JPH0870874A - 部位特異的変異導入方法 - Google Patents
部位特異的変異導入方法Info
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- JPH0870874A JPH0870874A JP6234489A JP23448994A JPH0870874A JP H0870874 A JPH0870874 A JP H0870874A JP 6234489 A JP6234489 A JP 6234489A JP 23448994 A JP23448994 A JP 23448994A JP H0870874 A JPH0870874 A JP H0870874A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 より簡便な部位特異的変異導入方法、及び該
方法を実施するためのキットを提供する。 【構成】 ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主細胞内で変
異を導入する部位特異的変異導入方法。ＤＮＡの修復系
を誘導させた宿主細胞を含む部位特異的変異導入用キッ
ト。宿主細胞の例には、ＤＮＡの修復系を誘導させた大
腸菌がある。
方法を実施するためのキットを提供する。 【構成】 ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主細胞内で変
異を導入する部位特異的変異導入方法。ＤＮＡの修復系
を誘導させた宿主細胞を含む部位特異的変異導入用キッ
ト。宿主細胞の例には、ＤＮＡの修復系を誘導させた大
腸菌がある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学において使用
される部位特異的変異導入（Site-directedmutagenesi
s)をより一層簡素化するための方法、及びそれに使用す
るキットに関する。
される部位特異的変異導入（Site-directedmutagenesi
s)をより一層簡素化するための方法、及びそれに使用す
るキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、部位特異的変異導入は、遺伝子工
学の分野においてクローニングした遺伝子の構造と機能
の関係を明らかにするためには最低限必要な技術であ
り、またタンパク質工学の分野においてもタンパク質を
改変し、その特性を変化させるにはなくてはならない技
術である。従来部位特異的変異導入は、例えば以下のよ
うな手順で行われていた： 目的の変異を導入したいＤＮＡをベクターに挿入し
た後、２本鎖プラスミドＤＮＡの場合、熱変性させて相
補鎖を解離させるか、又はＭ１３系のファージベクター
を用いるかして、１本鎖ＤＮＡを調製する。 目的の変異のとおりに化学合成されたオリゴヌクレ
オチド（変異導入用プライマー）を上記の一本鎖ＤＮＡ
にアニーリングさせた後、ポリメラーゼ反応とリガーゼ
反応によりインビトロ（in vitro) 系で目的の変異以外
は相補的な２本鎖ＤＮＡを調製する。 上記ＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、変異が導
入されたクローンを選択する。 しかしながらこのような手順そのままでは相補鎖の片方
だけに変異が導入されているため、大腸菌に導入後、複
製を経て必然的に変異の導入されていないクローンが生
じる。その結果、変異が導入されたクローンが得られる
割合は低くなる。そこでこの割合を高くするために、
の工程において変異が導入されていないＤＮＡが導入さ
れたクローンは生育しないように選択的に除く工夫がな
されてきた。例えばアンバー変異、異なった制限修飾
系、ｄｕｔ（dUTPase)とｕｎｇ（ウラシル−ＤＮＡグリ
コシダーゼ）変異の利用等である。しかしながらこのよ
うな部位特異的変異導入法はかなり手順が複雑でありか
なり手間のかかるものである。
学の分野においてクローニングした遺伝子の構造と機能
の関係を明らかにするためには最低限必要な技術であ
り、またタンパク質工学の分野においてもタンパク質を
改変し、その特性を変化させるにはなくてはならない技
術である。従来部位特異的変異導入は、例えば以下のよ
うな手順で行われていた： 目的の変異を導入したいＤＮＡをベクターに挿入し
た後、２本鎖プラスミドＤＮＡの場合、熱変性させて相
補鎖を解離させるか、又はＭ１３系のファージベクター
を用いるかして、１本鎖ＤＮＡを調製する。 目的の変異のとおりに化学合成されたオリゴヌクレ
オチド（変異導入用プライマー）を上記の一本鎖ＤＮＡ
にアニーリングさせた後、ポリメラーゼ反応とリガーゼ
反応によりインビトロ（in vitro) 系で目的の変異以外
は相補的な２本鎖ＤＮＡを調製する。 上記ＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、変異が導
入されたクローンを選択する。 しかしながらこのような手順そのままでは相補鎖の片方
