 있다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화가 암의 발생에 직접적으로 관여하는지 또는 암이 발생한 후의 이차적인 변화인지에 대하여는 논의의 소지가 있다. 그러나, 종양 억제 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 인덱스라는 것은 명백하므로, 암의 진단 및 조기 발견, 암 발생 위험의 예측, 암의 예후, 처치후의 후속 관찰 및 항암 치료에 대한 반응 예측을 포함하는 많은 부분에서 응용될 수 있다. 최근에는, 혈액, 객담, 침, 배설물 또는 뇨에서 종양 억제 유전자의 프로모터 메틸화를 검사하거나, 상기 검사 결과를 각종 암의 진단 및 치료에 사용하는 방법이 시도되고 있다 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000, Ahlquist, D. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000).

프로모터 메틸화를 이용하여 암 진단의 정확성을 극대화하고, 각 단계에 따른 암의 발달을 분석하고, 암과 노화에 따른 변화를 구별하기 위하여, 프로모터 CpG 섬의 모든 시토신 염기의 메틸화를 정확하게 분석할 수 있는 방법이 필요하다.최근에는, 샘플 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하고, 타겟 유전자의 CpG 섬의 모든 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법이 표준방법으로 사용되고 있다. 그러나 이 방법은 주어진 시간에 검사할 수 있는 유전자 또는 샘플의 수가 한정적이라는 문제점이 있다. 다른 문제점으로는 자동화가 어렵고, 많은 시간과 비용이 소요된다는 점이다.

CpG 섬의 메틸화는 인체의 발달과 분화 및 노화, 각종 암의 발생 및 질병과 같은 생리적 현상과 깊은 연관이 있다. 특히, 종양관련 유전자의 프로모터의 CpG 섬의 메틸화는 암의 발생과 진행에서 중요한 역할을 하기 때문에 암의 지표로 활용할 수 있다. 특히, 예를 들어, 자궁경부암에서 암의 진행 단계는 일반적인 이형성인 SIL(Squamous intraepithelial lesion), 경증의 이형성인 "LSIL", 중증에서 심각한 이형성인 "HSIL", CIS(carcinoma in situ) 및 편평상피 세포 암으로 나뉘어 진다. 따라서 이와 같은 암 진행 단계에 대하여 특이적인 마커 유전자를 찾는 것이 바람직하다.

정통적인 방법은 CpG 섬을 포함하는 유전자 부위를 메틸화 특이적 PCR(MSP)에 의하여 증폭하는 것과 염기서열 분석 방법(바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법)을 함께 사용한다. 또한, 진단, 초기 진단 또는 임상 실험에서의 다양한 암의 각 단계를 평가하는데 사용할 수 있는, 많은 유전자의 프로모터 메틸화의 다양한 변화를 정확하고, 신속하게 자동화 방식으로 분석할 수 있는 방법은 아직 없다.

이에, 본 발명자들은 자궁경부암을 효과적으로 진단할 수 있는 진단용 키트를 개발하고자 예의 노력한 결과, 자궁경부암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 메틸화 관련 유전자의 CpG 섬을 함유하는 단편을 바이오 마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써, 자궁경부암을 진단할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 자궁경부암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 메틸화 관련 유전자의 프로모터를 바이오 마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정여 자궁경부암을 진단할 수 있는 바이오 마커를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커의 메틸화 정도를 확인하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 검출방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 자궁경부암 특이적 마커의 CpG 섬을 포함하는 단편과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브를 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 핵산 칩을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자궁경부암에서 특이적으로 CpG 섬이 메틸화되는 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 임상 샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및

(b) 상기 분리된 DNA에서 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 상기 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커의 메틸화 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 자궁경부암에서 특이적으로 CpG 섬이 메틸화되는 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 CpG 섬을 포함하는 부분과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브를 함유하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 핵산 칩을 제공한다.

본 발명에 따르면, 자궁경부암을 초기 형질전환 단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 자궁경부암을 진단할 수 있다.

