TW202204631A - 肝素前體之製造方法及具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌 - Google Patents

Abstract

本發明之目標為提供一種藉由經由基因修飾具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬(the genus Escherichia)細菌提高肝素前體製造能力來高效製造肝素前體的方法。本發明係關於一種具有增加kpsS基因之表現的基因修飾且具有肝素前體製造能力的大腸桿菌屬細菌；以及一種使用該細菌製造肝素前體之方法。

Description

肝素前體之製造方法及具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌

本發明係關於一種藉由使用細菌進行醱酵製造來製造N-乙醯肝素前體(下文中被稱為肝素前體)之方法，該N-乙醯肝素前體為大腸桿菌屬(the genus Escherichia)細菌的莢膜多醣。

肝素(其為硫酸化多醣)為抗凝血劑，且用於治療血栓栓塞及瀰漫性血管內凝血症候群，並防止人工透析期間及體外循環中之凝血及其類似者。行業內，大部分使用中之肝素係自豬之腸道黏膜萃取且經純化。

在2008年由於豬源性肝素經雜質污染所發生之死亡事故，因此需要研究且研發非動物來源之製造受控及品質受控之肝素來源。作為一特定實例，醱酵製造且純化N-乙醯肝素前體(其為革蘭氏陰性(Gram-negative)微生物之莢膜多醣)的方法為化學上N-去乙醯化及N-硫酸化，隨後為酶促表異構化及硫酸化，以產生具有與來源於豬之彼等肝素相同之結構及抗凝活性的肝素(NPL 1及2)。

在上述方法中，作為基礎結構之肝素前體為由葡糖醛酸(GlcA)及N-乙醯基D-葡糖胺(GlcNAc)之重複雙醣結構構成的糖鏈。為製造肝素前體，已報導一種使用最初具有肝素前體製造能力之大腸桿菌(Escherichia coli) K5菌株之方法(PTL 1及NPL1)，一種使用亦具有肝素前體製造能力之大腸桿菌Nissle 1917菌株之方法(NPL 2)以及一種使用最初並不具有肝素前體製造能力之大腸桿菌之方法(PTL 4及NPL 3及4)。

將肝素前體分類為第2組莢膜多糖且眾所周知在基因體上形成簇之區域I、區域II以及區域III之基因組參與大腸桿菌K5菌株中肝素前體的合成及轉運(NPL 4)。

據稱在由彼等基因組編碼之蛋白質中，KpsS及KpsC允許將複數個3-去氧-D-甘露-辛酮糖酸(Kdo)殘基轉移至內膜中之磷脂醯甘油，且糖基轉移酶KfiA及KfiC添加前驅體糖核苷酸，藉此進行肝素前體之合成(NPL 5及NPL 6)。

另外，KfiD參與合成前驅體UDP-GlcA；KpsF及KpsU參與合成CMP-Kdo (其為用於Kdo連接子合成之受質)；以及KpsM、KpsT、KpsE及KpsD參與將內膜上合成之肝素前體轉運至細菌細胞之外部(NPL 6)。

已知將來源於大腸桿菌K5菌株之區域II之KfiABCD基因簇引入至宿主中的方法作為使用並不具有肝素前體製造能力之大腸桿菌之BL21菌株及K-12菌株作為宿主來執行肝素前體醱酵的方法。另外，已報導改善肝素前體製造之基因，諸如rfaH、nusG及rpoE (PTL 4以及NPL 3及NPL 4)。引用清單 專利文獻

PTL 1：日本專利第5830464號 PTL 2：美國專利第8771995號 PTL 3：WO2018/048973 PTL 4：美國專利第9975928號非專利文獻

NPL 1：Biotechnology and Bioengineering 107 (2010) 964-973 NPL 2：Applied Microbiology and Biotechnology 103 (2019) 6771-6782 NPL 3：Metabolic Engineering 14 (2012) 521-527 NPL 4：Carbohydrate Research 360 (2012) 19-24 NPL 5：Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 110 (2013) 20753-20758 NPL 6：Carbohydrate Research 378 (2013) 35-44

技術問題

如上文所描述，已進行用於製造來源於非人類動物之製造受控及品質受控之肝素的研究及研發，但習知製造方法之效率不足。同時，迄今為止尚不清楚由區域I、II及III編碼之各基因如何藉由具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌影響肝素前體製造。

因此，本發明之目標為提供一種藉由經由基因修飾具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌提高製造肝素前體之效率來高效製造肝素前體的方法。問題之解決方案

本發明之發明人已發現藉由使用具有特定基因修飾且具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌來提高肝素前體製造效率，且因此已完成本發明。

亦即，本發明係如下。 1.一種肝素前體之製造方法，其包含： 在培養基中培養具有以下基因修飾(1)且具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌，以在該培養基中製造肝素前體： (1)增加kpsS基因之表現的基因修飾。 2.如1之肝素前體之製造方法，其中該大腸桿菌屬細菌進一步具有以下基因修飾(2)及(3)中之至少一者： (2)增加至少一種選自以下之基因之表現的基因修飾：kfiA基因、kfiB基因、kfiC基因及kfiD基因；及 (3)造成yhbJ基因之功能喪失的基因修飾。 3.如1或2之肝素前體之製造方法，其中該基因修飾(1)為以下中之至少一者：修飾kpsS基因之表現控制區及增加kpsS基因之複本數。 4.如2或3之肝素前體之製造方法，其中該基因修飾(2)為以下中之至少一者：修飾至少一種選自該kfiA基因、該kfiB基因、該kfiC基因及該kfiD基因之基因的表現控制區域，及增加至少一種選自該kfiA基因、該kfiB基因、該kfiC基因及該kfiD基因之基因的複本數。 5.如2至4中任一項之肝素前體之製造方法，其中該基因修飾(3)為該yhbJ基因之缺失。 6.如1至5中任一項之肝素前體之製造方法，其中該大腸桿菌屬細菌為大腸桿菌。 7.如1至6中任一項之肝素前體之製造方法，其中該kpsS基因為包含SEQ ID NO: 33中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 33中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。 8.如2至7中任一項之肝素前體之製造方法，其中 該kfiA基因為包含SEQ ID NO: 34中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 34中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA， 該kfiB基因為包含SEQ ID NO: 35中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 35中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA， 該kfiC基因為包含SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA，且 該kfiD基因為包含SEQ ID NO: 37中所示之核苷酸序列之DNA，或包含與SEQ ID NO: 37中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。 9.如2至8中任一項之肝素前體之製造方法，其中該yhbJ基因為包含SEQ ID NO: 38中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 38中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中降低時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。 10.如1至9中任一項之肝素前體之製造方法，其中該大腸桿菌屬細菌不具有以下基因修飾(4)： (4)增加kpsC基因之表現的基因修飾。 11.一種大腸桿菌屬細菌，其具有肝素前體製造能力且具有以下基因修飾(1)： (1)增加kpsS基因之表現的基因修飾。 12.如11之大腸桿菌屬細菌，其進一步具有以下基因修飾(2)及(3)中之至少一者： (2)增加至少一種選自以下之基因之表現的基因修飾：kfiA基因、kfiB基因、kfiC基因及kfiD基因；及 (3)造成yhbJ基因之功能喪失的基因修飾。 13.如11或12之大腸桿菌屬細菌，其不具有以下基因修飾(4)： (4)增加kpsC基因之表現的基因修飾。本發明之有利效果

根據本發明之肝素前體之製造方法，可藉由使用具有特定基因修飾且具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌以優異製造效率來製造來源於非動物之肝素前體。

下文中，除非另外說明，否則本說明書中所用之術語具有領域中通常使用之含義。

＜本發明之細菌＞ 在本發明之肝素前體之製造方法中，使用具有以下基因修飾(1)且具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌(下文中縮寫為本發明之細菌)： (1)增加kpsS基因之表現的基因修飾。

本發明之細菌較佳地進一步具有以下基因修飾(2)及(3)中之至少一者： (2)增加至少一種選自以下之基因之表現的基因修飾：kfiA基因、kfiB基因、kfiC基因及kfiD基因；及 (3)造成yhbJ基因之功能喪失的基因修飾。 因此，大腸桿菌屬細菌中之基因修飾之實例包括上文所描述之(1)及(2)、上文所描述之(1)及(3)及上文所描述之(1)至(3)。