だけに変異が導入されているため、大腸菌に導入後、複
製を経て必然的に変異の導入されていないクローンが生
じる。その結果、変異が導入されたクローンが得られる
割合は低くなる。そこでこの割合を高くするために、
の工程において変異が導入されていないＤＮＡが導入さ
れたクローンは生育しないように選択的に除く工夫がな
されてきた。例えばアンバー変異、異なった制限修飾
系、ｄｕｔ（dUTPase)とｕｎｇ（ウラシル−ＤＮＡグリ
コシダーゼ）変異の利用等である。しかしながらこのよ
うな部位特異的変異導入法はかなり手順が複雑でありか
なり手間のかかるものである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、より
簡便な部位特異的変異導入方法、及び該方法を実施する
ためのキットを提供することにある。
簡便な部位特異的変異導入方法、及び該方法を実施する
ためのキットを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は部位特異的変異導入方法に関し、Ｄ
ＮＡの修復系を誘導させた宿主細胞内で変異を導入する
ことを特徴とする。本発明の第２の発明は部位特異的変
異導入用キットに関し、ＤＮＡの修復系を誘導させた宿
主細胞を含むことを特徴とする。
発明の第１の発明は部位特異的変異導入方法に関し、Ｄ
ＮＡの修復系を誘導させた宿主細胞内で変異を導入する
ことを特徴とする。本発明の第２の発明は部位特異的変
異導入用キットに関し、ＤＮＡの修復系を誘導させた宿
主細胞を含むことを特徴とする。
【０００５】本発明者らは、ＤＮＡの修復系を誘導させ
た大腸菌が、プラスミドの相同的組換えを起こした鎖の
みを優先的に複製することを見出し、宿主細胞内で効率
よく部位特異的変異を導入する方法を開発した。更に、
該方法による部位特異的変異を簡便に行うためのキット
を構築し、本発明を完成した。
た大腸菌が、プラスミドの相同的組換えを起こした鎖の
みを優先的に複製することを見出し、宿主細胞内で効率
よく部位特異的変異を導入する方法を開発した。更に、
該方法による部位特異的変異を簡便に行うためのキット
を構築し、本発明を完成した。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
使用される宿主細胞としては、ＤＮＡの修復系を誘導さ
せた大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、植物細胞、動物
細胞などで宿主−ベクター系が確立している細胞であれ
ばよいが、取扱いが容易な大腸菌が好ましく用いられ
る。
使用される宿主細胞としては、ＤＮＡの修復系を誘導さ
せた大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、植物細胞、動物
細胞などで宿主−ベクター系が確立している細胞であれ
ばよいが、取扱いが容易な大腸菌が好ましく用いられ
る。
【０００７】以下、宿主細胞として大腸菌を使用する例
を中心に説明する。大腸菌を宿主細胞とする本発明の方
法による部位特異的変異導入は、例えば、以下の工程に
よって行うことができる。 （１）ＤＮＡの修復系（ＳＯＳ修復）が誘導されるよう
な処理を、宿主大腸菌に施す。 （２）（１）で調製した宿主大腸菌に、部位特異的変異
導入の標的となるＤＮＡを挿入したベクターと変異導入
用ＤＮＡを導入する。 （３）（２）で調製した形質転換体を培養し、プラスミ
ドを複製させる。このとき、相同的組換えを起こして変
異が導入された鎖のみが優先的に複製する。 （４）プラスミドを抽出し、変異が導入されたＤＮＡを
得る。
を中心に説明する。大腸菌を宿主細胞とする本発明の方
法による部位特異的変異導入は、例えば、以下の工程に
よって行うことができる。 （１）ＤＮＡの修復系（ＳＯＳ修復）が誘導されるよう
な処理を、宿主大腸菌に施す。 （２）（１）で調製した宿主大腸菌に、部位特異的変異
導入の標的となるＤＮＡを挿入したベクターと変異導入
用ＤＮＡを導入する。 （３）（２）で調製した形質転換体を培養し、プラスミ
ドを複製させる。このとき、相同的組換えを起こして変
異が導入された鎖のみが優先的に複製する。 （４）プラスミドを抽出し、変異が導入されたＤＮＡを
得る。
【０００８】（１）で用いる宿主大腸菌は、ＳＯＳ修復
が正常に機能する菌株が用いられ、好ましくはＳＯＳ修
復に関与する代表的な遺伝子であるｒｅｃＡ遺伝子が正
常に機能するｒｅｃＡ+ の菌株が用いられる。ｒｅｃＡ
+ の菌株としては、ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、Ｃ６０
０、ＪＭ１０１、ＲＲ１等が挙げられる。
が正常に機能する菌株が用いられ、好ましくはＳＯＳ修
復に関与する代表的な遺伝子であるｒｅｃＡ遺伝子が正
常に機能するｒｅｃＡ+ の菌株が用いられる。ｒｅｃＡ
+ の菌株としては、ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、Ｃ６０
０、ＪＭ１０１、ＲＲ１等が挙げられる。
