PT687737E - Deteccao de treponema pallidum e haemophilus ducreyi - Google Patents

Description

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Descrição “Detecção de Treponema pallidum e Haemophilus ducreyp’ A presente invenção insere-se no campo da biologia molecular e da química dos ácidos nucleicos. Mais especificamente, descreve métodos e reagentes para detectar e distinguir Treponema pallidum e Haemophilus ducreyi. O microrganismo T pallidum, que é um agente causador da sífilis, e o microrganismo H. ducreyi, que é o agente causador de cancróide, são os dois principais agentes causadores de doenças ulcerativas genitais nos Estados Unidos da América do Norte. No momento presente, o diagnóstico de doenças ulcerativas genitais baseia-se predominantemente na observação clínica da própria úlcera. No entanto, o diagnóstico de herpes genitais, de sífilis ou de cancróide toma-se difícil devido aos padrões de sobreposição de aspectos clínicos e à ocorrência de infecções múltiplas ou mistas (ver Sturm et ai, 1987, Microbiol. Rev. 63:98--110). Atendendo a que são necessárias terapias específicas e distintas para o tratamento de infecções provocadas por cada um desses agentes, são necessários testes de diagnóstico que identifiquem com exactidão e permitam distinguir correctamente os agentes causadores de úlceras genitais. O T. pallidum é detectado normalmente por meio de um de dois métodos. O teste imediato convencional consiste em examinar com um microscópio de campo escuro o material da lesão. Em alternativa, identifica-se uma infecção de T pallidum pela presença de anticorpos específicos. A observação em campo escuro tem vários inconvenientes. A observação em campo escuro exige equipamento especializado e um técnico experiente e apenas permite uma

* 4 sensibilidade de detecção inferior a 75%. De igual modo, a detecção serológica tem uma utilidade limitada. Os anticorpos detectáveis podem não surgir durante uma semana após o aparecimento de uma lesão e podem persistir após uma infecção anterior. Além disso, o exame pode obrigar o paciente a fazer várias consultas médicas. O H. ducreyi é detectado normalmente por meio de uma cultura. O exame, que não está vulgarizado, tem apenas uma sensibilidade que não chega a 70%. A invenção da reacção em cadeia com polimerase (RCP), que é um método que serve para amplificar sequências específicas de ácidos nucleicos, faz com que seja possível a detecção rápida de sequências específicas de ácidos nucleicos existentes numa amostra em que haja de antemão uma quantidade indetectavelmente baixa (ver as patentes de invenção norte-americanas n- 4 683 195,4 683 202 e 4 965 188). A detecção directa de uma sequência de ácido nucleico amplificada, por hibridação com uma sonda oligonucleotídica específica dessa sequência, faz com que seja possível a detecção dos agentes etiológicos contidos numa amostra, permitindo assim exames de diagnóstico rápidos e sensíveis.

Os ensaios actuais à base da RCP para I pallidam e H. ducreyi são concebidos para se detectar apenas um único alvo. Um exame de diagnóstico rápido e sensível, capaz de permitir a detecção e a identificação de T. pallidum e de H. ducreyi em amostras possivelmente afectadas por múltiplas infecções, nunca ates foi descrito.

As obras a seguir referidas descrevem matéria importante semelhante à da presente invenção. O documento EP-A-439 968 divulga sondas de hibridação para detecção de estirpes de Haemophilus ducreyi. O documento EP-A-452 596 descreve sondas de hibridação obtidas a partir da região separadora entre os genes de ARNr 16S e 23S para a detecção de microrganismos de tipo não virai, servindo alguns deles para a detecção de estirpes de H. ducreyi. Chui et al.,

J (J. Clin. Microbiol. 31, 1993, pp. 659-664) descrevem iniciadores de RCP e sondas para a detecção do gene de ARNr 16S de estirpes de H. dncreyi. Burstains et ai, (J. Clin.-Microbiol. 29, 1991, pp. 62-69) descrevem um ensaio que tem por objecto o Trepomma pallidum, com base na reacção em cadeia com polimerase, mediante a amplificação de uma parte entre os nucleótidos 648 e 1305 do gene que codifica o imunogénio membranar de 47 kDa que foi descrito por Weigel et al. (Infection and Immunity 60, 1992, pp. 1568-1576). Grábnitz et al. (Klin. Lab., 38, 1992, pp. 537-543) divulgam a amplificação de duas partes localizadas entre os nucleótidos 301 e 509 ou entre os nucleótidos 200 e 480 do gene que codifica o imunogénio membranar de 47 kDa de T. pallidum. Finalmente, Orle e Weiss (''93ltJ General Meeting of the American Society for Microbiology’, Atlanta, Georgia, EUA, 16 a 20 de Maio de 1993, Abstr. Gen. Mut. Am. Soc. Microbiol. 93(0), 1993, pp. 132, Abstr. 0-210) descrevem o desenvolvimento de um ensaio por RCP para o diagnóstico simultâneo de V1HS, V2HS e T pallidum numa amostra. A presente invenção proporciona métodos e reagentes para detectar e identificar T pallidum q H. ducreyi.

De acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção descreve um processo para detectar numa amostra o ácido nucleico de T. pallidum e H. dncreyi, consistindo tal processo em recorrer à RCP, para amplificar quaisquer sequências relevantes de ácidos nucleicos que possam estar presentes na amostra, e em detectar e identificar o ácido nucleico amplificado, realizando a sua hibridação com sondas oiigonucleotídicas específicas da sequência Cada sonda é totalmente complementar para uma sequência que identifique exclusivamente o microrganismo visado. A hibridação tem lugar em condições tais que a sonda hibridante se ligue ao ácido nucleico para formar hélices duplas híbridas estáveis apenas se as regiões hibridantes das sondas forem totalmente complementares para o ácido nucleico.

De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção diz respeito a iniciadores oligonucleotídicos e a sondas hibridantes que permitem simultaneamente a amplificação e a detecção específica de T. pallidum e H. ducreyi.

De acordo com um outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona estojos úteis que permitem simultaneamente amplificar e detectar de forma específica o T. pallidum e o H. ducreyi. Estes estojos assumem diversas formas e contêm, de acordo com uma variante, um conjunto de dois pares de iniciadores para a amplificação simultânea de T. pallidum e H. ducreyi e um painel de sondas suficientes para se detectar e identificar de forma específica os produtos amplificados a partir de T pallidum e H. ducreyi. Estes estojos também podem conter um ou vários reagentes de amplificação, v.g. iniciadores, polimerases, tampões e nucleósido--trifosfatos.

Para auxiliar a compreender a presente invenção efectua-se seguidamente a descrição de alguns termos e expressões. A expressão “ácido nucleico” e o termo “oligonucleótido” referem-se a iniciadores, sondas hibridantes e fragmentos oligoméricos que irão ser detectados e devem ser genéricos para os polidesoxirribonucleótidos (contendo 2-desoxi-F-ribose), para os polirribonucleótidos (contendo D-ribose) e para qualquer outro tipo de polinucleótido que seja um N-glicósido de uma base púrica ou pirimidínica ou de uma base púrica ou pirimidínica modificada. Não há nenhuma distinção propositada na abrangência dos termos “ácido nucleico” e “oligonucleótido”, podendo estes termos ser livremente trocados entre si. Estes termos referem-se apenas à estrutura primária da molécula. Assim, estes termos designam ADN de cadeia dupla e de cadeia simples e também ARN de cadeia dupla e de cadeia simples. O tamanho exacto de um oligonucleótido depende de inúmeros factores e da finalidade ou utilização a que se destina tal oligonucleótido. Os oligonucleótidos podem ser preparados por