本發明之細菌較佳地不具有以下基因修飾(4)： (4)增加kpsC基因之表現的基因修飾。

作為大腸桿菌屬細菌之一實例，圖1展示大腸桿菌K5菌株之染色體上的肝素前體合成基因簇之示意圖[J. Nzakizwanayo等人，PLOS ONE, (2015)]。另外，圖2展示參與肝素前體製造的酶之示意圖。

如圖1中所展示，kpsS及kpsC為由區域I、區域II及區域III之基因組當中的區域I編碼之基因。如圖2中所展示，kpsS及kpsC參與起始肝素前體合成。在肝素前體製造中，kpsS與kpsC一起在將多個Kdo連接子添加至內膜中之磷脂醯甘油中起作用。

作為kpsS基因，來源於大腸桿菌屬之kpsS基因為較佳的。其特定實例包括大腸桿菌K5菌株之kpsS基因。大腸桿菌K5菌株之kpsS基因之核苷酸序列及由該基因編碼之蛋白質之胺基酸序列可獲自公共資料庫。將大腸桿菌K5菌株之kpsS基因登記為GenBank寄存號CAA52659.1。

kpsS基因之實例包括包含SEQ ID NO: 33中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 33中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在細菌中增加時具有增加具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。

如圖1中所展示，kfiA、kfiB、kfiC及kfiD為由區域I、區域II及區域III之基因組當中的區域II編碼之基因。如圖2中所展示，kfiA、kfiB、kfiC及kfiD參與肝素前體合成且在添加糖且藉此合成肝素前體中起作用。

作為kfiA、kfiB、kfiC或kfiD基因，來源於大腸桿菌屬之kfiA、kfiB、kfiC或kfiD基因為較佳的。其特定實例包括大腸桿菌K5菌株之kfiA、kfiB、kfiC或kfiD基因。大腸桿菌K5菌株之kfiA、kfiB、kfiC或kfiD基因之核苷酸序列及由該基因編碼之蛋白質之胺基酸序列可獲自公共資料庫。將kfiA登記為GenBank寄存號CAA54711.1；將kfiB登記為GenBank寄存號CAE55824.1；將kfiC登記為GenBank寄存號CAA54709.1；且將kfiD登記為GenBank寄存號CAA54708.1。

kfiA基因之實例包括包含SEQ ID NO: 34中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 34中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在細菌中增加時具有增加具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。

kfiB基因之實例包括包含SEQ ID NO: 35中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 35中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在細菌中增加時具有增加具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。

kfiC基因之實例包括包含SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在細菌中增加時具有增加具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。

kfiD基因之實例包括包含SEQ ID NO: 37中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 37中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在細菌中增加時具有增加具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。

圖3展示肝素前體生物合成路徑之示意圖。如圖3中所展示，GlmS為UDP-N-乙醯基葡糖胺供應路徑中之第一酶，其為肝素前體之前驅體且為催化果糖-6-磷酸鹽至葡糖胺-6-磷酸鹽之反應的酶。YhbJ為陰性控制GlmS之酶。

作為yhbJ基因，來源於大腸桿菌屬之yhbJ基因為較佳的。其特定實例包括大腸桿菌K-12菌株之yhbJ基因。大腸桿菌K-12菌株之yhbJ基因之核苷酸序列及由該基因編碼之蛋白質之胺基酸序列可獲自公共資料庫。將大腸桿菌K-12菌株之yhbJ基因登記為GenBank寄存號BAE77249.1。

yhbJ基因之實例包括包含SEQ ID NO: 38中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 38中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在細菌中降低時具有增加具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。

上文(1)至(3)中之各基因可藉由例如使用上文所描述之各基因之核苷酸序列的BLAST搜索或FASTA搜索而容易地獲自公共資料庫。另外，各基因之同系物可藉由例如使用微生物(諸如細菌)之染色體作為模板且使用基於此等已知基因序列製造之寡核苷酸作為引子的PCR來獲得。

上文(1)至(3)中之各基因可為基因之變異體，只要維持由該基因編碼之蛋白質之原始功能(例如，活性或特性)即可。可檢查由基因之變異體編碼之蛋白質是否維持其原始功能；具體言之，例如在原始功能藉由將基因之變異體引入至具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物中而提高肝素前體製造能力時。

上文(1)至(3)中之各基因之變異體可根據定點突變誘發方法藉由修飾基因之編碼區以使得所編碼蛋白質之特定位置處的胺基酸殘基經取代、缺失、插入或添加來獲得。另外，上文(1)至(3)中之各基因之變異體亦可藉由例如突變處理來獲得。

只要維持其原始功能，上文基因(1)至(3)中之每一者均可為編碼具有胺基酸序列之蛋白質的基因，其中一個或若干個位置處之一個或若干個胺基酸經取代、缺失、插入或添加。舉例而言，在經編碼蛋白質中，其N端及/或C端可經延長或縮短。片語「一個或若干個」視蛋白質之三維結構中的胺基酸殘基之位置及類型而不同。其特定實例包括1至50、1至40、1至30，且其較佳為1至20，更佳為1至10，甚至更佳為1至5且尤佳為1至3。

如上文所描述之一個或若干個胺基酸之取代、缺失、插入或添加為正常維持蛋白質之功能的保守突變。保守突變之代表為保守取代。保守取代為其中在取代位點為芳族胺基酸的情況下取代發生在Phe、Trp與Tyr之間；在取代位點為疏水性胺基酸的情況下取代發生在Leu、Ile與Val之間；在取代位點為極性胺基酸的情況下取代發生在Gln與Asn之間；在取代位點為鹼性胺基酸的情況下取代發生在Lys、Arg與His之間；在取代位點為酸性胺基酸的情況下取代發生在Asp與Glu之間以及在取代位點為具有羥基之胺基酸的情況下取代發生Ser與Thr之間的突變。視為保守取代的取代之特定實例包括用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；以及用Met、Ile或Leu取代Val。另外，如上文所描述之胺基酸之取代、缺失、插入、添加、其倒置以及類似物包括由天然存在之突變(突變體或變異體) (諸如基於基因所來源於之生物體之個體差異或物種差異的突變)引起的取代、缺失、插入及添加、倒置以及類似物。

另外，只要維持其原始功能，上文(1)至(3)中之各基因可為編碼與整個胺基酸序列具有80%或更大，較佳地90%或更大，更佳地95%或更大，甚至更佳地97%或更大且尤佳地99%或更大一致性之蛋白質的基因。

另外，只要維持其原始功能，上文(1)至(3)中之各基因可為在嚴格條件下與可由已知基因序列(諸如與核苷酸序列之全部或一部分互補的序列)製備之探針雜交的DNA。術語「嚴格條件」係指在其下形成所謂的特異性雜交體且不形成非特異性雜交體的條件。其實例包括在其下彼此具有較高水準一致性之DNA (例如彼此具有80%或更大，較佳地90%或更大，更佳地95%或更大，甚至更佳地97%或更大且尤佳地99%或更大一致性的DNA)彼此雜交且彼此具有較低水準一致性之DNA並不彼此雜交的條件；或其為用於在正常的南方雜交(Southern hybridization)中進行洗滌之條件的條件，其中洗滌在對應於60℃，1 × SSC及0.1% SDS，較佳為60℃，0.1 × SSC及0.1% SDS，且更佳為68℃，0.1 × SSC及0.1% SDS的鹽濃度及溫度下執行一次，較佳為二至三次。

用於上文雜交中之探針可為各基因之互補序列之一部分。此探針可藉由使用基於已知基因序列製造之寡核苷酸作為引子且使用含有上文(1)至(3)中之各基因之DNA片段作為模板的PCR來製造。舉例而言，長度為約300 bp之DNA片段可用作探針。在長度為約300 bp之DNA片段用作探針的情況下，用於在雜交中進行洗滌的條件之實例包括50℃，2 × SSC及0.1% SDS之條件。