【０００９】ＤＮＡの修復系を誘導する処理とは、例え
ば、ＤＮＡに損傷を与えるような処理であり、紫外線照
射や薬剤による処理が挙げられる。薬剤としては、メタ
ンスルホン酸メチル、メタンスルホン酸エチル等のアル
キル化剤や、ナリジクス酸等のＤＮＡ複製阻害剤が挙げ
られる。
ば、ＤＮＡに損傷を与えるような処理であり、紫外線照
射や薬剤による処理が挙げられる。薬剤としては、メタ
ンスルホン酸メチル、メタンスルホン酸エチル等のアル
キル化剤や、ナリジクス酸等のＤＮＡ複製阻害剤が挙げ
られる。
【００１０】（２）で用いるベクターは何でもよく、例
えば大腸菌でよく使用されるｐＵＣ系、ｐＢＲ系、Ｍ１
３系のベクターを用いることができる。
えば大腸菌でよく使用されるｐＵＣ系、ｐＢＲ系、Ｍ１
３系のベクターを用いることができる。
【００１１】変異導入用ＤＮＡとは目的の変異を含む天
然又は人工のＤＮＡであり、例えば、一本鎖の合成オリ
ゴヌクレオチドを用いることができる。オリゴヌクレオ
チドの長さとしては目的の配列に安定にハイブリダイズ
するものであればよいが、２０ｍｅｒ以上が一般的であ
る。変異導入用ＤＮＡとしてＰＣＲ産物等の長鎖ＤＮＡ
を用いることによって、更に高い効率で部位特異的変異
導入を行うことができる。例えば、目的の変異を含むオ
リゴヌクレオチドとベクターの別の箇所に相補的なオリ
ゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、該
ＰＣＲ産物を変異導入用ＤＮＡとして用いる。このよう
にすれば、化学合成が難しい長鎖ＤＮＡを簡単に調製で
きる。長鎖ＤＮＡの長さは、より長い方が安定した効率
が得られる。この方法は、オリゴヌクレオチドではハイ
ブリダイズが不安定な場合、目的の変異導入部位以外に
オリゴヌクレオチドと相補性が高い部位があるために目
的の変異が導入できない場合、形質転換効率の低い宿主
大腸菌を用いる場合等に特に有効である。
然又は人工のＤＮＡであり、例えば、一本鎖の合成オリ
ゴヌクレオチドを用いることができる。オリゴヌクレオ
チドの長さとしては目的の配列に安定にハイブリダイズ
するものであればよいが、２０ｍｅｒ以上が一般的であ
る。変異導入用ＤＮＡとしてＰＣＲ産物等の長鎖ＤＮＡ
を用いることによって、更に高い効率で部位特異的変異
導入を行うことができる。例えば、目的の変異を含むオ
リゴヌクレオチドとベクターの別の箇所に相補的なオリ
ゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、該
ＰＣＲ産物を変異導入用ＤＮＡとして用いる。このよう
にすれば、化学合成が難しい長鎖ＤＮＡを簡単に調製で
きる。長鎖ＤＮＡの長さは、より長い方が安定した効率
が得られる。この方法は、オリゴヌクレオチドではハイ
ブリダイズが不安定な場合、目的の変異導入部位以外に
オリゴヌクレオチドと相補性が高い部位があるために目
的の変異が導入できない場合、形質転換効率の低い宿主
大腸菌を用いる場合等に特に有効である。
【００１２】宿主大腸菌にＤＮＡを導入する方法として
は、高い形質転換効率が得られる方法で、例えば、エレ
クトロポレーションが好ましく用いられる。
は、高い形質転換効率が得られる方法で、例えば、エレ
クトロポレーションが好ましく用いられる。
【００１３】次に、（３）でプラスミドを複製させる。
通常、このような場合、同一菌体内に変異が導入された
プラスミドと導入されていないプラスミドが混在すると
考えられる。しかしながら、本発明者らの実験によれ
ば、変異が導入された鎖のみが優先的に複製され、同一
菌体内に変異が導入されていないプラスミドが混在する
ことはなかった。したがって、この方法によれば、従来
のようにアンバー変異等を利用して変異の導入されたプ
ラスミドのみを選択する必要がない。このため使用でき
る宿主大腸菌やベクターの選択の幅が広い。
通常、このような場合、同一菌体内に変異が導入された
プラスミドと導入されていないプラスミドが混在すると
考えられる。しかしながら、本発明者らの実験によれ
ば、変異が導入された鎖のみが優先的に複製され、同一
菌体内に変異が導入されていないプラスミドが混在する
ことはなかった。したがって、この方法によれば、従来
のようにアンバー変異等を利用して変異の導入されたプ
ラスミドのみを選択する必要がない。このため使用でき
る宿主大腸菌やベクターの選択の幅が広い。
【００１４】本発明の方法では、２本鎖ベクターをその
まま用いるため、従来のようにファージ感染や変性処理
等による１本鎖ＤＮＡの調製を必要としない。更にアニ
ーリングの工程や、ポリメラーゼ反応、リガーゼ反応と
いった酵素触媒による反応工程も必要としない。更に前
述のように変異の導入されたプラスミドのみを選択する
工程も必要としない。ＤＮＡ修復に関与するタンパク質
を用いてインビトロで相同的組換えを起こさせることに
よって、部位特異的変異を導入することもできる。例え
ば、ＡＴＰ存在下で、標的となるＤＮＡを挿入したベク
ターと変異導入用ＤＮＡに、ＤＮＡ修復に関与する代表
的なタンパク質の１つであるＲｅｃＡタンパク質をイン