도 1은 정상인, CIN I, CIN II, CIN III 그리고 자궁경부암 환자의 세포진으로부터 CpG 마이크로어레이 분석을 통하여 자궁경부암 진단을 위한 메틸화 바이오 마커를 발굴하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 도 1에 나타낸 방법을 이용하여 자궁경부암 메틸화 바이오마커 후보를 선별하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 5종의 자궁경부암 메틸화 바이오마커 후보의 CpG섬의 자궁경부암 세포주에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법으로 측정한 것이다.
도 4는 4종의 메틸화 바이오마커 후보의 CpG섬의 자궁경부암 세포진에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법으로 측정한 결과이다.
도 5는 2종의 메틸화 바이오마커의 자궁경부암 세포진에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법으로 측정한 결과와 자궁경부암 진단능력을 평가하기 위한 ROC 커브 분석 결과이다.

본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CpG 섬을 포함하는 부위는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 DNA 서열 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 메틸화 마커 유전자를 스크리닝하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 형질전환 세포 및 비형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA에 결합하는 단백질과 반응시켜 메틸화된 DNA를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 메틸화된 DNA를 증폭시킨 후, CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션한 다음, 정상 세포와 암 세포 간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 유전자를 메틸화 마커 유전자로 선정하는 단계.

상기 메틸화 바이오 마커 유전자의 선별방법으로 자궁경부암뿐만 아니라, 자궁경부암으로 진행 중인 여러 이형증 단계에서 다양하게 메틸화되는 유전자를 찾아낼 수 있으며, 선별된 유전자는 자궁경부암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.

다른 관점에서 본 발명은 (a) 임상 샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 DNA에서 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 상기 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커의 메틸화 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 메틸화 검출은 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 부위의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16)의 CpG 섬; 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 염기서열 변화를 근거로 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 메틸화 검출방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(Real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시쿼닝으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 임상샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포 혈액, 혈장 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 CpG 섬을 포함하는 부분과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브를 함유하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 핵산 칩에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CpG 섬을 포함하는 부분은 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

자궁경부암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 자궁경부암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이타는 다른 비-메틸화 연관 바이오 마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 자궁경부암 진단 시스템을 확립할 수 있을 것이다.

본 발명의 상기 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오 마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 자궁경부암 진행을 진단할 수 있다. 자궁경부암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 자궁경부세포의 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 자궁경부암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 하이퍼메틸화일 수 있다.

본 발명의 일례로, 핵산은 유전자의 조절 부위에서 메틸화될 수 있다. 다른 예로, 메틸화는 유전자의 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 메틸화를 검출하는 것으로 세포 형질전환에 관여하는 유전자를 조기 진단할 수 있다.

다른 예로, 본 발명에서는 다음 예 중의 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 키트를 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다: 서열번호 1 (NT_005612.16, 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열)과 DBX1 (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스 1 유전자와 이들의 조합

본 발명의 진단용 키트를 이용하면 검체의 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 자궁경부암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 정상으로 보이는 세포에서의 자궁경부암 특이적 유전자가 메틸화를 확인함으로, 자궁경부암을 조기 진단할 수 있다.

본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상(이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트를 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 형질전환된 자궁경부암 세포를 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 상기 키트를 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 자궁경부암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 소변, 혈청 또는 플라즈마를 사용할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 임상 샘플 유래 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 메틸화 측정방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR , 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액 또는 소변인 것을 특징으로 할 수 있다.

일예로, 본 발명에 있어서, 상기 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 임상샘플로부터 샘플 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 DNA를 서열번호 1 (NT_005612.16, 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열)과 DBX1 (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스 1 유전자와 이들의 조합으로 구성된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 생성 유무를 근거로 프로모터의 메틸화 여부를 결정하는 단계.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 자궁경부암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 빈도를 검토하고, 자궁경부암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여 조직의 자궁경부암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용된 "세포 형질전환"은 정상에서 비정상으로, 비-종양성에서 종양성으로, 미분화에서 분화로, 줄기세포에서 비-줄기세포로와 같이 세포의 특징이 한 형태에서 다른 형태로 바뀌는 것을 의미한다. 추가적으로, 상기 형질전환은 세포의 형태, 표현형, 생화학적 성질 등에 의하여 인식될 수 있다.

본 발명에서 암의 "조기 확인"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, 세포 형질전환의 "조기 확인"은 세포가 형질전환되는 형태가 되기 전에 초기 단계에서 형질전환이 일어날 가능성 높은 것을 말한다.

본 발명에서 "하이퍼메틸화"는 CpG 섬의 메틸화를 의미한다.