另外，由於密碼簡併視宿主而不同，因此上文(1)至(3)中之各基因可為藉由用等效密碼子取代任一密碼子而獲得的基因，只要維持其原始功能即可。舉例而言，表1至3之基因可經修飾以使得視所使用宿主之密碼子使用之頻率而定，其具有最佳密碼子。

突變處理之實例包括藉由羥胺或類似物活體外處理具有上文(1)至(3)中之各基因之核苷酸序列的DNA分子之方法；藉由X射線、紫外線或諸如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)及甲烷磺酸甲酯(MMS)以及類似物之誘變劑處理攜帶上文(1)至(3)中之各基因的微生物之方法。

＜＜增加基因表現量之基因修飾＞＞ 片語「基因表現的增加」意謂與未經修飾菌株之表現相比，基因之表現升高。增加基因之表現的一個態樣之實例包括其中與未經修飾菌株之表現相比，基因之表現較佳地增加1.5倍或更多倍，更佳地增加2倍或更多倍且甚至更佳地增加3倍或更多倍的態樣。

另外，片語「基因表現增加」不僅意謂目標基因在最初表現目標基因之菌株中的表現增加，且亦意謂目標基因在最初未表現目標基因之菌株中表現。亦即，片語「基因表現增加」包括例如將目標基因引入至不具有目標基因之菌株中且目標基因於其中表現的情況。此外，片語「基因表現增加」亦稱為片語「基因表現增強」及「基因表現升高」。

基因表現的增加可藉由例如增加基因之複本數來實現。增加基因之複本數可藉由將基因引入至宿主之染色體中來實現。將基因引入至染色體中可使用例如同源重組來執行(Miller I, J.H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory)。可引入基因之僅一個複本或可引入其兩個或更多個複本。

舉例而言，可藉由執行同源重組，同時靶向在染色體上具有多個複本之序列來將基因之多個複本引入至染色體中。在染色體上具有多個複本的序列之實例包括重複DNA序列(重複DNA)且反向重複序列存在於轉位子之兩端處。

替代地，可在靶向染色體上之適當序列，諸如製造目標物質非必需之基因時執行同源重組。同源重組可藉由例如以下方法來執行：使用直鏈DNA之方法；使用含有熱敏複製源之質體之方法；使用能夠接合轉移之質體之方法；使用不具有在宿主中起作用之複製源的自殺載體之方法；或使用噬菌體之轉導方法。另外，亦可使用轉位子或Mini-Mu將基因無規引入至染色體中(JP-A-H2-109985)。

可藉由使用具有與全部或一部分基因互補之序列之探針的南方雜交、使用基於基因之序列產生之引子的PCR或類似者來檢查目標基因是否已經引入至染色體中。

另外，亦可藉由將含有基因之載體引入至宿主中來增加基因之複本數。舉例而言，有可能藉由將含有目標基因之DNA片段接合至在宿主中起作用之載體，且用表現載體轉化宿主來構築基因之表現載體來增加基因之複本數。可藉由例如使用具有目標基因的微生物之基因體DNA作為模板的PCR來獲得含有目標基因之DNA片段。轉化方法不受特定限制且可使用習知已知方法。

可使用可在宿主細胞中自主複製的載體作為載體。載體較佳地為多複本載體。另外，載體較佳地具有標記物，諸如抗生素抗性基因或描述於文獻[Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)]中之另一基因，以便選擇轉化體(transformant)。此外，載體可具有啟動子或終止子，以便表現插入基因。載體之實例包括來源於細菌性質體之載體、來源於酵母質體之載體、來源於細菌噬菌體、黏質體、噬菌質體以及類似物之載體。

能夠在腸內菌科細菌(諸如大腸桿菌)中自主複製的載體之特定實例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322及pSTV29 (全部來自Takara Bio Inc.)；pACYC184、pMW219、pMW118及pMW119 (全部來自Nippon Gene)；pTrc99A (Pharmacia)；pPROK載體(Clontech)；pKK233-2 (Clontech)；pET載體(Novagen)；pQE載體(Qiagen)及廣泛宿主範圍的載體RSF1010。

在引入基因之情況下，其足以使基因保留在本發明中之具有基因修飾之大腸桿菌屬細菌中。具體言之，其足以引入基因以使得其在本發明之細菌中起作用之啟動子序列的控制下表現。啟動子可為來源於宿主之啟動子或異源啟動子。啟動子可為待引入之基因之內部啟動子或其他基因之啟動子。舉例而言，可使用稍後將描述的更強啟動子作為啟動子。

用於終止轉錄之終止子可安置在基因之下游。終止子不受特定限制，只要其在本發明之細菌中起作用即可。終止子可為來源於宿主之終止子或異源終止子。終止子可為對待引入之基因具有特異性之終止子或可為其他基因之終止子。終止子之特定實例包括T7終止子、T4終止子、fd噬菌體終止子、tet終止子及trpA終止子。

可用於各種微生物中之載體、啟動子及終止子詳細描述於例如「Basic Lecture 8 on Microbiology, Gene Engineering, KYORITSU SHUPPAN, 1987」中且可使用此等載體、啟動子及終止子。

另外，在引入兩種或更多種基因的情況下，足以使各基因以可表現方式保留在本發明之細菌中。舉例而言，各基因可全部保留在單一表現載體上或可全部保留在染色體上。此外，各基因可單獨地保留在複數個表現載體上或可單獨地保留在單一或複數個表現載體及一染色體上。此外，兩種或更多種基因可形成操縱子(operon)且經引入。「引入兩種或更多種基因之情況」之實例包括引入分別編碼兩種或更多種酶之基因的情況、引入分別編碼形成單一酶之兩個或更多個次單元之基因的情況以及其組合。

待引入之基因不受特定限制，只要其編碼在宿主中起作用之蛋白質即可。待引入之基因可為來源於宿主之基因或異源基因。待引入之基因可藉由例如使用基於基因之核苷酸序列設計之引子且使用具有基因或攜載基因之質體或類似物的生物體之基因體DNA作為模板的PCR來獲得。另外，待引入之基因可例如基於基因之核苷酸序列來完全合成[Gene, 60 (1), 115-127 (1987)]。

此外，基因表現的增加可藉由提高基因之轉錄效率來實現。提高基因之轉錄效率可藉由例如用更強啟動子取代染色體上的基因之啟動子來實現。「更強啟動子」係指相對於天然存在之野生型啟動子增強基因轉錄的啟動子。

「更強啟動子」之實例包括已知高表現啟動子，諸如uspA啟動子、T7啟動子、trp啟動子、lac啟動子、thr啟動子、tac啟動子、trc啟動子、tet啟動子、araBAD啟動子、rpoH啟動子、PR啟動子及PL啟動子。

另外，可使用各種報導基因來獲得高活性類型之習知啟動子作為更強啟動子。舉例而言，啟動子之活性可藉由使啟動子區中之-35及-10區更接近共有序列來增加(WO2000/18935)。

高活性類型啟動子之實例包括各種tac樣啟動子(Katashkina JI等人，俄羅斯聯邦專利申請案2006134574)及pnlp8啟動子(WO2010/027045)。用於評估啟動子強度之方法及強啟動子之實例描述於已知文獻[Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)及類似者]中。

另外，基因表現量的增加可藉由提高基因之轉譯效率來實現。基因之轉譯效率之提高可藉由例如用更強SD序列取代染色體上之基因之Shine-Dalgarno (SD)序列(亦稱作核糖體結合位點(RBS))來實現。

「更強SD序列」係指其中mRNA轉譯相對於天然存在之野生型SD序列得到改善的SD序列。更強SD序列之實例包括來自噬菌體T7的基因10之RBS (Olins P.O.等人，Gene, 1988, 73, 227-235)。另外，已知RBS與起始密碼子之間的間隔區中(特定言之緊接著起始密碼子(5'-UTR)之上游的序列中)的若干核苷酸之取代、插入或缺失顯著影響mRNA之穩定性及轉譯效率，且因此可藉由修飾此等核苷酸來提高基因之轉譯效率。