5 qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, a clonagem e a restrição de sequências apropriadas e a síntese química directa por meio de um método tal como: o método do fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; o método do fosfodiéster de Brown et ai, 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; o método da dietilfosforamidite de Beaucage etal., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; e o método em suporte sólido descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 458 066. Na obra de Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187 vem publicada uma resenha dos métodos de síntese. O termo “hibridação” refere-se à formação de uma estrutura de hélice dupla de dois ácidos nucleicos de cadeia simples por emparelhamento de bases complementares. A hibridação pode ter lugar entre cadeias complementares de ácidos nucleicos ou entre cadeias de ácidos nucleicos que contenham apenas pequenas regiões desemparelhadas. As condições em que hibridam apenas as cadeias totalmente complementares de ácidos nucleicos são designadas pela expressão “condições rigorosas de hibridação”. Dois ácidos nucleicos de cadeia simples que sejam complementares, excepto em regiões de extensão diminuta de desemparelhamento, recebem a designação de “quase complementares”. As hélices duplas estáveis de sequências quase complementares podem ser obtidas em condições de hibridação menos rigorosas. Os especialistas em tecnologia dos ácidos nucleicos sabem como determinar empiricamente a estabilidade das hélices duplas, tendo em conta diversas variáveis entre as quais se salienta, por exemplo, o comprimento e a composição dos oligonucleótidos, a força iónica e a incidência e o tipo dos pares de bases desemparelhadas. O termo “sonda” designa um oligonucleótido que forma uma estrutura dúplice com uma sequência de um ácido nucleico relevante devido ao emparelhamento de bases complementares. A sonda é constituída por uma “região de hibridação” que é uma região do

oligonucleótido constituída preferencialmente por 19 a 50 nucleótidos e mais preferencialmente por 15 a 30 nucleótidos, correspondente a uma região da sequência relevante destinatária. O termo “correspondente” significa idêntico ou complementar do ácido nucleico designado. Uma sonda oligonucleotídica pode ser ligada facultativamente a outras moléculas que permitam a detecção ou a imobilização da sonda hibridante, mas que não alterem as características de hibridação da sonda. Qualquer especialista na matéria sabe que, de um modo geral, o complemento de uma sonda oligonucleotídica também serve de sonda. A expressão “oligonucleótido específico da sequência” e “OES” (o mesmo que SSO) designam sondas oligonucleotídicas ou iniciadores em que a região de hibridação é exactamente (totalmente) complementar da sequência que se pretende detectar. A utilização de condições de hibridação rigorosas, definidas como sendo as condições de hibridação em que o oligonucleótido irá hibridar apenas e exactamente com a sequência relevante destinatária complementar, permite a detecção da sequência relevante e destinatária específica. As condições de hibridação rigorosas são bem conhecidas na especialidade (ver v.g. Sambrook et ai, 1985, “Molecular Cloning - A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). As condições rigorosas dependem da sequência em causa e irão ser diferentes consoante as circunstâncias. De um modo geral, as condições rigorosas de trabalho são seleccionadas de modo a que a temperatura seja cerca de 5°C inferior ao ponto térmico de fusão (Tf) da sequência específica para uma determinada força iónica e um determinado valor do pH. O valor Tf é a temperatura (nas condições definidas de força iónica e valor de pH) a que 50% dos pares de bases se dissociam. De uma forma típica, as condições rigorosas de trabalho irão ser aquelas em que a concentração salina seja pela menos de cerca de 0,2 M a pH 7 e a temperatura seja pelo menos de cerca de 60°C. A diminuição do rigor das condições 7

de hibridação fará com que sejam toleradas inexactidões sequenciais; o grau de inexactidão tolerado pode ser regulado por um ajustamento conveniente das condições de hibridação.

Uma sonda ou um iniciador oligonucleotídicos específicos da sequência, que hibridem com uma sequência nucleotídica que seja característica de uma espécie específica, recebem a designação de “específicos da espécie”. É possível recorrer à hibridação de uma amostra de ácido nucleico com uma sonda específica da espécie em condições rigorosas de hibridação para se identificar uma amostra de ácido nucleico proveniente de um membro da espécie. O termo “iniciador” designa um oligonucleótido, quer de origem natural quer sintético, capaz de funcionar como ponto de início da síntese do ADN em condições em que seja induzida a síntese de um produto de prolongamento do iniciador, complementar de um ácido nucleico, isto é, na presença de quatro nucleósido-trifosfatos diferentes e de um agente para a polimerização (isto é, a polimerase do ADN ou a transcriptase reversa) numa solução tampão adequada e a uma temperatura conveniente. De preferência, um iniciador é um oligodesoxirribo-nucleótido de cadeia simples. O comprimento adequado de um iniciador vai depender da finalidade para que se pretende o iniciador, mas está compreendido tipicamente entre 15 e 35 nucleótidos. As moléculas iniciadoras curtas necessitam geralmente de temperaturas mais baixas para formarem com a matriz complexos híbridos suficientemente estáveis. Não é necessário que um iniciador corresponda à sequência exacta da matriz, mas tem de ser suficientemente complementar para hibridar com uma matriz. Os iniciadores podem incorporar outras particularidades que permitam a detecção ou a imobilização do iniciador, mas que não alterem a propriedade básica do iniciador que é a de servir como ponto de início de síntese do ADN. A expressão “região relevante destinatária” designa uma região de um ácido nucleico que se pretenda analisar. A expressão “enzima polimerase teimostável” designa uma enzima que seja relativamente estável ao calor e que catalise a polimerização dos nucleósido-trifosfatos para formarem produtos de prolongamento do iniciador que sejam complementares para uma das cadeias de ácido nucleico da sequência relevante destinatária. A enzima inicia a síntese na extremidade 3’ do iniciador e continua no sentido da extremidade 5’ da matriz, até terminar a síntese. Há uma enzima polimerase termostável purificada que vem minuciosamente descrita na patente de invenção norte-americana n° 4 889 818.

As expressões “mistura de reacção de amplificação” e “mistura de reacção em cadeia com polimerase” referem-se a uma combinação de reagentes que é adequada para a realização de uma reacção em cadeia com polimerase. A mistura de reacção contém tipicamente iniciadores oligonucleotídicos, nucleótido-trifosfatos e polimerase do ADN numa solução tampão adequada. Como exemplos de misturas de reacção de amplificação refere-se as que vêm indicadas nos exemplos.

As técnicas convencionais da biologia molecular e da química dos ácidos nucleicos, que são matéria da competência de especialistas, estão perfeitamente descritas e explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook et al, 1985, supra: “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait, ed., 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B.D. Hames e S.J. Higgins eds., 1984) e um conjunto de textos “Methods in Enzimology” (Academic Press, Inc.). A presente invenção proporciona métodos e reagentes para um ensaio de diagnóstico capaz de detectar e de identificar T pallidum e H. ducreyi. A invenção proporciona pares de iniciadores que actuam numa RCP simples, de modo a que tenham lugar a amplificação de sequências relevantes destinatárias provenientes de uma ou de todas as espécies. A identificação do ácido nucleico amplificado é então realizada por hibridação do produto amplificado. utilizando para a hibridação sequências oligonucleotídicas específicas da sequência e detectando a formação de hélices duplas híbridas.

Para se detectar os tipos 1 e 2 do VHS, amplifica-se uma região de um gene gB da exonuclease alcalina, utilizando para tal os iniciadores KS30 (SEQ ID N° 1) e KS31 (SEQ ID N° 2). Os genes gB da exonuclease alcalina provenientes dos tipos 1 e 2 do VHS são muitíssimo homólogos entre si, mas não com nenhuma outra sequência de genes conhecidos na família dos vírus do heipes. Os iniciadores hibridam com sequências conservadas que são exclusivas dos tipos 1 e 2 do VHS e consequentemente permitem a amplificação específica dos dois tipos 1 e 2 de VHS, utilizando um único par de iniciadores. A identificação do ADN amplificado tem lugar mediante a hibridação com sondas específicas da sequência seleccionada entre o conjunto constituído pela sonda KS38 (SEQ ID N° 3) que é específica do tipo 1 do VHS, a sonda KS47 (SEQ ID N° 4) que é específica do tipo 2 do VSH e a sonda KS54 (SEQ ID N° 5) que hibrida quer com o tipo 1 de VHS quer com o tipo 2 de VHS. As sondas conferem a faculdade de se poder distinguir os tipos 1 e 2 de VHS ou de se detectar as sequências de VHS independentemente do tipo. As sequência nucleotídicas destes iniciadores e sondas estão indicadas adiante, estando representadas no sentido de 5’ para 3 ’.

