KR101804324B1 - 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA를 이용하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커, 키트 및 스크리닝 방법 - Google Patents

자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA를 이용하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커, 키트 및 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA 및 이를 포함하는 자궁경부암 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자는 자궁경부암이 유발되면 발현 양상이 변화하는 lncRNA이다. 그리하여 이러한 lncRNA를 이용하여 바이오마커, 키트, 제제 등을 제조하는 경우 자궁경부암을 신속하고 정확하게 진단하는 것이 가능하게 된다. 또한 자궁경부암이 유발된 경우 이러한 lncRNA의 유전자를 스크리닝하게 되면 보다 신속하고 정확하게 자궁경부암 유발 여부를 진단하는 것이 가능하게 된다.

Description

자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA를 이용하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커, 키트 및 스크리닝 방법{Biomarker diagnosing cervical cancer using lncRNA increasing expression induced cervical cancer, kit and screening method}
본 발명은 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA 및 이를 포함하는 자궁경부암 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
자궁은 체부(corpus)와 경부(cervix)로 구성되는데, 질에 연결된 자궁경부에 발생하는 악성종양을 자궁경부암이라고 한다. 자궁경부암은 전 세계적으로 여성에게 발병하는 암 중 두 번째로 흔한 암이며, 자궁경부암의 약 80 %는 아시아, 남미, 아프리카 등의 개발도상국에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 자궁경부암은 우리나라에서 발생하는 전체 암 중에서 4 위를 차지하고 있으며, 중앙암등록본부의 보고(1999~2002년)에 의하면 연평균 전체 여성암 환자 46,476명 중 자궁경부암 환자가 4,394명으로 약 9.5 %를 차지하고 있다. 이러한 자궁경부암의 원인은 성 접촉에 의한 인유두종 바이러스(human Papillomavirus, HPV) 감염이 주된 원인이며, 자궁경부암 환자의 99.7 %이상에서 고위험 인유두종 바이러스 감염이 발견된다고 보고되어 있다.
한편, lncRNAs(Long noncoding RNA, 긴 비-코딩 RNA)는 게놈에 침투적으로 전사되는 최근 발견된 새로운 부류의 전사체로서, 에피게놈의 중요한 조절인자이다. lncRNAs는 몇몇 암에서 불량한 예후와 종양 전이의 유용한 바이오마커일 수 있다. 이러한 Long noncoding RNA(lncRNA)는 최근에 Regulatory RNA로서 재조명되고 있으며, 특히 Epigenetic의 주요 역할을 수행하거나, Transcription 의 조절, 암 형성이나 배아 발달, 신경계통 장애, 혹은 다른 필수적인 biological Process 에 영향을 미치게 된다. 또한 상기 lncRNA의 silencing tool 은 분자생물학 Pathway를 더욱 자세히 설명해 줄 수 있는 Tool 이 될 것이다. 그러나, ncRNA의 기능은 단지 부분적으로만 이해되고 있는 실정이며, 특정 암의 바이오마커로 활용될 수 있는 특정 lncRNAs를 발굴하려는 연구는 많이 부족한 것이 현실이다.
뿐만 아니라, 이러한 lncRNA의 장점에도 불구하고 상기 자궁경부암을 진단하기 위해 유용하게 활용될 수 있는 특정 lncRNAs는 많이 부족하며, 이렇게 자궁경부암과 관련된 lncRNAs를 발굴하려는 노력도 많이 부족한 실정이다.
한편, 본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-1255768호(특허문헌 1)이 존재하며, 상기 특허문헌 1은 자궁경부암에서 특이적으로 CpG 섬이 메틸화되는 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 자궁경부암에서 특이적으로 CpG 섬이 메틸화되는 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오마커 및 상기 바이오마커의 메틸화 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 검출방법에 관한 기술만이 개시되어 있다.
특허문헌 1. 대한민국 등록특허 제10-1255768호
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 자궁경부암 유발시 특이적으로 발현 양상이 변화하는 lncRNA를 제공하는 것이 목적이다. 또한 이렇게 제공된 lncRNA를 이용하여 자궁경부암의 유발 여부를 간편하고 신속히 진단하는 것이 가능한 바이오마커, 키트, 제제 및 상기 lncRNA 유전자의 스크리닝 방법 등을 제공하는 것이 목적이다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 바이오마커는
서열번호 1로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1에 대한 안티센스로서 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 또는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열의 단편인 것을 특징으로 하며,
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커이다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트는
서열번호 1로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1에 대한 안티센스로서 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열의 단편, 또는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트이며,
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트이다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 lncRNA의 스크리닝 방법은
자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA의 스크리닝 방법이며,
상기 lncRNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 lncRNA의 스크리닝 방법이다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 약학 조성물은
서열번호 1의 염기서열에 대한 siRNA로서 서열번호 3의 염기서열, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료 및 예방용 약학 조성물이다.