在本發明中，影響基因(諸如啟動子、SD序列及RBS與起始密碼子之間的間隔區)之表現的位點亦統稱為「表現控制區」。表現控制區可使用基因搜索軟體，諸如啟動子搜索載體或GENETYX來確定。此等表現控制區之修飾可藉由例如使用熱敏載體之方法或Red驅動整合方法來執行(WO2005/010175)。

基因轉譯效率之提高亦可藉由例如密碼子修飾來實現。具體言之，例如在執行基因之異源表現以及類似者的情況下，可藉由用更頻繁使用之同義密碼子置換存在於基因中之罕見密碼子來提高基因之轉譯效率。

密碼子取代可藉由例如其中將目標突變引入至DNA中之目標位點中之定點誘變方法來執行。定點誘變方法之實例包括使用PCR之方法[Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H.A.編，Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)]及使用噬菌體之方法[Kramer, W.及Frits, H.J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T.A.等人，Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)]。替代地，可完全地合成其中密碼子已經取代之基因片段。各種生物體中密碼子之使用頻率描述於「Codon usage database」中[http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura, Y.等人，Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)]。

另外，亦可藉由擴增增加基因之表現的調節子或藉由缺失或減弱減小基因之表現的調節子來增加基因之表現。如上文所描述之用於增加基因之表現的此類技術可單獨使用或可以任何組合形式使用。

可例如藉由檢查基因之轉錄量的增加或藉由檢查由基因表現之蛋白質之量的增加來檢查基因之表現的增加。另外，可例如藉由檢查由基因表現之蛋白質之活性的增加來檢查基因之表現的增加。

檢查基因之轉錄量的增加可藉由將自基因轉錄之mRNA之量與未經修飾菌株(諸如野生菌株或母體菌株)進行比較來執行。用於評估mRNA之量的方法之實例包括北方雜交(Northern hybridization)、RT-PCR以及類似者[Sambrook, J.等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual/第三版, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001]。mRNA之量的增加係指例如與未經修飾菌株之量相比，mRNA之量已較佳地增加1.5倍或更多倍，已更佳地增加2倍或更多倍且已甚至更佳地增加3倍或更多倍的情況。

蛋白質之量的增加可藉由例如使用抗體之西方墨點(Western blot)來檢查。蛋白質之量的增加係指例如與未經修飾菌株之量相比，蛋白質之量已較佳地增加1.5倍或更多倍，已更佳地增加2倍或更多倍且已甚至更佳地增加3倍或更多倍的情況。

蛋白質之活性的增加可藉由例如量測蛋白質之活性來檢查。蛋白質之活性的增加係指例如與未經修飾菌株之活性相比，蛋白質之活性已較佳地增加1.5倍或更多倍，已更佳地增加2倍或更多倍且已甚至更佳地增加3倍或更多倍的情況。

用於增加基因之表現的上述技術可用於增強上文基因(1)及(2)中之每一者之表現。

增加kpsS基因之表現的基因修飾較佳地為kpsS基因之表現控制區之修飾及增加複本數之基因修飾中的至少一者。kpsFEDUCS基因以肝素前體製造基因組形式存在，但如稍後將在實例中所描述，本發明之發明人已發現藉由增加其中僅kpsS基因之表現來獲得特定提高肝素前體之製造的效果。因此，作為增加kpsS基因之表現的基因修飾，用於增加kpsS基因之複本數的基因修飾為尤佳的。

儘管本發明之細菌具有增加kpsS基因之表現的基因修飾，但本發明之細菌較佳地不具有增加kpsC基因之表現的基因修飾，更佳地不具有增加kpsC基因及至少一種選自kpsF、kpsE、kpsD及kpsU基因之基因之表現的基因修飾，且最佳地不具有增加所有kpsC、kpsF、kpsE、kpsD及kpsU基因之表現的基因修飾。

增加至少一種選自kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因之基因之表現的基因修飾較佳地為至少一種選自kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因之基因之表現控制區的修飾及增加基因之複本數中的至少一者。kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因構成如圖1中所展示之操縱子。增強由kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因構成之整個操縱子的基因修飾為較佳的，且kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因之表現控制區的修飾為更佳的。

＜＜造成基因功能之喪失的基因修飾＞＞ 造成上文(3)之yhbJ基因之功能喪失的基因修飾之實例包括其中由對應於造成yhbJ基因之功能之喪失的yhbJ之部分編碼的蛋白質之功能藉由修飾作為宿主的大腸桿菌屬細菌之基因體DNA中的編碼對應於yhbJ之部分的DNA而減少或完全停止的基因修飾。

在本發明之方法中，待添加至編碼對應於yhbJ之部分之DNA的修飾之形式不受特定限制，只要由對應於yhbJ之部分編碼的蛋白質之功能減少或完全停止即可，且可適當地使用已知方法。

減少或完全停止由對應於yhbJ之部分編碼的蛋白質之功能的形式之實例包括以下修飾(a)至(c)中之任一者： (a)移除編碼對應於yhbJ之部分的DNA之全部或一部分； (b)對編碼對應於yhbJ之部分的DNA進行一個或若干個取代、缺失或添加，及 (c)編碼對應於yhbJ之部分的DNA在修飾之前經與DNA序列具有小於80%一致性之DNA序列取代。

yhbJ基因之功能之喪失之實例包括相較於未經修飾菌株之活性，yhbJ基因之活性較佳為20%或更低，更佳為10%或更低，且甚至更佳為5%或更低的情況。可藉由北方墨點法(Northern blotting method)、西方墨點法(Western blotting method)或類似方法檢驗glmS之表現量來檢查yhbJ之活性[Kalamorz F.等人，(2007)「Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli.」Mol Microbiol. 65 (6):1518-33]。

＜＜大腸桿菌屬細菌＞＞ 屬於大腸桿菌屬之細菌不受特定限制，且其實例包括藉由微生物學專家已知之分類法分類為大腸桿菌屬的細菌。屬於大腸桿菌屬的細菌之實例包括描述於文獻[Backmann, B.J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, 第2460-2488頁. 表1. In F.D. Neidhardt (編), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, DC]中的細菌。

屬於大腸桿菌屬的細菌之實例包括大腸桿菌。大腸桿菌之實例包括大腸桿菌K-12菌株，諸如W3110菌株(ATCC 27325)及MG1655菌株(ATCC 47076)；大腸桿菌K5菌株(ATCC 23506)；大腸桿菌B菌株，諸如BL21 (DE3)菌株；大腸桿菌Nissle 1917菌株(DSM 6601)；以及其衍生菌株。

此等菌株可根據例如美國典型培養物保藏中心(the American Type Culture Collection) (地址:12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)定序。亦即，向各菌株給與登記號且菌株可使用此登記號定序(參考：https://www.atcc.org/)。對應於各菌株之登記號描述於美國典型培養物保藏中心之目錄號中。另外，BL21 (DE3)菌株係獲自例如Life Technologies (產品編號C6000-03)。

本發明之細菌可最初具有肝素前體製造能力，或可已經修飾以具有肝素前體製造能力。具有肝素前體製造能力之細菌可藉由例如向上文提及之細菌賦予肝素前體製造能力來獲得。

肝素前體製造能力可藉由引入編碼參與肝素前體製造之蛋白質的基因，藉由參考Metabolic Engineering 14 (2012) 521-527, Carbohydrate Research 360 (2012) 19-24，美國專利案第9,975,928號，來賦予，且參與肝素前體製造的蛋白質之類似實例包括糖基轉移酶及肝素前體流出載體蛋白。在本發明中，可引入一種種類之基因，或可引入兩種或更多種種類之基因。基因之引入可以與上文描述之用於增加基因之複本數之方法相同的方式來執行。

＜肝素前體之製造方法＞ 本發明之肝素前體之製造方法包含在培養基中培養本發明之細菌以在培養基中製造且積聚肝素前體。視需要，本發明之肝素前體之製造方法可進一步包含自培養基收集肝素前體。

所使用之培養基不受特定限制，只要本發明之細菌可生長且肝素前體經製造且積聚即可。舉例而言，可使用用於培養細菌之普通培養基作為培養基。培養基之實例包括LB培養基(Luria-Bertani培養基)，但實例不限於此。有可能使用例如含有選自碳源、氮源、磷酸鹽源、硫源之組分及視需要其他各種有機組分及無機組分的培養基作為培養基。熟習此項技術者可適當地設定培養基組分之類型及濃度。