Iniciadores e sondas para o VHS

Iniciador SEQ ID N° Sequência KS30 1 TTCAAGGCCACCATGTACTACAAAGACGT KS31 2 GCC GT AAAACGGGG AC AT GT AC AC AAAGT Sonda KS38 GCCAACGCCGCGACCCGCAC KS47 4 CAAGCCGGCGAAGGT C GC C ACG KS54 5 GGTCTCGTGGTCGTCCCGGTGAAA ΙΟ

Para se detectar o microrganismo T. pallidum amplifica-se uma região do gene imuno-génico membranar de 47 kDa utilizando para tal os iniciadores K03 A (SEQ ID N° 6) e K04 (SEQ ED N° 7). O gene imunogénico de 47 kDa é exclusivo do microrganismo T pallidum e a sequência do gene é invariante entre os isolados de T. pallidum. Em consequência, os iniciadores que são específicos para o microrganismo T. pallidum podem ser utilizados para amplificar todas as estirpes de T. pallidum. A identificação do produto amplificado efectua-se por hibridação com uma sonda hibridante específica da sequência que pode ser quer a sonda KOI7 (SEQ ID N° 8) quer a sonda KOI8 (SEQ ID N° 9). As sequências nucleotídicas destes iniciadores e destas sondas estão indicadas a seguir, estando representadas no sentido de 5: para 3\

Iniciadores e Sondas para o T pallidum

Iniciador SEOIDN0 Sequência K03A 6 GAAGTTT GT CCC AGTT GCGGTT K04 7 CAGAGCCATCAGCCCTTTTCA Sonda K017 8 CGGGCTCTCCATGCTGCTTACCTTA K018 9 TCGTGCGGGCTCTCCATGCTGCTTA

Para se detectar o microrganismo H. ducreyi amplifica-se uma região do gene de ARN ribossómico (ARNr) da subunidade pequenas 16S, utilizando para tal os iniciadores, específicos da espécie, K07A (SEQ ID N° 10) e K08A (SEQ ID N° 11). A detecção e a amplificação do produto amplificado tem lugar por hibridação com a sonda, específica da espécie, KOI5 (SEQ ID N° 12). As sequências nucleotídicas destes iniciadores e destas sondas estão indicadas a seguir, estando representadas no sentido de 5’ para 3’. 11

Iniciadores e Sondas para o H. ducreyi iniciador

K07A SEQIDN0 10

Sequência CAAGTCGAACGGTAGCACGAAG

K08A 11

TTCTGTGACTAACGTCAATCAATTTTG

Sonda K015 12

CCGAAGGTCCCACCCTTTAATCCGA

Os três sistemas de detecção descritos supra podem ser utilizados separadamente no caso de se pretender detectar uma única espécie. No entanto, uma vantagem importante dos pares de iniciadores de amplificação da presente invenção reside no facto de se poder utilizar simultaneamente dois pares de iniciadores para T. pallidum e H. ducreyi na mesma mistura de reacção para amplificar ácido nucleico proveniente das duas espécies. Os iniciadores foram concebidos não só para amplificar as suas respectivas sequências relevantes destinatárias, em condições idênticas, mas também para evitar a hibridação cruzada ou a formação de dímeros de iniciadores com outros iniciadores. A eliminação da necessidade de se recorrer a reacções de amplificação separadas simplifica imenso a identificação do agente causador da formação de úlceras genitais. A. seguir a amplificação com os dois pares de iniciadores, detecta-se o produto amplificado e identifica-se por hibridação com as condas específicas das espécies. Devido à ocorrência de infecções múltiplas, a seguir à amplificação podem estar presentes várias sequências amplificadas. Cada sequência não só detecta especificamente a sequência amplificada, utilizando um par de iniciadores, como também não vai hibridar de forma cruzada com as sequências amplificadas, utilizando o outro par de iniciadores. Além disso, o comprimento e a composição da sequência de cada sonda foram escolhidos de forma a permitir a hibridação nas mesmas condições. Assim sendo, as sondas hibridantes podem ser utilizadas convenientemente em ensaios de detecção que exijam condições uniformes de hibridação, tal como sucede quando se utiliza uma única placa num ensaio de detecção em placa de microcavidades, ou podem ligar-se a uma membrana simples num formato inverso de autorradiografias pontilhadas de amostras hibridadas.

Os iniciadores e as sondas supramencionados foram concebidos para se detectar o ácido nucleico dos microrganismos T. pallidum e H. ducreyi em amostras clínicas que eventualmente possam conter ácidos nucleicos provenientes de um ou vários organismos infecciosos. A especificidade do ensaio de co-amplificação e de detecção foi avaliada de forma empírica, conforme adiante se escreve nos exemplos. Foram analisadas as amostras que continham ácido nucleico proveniente de um grande número de organismos, incluindo os microrganismos comensais e patogénicos que existem também no tracto genitourinário ou na flora normal da pele e proveniente também de organismos estreitamente afins dos microrganismos VHS, I pallidum e H. ducreyi. Apenas as sequências de ácidos nucleicos provenientes de T, pallidum e H. ducreyi foram amplificadas utilizando os pares de iniciadores da presente invenção. Os produtos de amplificação foram detectados e coirectamente identificados por hibridação com sondas hibridantes específicas das sequências. O processo de amplificação por reacção em cadeia com polimerase (RCP) é perfeitamente conhecido na especialidade e vem descrito nas patentes de invenção norte-americanas n— 4 683 195, 4 683 202 e 4 965 188. Para facilitar a compreensão das vantagens proporcionadas pela presente invenção descreve-se seguidamente e de forma resumida o método de RCP:

Em cada ciclo de uma amplificação por RCP desnatura-se uma sequência relevante de cadeia dupla, os iniciadores são recombinados com cada cadeia da sequência relevante destinatária desnaturada e depois esses iniciadores são aumentados pela acção de uma polimerase de ADN. De uma forma típica repete-se o processo entre 25 e 40 vezes. Os dois iniciadores vão recombinar-se com extremidades opostas da sequência de ácido nucleico relevante desti-natária e com orientações tais que o produto do prolongamento de cada iniciador seja uma cópia complementar da sequência relevante destinatária e pode, quando separado do seu complemento, hibridar com o outro iniciador. Em cada ciclo, se houvesse uma eficiência de 100%, duplicar-se-ia o número de sequências relevantes destinatárias presentes.

Devido à enorme amplificação que é possível com o processo da RCP, pequenas quantidades de ADN retiradas de amostras com níveis elevados de ADN, de matrizes de contraprova positiva ou de amplificações anteriores podem originar um produto de RCP, mesmo na ausência do ADN da matriz deliberadamente acrescentada. Se possível, todas as misturas de reacção são preparadas numa zona separada da zona de preparação da amostra e de análise do produto de RCP. A utilização de recipientes, soluções e pipetas (de preferência pipetas de avanço), dedicados ou descartáveis, para a preparação de ARN/ADN, para as misturas de reacção e para as análises das amostras irá minimizar a contaminação cruzada. Ver também Higuchi e Kwok, 1989, Nature, 339:237-238 e Kwok e Orrego em Innis et al. eds., 1990, “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, Academic Press, Inc., San Diego, CA, EUA.

Na publicação da patente de invenção do PCT com o n° WO 92/01814 e na patente de invenção norte-americana como n° 5 035 996 vêm descritos métodos enzimáticos para atenuar o problema da contaminação de uma RCP devido à presença de ácido nucleico amplificado proveniente de reacções anteriores. Tais métodos permitem a degradação enzimática de todo o ADN amplificado em reacções anteriores. As amplificações por RCP são executadas na presença de dUTP em vez de dTTP O produto de amplificação de cadeia dupla resultante que incorpora uracilo fica sujeito a degradação por acção da uracil-N-glicosilase (UNG), ao passo que o ADN normal que contém timidina não é degradado pela UNG. As misturas de reacção de amplificação são tratadas com UNG antes da amplificação para degradar todo o ADN que continha uracilo e que possa servir de sequência destinatária relevante. Uma vez que a única fonte de ADN que contém uracilo é o produto amplificado de uma reacção anterior, este método elimina eficazmente o problema da contaminação originada por reacções anteriores (material transferido). A UNG fica temporariamente inactiva por acção do calor, pelo que os passos de desnaturação no procedimento de amplificação também servem para inactivar a UNG. Assim sendo, os novos produtos de amplificação, embora incorporem uracilo, são formados num ambiente de UNG inactivada e não são degradados.