ビトロで作用させて相同的組換えを起こさせて、部位特
異的変異を導入する。その後、宿主細胞に導入してプラ
スミドを複製させて、変異が導入したプラスミドを選択
すればよい。
まま用いるため、従来のようにファージ感染や変性処理
等による１本鎖ＤＮＡの調製を必要としない。更にアニ
ーリングの工程や、ポリメラーゼ反応、リガーゼ反応と
いった酵素触媒による反応工程も必要としない。更に前
述のように変異の導入されたプラスミドのみを選択する
工程も必要としない。ＤＮＡ修復に関与するタンパク質
を用いてインビトロで相同的組換えを起こさせることに
よって、部位特異的変異を導入することもできる。例え
ば、ＡＴＰ存在下で、標的となるＤＮＡを挿入したベク
ターと変異導入用ＤＮＡに、ＤＮＡ修復に関与する代表
的なタンパク質の１つであるＲｅｃＡタンパク質をイン
ビトロで作用させて相同的組換えを起こさせて、部位特
異的変異を導入する。その後、宿主細胞に導入してプラ
スミドを複製させて、変異が導入したプラスミドを選択
すればよい。
【００１５】本発明の方法は、用いる宿主細胞等をまと
めてキットとすることによって、更に簡便に行うことが
できる。キットは、少なくともＤＮＡの修復系が誘導さ
れた宿主細胞を含んでいればよいが、ほかにベクターな
どを含んでいてもよい。
めてキットとすることによって、更に簡便に行うことが
できる。キットは、少なくともＤＮＡの修復系が誘導さ
れた宿主細胞を含んでいればよいが、ほかにベクターな
どを含んでいてもよい。
【００１６】
【実施例】以下に、実施例をもって本発明を更に詳細に
説明するが、これらの実施例は本発明を何ら限定するも
のではない。
説明するが、これらの実施例は本発明を何ら限定するも
のではない。
【００１７】実施例１ オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入 （１）ｐＵＣ１９−Ｍｕｔの構築 以下の実施例に用いるプラスミドとして、ｐＵＣ１９の
ｌａｃＺ’遺伝子内のポリクローニングサイトの下流３
０番目のＧをＡに変換したプラスミドｐＵＣ１９−Ｍｕ
ｔを構築した。ｌａｃＺ’遺伝子はｌａｃＺα−ペプチ
ドをコードしており、この遺伝子をｌａｃＺΔＭ１５の
遺伝子型をもつ宿主菌に導入するとβ−ガラクトシダー
ゼの活性を生じる。したがって、塩基置換のされていな
いｌａｃＺ’遺伝子ではＩＰＴＧ存在下でＸ−ｇａｌを
基質とした反応により生育コロニーは青くなる。逆に、
塩基置換された変異型ｌａｃＺ’遺伝子では本来の活性
を生じることができず生育コロニーは白くなる。このこ
とを利用して、ｐＵＣ１９−Ｍｕｔの変異型ｌａｃＺ’
遺伝子の塩基置換を部位特異的変異導入によって復帰さ
せたときの効率を、青コロニー、白コロニーの数から算
出することができる。
ｌａｃＺ’遺伝子内のポリクローニングサイトの下流３
０番目のＧをＡに変換したプラスミドｐＵＣ１９−Ｍｕ
ｔを構築した。ｌａｃＺ’遺伝子はｌａｃＺα−ペプチ
ドをコードしており、この遺伝子をｌａｃＺΔＭ１５の
遺伝子型をもつ宿主菌に導入するとβ−ガラクトシダー
ゼの活性を生じる。したがって、塩基置換のされていな
いｌａｃＺ’遺伝子ではＩＰＴＧ存在下でＸ−ｇａｌを
基質とした反応により生育コロニーは青くなる。逆に、
塩基置換された変異型ｌａｃＺ’遺伝子では本来の活性
を生じることができず生育コロニーは白くなる。このこ
とを利用して、ｐＵＣ１９−Ｍｕｔの変異型ｌａｃＺ’
遺伝子の塩基置換を部位特異的変異導入によって復帰さ
せたときの効率を、青コロニー、白コロニーの数から算
出することができる。
【００１８】（２）変異導入用ＤＮＡとなるオリゴヌク
レオチドの合成 ｌａｃＺ’遺伝子内の塩基置換部位を復帰させるための
変異導入用ＤＮＡとして、配列表の配列番号１に示され
る５’末端リン酸化オリゴヌクレオチド（ｄＲ２）を合
成した。すなわちｄＲ２は１２番目のＣによって塩基置
換が復帰し、活性型のｌａｃＺ’遺伝子になるようにデ
ザインした。
レオチドの合成 ｌａｃＺ’遺伝子内の塩基置換部位を復帰させるための
変異導入用ＤＮＡとして、配列表の配列番号１に示され
る５’末端リン酸化オリゴヌクレオチド（ｄＲ２）を合
成した。すなわちｄＲ２は１２番目のＣによって塩基置
換が復帰し、活性型のｌａｃＺ’遺伝子になるようにデ
ザインした。
【００１９】（３）宿主大腸菌の調製 下記表１に示したような処理でＤＮＡの修復系を誘導さ
せたエレクトロポレーション用の宿主（大腸菌ＢＭＨ７
１−１８ｍｕｔＳ株）を調製した。
せたエレクトロポレーション用の宿主（大腸菌ＢＭＨ７
１−１８ｍｕｔＳ株）を調製した。
【００２０】
【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 紫外線照射 メタンスルホン酸エチル ナリジクス酸 （秒） （％） （ｍＭ） 宿主Ｎｏ．１ ３０ ０．０ ０．０ 宿主Ｎｏ．２ ３０ ０．１ ０．０ 宿主Ｎｏ．３ ０ ０．１ ０．０ 宿主Ｎｏ．４ ０ ０．２ ０．０ 宿主Ｎｏ．５ ０ ０．０ １００ 宿主Ｎｏ．６ ０ ０．０ ２００ 宿主Ｎｏ．７ ０ ０．０ ０．０ ───────────────────────────────────