碳源不受特定限制，只要其可由本發明之細菌利用以使得可製造肝素前體即可。碳源之實例包括糖，諸如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、糖蜜；澱粉水解產物及生質水解產物；有機酸，諸如乙酸、反丁烯二酸、檸檬酸、琥珀酸及蘋果酸；醇，諸如甘油、粗甘油；及乙醇；以及脂肪酸。可使用一種種類之碳源或可組合兩種或更多種種類之碳源作為碳源。

氮源之實例包括銨鹽，諸如硫酸銨、氯化銨及磷酸銨；有機氮源，諸如蛋白腖、酵母提取物、肉類提取物；及大豆蛋白分解產物；氨；及脲。可使用一種種類之氮源或可組合兩種或更多種種類之氮源作為氮源。

磷酸鹽源之實例包括磷酸鹽，諸如磷酸二氫鉀及磷酸氫二鉀；及磷酸聚合物，諸如焦磷酸。可使用一種種類之磷酸鹽源或可組合兩種或更多種種類之磷酸鹽源作為磷酸鹽源。

硫源之實例包括無機硫化合物，諸如硫酸鹽、硫代硫酸鹽及亞硫酸鹽；及含硫胺基酸，諸如半胱胺酸、胱胺酸及麩胱甘肽。可使用一種種類之硫源或可組合兩種或更多種種類之硫源作為硫源。

其他各種有機組分及無機組分之特定實例包括無機鹽，諸如氯化鈉及氯化鉀；痕量金屬，諸如鐵、錳、鎂及鈣；維生素，諸如維生素B1、維生素B2、維生素B6、菸鹼酸、菸鹼醯胺及維生素B12；胺基酸；核酸；含有此等之有機組分，諸如蛋白腖、酪蛋白胺基酸、酵母提取物及大豆蛋白分解產物。可使用一種種類之組分或可組合使用兩種或更多種種類之組分作為其他各種有機組分及無機組分。

另外，在使用需要胺基酸或類似物進行生長之營養缺陷型突變體的情況下，較佳的補充培養基所需之養分。此外，在使用攜載抗生素抗性基因之載體引入基因時，較佳的將對應抗生素添加至培養基中。

培養條件不受特定限制，只要本發明之細菌可生長且肝素前體經製造且積聚即可。可在例如用於培養細菌之正常條件下執行培養。培養條件可由熟習此項技術者適當地設定。

培養可例如藉由使用液體培養基的充氣培養或搖動培養以好氧地方式執行。培養溫度可為例如30℃至37℃。培養時段可為例如16至72小時。培養可藉由分批培養、分批補料培養、連續培養或其組合來執行。另外，可將培養劃分為預培養及主培養。預培養可使用例如盤培養基或液體培養基來執行。

藉由培養如上文所描述之本發明之細菌，肝素前體積聚於培養基中。

用於自培養溶液收集肝素前體的方法不受特定限制，只要可收集肝素前體即可。用於自培養溶液收集肝素前體的方法之實例包括實例中所描述之方法。具體言之，例如，可將培養上清液與培養溶液分離，且接著，可藉由乙醇沈澱來沈澱上清液中之肝素前體。所添加之乙醇之量可為例如上清液液體之量的2.5至3.5倍。為沈澱肝素前體，可不僅使用乙醇且亦可使用視情況可與水混溶的有機溶劑。

有機溶劑之實例包括乙醇、甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、三級丁醇、二級丁醇、丙二醇、乙腈、丙酮、DMF、DMSO、N-甲基吡咯啶酮、吡啶、1,2-二甲氧基乙烷、1,4-二㗁烷及THF。

用於自培養溶液收集肝素前體的方法之其他實例包括包含藉由靶向存在於肝素前體之末端處之Kdo來純化肝素前體的方法。

可將經沈澱肝素前體溶解於例如為原始上清液之量的兩倍的水中。除肝素前體以外，所收集肝素前體亦可含有諸如細菌細胞、培養基組分、水及細菌之代謝副產物的組分。可將肝素前體純化至所需程度。肝素前體之純度可為例如30% (w/w)或更高、50% (w/w)或更高、70% (w/w)或更高、80% (w/w)或更高、90% (w/w)或更高或95% (w/w)或更高。

可藉由已知方法來執行肝素前體之偵測及定量。具體言之，例如，可藉由如稍後將在實例中所描述之咔唑方法來偵測且定量肝素前體。咔唑方法為廣泛用作定量糖醛酸之方法的方法，且有可能藉由在硫酸之存在下使肝素前體與咔唑熱反應來偵測且定量肝素前體，且藉由所產生之著色物質來量測530 nm處之吸收[Bitter T.及Muir H.M., (1962)「A modified uronic acid carbazole reaction.」Analytical Biochemistry, 4 (4):330-334]。另外，例如，可藉由用肝素酶III (其為降低肝素前體之酶)來處理肝素前體且執行雙醣組成分析來偵測且定量肝素前體。

實例 實例係展示如下，但本發明不限於以下實例。實例 1

基因缺失型菌株之構築 (a)用於基因缺失之標記基因片段之構築 如下製備含有用作使用同源重組缺失大腸桿菌之基因之標記基因的氯胺苯醇抗性基因(cat)及聚果糖蔗糖酶基因(sacB)的DNA片段。

使用由SEQ ID NO:1及2中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集且使用質體pHSG396 (Takara Bio Inc.)作為模板來執行PCR，且藉此獲得包含cat基因之DNA片段。使用PrimeSTAR MaxDNA聚合酶(Takara Bio Inc.)根據說明書手冊中之描述來執行PCR。另外，使用由SEQ ID NO: 3及4中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集且使用pMOB3 (來源於ATCC 77282)作為模板來執行PCR，且藉此獲得包含sacB基因之DNA片段。

在純化包含cat基因之DNA片段及包含sacB基因之DNA片段之後，用SalI切割DNA片段。執行苯酚/氯仿處理及乙醇沈澱，且將兩個片段以等莫耳比混合且使用DNA接合套組版本2 (Takara Bio Inc.)進行接合。使接合反應溶液經受苯酚/氯仿處理且藉由乙醇沈澱純化，且使用因此獲得之產物作為模板且使用由SEQ ID NO: 5及6中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集來執行PCR。使用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen)來純化所得經擴增DNA，且藉此獲得包含cat基因及sacB基因之DNA片段(cat-sacB片段)。

(b)yhbJ缺失型菌株之構築 使用由SEQ ID NO: 7及8中所示之核苷酸序列組成的合成DNA及由SEQ ID NO: 9及10中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集且使用藉由習知方法製備之大腸桿菌Nissle 1917菌株[DSM 6601，Mutaflor (Pharma-Zentrale GmbH)，下文中縮寫為Nissle菌株]之基因體DNA作為模板來執行第一次PCR。因此，獲得分別包含距yhbJ基因之起始密碼子附近上游1000 bp及距yhbJ基因之終止密碼子附近下游約1000 bp的DNA片段。使用PrimeSTAR MaxDNA聚合酶(Takara Bio Inc.)根據說明書手冊中之描述來執行PCR。

使用藉由以等莫耳比將使用QIAquick PCR純化套組(由Qiagen製造)純化之經擴增產物與cat-sacB片段混合獲得的混合物作為模板來執行第二次PCR。使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)根據說明書手冊中之描述來執行PCR。對於引子集，使用由SEQ ID NO: 7及10中所示之核苷酸序列組成的合成DNA。使經擴增產物經受瓊脂糖凝膠電泳以分離約4.6 kbp DNA片段，且藉此獲得包含其中已插入cat-sacB片段之yhbJ周邊區域的DNA片段。

另外，使用由SEQ ID NO: 7及11中所示之核苷酸序列組成的合成DNA及由SEQ ID NO: 12及10中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集且使用大腸桿菌Nissle菌株之基因體DNA作為模板來執行第一次PCR。因此，獲得分別包含距yhbJ基因之起始密碼子附近上游1000 bp及距yhbJ基因之終止密碼子附近下游約1000 bp的DNA片段。