Tanto a amplificação das sequência genómicas relevantes destinatárias como a detecção por hibridação com sondas hibridantes específicas das sequências são procedimentos importantes para se conseguir uma sensibilidade e uma especificidade suficientes. As sondas hibridantes oligonucleotídicas específicas das sequências, de acordo com a invenção, são concebidas e projectadas de modo a serem complementares com as sequências nucleotídicas sobre as quais se sabe que ocorrem apenas nas espécies que se pretende detectar. As sondas de OES, quando utilizadas em condições de hibridação rigorosas em que tais sondas hibridam apenas com sequências totalmente complementares, possibilitam a detecção e a discriminação de T. pallidum e H. ducreyi.

Os métodos de ensaio para a detecção dos híbridos formados entre sondas de OES e as sequências de ácido nucleico relevantes destinatárias podem obrigar a que as sondas sejam ligadas a outros compostos que facilitem a detecção ou a imobilização da sonda hibridante. Tais compostos adicionais ligados às sondas para se conseguir a detecção ou a imobilização "-"Λ/ /& / ν· ,··'. 15^ não devem afectar as propriedades hibridantes das sondas que vão permitir a detecção e a discriminação de T. pallidum e H. ducreyi.

As sondas podem ser ligadas a um marcador detectável por processos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos. Como exemplos de marcadores úteis refere-se os seleccionados entre P, corantes fluorescentes, reagentes densos em electrões, enzimas (tais como as vulgarmente utilizadas nos EISLE (o mesmo que ELISA)), biotina ou haptenos e proteínas para as quais haja anti-soros ou anticorpos monoclonais. As sondas hibridantes também podem ser ligadas a outros compostos que sejam utilizados para imobilizar essas sondas hibridantes sobre um suporte sólido.

As sondas hibridantes marcadas, de acordo com a invenção, podem ser sintetizadas e marcadas recorrendo a técnicas anteriormente descritas para sintetizar oligonucleótidos. Por exemplo, a sonda hibridante pode ser marcada na extremidade 5’ com P mediante a incubação dessa sonda hibridante com 32P-ATP e cinase. Um marcador adequado não radioactivo para as sondas de OES é a peroxidase de Armorica msticana (PAR, o mesmo que HRP). Os métodos para a preparação e para a detecção de sondas hibridantes ligadas a este marcador estão descritos no exemplos subsequentes e nas patentes de invenção norte-americanas n- 4 914 210 e 4 962 029. A utilização de tais sondas hibridantes marcadas também está descrita na patente de invenção norte-americana n° 4 789 630 e nas obras de Saiki et ai, 1988, N. Eng. J.

Med. 319:537-541 e de Bugawan et ai, 1988, Bio/Technology 6:943-947. Os cromogénios úteis para a detecção de sondas hibridantes marcadas com PAR são o corante-vermelho reduzido (incolor) e 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB).

Como exemplos de compostos adicionais, ligados às sondas hibridantes para se conseguir a imobilização dessas sondas, refere-se um “apêndice” poli-dT comprido que pode ser fixado 16^ ^ -7 ? a um suporte de ‘nylon’ por irradiação, que é uma técnica que está descrita minuciosamente na publicação da patente de invenção PCT com o n° 89/11548.

As sondas hibridantes da presente invenção são utilizadas para a detecção e para a identificação de sequências nucleotídicas presentes numa amostra, sendo para isso determinado quais as sondas que hibridam com as sequências de ácido nucleico presentes na amostra. Os métodos de ensaio adequados para a detecção dos híbridos formados entre as sondas hibridantes e as sequências de ácido nucleico relevantes destinatárias existentes numa amostra são conhecidos na especialidade (Sambrook et al., 1985, supra). Como exemplos refere-se os protocolos de ensaio directo e inverso das autorradiografias pontilhadas de amostras hibridadas.

Segundo um procedimento de ensaio pelas autorradiografias pontilhadas de amostras hibridadas, o ADN relevante destinatário amplificado e não marcado é imobilizado sobre um suporte sólido, tal como uma membrana de ‘nylon’. Realiza-se a incubação do complexo membrana - ADN relevante conjuntamente com a sonda marcada, em condições de hibridação convenientes, remove-se a sonda não hibridada por lavagem, em condições adequadamente rigorosas, e pesquisa-se a membrana à procura da sonda ligada.

Um procedimento alternativo é o do método “inverso” das autorradiografias pontilhadas de amostras hibridadas em que o ADN relevante destinatário amplificado é marcado e as sondas hibridantes são imobilizadas sobre um suporte sólido, tal como uma membrana de ‘nylon’. De forma típica, o ADN relevante destinatário é marcado durante a amplificação por incorporação dos iniciadores marcados. Efectua-se a incubação do complexo membrana-sonda hibridante conjuntamente com a amostra marcada, em condições de hibridação convenientes, remove-se a amostra não hibridada por lavagem, em condições adequadamente rigorosas, e depois pesquisa-se o filtro à procura de ADN relevante ligado. 17

Em alternativa, o método de ensaio inverso pelas autorradiografias pontilhadas de amostras hibiidadas pode ser executado utilizando um suporte sólido que tenha um conjunto de cavidades ou locais de hibridação da sonda hibridante. De acordo com uma variante preferida da presente invenção, que é particularmente útil para aplicações clínicas dos métodos da presente invenção em grande escala, realiza-se a hibridação numa placa de microcavidades. A patente de invenção norte-americana n° 5 232 829 descreve um protocolo de ensaio inverso pelas autorradiografias pontilhadas de amostras hibridadas em que se utiliza uma placa de microcavidades. As sondas hibridantes podem ser imobilizadas numa placa de microcavidades, quer por ligação passiva quer conjugando em primeiro lugar as sondas hibridantes com albumina de soro de bovino (ASB) que adere às placas de microcavidades.

De acordo com um método alternativo de imobilização de hélices duplas hibridantes, para efeitos de detecção, as sondas específicas de espécies, conjugadas com ASB, são ligadas a micropartículas magnéticas. As sondas são hibridadas em solução com o produto de amplificação marcado. As hélices duplas hibridantes são então removidas da solução por métodos magnéticos e tais hélices duplas hibridantes imobilizadas magneticamente são depois detectadas, tal como se disse a propósito dos métodos descritos supra.

Um outro protocolo de ensaio conveniente é o que vem descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 210 015 em que se acrescenta uma sonda hibridante marcada durante o processo de amplificação por RCP. As sondas hibridantes são modificadas por forma a evitar-se que actuem como iniciadores para a síntese do ADN. Qualquer sonda que hibride com o ADN relevante destinatário, durante cada passo de síntese, é degradada pela actividade de exonuclease de 5’ para 3’ da polimerase do ADN, v.g. a polimerase do ADN de Taq. Depois detecta-se o produto de degradação da sonda hibridante. Assim, a presença do produto de decomposição da sonda indica que teve lugar a hibridação entre a sonda hibridante e o ADN relevante destinatário.