본 발명에 따른 유전자는 자궁경부암이 유발되면 발현 양상이 변화하는 lncRNA이다. 그리하여 이러한 lncRNA를 이용하여 바이오마커, 키트, 제제 등을 제조하는 경우 자궁경부암을 신속하고 정확하게 진단하는 것이 가능하게 된다. 또한 자궁경부암이 유발된 경우 이러한 lncRNA의 유전자를 스크리닝하게 되면 보다 신속하고 정확하게 자궁경부암 유발 여부를 진단하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 자궁경부암에서의 HOXA11 AS의 발현 평가 결과이다.
도 2는 HOXA11 AS 녹다운은 자궁경부암 세포에서 세포 증식을 감소시킴을 보여주는 결과이다.
도 3은 HOXA11 AS는 자궁경부암 세포의 이주 및 침입을 촉진함을 보여주는 결과이다.
도 4는 HOXA11 AS는 자궁경부 CSC에서 많이 발현됨을 보여주는 결과이다.
도 5는 HOXA11 AS의 억제는 자궁경부암 세포에서의 EMT-관련 유전자를 역전시킴을 보여주는 결과이다.
도 6은 HOXA11 AS는 자궁경부 CSC에서 많이 발현됨을 보여주는 결과이다.
도 7은 HOXA11 AS는 줄기세포성 표현형에 필요함을 보여주는 결과이다.
이에 본 발명자들은 자궁경부암이 유발되면 발현 양상이 변화하는 lncRNA를 발견하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 lncRNA 유전자를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
lncRNAs(Long noncoding RNA, 긴 비-코딩 RNA)는 게놈에 침투적으로 전사되는 최근 발견된 새로운 부류의 전사체로서, 에피게놈의 중요한 조절인자이다. 한편, HOXA11 안티센스 RNA(non-protein coding, 비-단백질 코딩)는 HOXA11 AS라고도 알려져 있는데 호메오박스 유전자 HOXA11을 암호화하는 유전자의 안티센스 가닥으로부터 전사된 lncRNA이다. 이러한 HOXA11 AS 전사체는 성인 사람 자궁내막에 존재한다. HOXA11 AS 전사의 프로게스테론-매개 하향조절은 HOXA11 센스 전사를 증가시킨다. 또한 상기 HOXA11 AS는 HOXA11 유전자의 발현을 네가티브하게 조절하면서, 센스/안티센스 상호작용에 의한 것보다 공통 유전자의 전사에 대해 경쟁함으로써 HOXA11 발현을 억제하는 전사 간섭에 의해서 기능한다. 본 발명은 자궁경부암이 유발된 환자의 경우 상기 HOXA11 AS의 발현 양상이 증가함을 발견하여 완성한 발명이다.
구체적으로 본 발명에 따른 바이오마커의 염기서열은 서열번호 1로 표시되며, 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA(Long noncoding RNA, 긴 비-코딩 RNA)인 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 lncRNA로서 HOXA11 AS인 것인데, 본 발명은 자궁경부암이 유발된 환자의 경우 상기 HOXA11 AS 유전자의 발현 양상이 증가함을 발견하여 본 발명을 완성한 것이다.
또한 자궁경부암 유발시 상기 HOXA11 AS의 발현이 증가하게 되면 EMT-관련 유전자자인 E-캐드헤린 발현은 감소되며, β-카테킨 및 비멘틴의 발현은 증가하게 된다. 또한 자궁경부암 유발시 상기 HOXA11 AS의 발현이 증가하게 되면 HeLa 세포에서의 MMP-2, MMP-9 및 VEGF로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질의 발현도 증가하게 된다.
이렇게 본 발명에 따른 바이오마커인 상기 HOXA11 AS는 자궁경부암 유발시 발현 양상이 증가하는 것으로서, 이러한 유전자를 이용하여 바이오마커, 진단용 키트, 진단용 제제로 활용하여 자궁경부암을 보다 신속하고 정확하게 진단하는 것이 가능하게 된다.
한편, 본 발명에 따른 상기 HOXA11 AS를 가지고 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커로 활용하는 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 이러한 본 발명에 따른 바이오마커는 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1에 대한 안티센스로서 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 또는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열의 단편인 것을 특징으로 하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커이다.
또한, 본 발명에 따른 상기 HOXA11 AS를 가지고 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트로 활용하는 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 이러한 본 발명에 따른 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트는 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1에 대한 안티센스로서 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열의 단편, 또는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트이며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트이다. 또한 상기 키트는 바람직하게는 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 키트이다.