使用藉由以等莫耳比將經純化擴增產物混合獲得的混合物作為模板來執行第二次PCR。對於引子集，使用由7及10中所示之核苷酸序列組成的合成DNA。使經擴增產物經受瓊脂糖凝膠電泳以分離約2.0 kbp DNA片段，且藉此獲得包含缺失yhbJ基因之yhbJ周邊區域的DNA片段。

接著，在LB培養基[10 g/L細菌蛋白腖(bactotripton) (由Difco製造)、5 g/L酵母提取物(由Difco製造)及5 g/L氯化鈉]中在15 g/L L-阿拉伯糖及100 mg/L安比西林(ampicillin)之存在下培養保留pKD46之大腸桿菌Nissle菌株(Nissle/pKD46菌株)。質體pKD46具有λ紅重組酶基因，且因此，可藉由L-阿拉伯糖誘導基因之表現。因此，當使用直鏈DNA轉化保留在L-阿拉伯糖之存在下生長之pKD46的大腸桿菌時，同源重組以高頻率發生。另外，由於pKD46具有熱敏複製源，因此質體可容易地藉由在42℃下生長pKD46而脫落。製備Nissle/pKD46菌株之勝任細胞，藉由電致孔向其中引入包含其中插入上文獲得之cat-sacB片段之yhbJ周邊軀體的DNA片段。

將所獲得轉化體施加至含有15 mg/L氯胺苯醇及100 mg/L安比西林之LB瓊脂培養基(LB +氯胺苯醇+安比西林)中，且進行培養，且選擇氯胺苯醇抗性菌落。由於其中已發生同源重組之菌株對氯胺苯醇具有抗性且對蔗糖敏感，因此選定菌落在含有10%蔗糖及100 mg/L安比西林以及LB +氯胺苯醇+安比西林之LB瓊脂培養基(LB +蔗糖+安比西林)中複製，且藉此選擇展示氯胺苯醇抗性及蔗糖敏感性之菌株。

在選定菌株上使用由SEQ ID NO: 13及10中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集執行菌落PCR，且其檢查到cat-sacB片段插入yhbJ基因之位置處。以與上文所描述相同之方式培養其中將cat-sacB片段插入yhbJ基因之位置處的菌株以製備勝任細胞，且藉由電致孔向其中引入上文獲得且含有缺失yhbJ基因之yhbJ周邊區域的DNA片段。

在LB +蔗糖瓊脂培養基上培養所獲得轉化體且選擇蔗糖抗性菌落。由於已進行同源重組之菌株不含有cat-sacB片段且因此對氯胺苯醇敏感且對蔗糖具有抗性，因此選定菌落在LB +氯胺苯醇瓊脂培養基及LB +蔗糖瓊脂培養基中複製，且藉此選擇展示氯胺苯醇敏感性及蔗糖抗性之菌株。

在選定菌株上使用由SEQ ID NO: 13及10中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集執行菌落PCR，且其檢查到缺失yhbJ基因。將其中檢查到缺失yhbJ基因之菌株施加至LB瓊脂培養基中且在42℃下培養，且接著選擇展示安比西林敏感性之菌株，亦即pKD46已自其脫落之菌株。

如上文所描述獲得其中缺失yhbJ基因之菌株且將其指定為大腸桿菌NY菌株。實例 2

基因增強型菌株之構築 藉由以下方法構築kfiA基因之經啟動子區域取代之菌株。使用由SEQ ID NO: 14及15中所示之核苷酸序列組成的合成DNA及由SEQ ID NO: 16及17中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集且使用藉由一般方法製備之大腸桿菌Nissle菌株之基因體DNA作為模板來執行第一次PCR。因此，獲得分別包含距kfiA基因之起始密碼子上游約100 bp上游1000 bp及距kfiA基因之起始密碼子附近下游約1000 bp的DNA片段。

使用藉由以等莫耳比將使用QIAquick PCR純化套組(由Qiagen製造)純化之經擴增產物與cat-sacB片段混合獲得的混合物作為模板來執行第二次PCR。對於引子集，使用由SEQ ID NO: 14及17中所示之核苷酸序列組成的合成DNA。使經擴增產物經受瓊脂糖凝膠電泳以分離約4.6 kbp DNA片段，且藉此獲得包含其中已插入cat-sacB片段之kfiA基因之啟動子周邊區域的DNA片段。

使用由SEQ ID NO: 14及18中所示之核苷酸序列組成的合成DNA及由SEQ ID NO: 19及17中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集且使用藉由一般方法製備之大腸桿菌Nissle菌株之基因體DNA作為模板來執行第一次PCR。因此，獲得分別包含距kfiA基因之起始密碼子上游約100 bp上游1000 bp及距kfiA基因之起始密碼子附近下游約1000 bp的DNA片段。 另外，使用由SEQ ID NO: 20及21中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集且使用藉由一般方法製備之大腸桿菌W菌株(ATCC 9637)之基因體DNA作為模板來執行PCR，且藉此獲得包含uspA啟動子之約300 bp 之DNA片段。

使用藉由以等莫耳比將經純化擴增產物混合獲得的混合物作為模板來執行第二次PCR。對於引子集，使用由14及17中所示之核苷酸序列組成的合成DNA。使經擴增產物經受瓊脂糖凝膠電泳以分離約2.3 kbp DNA片段，且藉此獲得自kfiA啟動子周邊區域缺失kfiA啟動子區但替代地包含uspA啟動子的DNA片段。

接著，在15 g/L L-阿拉伯糖及100 mg/L安比西林在存在下培養保留含有編碼γ紅重組酶之基因的質體pKD46的大腸桿菌Nissle菌株(Nissle/pKD46菌株)及實例1中構築的大腸桿菌NY菌株(NY/pKD46菌株)。製備兩種菌株之勝任細胞，藉由電致孔向其中引入包含其中插入上文獲得之cat-sacB片段之kfiA啟動子周邊區域的DNA片段。

在LB +氯胺苯醇+安比西林瓊脂培養基上培養所獲得轉化體且選擇氯胺苯醇抗性菌落。自選定菌落中進一步選擇展示氯胺苯醇抗性及蔗糖敏感性的菌株。

在選定菌株上使用由SEQ ID NO: 22及17中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集執行菌落PCR，且其檢查到cat-sacB片段插入至kfiA啟動子區中。

以與上文所描述相同之方式培養其中將cat-sacB片段插入至kfiA啟動子區中之菌株以製備勝任細胞，且藉由電致孔向其中引入上文獲得且自kfiA啟動子周邊區域缺失kfiA啟動子區但替代地包含uspA啟動子的DNA片段。

在LB +蔗糖瓊脂培養基上培養所獲得轉化體且選擇蔗糖抗性菌落。自選定菌落中進一步選擇展示氯胺苯醇敏感性及蔗糖抗性的菌株。

在選定菌株上使用由SEQ ID NO: 22及17中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集執行菌落PCR，且其檢查到uspA啟動子插入至kfiA啟動子區中。將其中檢查到uspA啟動子插入至kfiA啟動子區中之菌株施加至LB瓊脂培養基中且在42℃下培養，且接著選擇展示安比西林敏感性之菌株，亦即pKD46已自其脫落之菌株。

獲得如上文所描述之其中uspA啟動子插入至kfiA啟動子區中之菌株且分別指定為大腸桿菌之NA菌株及NYA菌株。實例 3

使用NY菌株、NA菌株及NYA菌株之肝素前體製造測試 (a)肝素前體製造菌株之培養 將實例1中獲得之yhbJ缺失型突變體NY菌株、實例2中獲得之經kfiA啟動子取代之菌株NA菌株及經kfiA啟動子取代之yhbJ缺失型菌株NYA菌株以及Nissle菌株(其為母體菌株)在LB瓊脂培養基上在30℃下培養24小時，且分別接種至含有330 mL預培養培養基[10 g/L大豆肽(Hinute AM；由Fuji Oil Co., Ltd.製造)、5 g/L氯化鈉、5 g/L酵母提取物粉末(AY-80；由Asahi Food and Healthcare Co., Ltd.製造)經氫氧化鈉調節以使得pH變成pH 7.2]之2 L擋板中且在30℃下培養18小時。