【００２１】ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主大腸菌は
以下のようにして調製した。大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍ
ｕｔＳ株（宝酒造）を３ｍｌのＬ−培地で６時間培養し
たものを１０3 倍希釈してＬＢ寒天培地に塗布した。そ
の後、日立殺菌ランプＧＬ１５（日立）にて５０ｃｍの
距離で３０秒間の紫外線照射を行い、３７℃で一晩暗所
中にてインキュベートし、そこで生育してきたコロニー
を１００ｍｌのＬ−培地に植菌して吸光度（６６０ｎ
ｍ）で０．８付近になるまで培養を行った。なお、メタ
ンスルホン酸エチル及びナリジクス酸で薬剤処理を行う
際には、培養中に吸光度が０．４付近になったところで
各濃度になるように添加した。その培養液を４，０００
ｒｐｍ、８分間遠心することにより菌体を集め、８００
μｌの１０％グリセリンに懸濁させ、これをエレクトロ
ポレーション用の宿主とした。
以下のようにして調製した。大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍ
ｕｔＳ株（宝酒造）を３ｍｌのＬ−培地で６時間培養し
たものを１０3 倍希釈してＬＢ寒天培地に塗布した。そ
の後、日立殺菌ランプＧＬ１５（日立）にて５０ｃｍの
距離で３０秒間の紫外線照射を行い、３７℃で一晩暗所
中にてインキュベートし、そこで生育してきたコロニー
を１００ｍｌのＬ−培地に植菌して吸光度（６６０ｎ
ｍ）で０．８付近になるまで培養を行った。なお、メタ
ンスルホン酸エチル及びナリジクス酸で薬剤処理を行う
際には、培養中に吸光度が０．４付近になったところで
各濃度になるように添加した。その培養液を４，０００
ｒｐｍ、８分間遠心することにより菌体を集め、８００
μｌの１０％グリセリンに懸濁させ、これをエレクトロ
ポレーション用の宿主とした。
【００２２】（４）宿主大腸菌への導入 エレクトロポレーションによる宿主大腸菌への導入は、
ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いて以下のよう
に行った。（３）で調製した５０μｌの宿主に対して、
ｄＲ１を１００ｐｍｏｌ／μｌ濃度になるように作成し
た溶液１μｌ及び０．１ｎｇ分のｐＵＣ１９−Ｍｕｔを
添加した。これを氷中であらかじめ冷やしておいた０．
１ｃｍ幅の専用のキュベットに注入し、１．５ｋＶのパ
ルスを印加した。直ちに１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、３
７℃で１時間振とう培養した。培養後集菌を行い、全菌
体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンとＸ−ｇａｌを含
むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベート
した。その後生育してきたコロニー数をカウントし、部
位特異的変異の効率を計算した。なおｌａｃＺ’遺伝子
内の変異部分が復帰するとコロニーは青く、しないとコ
ロニーは白くなる。結果を以下の表２に示す。
ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いて以下のよう
に行った。（３）で調製した５０μｌの宿主に対して、
ｄＲ１を１００ｐｍｏｌ／μｌ濃度になるように作成し
た溶液１μｌ及び０．１ｎｇ分のｐＵＣ１９−Ｍｕｔを
添加した。これを氷中であらかじめ冷やしておいた０．
１ｃｍ幅の専用のキュベットに注入し、１．５ｋＶのパ
ルスを印加した。直ちに１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、３
７℃で１時間振とう培養した。培養後集菌を行い、全菌
体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンとＸ−ｇａｌを含
むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベート
した。その後生育してきたコロニー数をカウントし、部
位特異的変異の効率を計算した。なおｌａｃＺ’遺伝子
内の変異部分が復帰するとコロニーは青く、しないとコ
ロニーは白くなる。結果を以下の表２に示す。
【００２３】
【表２】 表 ２ ─────────────────────────────────── 青 白 合計 （青／合計）×１００ 宿主Ｎｏ．１ １ ５ ６ １７ 宿主Ｎｏ．２ １ １ ２ ５０ 宿主Ｎｏ．３ １ １５ １６ ６．３ 宿主Ｎｏ．４ ２ ７ ９ ２２ 宿主Ｎｏ．５ １ ３ ４ ２５ 宿主Ｎｏ．６ １ １ ２ ５０ 宿主Ｎｏ．７ ０ ２３ ２３ ０ ───────────────────────────────────
【００２４】すなわち、Ｎｏ．２又は６の宿主を用いた
際に５０％の効率で部位特異的変異ミュータントが得ら
れた。