본 발명에서, "샘플" 또는 "검체 샘플"은 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 샘플을 포함하는 폭넓은 범위의 샘플을 의미한다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. 바람직한 소스는 자궁경부의 생검(biopsy)이다.

메틸화 조절 바이오 마커의 스크리닝

본 발명에서는 세포 또는 조직이 형질전환되거나 세포의 형태가 다른 형태로 변화될 때에 메틸화되는 바이오 마커 유전자를 스크리닝하였다. 여기서, "형질전환" 세포는 정상형태가 비정상형태로, 비-종양성이 종양성으로, 미분화형태가 분화형태로 바뀌는 등의 세포 또는 조직의 형태가 다른 형태로 변화되는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 정상인 및 자궁경부암 환자의 세포진 (scrape)으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA만을 획득하기 위하여, 상기 게놈 DNA를 메틸화된 DNA에 결합하는 MBD2bt와 반응시킨 후, MBD2bt 단백질에 결합하는 메틸화된 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 MBD2bt 단백질에 결합하는 메틸화된 DNA를 증폭한 후, 정상인 유래 DNA는 Cy3으로, 자궁경부암 환자 유래 DNA는 Cy5로 표지한 다음, human CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션시켜 정상인과 자궁경부암 환자간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 ASCC3 유전자를 바이오 마커로 선택하였다.

본 발명에서는 상기 바이오 마커가 메틸화되었는지 추가로 확인하기 위하여, 파이로시퀀싱을 수행하였다.

즉, 자궁경부암 세포주 C33A, HeLa, SiHa 및 Caski로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여 바이설파이트를 처리한 후, 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA를 증폭하였다. 이후, 상기 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱을 수행하여 메틸화 정도를 측정하였다. 그 결과, 상기 바이오 마커 유전자가 모두 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.

자궁경부암에 대한 바이오 마커

본 발명에서는 자궁경부암 진단을 위한 바이오 마커를 제공한다.

자궁경부암에 대한 바이오 마커-정상세포와의 비교를 위한 암세포의 용도

본 실시예에서, "정상" 세포는 비정상적 세포 형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미한다. "종양"세포는 암 세포를 의미하고, "비종양" 세포는 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포를 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 자궁경부암과 다음에 기재된 10개 유전자의 프로모터 또는 엑손부위 하이퍼메틸화 사이의 관련성의 발견에 기반을 둔 것이다: 서열번호 1 (NT_005612.16, 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열)과 DBX1 (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스 1 유전자와 이들의 조합

본 발명의 진단용 키트의 다른 용도로, 검체에서 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계를 결정하여 검체의 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상을 조기 진단할 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.

본 발명의 진단용 키트의 다른 용도로, 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화를 결정하는 것을 포함하는 검체의 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상 소양을 진단할 수 있다. 상기 핵산은 서열번호 1 (NT_005612.16, 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열)과 DBX1 (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스 1 유전자와 이들의 조합을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상에 대한 소양을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 "소양"은 상기 세포 성장성 이상에 걸리기 쉬운 성질을 의미한다. 소양을 가진 검체는 아직은 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않지만, 세포 성장성 이상이 존재하거나 존재할 경향이 증가된 검체를 말한다.

본 발명은 다른 관점에서, 검체의 핵산을 포함하는 시료를 시료의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키고, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 확인하는 것을 포함하는 검체의 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화는 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체의 동일한 핵산의 동일한 부위의 메틸화 단계와 다른 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.

서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다.

메틸화(methylation)

본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G*C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다.

여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한 유전자 코딩 부위의 3' 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5' 부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론을 포함하는 여러 부위에서 발견된다.

통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.

핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이 서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.

핵산은 정보를 코드하거나 핵산의 전사를 조절하는 DNA 부위인 조절 부위를 포함할 수 있다. 조절 부위는 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. "프로모터"는 전사를 지시하는데 필요한 최소한의 서열이고, 프로모터-의존성 유전자에서 세포 타입 특이적, 조직 특이적 또는 외부 시그널이나 제제에 의한 유도성을 조절할 수 있다. 프로모터는 유전자의 5' 또는 3' 부위에 위치한다. 프로모터 부위의 전체 또는 부분의 핵산 수는 CpG 섬 부위의 메틸화를 측정하는데 적용될 수 있다. 타겟 유전자 프로모터의 메틸화는 외곽에서부터 내부로 진행한다. 그러므로, 세포 전환의 초기 단계는 프로모터 부위의 외곽에서의 메틸화를 분석함으로써 검출할 수 있다.