Qualquer especialista na matéria sabe que a utilização de diferentes marcadores em ensaios de detecção ou a prática de diferentes métodos de imobilização pode exigir optimizações menores das condições e/ou das sequências das sondas hibridantes. Qualquer que seja o método para se determinar quais são as sondas de OES da invenção que hibridam com as sequências do ácido nucleico relevante destinatário numa amostra, a questão central do método de caracterização implica a identificação do ácido nucleico presente na amostra, mediante a detecção da hibridação das sondas oligonucleotídicas com o ADN relevante destinatário amplificado. A aplicação específica irá determinar quais são as sondas a utilizar. Por exemplo, se for importante reconhecer só a presença ou a ausência de uma espécie apenas, então é adequada uma única sonda específica da sequência. A presente invenção também diz respeito a estojos que são unidades de multicontentores onde estão contidos componentes úteis para a prática do método da invenção. Um estojo útil pode conter uma mistura de reagentes para a RCP, na qual há dois pares de iniciadores para amplificar T. pallidum e H. dacreyi. Além disso, um estojo pode conter um conjunto de sondas hibridantes específicas para os ácidos nucleicos de I pallidum e H. diicreyi. Em alguns casos, as sondas de OES podem ser fixadas a uma membrana de suporte adequada, tal como uma placa de microcavidades. Um estojo ainda pode conter outros componentes facultativos, entre os quais se salienta, por exemplo, um agente para catalisar a síntese dos produtos de prolongamento do iniciador, os nucleósido-trifosfatos de substrato, os meios utilizados para fazer as marcações (por exemplo, um conjugado de avidina-enzima e substrato enzimático e ainda um cromogénio, se o marcador for a biotina), as soluções tampão adequadas para a RCP ou para as reacções de hibridação e ainda as instruções para a execução do método da presente invenção. β> 19 /sj*

Seguidamente ilustrar-se-á a presente invenção por meio de exemplos.

Exemplo 1 Protocolos

Descreve-se seguidamente os protocolos preferidos de amplificação e de detecção.

Realiza-se a amplificação por meio dé uma única RCP em que estão presentes três pares de iniciadores. Efectua-se a detecção segundo um protocolo de ensaio em placa de microcavidades em que as sondas específicas das sequências são imobilizadas na placa e o ADN relevante destinatário amplificado é macerado durante a amplificação. A seguir à hibridação com o ADN relevante destinatário amplificado, as hélices duplas híbridas são detectadas recorrendo a um ensaio colorimétrico.

Preparação das Amostras

Os esfregaços de úlceras genitais são as amostras clínicas preferidas para a detecção dos tipos 1 e 2 de VHS e de I pallidum e H. ducreyi, embora se possa utilizar uma grande diversidade de fluidos corporais. Obtém-se os esfregaços das úlceras genitais que são então colocados num meio de transporte da amostra (MTA), constituído por dodecil-sulfato de sódio (DSS) a 0,4% e Tris-HCl 10 mM a pH 8,0. Os esfregaços são agitados vigorosamente no MTA durante 15 segundos, o líquido é projectado contra as paredes do tubo e os esfregaços são então removidos. Qualquer excesso de muco presente na amostra tem de ser removido nesta altura, sendo recolhido no esfregaço. A amostra assim obtida mantém-se estável durante 24 horas à temperatura ambiente. As amostras podem ser guardadas a uma temperatura entre 2°C e 8°C, mas devem ser analisadas e testadas nos 10 dias subsequentes à colheita.

Antes da amplificação, a amostra colhida é misturada com 1 mL de diluente de prova (DP) constituído por Tween 20 a 20%, azida de sódio a 0,1% e Tris-HCl 10 mM a pH 8,0.

Depois centrifuga-se a amostra vigorosamente durante 5 a 10 segundos e deixa-se a incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos.

Amplificação

As amplificações por RCP são realizadas utilizando os três pares de iniciadores, de-signadamente KS30 (SEQ ID N° 1) e KS31 (SEQ ID N° 2), K03A (SEQ ID N° 6) e K04 (SEQ ID N° 7) e K07A (SEQ ID N° 10) e K08A (SEQ ID N° 11), que possibilitam a amplificação simultânea dos ácidos nucleicos dos tipos 1 e 2 de VHS e de I pallidum e de H. ducreyi. As amplificações por RCP são executadas num volume de reacção total de 100 pL em que 50 pL são da amostra de ADN que se juntou a 50 pL da mistura de reacção. As concentrações finais da reacção são as seguintes: 25 pmol de cada iniciador, 200 pM de cada uma das substâncias dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 50 mM de KC1, 10 mM de Tris-HCl a pH 8,3 3,0 mM de MgCl2, 12,5% de glicerol, 2,5 unidades (U) de polimerase do ADN de Taq*, 1 unidade (U) de UNG*. * Substâncias desenvolvidas e produzidas por Hofímann-La Roche e comercializadas por Perkin Elmer, Norwalk, CT, EUA.

As reacções de amplificação são levadas a cabo no sistema 9600 de RCP de modelo GeneAmp comercializado por Perkin Elmer, Norwalk, CT, EUA. O aparelho que executa os ciclos térmicos é programado para o perfil térmico seguinte:

Fasso

Tempo incubar

2 minutos, 50°C 35 ciclos desnaturar recombinar aumentar esperar

5 minutos, 95°C 20 segundos, 95°C 20 segundos, 62°C 20 segundos, 72°C > 10 minutos, 72°C

Os 2 minutos iniciais de incubação são o período necessário para que a UNG degrade todo o ADN contaminante resultante de reacções anteriores. Os 10 minutos finais de espera, que podem prolongar-se até várias horas, são o período em que é inactivada qualquer UNG residual e garantem que foi completada a síntese total do produto. Incubações finais durante períodos mais longos (v.g. de um dia para o outro) têm como consequência a degradação do ADN relevante destinatário amplificado.

Detecção por Electroforese em Gel É possível avaliar a presença e a quantidade de produto amplificado recorrendo à electroforese em gel. A detecção do produto que resulta da amplificação, por electroforese em gel, é um método perfeitamente descrito na literatura (ver por exemplo, Sambrook et ai, 1989, supra). De preferência, utiliza-se gel de agarose (100 mL de ‘NuSieve’ a 2% e ‘SeaChem’ a 5%) e TE IX (Tris 0,089 M, ácido bórico 0,089 M e EDTA dissódico 0,0025 M) como tampão da experiência. A electroforese é executada à tensão de 100 V durante aproximadamente 1 hora. A seguir à electroforese acrescenta-se brometo de etídio (0,5 pg/mL). Efectua-se rapidamente uma descoloração do gel em água e as bandas de ADN coradas com brometo de etídio são visualizadas fazendo incidir radiação UV. 22 22 /V s

Ensaio em Placas de Microcavidades

Segundo este esquema de detecção, as sondas hibridantes são imobilizadas numa cavidade de uma placa de microcavidades e o ADN relevante destinatário amplificado é hibridado com as sondas hibridantes ligadas. A amplificação tem lugar mediante a utilização de iniciadores biotinilados que permitem a detecção do ADN amplificado que hibrida com as sondas hibridantes ligadas. Os iniciadores são biotinilados conforme descrito por Levenson e Chang, 1989, em “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, Innis et ai, eds., Academic Press, San Diego, páginas 92-112. Atente-se no facto de poder ser biotinilado apenas um iniciador ou os dois.

Para se imobilizar as sondas hibridantes específicas das espécies, em placas de microcavidades, espera-se que as sondas conjugadas com a ASB sejam adsorvidas pela superfície do plástico de cada uma das cavidades de uma placa de microcavidades. De preferência, são utilizadas placas de 96 cavidades fornecidas por Corning (Corning, N.Y., EUA). As sondas hibridantes são imobilizadas sobre uma placa de microcavidades, segundo uma concentração compreendida entre 25 e 100 ng/cavidade, sendo de preferência de 50 ng/cavidade. Em alternativa, as sondas hibridantes podem ser imobilizadas de forma passiva sobre a superfície do plástico de uma placa de microcavidades, conforme adiante se descreve. Introduz-se em cada cavidade de uma placa de microcavidades 100 pL de uma solução de CH3COONH4 1 M que contém a sonda hibridante segundo uma concentração compreendida entre 0,025 e 3 ng/pL. Deixa-se a placa a incubar à temperatura de 3 7o C durante um período de 10 a 20 horas (de um dia para 0 outro) e depois enxagua-se com STP/EDTA (o STP (o mesmo que PBS) é uma mistura de KC12,68 miM, NaCl 137 mM, KH2P04 1,47 mM e Na2HP04 8,03 mM). A seguir à amplificação acrescenta-se a cada tubo da RCP 100 pL de solução de desnaturação (NaOH 0,4 M, EDTA 80 mM e azul-de-timol a 0,005%). Usa-se uma ponta nova de pipeta para cada tubo. Se a detecção não for realizada imediatamente, então os tubos de RCP devem guardados a -20°C e aquecidos rapidamente a uma temperatura entre 25°C e 30°C antes de serem abertos.