際に５０％の効率で部位特異的変異ミュータントが得ら
れた。
【００２５】（５）変異部位の解析 （４）で得られた青コロニーをアンピシリンを含む３ｍ
ｌのＬ−培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートし
た菌体よりプラスミドの抽出を行った。これを用いて大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン及びＸ−ｇ
ａｌを含むＬ−寒天培地に塗布した結果、生育してきた
コロニーはすべて青であった。更にシークエンシングを
行って変異部位塩基を解析した結果、復帰したＧのみ観
察され、Ａは全く観察されなかった。このことは、同一
菌体内でも変異が導入されたプラスミドと変異が導入さ
れていないプラスミドは混在せず、変異が導入された鎖
のみが優先的に複製されることを示している。以上のよ
うに、従来のギャップトデュプレックス法やクンケル法
では少なくとも３日を要していた部位特異的導入が、わ
ずか１日で行うことができた。
ｌのＬ−培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートし
た菌体よりプラスミドの抽出を行った。これを用いて大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン及びＸ−ｇ
ａｌを含むＬ−寒天培地に塗布した結果、生育してきた
コロニーはすべて青であった。更にシークエンシングを
行って変異部位塩基を解析した結果、復帰したＧのみ観
察され、Ａは全く観察されなかった。このことは、同一
菌体内でも変異が導入されたプラスミドと変異が導入さ
れていないプラスミドは混在せず、変異が導入された鎖
のみが優先的に複製されることを示している。以上のよ
うに、従来のギャップトデュプレックス法やクンケル法
では少なくとも３日を要していた部位特異的導入が、わ
ずか１日で行うことができた。
【００２６】実施例２ ＰＣＲ産物を用いた部位特異的変異導入 分子間の相同的組換えの場合、双方の相同配列領域が長
いほど確実に組換えることが可能である。この実施例は
ＰＣＲによって得られた長鎖の変異導入用ＤＮＡを用い
ることで、より高効率で部位特異的変異が行えることを
示す。
いほど確実に組換えることが可能である。この実施例は
ＰＣＲによって得られた長鎖の変異導入用ＤＮＡを用い
ることで、より高効率で部位特異的変異が行えることを
示す。
【００２７】（１）ＰＣＲによる変異導入用ＤＮＡの調
製 配列表の配列番号２で示される目的の変異を含むオリゴ
ヌクレオチド（ｄＲ１）と配列番号３で示される鋳型の
別の箇所に相補的なオリゴヌクレオチド（ｄＲ３）をプ
ライマー対とし、実施例１−（１）のｐＵＣ１９−Ｍｕ
ｔを鋳型として以下のようにＰＣＲを行った。反応液組
成はｐＵＣ１９−Ｍｕｔ １０ｎｇ、プライマーｄＲ１
及びｄＲ３ 各２０ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ＴＴＰ 各２００μＭ、アンプリタックＤＮＡ
ポリメラーゼ（宝酒造）２．５ユニット、トリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．４） １０ｍＭ、ＫＣｌの５０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2 ２．５ｍＭ、ゼラチン ０．０２％で、全量１
００μｌの系で、ミネラルオイル重層後、９４℃３０
秒、６０℃３０秒、７２℃１分、の条件で３０サイクル
行った。反応後、重層したミネラルオイルを除き、反応
液の１０μｌを取り電気泳動により目的のサイズのＤＮ
Ａ断片が増幅されていることを確認した。その後反応液
をマイクロコン１００（宝酒造）を用いて約１０μｌま
で濃縮・精製を行った。
製 配列表の配列番号２で示される目的の変異を含むオリゴ
ヌクレオチド（ｄＲ１）と配列番号３で示される鋳型の
別の箇所に相補的なオリゴヌクレオチド（ｄＲ３）をプ
ライマー対とし、実施例１−（１）のｐＵＣ１９−Ｍｕ
ｔを鋳型として以下のようにＰＣＲを行った。反応液組
成はｐＵＣ１９−Ｍｕｔ １０ｎｇ、プライマーｄＲ１
及びｄＲ３ 各２０ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ＴＴＰ 各２００μＭ、アンプリタックＤＮＡ
ポリメラーゼ（宝酒造）２．５ユニット、トリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．４） １０ｍＭ、ＫＣｌの５０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2 ２．５ｍＭ、ゼラチン ０．０２％で、全量１
００μｌの系で、ミネラルオイル重層後、９４℃３０
秒、６０℃３０秒、７２℃１分、の条件で３０サイクル
行った。反応後、重層したミネラルオイルを除き、反応
液の１０μｌを取り電気泳動により目的のサイズのＤＮ
Ａ断片が増幅されていることを確認した。その後反応液
をマイクロコン１００（宝酒造）を用いて約１０μｌま