검체로부터 분리된 핵산은 검체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 자궁경부암이나 자궁경부암의 진행 단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 자궁경부 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해 분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 검체로부터 얻어진 샘플의 핵산의 메틸화 정도는 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체의 동일한 핵산 부분과 비교하여 측정한다. 하이퍼메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립유전자가 존재하는 것을 말한다. 자궁경부 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체는 동일한 핵산을 검사했을 때, 메틸화 대립유전자가 나타나지 않는다.

샘플(sample)

본 발명은 자궁경부암의 조기 확인에 대하여 기술하고 있으며, 자궁경부암 특이적 유전자 메틸화를 이용하고 있다. 자궁경부암 특이적 유전자의 메틸화는 종양 부위의 부근 조직에서도 일어났다. 그러므로, 자궁경부암의 조기 확인 방법은 액체 또는 고체 조직을 포함하는 모든 샘플로 자궁경부암-특이적 유전자의 메틸화의 유무를 확인할 수 있다. 상기 샘플은 조직, 세포, 소변, 혈청 또는 플라즈마를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

개별 유전자 및 패널

본 발명은 진단 또는 예측 마커로서 서열번호 1 또는 DBX1을 사용하거나, 서열번호 1 및 DBX1 마커 유전자를 조합하여 패널 디스플레이 형태로 하여 사용할 수 있고, 서열번호 1 및 DBX1 마커 유전자는 전체적인 패턴 또는 메틸화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 확인된 유전자는 개별적으로, 또는 본 실시예에서 언급된 유전자가 조합된 유전자 세트로 사용될 수 있다. 또는, 유전자들은 함께 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명에 속한다.

메틸화 검출 방법

메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR)

지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR)

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.

파이로시퀀싱

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타내었다.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 프로모터 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하였다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 McrBt에 제한되지 않는다.

차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제

차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.

별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다.

특이적 프라이머를 핵산 샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.

여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.

본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭 과정은 예를 들면, PCR과 같은, 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(+) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링되면, DNA 폴리머라아제 I(Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 + 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.

상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.

차별적 메틸화의 검출-바이설파이트 시퀀싱 방법

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.

기질

타겟 핵산 부위가 증폭되면 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭 산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.

여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 형태의 멤브레인은 당해 분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREEN^TM, ZETAPROBE^TM(Biorad) 및 NYTRAN^TM 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건

핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.

매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.

표지(Label)

중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

키트(Kit)

본 발명에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 자궁경부암 특이적 메틸화 바이오마커 서열번호 1 및 DBX1 유전자 발굴

자궁경부암에서 특이적으로 메틸화된 바이오 마커를 선별하기 위하여, 정상인 5명, CIN I(cervical intraepithelial neoplasia I) 환자 5명, CIN II(cervical intraepithelial neoplasia II) 환자 5명, CIN III(cervical intraepithelial neoplasia III) 환자 5명 그리고 자궁경부암 환자 5명으로부터 제공받은 세포진 (충남대학교 병원 산부인과, (IRB No. 0904-34))으로부터 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 게놈 DNA 500ng을 초음파 분쇄(Vibra Cell, SONICS)하여, 약 200~300bp의 게놈 DNA 절편을 제작하였다.

게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA만을 획득하기 위하여, 메틸화 DNA에 결합한다고 알려진 메틸바인딩 도메인 (Methyl binding domain; MBD2bt) (Moon et al., Amerrican Biotechnology Laboratory 27: 23, 2009)을 사용하였다. 즉, 6X His가 tagging된 MBD2bt 2㎍을 대장균 JM110(한국생명공학연구원 생명자원센터, No. 2638) 게놈 DNA 500ng과 pre-incubation시킨 다음, Ni-NTA 마그네틱 비드 (Qiagen, USA)에 결합시켰다. 여기에 상기 초음파 분쇄된 정상인 및 자궁경부암 환자에서 분리한 게놈 DNA 500ng을 결합 반응 용액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 3mM MgCl₂, 0.1% Triton-X100, 5% 글리세롤, 25㎎/㎖ BSA)하에서 4℃, 20 분간 반응시킨 후, 700mM NaCl이 포함된 결합 반응 용액 500㎕를 이용하여 3회 세척한 다음, MBD2bt에 결합된 메틸화된 DNA를 QiaQuick PCR purification kit(QIAGEN, USA)을 사용하여 분리하였다.

