JP2019069994A - 標的化剤としてのＧｌａドメイン - Google Patents

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Abstract

【課題】細胞膜上のホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）の標的化に関する診断剤および治療剤の提供。【解決手段】ガンマ−カルボキシグルタミン酸ドメインを含みプロテアーゼまたはホルモン結合ドメインを欠く単離されたポリペプチドを準備し、該ペプチドを細胞表面と接触させて、該ポリペプチドを細胞膜上のＰｔｄＳに結合させる方法。【選択図】図１

Description

本出願は２０１３年３月１５日付け出願の米国仮特許出願第６１／７８７，７５３号お
よび２０１３年３月１５日付け出願の米国仮特許出願第６１／７９１，５３７号（それら
の全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に基づく優先権の利益を主張す
るものである。
１．分野
本開示は、Ｇｌａドメインペプチドおよびポリペプチドを使用する、細胞膜上のホスフ
ァチジルセリン（ＰｔｄＳ）の標的化に関する。診断剤および治療剤としてのこれらのペ
プチドおよびポリペプチドの使用を開示する。
２．関連技術
ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）は、通常は細胞膜の内部小葉（ｉｎｎｅｒ−ｌｅａ
ｆｌｅｔ）（細胞膜側）に局在している負荷電リン脂質成分である。しかし、ＰｔｄＳは
内部小葉から外部小葉へとスクランブラーゼ（フリッパーゼファミリーのメンバー）によ
り輸送され、細胞表面上に露出されうる。非常に少数の例外を除き、ＰｔｄＳのこの活性
外在化は細胞損傷に対する応答である（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅら，２００１；Ｅ
ｒｗｉｇおよびＨｅｎｓｏｎ，２００８）。例えば、組織損傷は血小板、白血球および内
皮細胞にシグナル伝達して、ＰｔｄＳを迅速かつ可逆的に再分布させ、これは細胞表面上
の補体活性化および凝固の促進を招く。同様に、アポトーシスシグナルはＰｔｄＳの外在
化を引き起こすが、これはより穏やか且つ持続的な様態で生じる。この外部ＰｔｄＳは、
マクロファージが周辺組織からの瀕死細胞を摂取することを可能にする鍵認識マーカーを
与える（ＥｒｗｉｇおよびＨｅｎｓｏｎ，２００８）。この除去プロセスは組織恒常性に
必須であり、「健常」環境においてはそれは極めて効率的である。実際、１日当たり＞１
０９個の細胞の喪失にもかかわらず、アポトーシス細胞の組織学的検出は正常組織におい
ては稀な事象である（ＥｌｌｔｉｏｔおよびＲａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ，２０１０；Ｅｌ
ｌｔｉｏｔら，２００９）。しかし、多数の病態においては、アポトーシス細胞除去のプ
ロセスが圧倒され、遅延し、または存在しないという証拠が存在する（Ｅｌｌｔｉｏｔお
よびＲａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ，２０１０；Ｌａｈｏｒｔｅら，２００４）。例えば、幾
つかの腫瘍学研究は、高いアポトーシス指数がより高い悪性度の腫瘍、転移速度の増加お
よび患者の予後不良に関連づけられることを示唆している（Ｎａｒｅｓｈら，２００１；
Ｌｏｏｓｅら，２００７；Ｋｕｒｉｈａｒａら，２００８；Ｋｉｅｔｓｅｌａｅｒら，２
００２）。これらの研究およびそれらの類似研究は、アポトーシスおよび外部ＰｔｄＳ発
現が疾患の強力なマーカーでありうることを示唆している（ＥｌｌｔｉｏｔおよびＲａｖ
ｉｃｈａｎｄｒａｎ，２０１０）。
アニオン性リン脂質表面に対して高いアフィニティを有する幾つかのタンパク質が存在
し、アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）−ＶがＰｔｄＳ標的化プローブとして最も広く利用さ
れている（Ｌａｈｏｒｔｅら，２００４）。ＰｔｄＳ含有小胞に対する高いアフィニティ
（Ｋｄ＝０．５〜７ｎＭ）および腎臓濾過のための閾値（約６０ｋＤａ）未満である分子
量（３７ｋＤａ）を有するアネキシン−Ｖはアポトーシスプローブとして臨床において有
望であることが示されている（Ｌｉｎら，２０１０；ＴａｉｔおよびＧｉｂｓｏｎ，１９
９２）。更に、それは、腫瘍学、神経学および心臓病学を含む広範な適応症に利用されて
いる（Ｌａｈｏｒｔｅら，２００４；Ｂｏｅｒｓｍａら，２００５；Ｂｌａｎｋｅｎｂｅ
ｒｇ，２００９；Ｒｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅｒｇｅｒら，２００２）。ＰｔｄＳ細胞表面
発現を標的化する生物学的プローブの使用がインビトロおよびインビボの両方で示されて
いる。臨床におけるそれらの有用性は有望ではあるが、それらは大部分が未開発なままで
ある。
概要