向含有760 mL主培養基[其中20 g/L葡萄糖、13.5 g/L磷酸二氫鉀、4 g/L磷酸二銨、1.7 g/L檸檬酸、1.7 g/L硫酸鎂七水合物、10 mg/L鹽酸噻胺及10 mL/L痕量礦物質溶液經由5 mol/L氫氧化鈉調節以使得pH變成pH 6.7，且在高壓釜滅菌(在120℃下20分鐘)之後單獨添加葡萄糖及硫酸鎂七水合物]的缸式醱酵槽中接種40 mL所獲得預培養物且在37℃下以800 rpm之攪拌速度及1.5 L/min之充氣速率培養72小時。

痕量礦物質溶液係指使10 g/L硫酸鐵七水合物、2 g/L氯化鈣、2.2 g/L硫酸鋅七水合物、0.5 g/L硫酸錳四水合物、1 g/L硫酸銅五水合物、0.1 g/L七鉬酸六銨四水合物及0.02 g/L四硼酸鈉十水合物溶解於5 mol/L鹽酸中的溶液。

自培養溶液中之葡萄糖濃度變為0 g/L (0小時)之時間至72小時，以7.0毫升/小時添加進料溶液[500 g/L葡萄糖、33.6 g/L磷酸二氫鉀、14.3 g/L硫酸鎂、0.4g/L鹽酸噻胺及14.3mL/L痕量礦物質溶液]。培養結束時添加的進料溶液之量為約450 mL。

(b)自肝素前體製造菌株之培養溶液部分純化肝素前體 在將用蒸餾水稀釋10倍之培養溶液在100℃下培育30分鐘之後，藉由離心自培養溶液移除細菌細胞且將200微升之所獲得上清液轉移至1.5 mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)中。在添加且混合40微升之0.5 mol/L硫酸鈉水溶液之後，添加400微升之10 g/L十六烷基吡啶氯水溶液且藉由翻轉混合，且使混合物在37℃下靜置1小時。

溶液經離心以形成沈澱物，且移除上清液。在用蒸餾水洗滌沈澱物之後，添加100微升之溶液[含有0.5 mol/L氯化鈉及4% (v/v)乙醇的水溶液]，以溶解沈澱物。在另外使其在4℃靜置隔夜之後，添加900微升之0.25 mol/L氯化鈉水溶液且混合，且藉此獲得粗肝素前體溶液。亦藉由以相同方式處理200微升之主培養基來製備坯料。

(c)藉由咔唑-硫酸方法量測所積聚之肝素前體之量 當將20微升粗肝素前體溶液冷卻時，添加且混合100微升之硫酸溶液[使9.5 g/L四硼鈉十水合物溶解於濃硫酸中的溶液]，隨後在100℃下培育10分鐘。當將溶液再次冷卻時，向其中添加4微升之咔唑溶液[1.25 g/L咔唑溶解於100%乙醇中的溶液]且混合，且在100℃下培育15分鐘。

在將溶液再次冷卻之後，使溫度返回至室溫，且使用微量盤讀數器來量測530 nm處之吸收度。使用0、0.1及0.2 g/L葡糖醛酸鈉單水合物用於校準曲線，產生橫軸作為葡糖醛酸濃度(g/L)且豎軸作為530 nm處之吸收度的校準曲線。

根據下文描述之計算表達式計算肝素前體濃度。其中所需肝素前體濃度表示H (g/L)，所獲得校準曲線表示y = ax + b，粗肝素前體樣本之A530量測值表示h，空白A530量測值表示k，且最終稀釋比率表示n。0.5387指示肝素前體中葡糖醛酸之含量，且216/234指示葡萄糖醛酸鈉單水合物中葡萄糖醛酸鈉之含量。

[數學式1]

(d)量測所積聚之肝素前體之量的結果 表1展示在藉由上文方法量測時積聚的肝素前體之量

[表1]

菌株	所積聚之肝素前體之量(g/L)
Nissle	3.9
NY	9.9
NA	5.5
NYA	12.5

如表1中所展示，積聚於缺失yhbJ之NY菌株中的肝素前體之量為母體菌株Nissle中之量的兩倍。另外，即使在kfiA啟動子經uspA啟動子取代之NA菌株中，相較於母體菌株Nissle中之量，所積聚之肝素前體之量增加。組合此兩種突變之NYA菌株展示甚至更高的肝素前體產率。實例 4

表現參與肝素前體製造之基因的質體之構築 使用大腸桿菌Nissle菌株之染色體DNA作為模板且使用由SEQ ID NO: 23及24中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集來執行PCR反應，且藉此獲得含有kpsC及kpsS基因區域(下文中被稱為kpsCS基因擴增片段)之約3.3 kbp DNA片段。

使用pMW118載體作為模板且使用由SEQ ID NO: 25及26中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集來執行PCR反應，且藉此獲得約4 kbp pMW118直鏈DNA片段。另外，使用大腸桿菌W菌株(ATCC 9637)之染色體DNA作為模板且使用由SEQ ID NO: 20及21中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集來執行PCR反應，且藉此獲得包含uspA啟動子區之約300 bp DNA片段。

將如上獲得之pMW118直鏈DNA片段、含有uspA啟動子區之DNA片段及kpsCS基因擴增片段混合且使用In-Fusion HD選殖套組(Takara Bio Inc.)接合。

使用所獲得之接合DNA轉化大腸桿菌DH5 α菌株，且使用安比西林抗性作為索引來選擇轉化體。根據已知方法自轉化體提取質體，且使用由SEQ ID NO: 27及24中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集來執行PCR反應，且藉此其檢查到獲得基因表現質體，將該基因表現質體指定為pMW118-kpsCS。

另外，使用大腸桿菌Nissle菌株之染色體DNA作為模板且使用由SEQ ID NO: 28及24中所示之核苷酸序列組成的合成DNA及由SEQ ID NO: 29及24中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集來執行PCR反應，且藉此分別獲得含有kpsS基因區域之約1.2 kbp DNA片段(下文中被稱為kpsS基因擴增片段)及含有kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC及kpsS基因區域之約7.9 kbp DNA片段(下文中被稱為kpsFEDUCS基因擴增片段)。

此外，使用上文獲得之質體pMW118-kpsCS作為模板且使用由SEQ ID NO: 25及21中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為引子集來執行PCR反應，且藉此獲得含有uspA啟動子序列之約4.3 kbp pMW118直鏈DNA片段。

將如上獲得之含有uspA啟動子序列之pMW118直鏈DNA片段及kpsS基因擴增片段混合且使用In-Fusion HD選殖套組(Takara Bio Inc.)接合。以相同方式，混合且接合包含uspA啟動子序列之pMW118直鏈DNA片段及kpsFEDUCS基因擴增片段。

使用所獲得之接合DNA中之每一者轉化大腸桿菌DH5 α菌株且使用安比西林抗性作為索引來選擇轉化體。根據已知方法自轉化體提取質體，且使用由SEQ ID NO: 20及24中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為用於接合kpsS基因擴增片段之質體的引子集且使用由SEQ ID NO: 27及30中所示之核苷酸序列組成的合成DNA及由SEQ ID NO: 31及32中所示之核苷酸序列組成的合成DNA作為用於接合kpsFEDUCS基因擴增片段之質體的引子集來執行PCR反應。因此，檢查到分別獲得表現基因之質體，該等質體分別指定為pMW118-kpsS及pMW118-kpsFEDUCS。實例 5

使用保留基因表現質體-1之菌株的肝素前體製造測試 將實例4中獲得之pMW118質體及pMW118-PuspA-kpsS、pMW118-PuspA-kpsCS及pMW118-PuspA-kpsFEDUCS分別轉化為實例1中獲得之NY菌株。將所獲得轉化體分別指定為NY/pMW118菌株、NY/pMW118-PuspA-kpsS菌株、NY/pMW118-PuspA-kpsCS菌株及NY/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS菌株。