이후, 상기 MBD2bt에 결합된 메틸화된 DNA를 게놈 증폭 키트(Sigma, USA, Cat. No. WGA2)를 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 게놈 DNA 4㎍을 BioPrime Total Genomic Labeling system I(Invitrogen Corp., USA)을 이용하여 정상인 및 CIN I 환자 유래 메틸화 DNA는 Cy3, CIN II, CIN III 및 자궁경부암 환자 유래 메틸화 DNA는 Cy5로 표지하였다. 상기 DNA들을 혼합한 후, 244K human CpG 마이크로어레이(Agilent, USA)에 하이브리다이제이션시켰다 (도 1). 상기 하이브리다이제이션 후, 일련의 세척 과정을 거친 다음. Agilent scanner를 이용하여 스캐닝하였다. 마이크로어레이 이미지로부터 시그날 값의 계산은 Feature Extraction 프로그램 v. 9.5.3.1(Agilent)을 이용하여 Cy3와 Cy5간 시그날의 상대적인 강도 차이를 계산하였다. 계산된 시그날 값들을 LOWESS 방법으로 정규화 하였다.

정상 및 CIN I에 비하여 CIN II, CIN III 및 자궁경부암에서 과메틸화되어 있는 스팟을 선택하기 위하여, Cy5/Cy3 비가 2.0 이상인 스팟들을 3,635개 선별하고, 이로부터 다시 유의성이 높은 과메틸화 유전자를 선별하기 위하여 CpG 섬내에 2개 이상 연접해 있는 부위의 프로브에서 과메틸화가 확인된 5개의 타겟 (ECAT1, NLE1, GNA14, DBX1 및 SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1)을 선별하였다. MethPrimer (~urolab/ methprimer/index1.html)을 이용하여 상기 타겟들에 CpG islands가 존재하는 것을 확인하였으며, 이를 자궁경부암 진단을 위한 메틸화 바이오 마커로 후보로 확보하였다 (도 2).

실시예 2: 암 세포주에서의 바이오 마커 유전자의 메틸화 측정

상기 5개의 표적의 메틸화 상태를 추가적으로 확인하기 위하여, 자궁경부암 세포주 C33A (ATCC HTB-31), HeLa (한국세포주 은행 No. 10002), Caski (한국세포주 은행 No. 21550) 그리고 SiHa (한국세포주 은행 No. 30035) 각각의 게놈 DNA를 분리하고 프로모터에 대해 파이로시퀀싱을 수행하였다.

바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, 각 세포주의 전체 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다.

상기 유전자에 대한 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 1과 같다.

PCR 및 시퀀싱 프라이머 서열

유전자	프라이머	서열 (5'→3')	서열번호	CpG 위치a	앰플리콘 크기 (bp)
ECAT1	forward	TAGTATTATYGATTATATTGGGATTAGTAG T	3	+7308, +7320, +7323	267
	reverse	Biotin-AAAAAACCAAATAAATACTAATTC	4
	시퀀싱프라이머	GYGGTATTATTGGATATT	5
NLE1	forward	GGTGGGGGAATTATATTAT	6	+394, +404, +419, +425	146
	reverse	Biotin-CAAATAAACCCCTTTAATTA	7
	시퀀싱프라이머	GGTGGGGGAATTATATTA	8
GNA14	forward	GATAGTTTYGTYGGGATAAGAAG	9	+722, +724, +726, +743, +755, +761	214
	reverse	Biotin-CCCCAAATTACTAACATCC	10
	시퀀싱프라이머	TTYGGTTTTTTTATTGGTAT	11
DBX1	forward	GGGGGAAYGAAATTTTTA	12	-2968, -2966, -2953, -2933	300
	reverse	Biotin-TACRTCCTACCATTCACTATTATAT	13
	시퀀싱프라이머	AGTTTAGTTTTGAGATAAAG	14
서열번호 1b	forward	AYGTTGGGYGGTTTTAAAT	15	+7299, +7301, +7310, +7325	267
	reverse	Biotin-ACTCRAATAAATCCTACTTACC	16
	시퀀싱프라이머	TTGTTTGTTTGAGGGA	17

^a 전사 개시점(+1)으로부터의 거리(nucleotide): 메틸화 측정에 사용된 CpG 부위의 게놈 DNA 상의 위치

^b SOX14 유전자 전사개시점 (+1)으로 부터의 거리

상기의 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer(Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase(Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP(Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕(10 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 상기 파이로시퀀싱 후, 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 메틸화 정도를 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.