Remove-se o número adequado de 8 faixas de cavidades da placa de microcavidades (no mínimo duas faixas), sendo colocadas na célula da placa de microcavidades. Com uma pipeta introduz-se em cada cavidade da placa de microcavidades 100gL de tampão de hibridação/ /neutralização (NaSCN 2,5 M, Naf^POj 80 mM, NaHiPOj 10 mM e Tween 20’ a 0,125%; pH = 5,0 ± 0,2). Utilizando pontas obturadas com uma pipetadora multicanais pipetou-se para a correspondente posição de cavidade na placa de microcavidades uma quantidade de 25 gL do produto desnaturado da reacção de amplificação proveniente de cada tubo de RCP no tabuleiro. Cobriu-se a placa com a correspondente tampa de placa de microcavidades e bateu-se--lhe suavemente de lado 10 a 15 vezes. As cavidades em que havia sido realizada uma dosagem adequada de reagente mudaram de cor para amarelo claro. A ausência de mudança de cor ou uma mudança apenas ligeira para azul significa que se acrescentou excesso de produto amplificado. No entanto, isto não afecta os resultados do estudo. A adição de excesso de produto amplificado vai fazer aumentar os valores positivos de DO mas os valores negativos de DO, não irão ser afectados. Mantém-se a placa a incubar durante 60 minutos à temperatura de 37°C para permitir a hibridação.

A seguir à incubação lava-se a placa 5 vezes com uma solução tampão de lavagem de RCP IX. Uma solução tampão de lavagem de RCP concentrada 10 vezes contém 9,94 g de fosfato de sódio dibásico por litro, 4,41 g de fosfato de sódio monobásico por litro, 3,722 g de EDTA por litro, 87,66 g de cloreto de sódio por litro, 13,7 g de ‘Tween 20’ por litro e 10 g de ‘Pro Clin 300’ por litro (Rohm & Haas. Philadelphia, PA, EUA). Ajusta-se o valor do pH

24 / com ácido fosfórico (de preferência para pH 6,5 a 7,1). A lavagem da placa pode ser feita manualmente ou com uma lavadora automática de placas de microcavidades programada para o efeito.

Para se fazer a lavagem manual esvazia-se o conteúdo da placa e bate-se-lhe com pancadas ligeiras depois de seca. Junta-se a cada cavidade da placa que se está a testar 300 pL de solução de lavagem e deixa-se a placa ficar impregnada durante 15 a 30 segundos. Esvazia-se novamente a placa e bate-se-lhe com pancadas ligeiras depois de seca. Repete-se este processo mais 4 vezes.

Com uma lavadora automática de placas de microcavidades utiliza-se o procedimento a seguir descrito. Aspira-se o conteúdo das cavidades. Programa-se a lavadora para acrescentar a cada cavidade da placa que está a ser testada 350 pL da solução de lavagem utilizada na operação, deixa-se impregnar durante 30 segundos e aspira-se. Estes passos são repetidos mais 4 vezes. Depois bate-se suavemente na placa seca.

Prepara-se o conjugado de avidina-PAR do modo a seguir indicado. Prepara-se um diluente que contém 0,025% de ‘Emulsit 25’ 0,1 M (DKS International, Inc., Tóquio, Japão); 1,0% de ‘Kathon CG’ (Rohm & Haas, Philadelphia, PA, EUA); 0,1% de fenol; e 1,0% de globulina γ de bovino. Ajusta-se o valor do pH da solução diluente para 7,3 com HC1 concentrado. A este diluente acrescenta-se 10 nM de avidina conjugada (Vector Labs, Burlingame, CA, EUA). Acrescenta-se a cada cavidade da placa que está a ser testada uma quantidade de 100 pL de conjugado de avidina-PAR. Depois tapa-se a placa e deixa-se a incubar durante 15 minutos à temperatura de 37°C e lava-se outra vez, conforme descrito supra.

Prepara-se o substrato utilizado na operação misturando 2,0 mL de Substrato A (peróxido de hidrogénio 3 mM, citrato 6,5 mM e ‘Kathon CG’ a 0,1%) e 0,5 mL de Substrato B (3,3’5,5'tetrametil-benzidina 4,2 mlVI e dimetilformamida a 40%) para cada múltiplo de duas faixas da placa de microcavidades com 8 cavidades (16 testes). O Substrato utilizado na operação é preparado não mais do que 3 horas antes de ser utilizado e é mantido ao abrigo da luz solar directa. Acrescenta-se a cada cavidade da placa que está a ser testada uma quantidade de 10 pL de substrato utilizado na operação (mistura dos Substratos A e B). Depois tapa-se a placa e deixa-se a incubar ao abrigo da luz (no escuro), durante 10 minutos à temperatura ambiente (20°C a 25°C).

Junta-se a cada cavidade que está a ser testada 100 pL de reagente de paragem (H2S04 a 5%). Uma hora após a adição do reagente de paragem lê-se a absorvência de cada cavidade a 450 nm. De um modo geral considera-se como sendo um sinal positivo uma absorvência que seja pelo menos 3 vezes superior ao nível espontâneo, com a medição efectuada ao amplificar-se por RCP uma amostra que não tenha nenhum ADN.

Exemplo 2

Sensibilidade da Detecção

Para se avaliar a sensibilidade do ensaio de detecção amplificou-se e testou-se quantidades conhecidas de ADN relevante purificado, retirado do tipo 2 de VHS de T. pallidum e de H. ducreyi, praticando para tal os ensaios de hibridação em placas de microcavidades, conforme descrito no exemplo 1.

As amplificações foram conseguidas a partir de amostras que continham o ADN plas-mídico construído de forma a conter uma das sequências relevantes. Efectuou-se a purificação dos ADN plasmídicos e quantificou-se para que fosse possível acrescentar a cada uma das reacções um número conhecido de cópias. Antes da amplificação efectuou-se a linearização dos plasmídeos, utilizando para tal uma enzima de restrição que corta o plasmídeo num único local. Efectuou-se cada amplificação numa mistura de reacçào que continha a totalidade dos três pares de iniciadores, independentemente da sequência relevante destinatária que se pretendia amplificar. Avaliou-se a sensibilidade da detecção quer em amplificações em que cada sequência relevante estava presente apenas por si só quer em amplificações em que havia as três sequências relevantes em concentrações iguais. As amplificações foram executadas utilizando plasmídeos linearizados e diluídos até uma concentração compreendida entre 10'2 e 107 cópias. Foram efectuadas ainda outras amplificações para se determinar a sensibilidade do ensaio para cada sequência relevante, quando amplificada na presença das outras duas sequências também visadas, cada uma delas na concentração de 107 cópias por reacção.

Nas amplificações em que havia apenas uma sequência relevante para amplificar, cada uma dessas sequências foi amplificada com êxito e detectada desde uma concentração inicial de 1 a 10 cópias por reacção. De igual modo, nas amplificações em que se juntou a cada reacção o mesmo número de cópias de cada uma das três sequências relevantes, a amplificação e a detecção de cada uma dessas sequências foi realizada com êxito desde uma concentração inicial compreendida entre 1 e 10 cópias por reacção. Nas amplificações em que se juntou 10 cópias de uma sequência relevante a uma reacção que continha 107 cópias de ADN proveniente de cada um dos outros dois organismos, embora a intensidade do sinal detectado fosse menor, realizou-se em cada caso com êxito a amplificação e a detecção da sequência relevante para uma concentração de 10 cópias.