で濃縮・精製を行った。
【００２８】（２）宿主大腸菌への導入 （１）で調製したＰＣＲ産物（１５６ｂｐ）１μｌとｐ
ＵＣ１９−Ｍｕｔ ０．１ｎｇ分を５０μｌの大腸菌Ｂ
ＭＨ７１−１８ｍｕｔＳと混合し、実施例１−（４）と
同様にしてエクレトロポレーションにより導入し、コロ
ニー数から部位特異的変異の効率を数値化した。ＢＭＨ
７１−１８ｍｕｔＳは実施例１−（３）で調製した宿主
Ｎｏ．２、Ｎｏ．６及びＮｏ．７を使用し、エクレトロ
ポレーションの条件は ２．２５ｋＶ、２００Ω、２
５μＦＤ、 １．５ｋＶ、１００Ω、２５μＦＤの２
種類に設定した。その結果を表３に示す。
ＵＣ１９−Ｍｕｔ ０．１ｎｇ分を５０μｌの大腸菌Ｂ
ＭＨ７１−１８ｍｕｔＳと混合し、実施例１−（４）と
同様にしてエクレトロポレーションにより導入し、コロ
ニー数から部位特異的変異の効率を数値化した。ＢＭＨ
７１−１８ｍｕｔＳは実施例１−（３）で調製した宿主
Ｎｏ．２、Ｎｏ．６及びＮｏ．７を使用し、エクレトロ
ポレーションの条件は ２．２５ｋＶ、２００Ω、２
５μＦＤ、 １．５ｋＶ、１００Ω、２５μＦＤの２
種類に設定した。その結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】 表 ３ ─────────────────────────────────── 設定条件 設定条件 宿主Ｎｏ．２ ７３／１０４（７０％） １／３（３３％） 宿主Ｎｏ．６ ８６／１４１（６１％） ２／４（５０％） 宿主Ｎｏ．７ ２／１２４（２％） ０／７（０％） （青コロニー数／総コロニー数で示した） ───────────────────────────────────
【００３０】実施例１において、短鎖の変異導入用ＤＮ
Ａを用いた場合では、変異効率はエクレトロポレーショ
ンの条件に非常に左右されやすく、設定条件によっては
１０％程度まで低下してしまう。ところがＰＣＲによる
長鎖の変異導入用ＤＮＡを用いることにより、上記に示
したとおり条件によらず比較的安定な変異効率が得ら
れ、またその値も７０％まで高めることに成功した。こ
のことから本発明方法においてＰＣＲなどの手法を利用
し、長鎖の変異導入用ＤＮＡを用いることは、より確実
に部位特異的変異を行うための有効な手段である。
Ａを用いた場合では、変異効率はエクレトロポレーショ
ンの条件に非常に左右されやすく、設定条件によっては
１０％程度まで低下してしまう。ところがＰＣＲによる
長鎖の変異導入用ＤＮＡを用いることにより、上記に示
したとおり条件によらず比較的安定な変異効率が得ら
れ、またその値も７０％まで高めることに成功した。こ
のことから本発明方法においてＰＣＲなどの手法を利用
し、長鎖の変異導入用ＤＮＡを用いることは、より確実
に部位特異的変異を行うための有効な手段である。
【００３１】実施例３ 部位特異的変異導入用キットの構築 宿主大腸菌、コントロール用のベクターとオリゴヌクレ
オチドをセットにして、部位特異的変異導入用キット
（１０回分）を構築した（表４）。なお、宿主大腸菌
（ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ）は、実施例１−（３）で
エクレトロポレーション用に調製した宿主Ｎｏ．２を用
いた。
オチドをセットにして、部位特異的変異導入用キット
（１０回分）を構築した（表４）。なお、宿主大腸菌
（ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ）は、実施例１−（３）で
エクレトロポレーション用に調製した宿主Ｎｏ．２を用
いた。
【００３２】
【表４】 表 ４ ─────────────────────────────────── ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ（１０％グリセリン溶液） ５００μｌ ｐＵＣ１９−Ｍｕｔ （１０ｎｇ／μｌ） １０μｌ ｄＲ１ （１００ｐｍｏｌ／μｌ） １０μｌ ───────────────────────────────────
【００３３】
【発明の効果】本発明により、より簡便な部位特異的変
異導入方法及び該方法に用いるためのキットが提供され
た。
異導入方法及び該方法に用いるためのキットが提供され
た。
【００３４】
【００３５】配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGGGTTTTC CCAGTCACGA CG ２２
【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGGTAACGCC AGGGTTTTCC CAGTCACGAC G ３１
【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGG ２４
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 野田 晃弘 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 中島 和男 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主細胞内