한편, 본 발명에 따른 상기 lncRNA인 HOXA11 AS의 스크리닝 방법은 특별한 제한 없이 당업계에 공지된 방법에 의해 수행되는 모든 유전자 스크리닝 방법을 통해 수행되는 것일 수 있다. 이러한 스크리닝 방법의 바람직한 일실시예는
1) 실험군에 해당하는 자궁경부암 진단을 위한 환자 및 대조군에 해당하는 정상인의 자궁내막에서 채취된 샘플을 각각 수득하는 단계;
2) 상기 샘플로부터 서열번호 1의 염기서열로 표시되며 lncRNA인 HOXA11 AS를 수득하는 단계;
3) 상기 단계 2)에 따른 실험군 및 대조군의 HOXA11 AS로부터 상보적 염기서열의 cDNA를 합성하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 cDNA를 PCR을 통해 증폭시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 증폭된 산물을 증폭 전후로 비교 분석하는 단계;
를 포함할 수 있다.
상기 RNA를 cDNA 로의 합성은 당업계에 적용되는 공지의 모든 방법에 의해 합성될 수 있으며, 바람직하게는 역전사효소에 의해 합성 될 수 있다.
또한 상기 PCR의 조건은 상기 cDNA 를 효과적으로 증폭할 수 있는 범위 이내라면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 적용되는 PCR의 조건이 모두 포함될 수 있으나, 바람직하게는 정량적 분석을 위해 실시간 RT-PCR인 것이 바람직하다.
또한 상기 분석은 당업계에 적용되는 모든 유전자 분석 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 당업계에 알려진 분석 소프트웨어를 사용할 수 있다.
또한 상기 비교 분석하는 단계는 바람직하게는 상기 PCR에 의해 증폭된 산물의 증폭 전후를 비교하여 유전자의 발현량이 유의하게 변화한 내용을 가지고 상기 실험군과 대조군을 비교 분석하여 스크리닝 할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 상기 서열번호 1의 염기서열에 따른 HOXA11 AS의 siRNA(siHOXA11 AS, 서열번호 3)는 자궁경부암 유발시 자궁내막서 발현 양상이 변화되는 유전자 또는 단백질의 발현 양상을 정상으로 역전시킬 수 있어 자궁경부암의 치료 또는 예방용 약학 조성물로 활용될 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 약학 조성물은 서열번호 1의 염기서열에 대한 siRNA로서 서열번호 3의 염기서열, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료 및 예방용 약학 조성물이다. 이러한 약학 조성물의 약리기전은 자궁경부암 대상 환자에게서 상기 서열번호 3의 염기서열에 따른 siRNA의 발현이 증가하는 경우 HeLa 세포에서의 MMP-2, MMP-9 및 VEGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 또한 이러한 약학 조성물의 약리기전은 자궁경부암 대상 환자에게서 상기 서열번호 2의 염기서열에 따른 siRNA의 발현이 증가하는 경우 EMT-관련 유전자자인 E-캐드헤린 발현은 증가되며, β-카테킨 및 비멘틴의 발현은 감소하는 것일 수 있다. 이러한 약리기전들을 통하여 자궁경부암을 치료 또는 예방하는 약리효과가 달성되게 된다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
HOXA11 AS의 발현 양상이 자궁경부암과 어떤 연관이 있는지 밝히기 위해 아래와 같은 방법을 도입하였다. 즉, HOXA11 AS 발현이 자궁경부암 조직(n=95)과 상응하는 정상 조직(n=30)에서 실시간 RT-PCR에 의해서 결정되었다. 세포 증식, 이주 및 침입에서의 HOXA11 AS의 역할을 결정하기 위하여 RNA 간섭을 사용하여 HeLa 및 Caski 자궁경부암 세포에서의 HOXA11 AS 발현을 녹다운시키는 등의 방법을 도입하였다. 그리고 이를 바탕으로 HOXA11 AS의 발현 양상이 자궁경부암과 어떤 연관이 있는지 아래와 같은 과정을 통해 확인하였으며, 이하에서 이를 보다 구체적으로 설명하고 있다.
<사람 조직>
자궁경부암 샘플을 2007년에서 2012년 사이에 연세대학교 연세세브란스 병원에서 수술을 받은 95명의 여성 환자로부터 얻었다. 사전 치료를 받지 않았던 침입성(FIGO[세계산부인과학회] 단계 IA 내지 IVB) 자궁경부암으로 새로 진단된 환자로부터의 견본이 연구에 포함되었다. 자궁근종 때문에 간단한 자궁절제술을 받은 환자로부터 정상 자궁경부 샘플 30개를 대조군으로 얻었다. 부인과 암이 수반된 환자로부터의 견본은 연구에서 제외되었다. 모든 견본은 즉시 액체 질소에 냉동하여 RNA 추출시까지 -80 ℃에 보관했다. 본 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라서 수행되었으며, 연세세브란스 병원의 윤리위원회에 의해서 승인되었다. 모든 환자로부터 사전 동의를 얻었다.