도 3은 5개 메틸화 표적의 자궁경부암 세포주에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 정량적으로 나타낸 것이다. 그 결과, 최소 3개 이상의 세포주에서 높은 수준으로 메틸화되어 있는 4개의 메틸화 표적 (ECAT1, GNA14, DBX1, SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1))을 임상검증을 위한 바이오마커 후보로 확보하였다.

실시예 3: 자궁경부암 환자의 세포진에서의 바이오 마커 유전자의 메틸화 측정

상기 4개의 유전자 또는 염기서열을 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커로 사용할 수 있는지 검증하기 위하여, 충남대학교 병원 산부인과 (IRB No. 0904-34)로 부터 정상인 6명, CIN I (LSIL) 6명, CIN II 및 CIN III (HSIL) 12명, CIS (Carcinoma in situ) 6명 그리고 자궁경부암 환자 6명의 자궁경부 세포진 시료로부터 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 파이로시퀀싱에 사용하였다.

상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕(10pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.

도 4는 상기 4개의 메틸화 표적의 자궁경부 세포진에서의 메틸화를 측정한 결과이다. ECAT1 유전자와 GNA14 유전자는 정상부터 자궁경부암까지 메틸화 정도의 유의한 차이를 나타내지 않아서 바이오마커로서의 유용성이 없는 것으로 확인되었다. 유의성 검증은 Kruskal-Wallis 테스트를 수행하였으며, p 값이 0.01 미만인 경우를 유의한 것으로 간주하였다. 반면에 DBX1 유전자와 SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1)의 경우는 고위험군인 CIN III부터 자궁경부암까지 메틸화 수준이 정상에 비하여 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있다. 따라서 DBX1과 염기서열 1은 자궁경부 고위험군 환자 및 자궁경부암을 진단할 수 있는 메틸화 바이오마커로서의 유용성이 높음을 확인하였다.

실시예 4: DBX1 및 염기서열 1의 고위험군 및 자궁경부암 진단능력 평가

상기 2개의 DBX1 유전자 또는 SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1)을 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오마커의 유용성을 평가하기 위하여 추가적인 자궁경부암 세포진 시료를 대상으로 메틸화를 검증하는 실험을 수행하였다. 충남대학교 병원 산부인과 (IRB No. 0904-34)로 부터 정상인 20명, CIN I (LSIL) 52명, CIN II 및 CIN III (HSIL) 각각 14명, CIS (Carcinoma in situ) 31명 그리고 자궁경부암 환자 20명의 자궁경부 세포진 시료로부터 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 파이로시퀀싱에 사용하였다.

상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕(10pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.

도 5A에 보는 것처럼 DBX1 및 SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1) 전부가 정상에 비하여 자궁경부암 환자에서 메틸화 수준이 매우 높게 측정되는 것을 확인할 수 있고, 또한 고위험군인 CIN II 및 CIN III 환자의 일부에서도 높은 메틸화 수준을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

정상인과 자궁경부암 환자의 메틸화 지수를 측정한 후, 자궁경부암 환자 진단을 위한 메틸화 지수 cut-off를 ROC(receiver operating characteristic) 커브 분석을 통하여 결정하였다.

도 5B는 자궁경부암 진단을 위한 DBX1 유전자와 SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1)의 cut-off 값을 구하기 위한 ROC 커브 분석 결과를 나타낸 것이다. 또한, 자궁경부암 진단을 위한 ROC 커브 분석 결과는 표 2에 나타내었다. DBX1의 자궁경부암 진단을 위한 민감도는 80%이고 특이도는 100%로 측정되었다. SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1)의 자궁경부암 진단을 위한 민감도는 85.0%이고 특이도는 100%로 확인되었다.