Exemplo 3 Especificidade

Avaliou-se a especificidade do ensaio de detecção descrito no Exemplo 1 utilizando para tal amostras provenientes de um grande número de organismos, preparadas essencialmente

J 27^ conforme descrito no Exemplo 1. Os organismos seleccionados para as experiências eram microrganismos comensais e patogénicos que podem ser encontrados no tracto genitourinário, organismos pertencentes à flora normal da pele e organismos estreitamente afins das espécies relevantes visadas. Além disso, foram utilizadas 10 estirpes de H. ducreyi, representativas dos 10 ribotipos conhecidos de ARN de 16S, obtidas na instituição ‘Center for Disease Control’, tendo sido testadas para se garantir que o ensaio podia permitir a detecção de todos os ribotipos conhecidos.

As amostras das leveduras e das bactérias testadas eram constituídas por massas celulares que continham pelo menos 107 células. Para as amplificações virais, as amostras utilizadas foram isolados virais retirados de culturas celulares. As amostras das leveduras e das bactérias testadas foram misturadas pór centrifugação e lavadas uma vez com 1 mL de STP. As amostras foram novamente colocadas em suspensão em 0,5 mL de STM e congeladas em aliquotas de 0,1 mL. Para se efectuar a amplificação as aliquotas foram descongeladas, diluídas em 0.1 mL de DS, tendo sido acrescentados 50 uL à mistura de reacção. Para todas as amostras acrescentou-se à mistura de RCP pelo menos 104 cópias do ADN do organismo.

As amostras amplificadas foram analisadas por electroforese em gel e por hibridaçao, utilizando para tal sondas hibridantes específicas das sequências, conforme descrito supra. Os resultados das experiências estão indicados a seguir. A presença ou a ausência de produto da amplificação, identificada respectivamente por “+” ou na detecção feita por electroforese em gel, estão indicadas na coluna designada por “amplificação”. De igual modo, a detecção por hibridação com a sonda hibridante está indicada na coluna marcada com as designações das sondas utilizadas anteriormente. As estirpes representativas dos 10 ribotipos de H. ducreyi estão marcadas com a designação atribuída pela instituição ‘Center for Disease Control’. Os organismos para os quais o ensaio foi concebido com a finalidade de os amplificar e detectar estão escritos a negrito.

Especificidade KS54

Amplificação KQ15 KQ17

BACTÉR1A/LEVEDURA

Achromobacter xerosis - - -

Acinetobacter calcoaceticus - -

Acinetobacter rwolfi - -

Actinomyçes isrealii - - -

Aerococcus viridans

Aeromonas hydrophila - -

Agrobacterium radiobacter -

Alcaligenes dentrificans - -

Alcaligenes faecalis -

Bacillus siibtilis - -

Bacteroides fragilis - -

Bifidobacterium adolescentis -

Borre lia bargdorjeri - -

Branhamela catarrhalis -

Brevibacterium linens - - -

Campylobacterfetiis - -

Campylobacterjejuni - -

Candida albicans - - -

Candida glabrata

Candida gnilliemiondii -

Candida krnisii -

Candida parapsilosis - -

Candida tropicalis - - -

Chlamydia trachomaiis -

Amplificação

Chmmobacter violaceum Citrobacterfreundii Closíridiiim innocmtm Clostridium perfringeris Corynebacterium genitalium Corynebacterium pseudotuberciilosis Corynebacterium xerosis Cryptococcns neoformans Deinococcns radiopugncms Derxia gnmmosa Echvardsiella tarda Eikenella corrodens Entercoccus faecalis Entercoccus avinm Enterobacter cloacae Enterococcus facinm Erysipelothrix rhusiopathiae Escherichia coli

Flavobacterium meningosepticnm Gardnerella vaginalis Haemophilus aegypticus Haemophihis aphrophilus Haemophilus ducreyi 30 ATCC 27721 Amplificação + K015 + K017 KS54 ATCC 27721 + + - - ATCC 33940 + + - - ribotipos: CDC# 174 + + - - 175 + + - - 176 + + - - 178 + + - - 179 + + - - 181 + + - - 182 + + - - 186 „ + + - - 187 + + - - 189 + + - - Haemophilus haemoglobinophilus - - - - Haemophihis haemolyticus - - - - Haemophilus influenzae - - - - Haemophihis paracimiculus - - - - Haemophihis parahaemolyticus - - - - Haemophihis parainfluenzae - - - Haemophihis segnis - - - “ Kingella kingae - - - Klebsiella pneumoniae - - - “ Lactobacillus casei - - - - Lactococcus lactis cremoris - - - - Lactococcus lactis lactis - - - Legionella pneumophila - - - - Micrococcus luteiis - - - - Mycoplasma pneumoniae - - - - Mycoplasma genitalium - - - - -7 -7 CK.

Amplificação KQ15 KQ17 KS54

Mycoplasma hominis - '

Neisseria gonorrhoeae - ~

Neisseria meningitidis - ' '

Peptostreptococcus anaerobícns - -

Propionibacterium acnes - "

Proteus mirabilis ·

Pseudomonas aeruginosa - -

Staphylococcus aureus - ‘

Staphylococcus epidermidus - - .

Streptococcus agalactiae

Streptococcas mitns - "

Streptococcus mutans - '

Streptococcus pneumoniae - -

Streptococcus pyogenes - "

Streptococcus sanguis - -

Treponema pallidum + - + -

Ureaplasma urealyticum - ~

Vibrio parahaemolyticus ~ ~

Yersinia enterocolitica - ~

VIRUS

CMV

VEB

HHV-VI

V 16 PH

V 18 PH VIHS VIfflS vvz

Não foram observadas nenhumas amplificações não específicas; apenas foi amplificado o ADN proveniente das sequências visadas, designadamente de VHS, T. pallidum e H. ducreyi. Além do mais, todas as estirpes dos organismos relevantes visados foram amplificadas com êxito. A detecção e a amplificação do produto amplificado foram executadas com êxito por hibridação com a sonda hibridante. O ensaio de co-amplificação e hibridação constitui um método rigoroso para detectar e identificar o VHS, o T. pallidum e o H. ducreyi, mesmo em amostras co-infectadas com outros organismos distintos.

3

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: F. Hoffinann-La Roehe AG (B) RUA: Grenzacherstr. 124 (C) CIDADE: Basel (D) ESTADO: Basel City (E) PAÍS. Suíça (F) CÓDIGO POSTAL: 4002 (G) TELEFONE: 061 688 27 08 (H) TELEFAX. 061 688 13 95 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Métodos e reagentes para a detecção do vírus Herpes simplex, de Treponema pallidum e de Hciemophilus ducreyf" (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (vi) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/243 544 (B) DATA DE DEPÓSITO: 16-MAIO-1994 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l TTCAAGGCCA CCATGTACTA CAAAGACGT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l GCCGTAAAAC GGGGACATGT ACACAAAGT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3 GCCAACGCCG CGACCCGCAC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: CAAGCCGGCG AAGGTCGCCA CG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: GGTCTCGTGG TCGTCCCGGT GAAA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: GAAGTTTGTC CCAGTTGCGG TT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO, simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 36 36

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: CAGAGCCATC AGCCCTTTTC A (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO, simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: CGGGCTCTCC ATGCTGCTTA CCTTA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:9: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: TCGTGCGGGC TCTCCATGCT GCTTA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA. ADN (genómico) 21 25

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10 CAAGTCGAAC GGTAGCACGA AG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11 TTCTGTGACT AACGTCAATC AATTTTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA. ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12 CCGAAGGTCC CACCCTTTAA TCCGA 2000

Lisboa, 7 de Novembro

Claims (13)