<세포 배양>
SiHa(편평 자궁경부 암종), HeLa(상피 자궁경부 암종), 및 Caski(소장 장간막 전이로부터 확립된 표피양 자궁경부 암종) 사람 자궁경부암 셀라인을 American Type Culture Collection(Rockville, MD)로부터 얻었다. SiHa 및 HeLa 세포는 듈베코스 변형 이글 배지에서 배양했고, Caski 세포는 RPMI-1640 배지(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 배양했다. 사람 정상 난소암 셀라인 HOSE는 MCDB 105(Sigma Aldrich, Castle Hill, Australia) 배지에서 배양했다. 배양 배지는 10%(vol/vol) 태아 소 혈청과 페니실린/스트렙토마이신으로 보충했다. 셀라인을 5 % CO2와 95 % 공기의 가습된 분위기 중에 37 ℃에서 유지했다. <20 계대배양된 세포를 모든 실험에 사용했다.
<정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응( qRT - PCR )>
TRIzol® 시약(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 암성/비암성 견본 또는 셀라인으로부터 총 RNA를 추출했고, 총 RNA 2 μg을 제조자의 프로토콜에 따라서 역전사 시약 키트(Invitrogen)을 사용하여 제1-가닥 cDNA에 역전사시켰다. SYBR® 그린 마스터 PCR 믹스 10 μL, 포워드 및 리버스 프라이머 각 5 pmol, 희석된 cDNA 주형 1 μL 및 적절한 양의 멸균 증류수를 함유한 20 μL 반응물 부피에서 SYBR® 그린 리얼-타임 PCR 키트(TOYOBO Co. Ltd, Osaka, Japan)를 사용하여 qRT-PCR을 수행했다. 유전자 증폭 조건은 다음과 같았다. 3 분간 95 ℃에서 초기 변성; 15 초간 95 ℃에서 변성, 60 초간 60 ℃에서 아닐링 및 60 초간 72 ℃에서 신장 40 사이클; 및 5 분간 72 ℃에서 마지막 신장하였다. ABI 스텝 원 플러스 리얼-타임 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 qRT-PCR을 수행했다. 모든 정량은 내부 표준으로 U6과 함께 수행되었다. PCR 프라이머 서열은 다음과 같았다: HOXA11 AS, 5’-GAGTTTGAAGCCGTGGATGT-3 (센스) 및 5’-AGATGAGGGGAGAGGTGGAT-3 (안티센스), E-캐드헤린, 5’-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3’(센스) 및 5’-AGTAGTCATAGTCCTGGTCCT-3’(안티센스), β-카테닌, 5’-TGCAGTTCGCCTTCACTATG-3’(센스) 및 5’- ACTAGTCGTGGAATGGCACC-3’(안티센스), 비멘틴, 5’-TG GATTCACTCCC TCTGGTT-3’(센스) 및 5’-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3’(안티센스), 스네일, 5’-GAGGCGGTGGCAGACTAG-3’(센스) 및 5’-GACACATCGGTCAGACCAG-3’(안티센스) 및 U6, 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(센스) 및 5’-AACGCTTCAGGAATTTGCGT-3’(안티센스). 2?ΔΔCT 방법을 사용하여 상대적 유전자 발현을 분석했고, 그 결과를 대조군 값에 대한 변화 범위로서 표시했다. qRT-PCR 실험은 적어도 3번 중복 수행되었다.
<작은 간섭 RNA ( siRNA ) 트랜스펙션 >
HOXA11as siRNA(siHOXA11as)와 음성 대조군 siRNA(siNC)는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서 구입했다. 세포(5×104 세포/웰)를 6-웰 플레이트에 파종하고 G-펙틴 키트(Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 포스페이트-완충 식염수(PBS) 중의 10nM RNA로 트랜스펙션했다. 이들 siRNA-트랜스펙션된 세포를 트랜스펙션-후 48h째에 시험관내 분석에 사용했다. HOXA11as siRNA의 표적 서열은 다음과 같았다: siRNA, 5’-CGGAAUAUCGGAAUAAAGUUU-3’.
<세포 증식 분석>
세포 계수 키트-8(CCK-8) 분석을 사용하여 세포 증식을 평가했다(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). 세포(2×103 세포/웰)를 완전 배지 100 μL 중에서 바닥이 평평한 96-웰 플레이트에 파종했다. 세포를 하룻밤 인큐베이션하여 세포 부착 및 회수를 허용했고, 이어서 24, 48, 72 및 96h 동안 siNC 또는 siHOXA11as로 트랜스펙션했다. CCK-8 용액(10 μL)을 각 웰에 첨가하고, 세포를 2h 더 인큐베이션했다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정했다. 3번의 독립적 실험을 3 번 중복 수행했다.