で変異を導入することを特徴とする部位特異的変異導入
方法。 - 【請求項２】 宿主細胞がＤＮＡの修復系を誘導させた
大腸菌である請求項１記載の部位特異的変異導入方法。 - 【請求項３】 請求項１記載の部位特異的変異導入方法
に用いるためのキットであって、ＤＮＡの修復系を誘導
させた宿主細胞を含むことを特徴とする部位特異的変異
導入用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23448994A JP3526326B2 (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | 部位特異的変異導入方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23448994A JP3526326B2 (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | 部位特異的変異導入方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870874A true JPH0870874A (ja) | 1996-03-19 |
| JP3526326B2 JP3526326B2 (ja) | 2004-05-10 |
Family
ID=16971834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23448994A Expired - Fee Related JP3526326B2 (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | 部位特異的変異導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3526326B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009136471A1 (ja) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | 天野エンザイム株式会社 | β－アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
| WO2010047047A1 (ja) | 2008-10-24 | 2010-04-29 | 天野エンザイム株式会社 | タンナーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
| WO2011001722A1 (ja) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | 天野エンザイム株式会社 | マルトトリオシル転移酵素及びその製造方法並びに用途 |
| WO2011007404A1 (ja) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | 天野エンザイム株式会社 | β－アミラーゼを利用した食品の改質方法 |
| WO2014042237A1 (ja) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | 天野エンザイム株式会社 | 糖質酸化酵素とその製造方法並びに用途 |
-
1994
- 1994-09-05 JP JP23448994A patent/JP3526326B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009136471A1 (ja) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | 天野エンザイム株式会社 | β－アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
| WO2010047047A1 (ja) | 2008-10-24 | 2010-04-29 | 天野エンザイム株式会社 | タンナーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
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| WO2014042237A1 (ja) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | 天野エンザイム株式会社 | 糖質酸化酵素とその製造方法並びに用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3526326B2 (ja) | 2004-05-10 |
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