자궁경부암 메틸화 바이오 마커의 자궁경부암 진단을 위한 ROC 커브 분석 결과

바이오마커	DBX1	서열번호 1의 염기서열
AUC (95% C.I)	0.805 (0.649 - 0.913)	0.945 (0.823 - 0.991)
Cut-offa	> 7.48	> 9.0
p 값	0.0001	0.0001
Sensitivity (%, 95% C.I)	80.0 (56.3 - 94.1)	85.0 (62.1 - 96.6)
Specificity (%, 95% C.I)	100 (83.0 - 100)	100 (83.0 - 100)

a, 정상과 암을 구분하기 위한 메틸화 지수 기준

표 3은 총 151예의 자궁경부 세포진 시료를 대상으로 SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1)의 메틸화 양성 빈도를 나타낸 것이다. 메틸화 양성 빈도는 고위험군인 CIN III부터 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이러한 결과는 SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1) 바이오마커가 자궁경부암 진단 뿐만 아니라 고위험군 환자중 암으로 진행될 위험을 지닌 환자의 구분에도 사용될 수 있을 나타내 준다.

2종 자궁경부암 바이오마커 유전자의 자궁경부 임상병변별 메틸화 양성 빈도

유전자	메틸화 양성 시료수/시험된 시료수 (%)						p-value
	Normal	CIN I	CIN II	CIN III	CIS	ICC
DBX1	0/20 (0)	6/52 (11.5)	2/13 (15.4)	4/14 (28.6)	15/28 (53.6)	16/20 (80.0)	0.0001
서열번호 1의 염기서열	0/20 (0)	0/52 (0)	2/14 (14.3)	4/14 (28.6)	14/31 (45.2)	17/20 (85.0)	0.0001

메틸화 양성 기준: ROC(receiver operating characteristic) 커브 분석을 통해 얻은 자궁경부암을 진단하기 위한 메틸화 지수가 cut-off 보다 높은 경우를 메틸화 양성으로 판정하였고, 이하인 경우에는 음성으로 판정하였다.

실시예 4: 자궁경부암 환자의 세포진에서의 DBX1 유전자와 SOX 1 의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1)의 조합을 통한 진단 성능 증가효과

DBX1 유전자와 SOX 1의 전자개시점으로부터 +7,000~+7,500nt 해당서열(서열번호 1)을 패널로 조합하였을 경우의 자궁경부암 및 고위험군 환자에 대한 진단능력이 개선되는지를 확인하고자 하였다. 두 개의 바이오마커 중 최소 1개 이상 메틸화 양성을 나타내는 빈도를 측정한 결과는 표 4에 나타내었다. 메틸화 양성의 기준은 ROC 커브 분석을 통하여 실시예 4에서 얻어진 cut-off를 적용하였다.

2종 자궁경부암 바이오마커 패널의 자궁경부 임상병변별 메틸화 양성 빈도

유전자	메틸화 양성 시료수/시험된 시료수 (%)						p-value
	Normal	CIN I	CIN II	CIN III	CIS	ICC
Panel	0/20 (0)	6/52 (11.5)	3/14 (21.4)	6/14 (42.9)	18/31 (58.1)	20/20 (100.0)	0.0001