< 매트리겔 침입 분석>
BD 바이오코트 매트리겔 인베이젼 챔버(기공 크기: 8mm, 24-웰; BD Biosciences, Bedford, MA, USA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 매트리겔 침입 분석을 수행했다. siHOXA11as-트랜스펙션된 세포와 siNC-트랜스펙션된 세포(5×104 세포/플레이트)를 혈청-프리 배지 중에서 위 챔버에 평판하고 완전 배지를 아래 챔버에 첨가했다. 매트리겔 침입 챔버를 5 % CO2 하에 37 ℃에서 48h 동안 인큐베이션했다. 비-침입성 세포를 끝이 면으로 된 면봉을 사용하여 위 챔버에서 제거했다. 필터의 하부측 위 기공을 통해서 침입한 세포를 염색하고(Diff Quik, Sysmes, Kobe, Japan), 혈구계수기를 사용하여 이들을 계수했다. 1로 설정한 siNC-트랜스펙션된 세포에 대한 변화 배수로서 침입된 siHOXA11as-트랜스펙션된 세포의 수를 표시했다. 이 분석은 적어도 3 번 중복 수행되었다.
<상처 치유 이주 분석>
siNC 또는 siHOXA11as-트랜스펙션된 세포(5×105 세포/웰)를 혈청-함유 배지와 함께 6-웰 배양 플레이트에 파종하고, 세포 밀도가 90 % 컨플루언시에 도달할 때까지 배양했다. 혈청-함유 배지를 제거하고, 세포를 24h 동안 혈청 고갈시켰다. 세포 밀도가 대략 100 % 컨플루언시에 도달했을 때 200 μL 피펫 팁으로 단층을 긁어서 인공적으로 균질한 상처를 만들었다. 긁은 후에 세포를 혈청-프리 배지로 세척했다. 상처로 이주한 세포의 이미지를 현미경을 사용하여 0, 24 및 48h 째에 캡쳐했다. 이 분석은 3 번 중복 수행되었다.
<자기-재생 분석>
Caski 및 HeLa 세포(1 세포/μL SFM)를 7일간 96-웰 플레이트에서 100 μL/웰로 파종했다. 각 웰에서 구체의 총수를 현미경 하에서 계수했다. 이어서, 세포를 해리시켜 트립판 블루(Amresco Inc., Solon, OH)로 염색해서 현미경 하에서 계수하여 총 세포수를 결정했다. 모든 실험은 3 번 중복 수행되었다.
<형광-활성화 세포 정렬 분석>
세포를 PBS로 세척하고 3 % 파라포름알데하이드로 보충된 PBS로 고정한 다음(10 분, 4 ℃), 다음과 같이 인큐베이션했다: 1) 없음, 2) 항-CD44-APC(클론-IM7, eBioscience), 3) 항-CD133-PE(클론-AC133, Miltenyi Biotec), 4) 항-CD133-PE와 항-CD44-APC 둘다. 세포 염색은 제조자의 지시에 따랐다. FACS 분석을 FACScanto 장치(Becton Dickinson)를 사용하여 수행했다.
< 웨스턴 블롯 분석>
세포를 48h 동안 siNC 또는 si HOXA11 AS로 트랜스펙션하고, 얼음 냉각된 0.01 M PBS(pH 7.2)로 세척하고, 프로테아제 억제제로 보충된 세포용해 버퍼(50 mM 트리스?HCl[pH 7.4], 150 mM 식염수, 1 % NonidetP-40 및 0.1 % 나트륨도데실설페이트[SDS]) 중에 세포용해했다. Bradford 방법에 따라서 Bio-Rad 단백질 분석 시약을 사용하여 단백질 농도를 결정했다(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). 샘플을 5 분간 끓여서 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 한 다음, 2불화 폴리비닐리덴 멤브레인(Millipore, Billerica, MA)으로 전기영동적으로 옮겼다. 이 멤브레인을 1h 동안 실온에서 0.1 % Tween 20(TBST; pH 7.6)을 함유하는 1x 트리스-완충 식염수 중의 5% 비-지방 건조 밀크로 차단하고, 이어서 일정하게 교반하면서 4 ℃에서 하룻밤 1차 항체와 함께 인큐베이션했다. 사용된 1차 항체는 다음을 포함했다: 토끼 항-사람 VEGF(1:500 희석; Abcam, Cambridge, MA, USA), 토끼 항-사람 MMP-9(1:1000 희석; Cell Signaling, Beverly, MA, USA), 토끼 항-사람 E-캐드헤린(1:1000 희석; Cell Signaling), 토끼 항-사람 β-카테닌(1:1000 희석; Cell Signaling), 마우스 항-사람 비멘틴(1:1000 희석; Sigma, St. Louis, MO, USA), 마우스 항-사람 스네일(1:1000 희석; Cell Signaling) 및 마우스 항-사람 β-액틴 항체(1:5000 희석; Sigma). 멤브레인을 1x TBST로 3 번 세척하여 양고추냉이 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 항-토끼 2차 항체(1:2000 희석; Abcam)나 항-마우스 2차 항체(1:2000 희석; Abcam)와 함께 1h 동안 실온에서 일정하게 교반하면서 인큐베이션하고, 이어서 1x TBST로 3번 세척했다. 단백질을 증진된 화학발광 시스템(ECL™; Amersham, Little Chalfont, UK)을 사용하여 시각화하고, 발광 이미지 분석장치(LAS-4000 mini, Fujifilm, Uppsala, 스웨덴)를 사용하여 밴드 강도를 정량했다.