1. Reivindicações 1. Par de iniciadores oligonucleotídicos para a amplificação de ácido nucleico de Treponema pallidum, em que o referido par de iniciadores permite a amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, de uma região do gene imunogénico da membrana de 47 kDa do Treponema pallidum, sendo o referido par de iniciadores constituído por K.03A (SEQ ÍD N° 6) e K04 (SEQ LD N° 7).
2. 2. Par de iniciadores oligonucleotídicos para a amplificação de ácido nucleico de Haemophilus ducreyi, em que o referido par de iniciadores permite a amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, de uma região do gene de ARN ribossómico 16S de Haemophilus ducreyi, sendo o referido par de iniciadores constituído por K07A (SEQ ID N° 10) e K08A (SEQ ID N° 11).
3. 3. Conjunto de iniciadores oligonucleotídicos para amplificação de ácido nucleico de Treponema pallidum e de Haemophilus ducreyi, utilizando uma única reacção em cadeia com polimerase, sendo o referido conjunto constituído por: (a) um par de iniciadores para a amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, de uma região do gene imunogénico da membrana de 47 kDa do Treponema pallidum, sendo o referido par de iniciadores constituído por K03A (SEQ ID N° 6) e K04 (SEQ ID N° 7); e (b) um par de iniciadores oligonucleotídicos para a amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, de uma região do gene de ARN ribossómico 16S de Haemophilus 2 ducreyi, sendo o referido par de iniciadores constituído por K07A (SEQ ID N° 10) e K08A (SEQ ID N° 11).
4. 4. Sonda hibridante oligonucleotídica para detectar e identificar ácido nucleico de Treponema pallicliim, em que a referida sonda híbrida, em condições específicas da sequência, com uma região do gene imunogénico da membrana de 47 kDa de Treponema pallidum, em que a referida sonda hibridante é seleccionada entre o conjunto constituído por K017 (SEQ ID N° 8) e KOI8 (SEQ LD N° 9) e seus complementos.
5. 5. Sonda hibridante oligonucleotídica para detectar e identificar ácido nucleico de Haemophilus ducreyi, em que a referida sonda híbrida, em condições específicas da sequência, com uma região do gene de ARN ribossómico 16S de Haemophilus ducreyi, em que a referida sonda hibridante é KOI5 (SEQ ID N° 12) ou o seu complemento.
6. 6. Conjunto de oligonucleótidos para amplificar, detectar e identificar ácido nucleico de Treponema pallidum, em que o referido conjunto é constituído por: (a) um par de iniciadores para a amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, de uma região do gene imunogénico da membrana de 47 kDa de Treponema pallidum, em que o referido par de iniciadores é constituído por K03A (SEQ ID N° 6) e K04 (SEQ ID N° 7); e (b) uma sonda hibridante oligonucleotídica para detectar e identificar o ácido nucleico de Treponema pallidum, em que a referida sonda híbrida, em condições de hibridação específicas da sequência, com uma região do gene imunogénico da membrana de 47 kDa de

   3 Treponema pallidum, sendo a referida sonda hibridante seleccionada entre o conjunto constituído por KOI7 (SEQID N° 8) e KOI8 (SEQ ID N° 19) e seu complementos.
7. 7. Conjunto de oligonucleótidos para amplificar, detectar e identificar ácido nucleico de Haemophilus ducreyi, em que o referido conjunto é constituído por: (a) um par de iniciadores oligonucleotídicos para a amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, de uma região do gene de ARN ribossómico 16S de Haemophilus ducreyi, sendo o referido par de iniciadores constituído por K07A (SEQ DD N° 10) e K08A (SEQ ID N° 11); e (b) uma sonda hibridante oligonucleotídica para detectar e identificar ácido nucleico de Haemophilus ducreyi, em que a referida sonda híbrida, em condições de hibridação específicas da sequência, com uma região do gene de ARN ribossómico 16S de Haemophilus ducreyi, em que a referida sonda hibridante é KOI5 (SEQ ID N° 12) ou o seu complemento.
8. 8. Conjunto de oligonucleótidos para amplificar, detectar e identificar ácido nucleico de Treponema pallidum e Haemophilus ducreyi, utilizando uma única reacção em cadeia com polimerase, em que o referido conjunto é constituído por: (a) um par de iniciadores para a amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, de uma região do gene imunogénico da membrana de 47 kDa de Treponema pallidum, em que o referido par de iniciadores é constituído por K03A (SEQ ID N° 6) e K04 (SEQ ID N° 7); e (b) uma sonda hibridante oligonucleotídica para detectar e identificar o ácido nucleico de Treponema pallidum, em que a referida sonda híbrida, em condições de hibridação 4 específicas da sequência, com uma região do gene imunogénico da membrana de 47 kDa de Treponema pallidum, sendo a referida sonda hibridante seleccionada entre o conjunto constituído por KOI7 (SEQ DD N° 8) e KOI8 (SEQID N° 19) e seu complementos; (c) um par de iniciadores oligonucleotídicos para a amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, de uma região do gene de ARN ribossómico 16S de Haemophilus ducreyi, sendo o referido par de iniciadores constituído por K07A (SEQ ED N° 10) e K08A (SEQ ID N° 11); e (d) uma sonda hibridante oligonucleotídica para detectar e identificar ácido nucleico de Haemophilus ducreyi, em que a referida sonda híbrida, em condições de hibridação específicas da sequência, com uma região do gene de ARN ribossómico 16S de Haemophilus ducreyi, em que a referida sonda hibridante é KOI5 (SEQ ID N° 12) ou o seu complemento.
9. 9. Método para detectar e identificar ácido nucleico de Treponema pallidum contido numa amostra, em que o referido método compreende os passos seguintes: (a) misturar a referida amostra com uma mistura de reacção em cadeia com polimerase, que contenha os iniciadores da reivindicação 1; (b) submeter a referida mistura de reacção em cadeia com polimerase a condições em que seja amplificado o ácido nucleico de Treponema pallidum-, e (c) detectar a presença das sequências do ácido nucleico amplificado.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido passo (c) consiste em misturar com uma sonda oligonucleotídica a referida mistura de reacção em cadeia com polimerase, sendo essa sonda seleccionada entre o conjunto constituído por KOI7 (SEQ

    5 ID N° 8), K018 (SEQ CD N° 9) e seus complementos, em condições de hibridação específicas da sequência, e em detectar a presença da referida sonda hibridada com o referido ácido nucleico amplificado.
11. 11. Método para detectar e identificar ácido nucleico de Haemophilus ducreyi contido numa amostra, em que o referido método compreende os passos seguintes: (a) misturar a referida amostra com uma mistura de reacção em cadeia com polimerase que contenha os iniciadores da reivindicação 2; (b) submeter a referida mistura de reacção em cadeia com polimerase a condições em que seja amplificado o ácido nucleico de Haemophilus ducreyi; e (c) detectar a presença das sequências do ácido nucleico amplificado.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o referido passo (c) consiste em misturar com uma sonda oligonucleotídica a referida mistura de reacção em cadeia com polimerase, em que a referida sonda seleccionada é KOI5 (SEQ ID N° 12) ou o seu complemento, em condições de hibridação específicas da sequência, e em detectar a presença da referida sonda hibridada com o referido ácido nucleico amplificado.
13. 13. Método para detectar e identificar ácido nucleico de Treponema pallidum contido numa amostra, em que o referido método compreende os passos seguintes: (a) misturar a referida amostra com uma mistura de reacção em cadeia com polimerase que contenha os iniciadores da reivindicação 3; (b) submeter a referida mistura de reacção em cadeia com polimerase a condições em que seja amplificado o ácido nucleico de Treponema pallidum; e

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    Resumo ‘Detecção de Treponema pallidum e Haemophilus ducreyi A presente invenção proporciona métodos e reagentes para detectar e identificar quatro agentes causadores de ulcerações genitais, designadamente os vírus de tipo 1 e 2 do herpes simplex (VHS), Treponema pallidum e Haemophilus ducreyi. Nesses métodos são utilizados iniciadores específicos das sequências que permitem a amplificação por reacção em cadeia com polimerase, simultaneamente das sequências de ácido nucleico dos tipos 1 e 2 de VHS, de I pallidum e de H. ducreyi. A seguir à amplificação as sondas oligonucleotídicas específicas das sequências são utilizadas para detectar e distinguir os ácidos nucleicos dos tipos 1 e 2 de VHS, T. pallidum e de H. ducreyi. Lisboa, 7 de Novembro de 2000