표 4에 보는 바와 같이 두 개 바이오마커 패널의 메틸화 양성 빈도는 단일 마커 보다 높게 나타나는 것을 확인하였고, 특히 자궁경부암에서는 100%를 나타내어 암진단의 민감도는 100% 그리고 특이도도 100%로 매우 우수함을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Gnomictree,Inc. <120> Biomarker for Diagnosing Cervical Cancer Containing CpG island of Cervical Cancer Specific Methylation Gene <130> P10-B297 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 500 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaacacccat ccatatgcag tgtttgagaa ctaaggcagc tcccttgctc tgttttcctg 60 cgcctagccc ccggactttt gtgccgtttg cagctctttt tcatttcgaa tacccgcata 120 gacgcgagcc cacttctgcc ctcttcctac gctgggcggc tccaaacccg ccgcgagggc 180 tgaggtgttc acacctgccc acggcagcct gcctcgccct caagcgcctc aaagcttcct 240 aagcgcttac attggtcttg ggacagccga ctttggcttc tttgtttgtt tgagggaccg 300 cggaagtggc ggggaatgtg cccccgcttg agaccgctta ttgtgagccc tcaacggaaa 360 tcctgcacgg aaggcaaccg cctccccgct cgcggtaagc aggatccacc cgagtagcgg 420 ggaccgaatc ccatctttct tatctctcga agactccttt caggctgaga tcagagaggg 480 agggaaaaag aagagagaat 500 <210> 2 <211> 1000 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 caaaatgcgc tctcactctg ttggctgctc cggcagggag catggaggac tgggggtccg 60 aagcctgcaa agggtgacct tagcgttgca gccttcccga aacggagact tgccatcttt 120 tcagagggcg gggaagctca caccactctc tgctttatag tgtccgtttc gcctcgcttg 180 ctggcccttc gcttacccga gacattccag gcacggctcg cactggagag ggccgcgctg 240 ctgctgcgac cgcacggcgc ccggggcagg aacatgctcg ctctcccctg cgcgggggga 300 acgaaacccc cagagtgcgt tccgacacgc tctttctact atccaaggca ggtttcggca 360 gctttggcca cctaggcccg gggagcccca gccggatctg ctgcggcctc ccccgcagcg 420 taggcaagga ccttaaaccc caaaccaggg actccgattc tctcttttcc cctcccgtct 480 tcttttctct tgaaagagaa atagacagaa agctcagcct tgagacaaag aacgcgagtg 540 atttctccga aataaacttg aagataacga cataacagtg aatggcagga cgcacaaaac 600 cccatgggct caggtcaaat ggcattagtc acaggtctta gccgcagccg ccgcgccgcg 660 cagctccttg ggctatcgcg gagtttgaaa agacgcgttc aaggagatca cttaaagtaa 720 gatcctttcg tccgatttct tgcttcctta ggatttattt ttcctttcac gggcggccag 780 ccctcgcccc ctcgcccccg ccctcacttt tcctctttgg cgctttagga attctttagg 840 aggctgtgga gaccgacccc aggaagcagg gtccacgtgg atcgcagcaa ggggttgatc 900 caccctccaa aaaatggcag ggtagacttt taaaagccga gaagttagta gcagttagtc 960 tatagtgagg cagaatggct ggggcttggg gtgggggcta 1000 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tagtattaty gattatattg ggattagtag t 31 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aaaaaaccaa ataaatacta attc 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gyggtattat tggatatt 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggtgggggaa ttatattat 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caaataaacc cctttaatta 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtgggggaa ttatatta 18 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gatagtttyg tygggataag aag 23 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ccccaaatta ctaacatcc 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttyggttttt ttattggtat 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gggggaayga aattttta 18 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tacrtcctac cattcactat tatat 25 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agtttagttt tgagataaag 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aygttgggyg gttttaaat 19 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 actcraataa atcctactta cc 22 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ttgtttgttt gaggga 16

Claims (9)

1. (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 CpG 섬을 포함하는 부위는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열표시되는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커.
   
3. 다음 단계를 포함하는 제1항의 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커의 메틸화 검출방법:
   (a) 임상 샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및
   (b) 상기 분리된 DNA에서 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16)의 CpG 섬; 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 CpG 섬의 메틸화를 검출하는 단계.
   
4. 제3항에 있어서, (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 메틸화 검출은 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 부위의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커의 메틸화 검출방법.
   
5. 제3항에 있어서, (b) 단계는 (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16)의 CpG 섬; 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 염기서열 변화를 근거로 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커의 메틸화 검출방법.
   
6. 제3항에 있어서, 상기 메틸화 검출방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(Real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시쿼닝으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커의 메틸화 검출방법.
   
7. 제3항에 있어서, 상기 임상샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포 혈액, 혈장 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커의 메틸화 검출방법.
   
8. (1) 3번 염색체 SOX14 유전자의 전사개시점으로부터 +7,000 ~ +7,500 nt에 해당하는 염기서열(NT_005612.16); 또는 (2) DBXI (NM_001029865) - 뇌발생 호메오박스I 유전자의 CpG 섬을 포함하는 부분과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브를 함유하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 핵산 칩.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 CpG 섬을 포함하는 부분은 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2 표시되는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 핵산 칩.
   
   
   
   

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