<통계적 분석>
스튜던트 t 테스트를 사용하여 통계적 유의성이 결정되었다. 평균 차이는 P<0.05일 때 유의한 것으로 간주되었다. 그 결과는 평균±SD로 나타낸다.
실험예
<자궁경부암에서의 HOXA11 AS 의 발현 평가>
HOXA11 AS lncRNA 발현이 자궁경부암 조직(n=95)과 상응하는 정상 조직(n=30)에서 qRT-PCR을 사용하여 결정되었다. 자궁경부암 조직에서의 HOXA11 AS의 발현은 비암성 조직에서보다 49.8 배 이상이었으며(도 1), 이는 HOXA11 AS의 발현이 자궁경부암에서 상향 조절된다는 것을 나타낸다.
< HOXA11 AS 녹다운은 자궁경부암 세포에서 세포 증식을 감소시킴>
자궁경부암에서의 HOXA11 AS의 기능적 역할을 결정하기 위하여, siRNA를 사용하여 HOXA11 AS 발현을 하향 조절시켰다. 이를 위해서 qRT-PCR을 사용하여 HeLa, Caski, ME-180, C33A 및 SiHa 자궁경부암 셀라인에서의 HOXA11 AS 발현이 먼저 결정되었다. 하기 도 2A에 도시된 대로, HOXA11 AS 발현 수준은 ME-180 및 C33A 세포보다 HeLa 및 CasKi 세포에서 더 높았다. 따라서, HeLa 및 CasKi 세포가 HOXA11as 발현의 siRNA-매개 녹다운에 사용되었다. HOXA11 AS-특이적 siRNA(siHOXA11as)의 녹다운 효능이 평가되었으며, siHOXA11 AS는 더 높은 침묵화 효능을 갖는 것으로 판명되었다(도 2B). 자궁경부암 세포의 성장에서 HOXA11 AS의 역할을 결정하기 위하여 siHOXA11 AS-트랜스펙션된 세포가 CCK-8 분석에 사용되었다. HOXA11 AS의 siRNA-매개 녹다운은 HeLa 세포에서 트랜스펙션-후 96h째에 40 %까지 세포 증식을 감소시켰다(도 2C). 또한, HOXA11 AS siRNA는 Caski 세포에서 세포 증식을 억제했다. 이 발견은 HOXA11 AS가 자궁경부암 세포의 증식에 관련된다는 것을 나타낸다.
< HOXA11 AS 는 자궁경부암 세포의 이주 및 침입을 촉진함>
이주 및 침입에 대한 HOXA11 AS의 효과를 조사하기 위하여 siHOXA11 AS-트랜스펙션된 세포가 상처 치유 및 매트리겔 침입 분석에 각각 사용되었다. 상처 폐쇄 폭은 siNC-트랜스펙션된 HeLa 세포보다 siHOXA11 AS-트랜스펙션된 세포에서 더 컸다(도 3A). 따라서, HOXA11 AS의 하향 조절은 자궁경부암 세포의 이주를 감소시켰다. 우리는 또한 HOXA11 AS 녹다운이 HeLa 세포 침입에 억제성 효과를 갖는지 시험했다. HOXA11 AS의 녹다운은 HeLa 세포 침입을 80% 이상 억제했다(도 3B). 종합하면, 이들 결과는 HOXA11 AS가 자궁경부암 세포의 이주 및 침입 표현형에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
< HOXA11 AS 의 녹다운은 자궁경부암 세포에서의 MMP -2, MMP -9 및 VEGF 발현을 억제함>
MMP-2, MMP-9 및 VEGF는 이주와 침입을 촉진함으로써 종양 진행에 중요한 역할을 한다. 따라서, RNA와 이들 단백질의 발현 수준에 대한 HOXA11 AS의 효과가 HeLa 세포에서 결정되었다. 하기 도 4A에 도시된 대로, siHOXA11 AS는 HeLa 세포에서의 MMP-2, MMP-9 및 VEGF 발현 수준을 감소시켰다. MMP-2, MMP-9 및 VEGF 단백질 발현은 siNC-트랜스펙션된 세포보다 siHOXA11 AS-트랜스펙션된 세포에서 유의하게 더 낮았다(도 4B). 종합하면, 우리의 발견은 HOXA11 AS가 MMP-2, MMP-9 및 VEGF 발현의 상향 조절을 통해서 자궁경부암 세포의 이주 및 침입을 촉진할 수 있다는 것을 시사한다.