將上文獲得之轉化體接種至含有含100 mg/L安比西林之5 mL LB培養基的大測試管中，且在37℃下培養15小時。將1%培養溶液接種至含有含100 mg/L安比西林之5 mL R培養基的測試管中[其中20 g/L葡萄糖、13.5 g/L磷酸二氫鉀、4 g/L磷酸二銨、1.7 g/L檸檬酸、1 g/L硫酸鎂七水合物、10 mg/L鹽酸噻胺及10 mL/L痕量礦物質溶液經5 mol/L氫氧化鈉調節以使得pH變成pH 6.8，且在高壓釜滅菌(在120℃下20分鐘)之後單獨添加葡萄糖及硫酸鎂七水合物]，且在37℃下培養24小時。另外，在不含有安比西林之條件下對NY菌株執行相同操作。

藉由描述於實例3中之方法處理所獲得培養溶液且量測積聚於培養溶液中的肝素前體之量。結果展示於表2中。

[表2]

菌株	所積聚之肝素前體之量(mg/L)
NY	192
NY/pMW118	220
NY/pMWl 18-PuspA-kpsS	349
NY/pMWl18-PuspA-kpsCS	328
NY/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS	348

如表2中所展示，在表現kpsS之NY/pMW118-PuspA-kpsS菌株中，相較於母體菌株NY及僅保留pMW118載體之NY/pMW118菌株中的量，所積聚之肝素前體之量明顯增加。

同時，基於表現kpsC及kpsS之NY/pMW118-PuspA-kpsCS菌株以及表現kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC及kpsS之NY/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS菌株展示與NY/pMW118-PuspA-kpsS菌株幾乎相同的肝素前體產率的結果，已發現藉由增強kpsFEDUCS (其為肝素前體製造基因組)中之僅kpsS之表現足以獲得提高肝素前體製造能力的效果。實例 6

使用保留基因表現質體-2之菌株的肝素前體製造測試 將實例4中獲得之pMW118質體及pMW118-PuspA-kpsS、pMW118-PuspA-kpsCS及pMW118-PuspA-kpsFEDUCS分別轉化為大腸桿菌Nissle之野生型菌株。將所獲得轉化體分別指定為N/pMW118菌株、N/pMW118-PuspA-kpsS菌株、N/pMW118-PuspA-kpsCS菌株及N/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS菌株。

將上文獲得之轉化體接種至含有含100 mg/L安比西林之5 mL LB培養基的大測試管中，且在37℃下培養15小時。將1%培養溶液接種至含有含100 mg/L安比西林之5 mL R培養基的測試管中[其中20 g/L葡萄糖、13.5 g/L磷酸二氫鉀、4 g/L磷酸二銨、1.7 g/L檸檬酸、1 g/L硫酸鎂七水合物、10 mg/L鹽酸噻胺及10 mL/L痕量礦物質溶液經5 mol/L氫氧化鈉調節以使得pH變成pH 6.8，且在高壓釜滅菌(在120℃下20分鐘)之後單獨添加葡萄糖及硫酸鎂七水合物]，且在37℃下培養24小時。另外，在不含有安比西林之條件下對野生型Nissle菌株執行相同操作。

藉由描述於實例3中之方法處理所獲得培養溶液且量測積聚於培養溶液中的肝素前體之量。結果展示於表3中。

[表3]

菌株	所積聚之肝素前體之量(當野生型Nissle菌株為1.0時的比率)
Wild-type Nissle菌株	1.0
N/pMW 118	0.9
N/pMW 118-PuspA-kpsS	3.3
N/pMW 118-PuspA-kpsCS	1.7
N/pMW 118-PuspA-kpsFEDUCS	1.8

如表3中所展示，在表現kpsS之N/pMW118-PuspA-kpsS菌株中，相較於母體野生型Nissle菌株及僅保留pMW118載體之N/pMW118菌株中的量，所積聚之肝素前體之量增加三倍或更多倍。

同時，在表現kpsC及kpsS之N/pMW118-PuspA-kpsCS菌株以及表現kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC及kpsS之N/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS菌株中，效價提高母體菌株的至多1.8倍。在此方面，已發現藉由增強肝素前體製造基因組kpsFEDUCS當中的僅kpsS之表現足以獲得提高肝素前體製造能力的效果，且當未增強而非增強kpsC及kpsFEDU之表現時，肝素前體製造能力變得更高。

雖然已參考本發明之特定實施例詳細描述本發明，但是對熟習此項技術者而言，在不偏離本發明之精神及範疇的情況下，可對其作出各種改變及修改。本文中所引用之所有參考文獻以全文併入本文中。本申請案係基於2020年4月3日申請的國際申請案第PCT/JP2020/015384號，其全部內容以引用之方式併入其中。

[圖1]圖1展示大腸桿菌K5菌株之染色體上的肝素前體合成基因簇之示意圖。 [圖2]圖2展示參與肝素前體製造之酶之示意圖。 [圖3]圖3展示肝素前體生物合成路徑之示意圖。

Claims (13)

1. 一種肝素前體之製造方法，其包含： 在培養基中培養具有以下基因修飾(1)且具有肝素前體製造能力之大腸桿菌屬(the genus Escherichia)細菌，以在該培養基中製造肝素前體： (1)增加kpsS基因之表現的基因修飾。
2. 如請求項1之肝素前體之製造方法，其中該大腸桿菌屬細菌進一步具有以下基因修飾(2)及(3)中之至少一者： (2)增加至少一種選自以下之基因之表現的基因修飾：kfiA基因、kfiB基因、kfiC基因及kfiD基因；及 (3)造成yhbJ基因之功能喪失的基因修飾。
3. 如請求項1或2之肝素前體之製造方法，其中該基因修飾(1)為以下中之至少一者：修飾該kpsS基因之表現控制區及增加該kpsS基因之複本數。
4. 如請求項2或3之肝素前體之製造方法，其中該基因修飾(2)為以下中之至少一者：修飾至少一種選自該kfiA基因、該kfiB基因、該kfiC基因及該kfiD基因之基因的表現控制區域，及增加至少一種選自該kfiA基因、該kfiB基因、該kfiC基因及該kfiD基因之基因的複本數。
5. 如請求項2至4中任一項之肝素前體之製造方法，其中該基因修飾(3)為該yhbJ基因之缺失。
6. 如請求項1至5中任一項之肝素前體之製造方法，其中該大腸桿菌屬細菌為大腸桿菌(Escherichia coli)。
7. 如請求項1至6中任一項之肝素前體之製造方法，其中該kpsS基因為包含SEQ ID NO: 33中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 33中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。
8. 如請求項2至7中任一項之肝素前體之製造方法，其中 該kfiA基因為包含SEQ ID NO: 34中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 34中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA， 該kfiB基因為包含SEQ ID NO: 35中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 35中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA， 該kfiC基因為包含SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA，且 該kfiD基因為包含SEQ ID NO: 37中所示之核苷酸序列之DNA，或包含與SEQ ID NO: 37中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中增加時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。
9. 如請求項2至8中任一項之肝素前體之製造方法，其中該yhbJ基因為包含SEQ ID NO: 38中所示之核苷酸序列的DNA，或包含與SEQ ID NO: 38中所示之核苷酸序列具有90%或更大一致性之核苷酸序列且在表現量在該細菌中降低時具有增加具有該肝素前體製造能力之該大腸桿菌屬細菌之肝素前體製造能力之特性的DNA。
10. 如請求項1至9中任一項之肝素前體之製造方法，其中該大腸桿菌屬細菌不具有以下基因修飾(4)： (4)增加kpsC基因之表現的基因修飾。
11. 一種大腸桿菌屬細菌，其具有肝素前體製造能力且具有以下基因修飾(1)： (1)增加kpsS基因之表現的基因修飾。
12. 如請求項11之大腸桿菌屬細菌，其進一步具有以下基因修飾(2)及(3)中之至少一者： (2)增加至少一種選自以下之基因之表現的基因修飾：kfiA基因、kfiB基因、kfiC基因及kfiD基因；及 (3)造成yhbJ基因之功能喪失的基因修飾。
13. 如請求項11或12之大腸桿菌屬細菌，其不具有以下基因修飾(4)： (4)增加kpsC基因之表現的基因修飾。

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