< HOXA11 AS 의 억제는 자궁경부암 세포에서의 EMT -관련 유전자를 역전시킴>
EMT는 세포의 이주 및 침입에서 중요하기 때문에, 우리는 또한 HOXA11 AS의 직접적 억제가 HeLa 세포에서의 EMT-관련 마커를 역전시킬 수 있는지 HOXA11 AS의 녹다운 후 실시간 RT-PCR과 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 조사했다. 예상된 대로, siHOXA11 AS는 E-캐드헤린 발현의 증가와 β-카테킨 및 비멘틴 발현의 감소를 가져왔다(도 5A 및 도 5B). 다음에 우리는 EMT를 촉진한다고 알려진 전사 인자인 스네일의 발현에 대한 HOXA11 AS 녹다운의 효과를 평가했다. siHOXA11 AS-트랜스펙션된 세포는 siNC-트랜스펙션된 세포와 비교하여 스네일을 더 낮은 수준으로 발현했다(도 5A 및 도 5B). 종합하면, EMT-관련 유전자 발현의 이상조절은 자궁경부암 세포의 이주 및 침입과 HOXA11 AS의 관련성을 부분적으로 설명한다.
< HOXA11 AS 는 자궁경부 CSC 에서 많이 발현됨>
최근 연구들은 EMT 프로그램이 정상 세포나 종양 세포에 줄기세포-유사 특성을 제공한다는 것을 증명했다. HOXA11 AS가 EMT 프로그램을 촉진하는데 필수이므로(도 5) 우리는 HOXA11 AS가 CSC 발생에 어떤 역할을 하는지 시험했다. 우리는 자궁경부암 세포인 Caski와 HeLa를 5 일간 처리한 후, CSC 마커 CD133+/CD44+를 발현하는 세포의 수를 계수했다. 예상된 대로 타원체 HeLa 세포는 CD133+/CD44+ 수의 증가를 촉진했다(도 6A 및 도 6B).
본 발명자들은 다음에 비타원체 세포와 타원체 세포에서의 HOXA11 AS 발현을 평가했다. Caski 및 HeLa 세포에서의 유전자 발현 분석은 대조군 세포와 비교했을 때 타원체 세포가 각각 10 배 또는 4 배 더 높은 수준으로 HOXA11 AS를 발현하는 것으로 드러났다(도면 6C).
< HOXA11 AS 는 줄기세포성 표현형에 필요함>
타원체 세포가 더 높은 수준의 HOXA11 AS를 발현한다는 것을 고려하여 우리는 HOXA11 AS가 CSC의 발생에 필요하다는 가설을 세웠다. 이 의제를 다루기 위해서 본 발명자들은 구체 형성 분석을 수행하여 자기-재생 잠재성을 평가했다. HOXA11 AS 녹다운 후 2 일째에 Caski 및 HeLa 세포가 타원체 형성 분석에 사용되었다. 앵커리지-독립적 조건에서 7일 인큐베이션 후, 대조군 세포는 상승된 수의 큰 콜로니를 나타냈지만, HOXA11as에 대해 침묵된 세포는 작은 크기의 콜로니를 약간 형성했을 뿐이다(도 7A). 콜로니 계수 결과 대략 78 %의 구체 형성 감소가 확인 되었다(도 7B). 본 발명자들은 다음에 CSC 마커 CD133+/CD44+를 발현하는 세포의 수를 계수했다. 예상된 대로 siHOXA11 AS-타원체 HeLa 세포는 siNC-타원체 HeLa 세포와 비교하여 CD133+/CD44+ 수의 증가를 억제했다(도 7C). 구체 형성 분석 동안 HOXA11 AS 녹다운의 유효성을 검증하기 위하여 우리는 siRNA 처리 후 7 일째에 그것의 발현을 평가했다. 우리는 HOXA11 AS 발현이 약간 회복되었음을 확인하였지만, 여전히 유의한 녹다운이 관찰되었다(도 7D). 따라서, 우리 데이터는 HOXA11 AS가 자궁경부암 셀라인에서의 CSC 표현형의 유지에 필요하다는 것을 시사한다.
<전체 결과 요약>
자궁경부암 조직에서의 HOXA11 AS의 발현은 정상 조직보다 유의하게 더 높았다. 실시간 RT-PCR 결과는 HeLa, Caski 및 SiHa 셀라인에서의 HOXA11 AS의 높은 발현 수준을 나타냈다. HOXA11 AS의 녹다운은 HeLa 및 Caski 세포에서의 세포 증식, 이주 및 침입을 감소시켰다. 또한, HOXA11 AS 녹다운은 세포 운동성 및 전이에 중요한 혈관내피 성장인자, 바탕질 메탈로프로테이나아제-9 및 상피-간엽 이전(EMT)의 발현을 감소시켰다. 더욱이, 본 발명자들은 자궁경부암 줄기세포(CSC) 하위집단(CD133+/CD44+)이 비-줄기세포 하위집단과 비교했을 때 훨씬 더 높은 수준의 HOXA11 AS를 나타낸다는 것을 관찰했다. 이들 결과는 HOXA11 AS가 EMT에 관련된 다중 신호화 메커니즘을 제어하는 핵심 조절인자로서 작용함을 나타낸다. 종합하면, 상기 데이터는 종양형성에서의 HOXA11 AS의 역할이 EMT 촉발 및 줄기세포성 취득을 통해서 일어난다는 것을 시사한다.
<결론>
HOXA11 AS는 자궁경부암 조직에서 많이 발현되며, 자궁경부암 진행과 관련된다. 상기 데이터는 HOXA11 AS 발현이 상이한 암세포 계통에서 EMT 및 CSC 형성을 추진함을 보여주었다. 이들 발견은 HOXA11 AS가 EMT 유전자 프로그램을 활성화함으로써 종양형성을 촉진한다는 것을 시사한다. HOXA11 AS는 예후에 대한 새로운 바이오마커로서 자궁경부암에서 유망한 치료 표적으로 사용될 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Biomarker diagnosing cervical cancer using lncRNA increasing expression induced cervical cancer, kit and screening method <130> HPC-5626 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> lncRNA increasing expression induced cervical cancer <400> 1 gagtttgaag ccgtggatgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> lncRNA increasing expression induced cervical cancer <400> 2 agatgagggg agaggtggat 20 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> siRNA of lncRNA increasing expression induced cervical cancer <400> 3 cggaauaucg gaauaaaguu u 21

Claims (9)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1에 대한 안티센스로서 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 또는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열의 단편인 것을 특징으로 하며,
    상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커.
  2. 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1에 대한 안티센스로서 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열의 단편, 또는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트이며,
    상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 키트는 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단 또는 예후 분석용 키트.
  4. 삭제
  5. 자궁경부암 유발시 발현이 증가하는 lncRNA의 스크리닝 방법이며,
    상기 lncRNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 lncRNA의 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 lncRNA의 스크리닝 방법은
    1) 실험군에 해당하는 자궁경부암 진단을 위한 환자 및 대조군에 해당하는 정상인의 자궁내막에서 채취된 샘플을 각각 수득하는 단계;
    2) 상기 샘플로부터 서열번호 1의 염기서열로 표시되며 lncRNA인 HOXA11 AS를 수득하는 단계;
    3) 상기 단계 2)에 따른 실험군 및 대조군의 HOXA11 AS로부터 상보적 염기서열의 cDNA를 합성하는 단계;
    4) 상기 단계 3)의 cDNA를 PCR을 통해 증폭시키는 단계; 및
    5) 상기 단계 4)의 증폭된 산물을 증폭 전후로 비교 분석하는 단계;
    를 포함하는 lncRNA의 스크리닝 방법.
  7. 서열번호 1의 염기서열에 대한 siRNA로서 서열번호 3의 염기서열, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료 및 예방용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    자궁경부암 대상 환자에게서 상기 서열번호 3의 염기서열에 따른 siRNA의 발현이 증가하는 경우 HeLa 세포에서의 MMP-2, MMP-9 및 VEGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 치료 및 예방용 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    자궁경부암 대상 환자에게서 상기 서열번호 3의 염기서열에 따른 siRNA의 발현이 증가하는 경우 EMT-관련 유전자자인 E-캐드헤린 발현은 증가되며, β-카테킨 및 비멘틴의 발현은 감소하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 치료 및 예방용 약학 조성물.

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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102534199B1 (ko) * 2020-11-11 2023-05-19 아주대학교산학협력단 자궁경부암의 조기 진행 진단용 바이오 마커 및 이의 용도
CN113736884B (zh) * 2021-09-08 2023-01-24 山西医科大学第二医院 LncRNA标志物作为宫颈癌标志物及治疗靶点在宫颈癌治疗药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011132989A2 (ko) 2010-04-23 2011-10-27 (주)지노믹트리 자궁경부암 진단용 메틸화 마커
EP2626435A1 (en) 2008-03-21 2013-08-14 MDxHealth SA Detection and prognosis of cervical cancer
US8957042B2 (en) 2012-03-07 2015-02-17 The Texas A&M University System Cancer treatment targeting non-coding RNA overexpression

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101255768B1 (ko) 2010-12-03 2013-04-19 (주)지노믹트리 자궁경부암 특이적 메틸화 유전자의 ＣｐＧ 섬을 함유하는 자궁경부암 또는 자궁경부암 진행단계 진단용 바이오마커

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2626435A1 (en) 2008-03-21 2013-08-14 MDxHealth SA Detection and prognosis of cervical cancer
WO2011132989A2 (ko) 2010-04-23 2011-10-27 (주)지노믹트리 자궁경부암 진단용 메틸화 마커
US8957042B2 (en) 2012-03-07 2015-02-17 The Texas A&M University System Cancer treatment targeting non-coding RNA overexpression

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BMC Genomics. 2012; 13: 251
Development 121, 1373-1385 (1995)
Gynecologic Oncology 133 (2014) 2-207

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