したがって、本開示においては、（ａ）ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ド
メインを含みプロテアーゼまたはホルモン結合ドメインを欠く単離されたポリペプチドを
準備し、（ｂ）該ペプチドを細胞表面と接触させて、該ポリペプチドを細胞膜上のＰｔｄ
Ｓに結合させることを含む、細胞膜ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）を標的化する方法
を提供する。細胞膜は心細胞膜、神経細胞膜、内皮細胞膜、ウイルス感染細胞膜、アポト
ーシス細胞膜、血小板膜または癌細胞膜でありうる。該ポリペプチドは更に、ＥＧＦ結合
ドメイン、クリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインおよび／または芳香族アミノ酸スタッ
クドメインを含みうる。Ｇｌａドメインは第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ
因子、プロテインＳまたはプロテインＣからのものでありうる。
該ポリペプチドは更に、検出可能な標識、例えば蛍光標識、化学発光標識、放射能標識
、酵素、色素またはリガンドを含みうる。該ポリペプチドは更に、治療剤（治療用物質）
、例えば抗癌剤、例えば化学療法剤、放射線療法、サイトカイン、ホルモン、抗体もしく
は抗体フラグメントまたは毒素、または抗ウイルス剤を含みうる。該治療剤は、酵素、例
えばプロドラッグ変換酵素、サイトカイン、増殖因子、凝固因子または抗凝固剤でありう
る。該ポリペプチドは３００残基以下、２００残基以下または１００残基以下、例えば、
１００〜２００および１００〜３００残基でありうる。
該ポリペプチドは５〜１５個のＧｌａ残基、９〜１３個のＧｌａ残基、例えば、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のＧｌａ残基を含みうる。該
ポリペプチドは、１３個を超えるＧｌａ残基を含むが、３０％未満の全Ｇｌａ残基しか含
んでいないことが可能である。該ポリペプチドは約４．５〜３０ｋＤａのサイズを有しう
る。該ポリペプチドは少なくとも１つのジスルフィド結合または２〜５個のジスルフィド
結合を含みうる。該ポリペプチドはプロテインＳ Ｇｌａドメインを含みうる。該ポリペ
プチドはプロテインＳ Ｇｌａドメイン＋プロテインＳ ＥＧＦドメイン、プロトロンビ
ンＧｌａドメイン、プロトロンビンＧｌａ＋プロトロンビンクリングルドメイン、プロテ
インＺ Ｇｌａドメイン、プロテインＺ Ｇｌａドメイン＋プロトロンビンクリングルド
メイン、第ＶＩＩ因子Ｇｌａドメインまたは第ＶＩＩ因子Ｇｌａドメイン＋プロトロンビ
ンクリングルドメインを含みうる。該ポリペプチドは更に、抗体Ｆｃ領域を含みうる。前
記のものはいずれも、前記タンパク質の天然配列の保存的置換を含有することが可能であ
り、および／または記載されている天然ドメインに対する相同性を示しうる。
もう１つの実施形態においては、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメイン
を含みプロテアーゼまたはホルモン結合ドメインを欠く単離されたポリペプチドを対象に
投与することを含む、対象における癌の治療方法を提供し、ここで、該ポリペプチドは治
療用ペイロード（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐａｙｌｏａｄ）に連結されている。該治療
用ペイロードは化学療法剤、放射線療法または毒素でありうる。癌は乳癌、脳癌、胃癌、
肺癌、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、結腸癌、皮膚癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、肝臓癌
、膵臓癌、頭頸部癌または食道癌でありうる。
更にもう１つの実施形態においては、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメ
インを含みプロテアーゼまたはホルモン結合ドメインを欠く単離されたポリペプチドを対
象に投与することを含む、対象におけるウイルス疾患の治療方法を提供し、ここで、該ポ
リペプチドは抗ウイルス剤に連結されている。該ウイルス疾患はインフルエンザ、ヒト免
疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、天然痘ウイルス、呼吸器合胞体ウ
イルス、朝鮮出血熱ウイルス、水痘、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１ま
たは２、エプスタイン−バーウイルス、マールブルグウイルス、ハンタウイルス、黄熱病
ウイルス、Ａ、Ｂ、ＣまたはＥ型肝炎、エボラウイルス、ヒトパピローマウイルス、ライ
ノウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、狂
犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ロタウイルス、ＨＴＬＶ−１および２であり
うる。
本明細書に記載されているいずれかの方法または組成物はいずれかの他の方法または組
成物に関して実施されうる。
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかし、
本開示の精神および範囲内の種々の変更および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らか
となるため、そのような詳細な説明および特定の実施例は、本開示の特定の実施形態を示
しているものの、単なる例示として記載されているに過ぎないと理解されるべきである。
以下の図面は本明細書の一部を構成し、本開示の或る態様を更に実証するものとして含
まれる。本開示は、詳細な説明と共にこれらの図面の１以上を参照して更に深く理解され
うる。
ＧｌａおよびＧｌａ−ＥＧＦ／クリングルドメインタンパク質のパネルの構 築。 発現に関するＧｌａドメインタンパク質構築物の試験。２９３ｃｅｌｌＦｅｃｔｉｎを使用する２９３細胞内への一過性トランスフェクション。１０％ ゲル（還元サンプル含有）、２３．３μｌのローディングされた培地。 発現に関するＧｌａドメインタンパク質構築物の試験。ＢＨＫ２１細胞における一過性トランスフェクション。１０％ ゲル（還元サンプル含有）、２０μｌ（全細胞ペレットの１／１００の）がローディングされた。 シグナル配列の変化は分泌を変化させる。ＢＨＫ２１細胞における一過性トランスフェクション。１０％ ゲル（還元サンプル含有）、１３．３μｌがローディングされた。 プロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦ配列。 プロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦの精製。Ｆ１〜Ｆ４はカラムクロマトグラフィー画分である。１０％ ゲル、非還元条件。 プロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦに関するアポトーシスアッセイ。上および下パネルは同一の重複実験操作を表す。ただし、プロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦの量は低減され、抗Ｈｉｓドメイン抗体の量は低減された。 プロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦに関するアポトーシスアッセイ。上および下パネルは同一の重複実験操作を表す。ただし、使用されたアネキシンＶの量は下パネルにおいては２倍である。
例示的実施形態の説明
アネキシンと同様に、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）−ドメインタンパク
質、例えば第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣおよびプロ
テインＳはアニオン性膜に結合する。実際、アポトーシス特異的プローブとなるように合
理的に設計された小分子のモデルとして、Ｇｌａ−ドメインが使用されている（Ｃｏｈｅ
ｎら，２００９）。ここで、本発明者らは、アポトーシスおよび疾患に特異的な生物学的
プローブの新規クラスとしてのこれらのＧｌａ−ドメインタンパク質の膜標的化部分の利
用を提示する。これらの天然に存在する標的化タンパク質の使用は、より小さいサイズ（
＜３０ｋＤａ）という付加的利点と共に、現在のプローブと比較して増強した特異性をも
たらしうる。ＥＧＦおよび／またはクリングルドメインを含む、より大きな実施形態にお
いてさえも、これらのタンパク質はアネキシンＶ（３７ｋＤａ）より尚も小さくなること
が可能であり、潜在的には僅か＜５ｋＤａとなりうる。これらの生物学的プローブはイン
ビトロおよびインビボの両方においてＰｔｄＳ細胞表面発現を標的化しうる。したがって
、アフィニティ、特異性およびサイズにおいてアネキシンＶより優れており、治療剤とし
ての使用の付加的可能性を有するアポトーシス／疾患標的化プローブを開発することが可
能である。本開示のこれらの及び他の態様を以下に更に詳細に説明する。
適当な場合には、単数形で用いられる用語は複数形対象物をも含み、その逆も成り立つ
。後記のいずれかの定義がいずれかの他の文書（参照により本明細書に組み入れるいずれ
かの文書を含む）におけるその語の用法に矛盾する場合には、反対の意味が明らかに意図
される場合（例えば、その語が元来用いられている文書における場合）を除き、本明細書
およびその添付の特許請求の範囲の解釈の目的においては後記の定義が常に優先するもの
とする。特に示されていない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。
本明細書における単数形の使用は、特に示されていない限り、または「１以上」の使用が
明らかに不適切である場合を除き、「１以上」を意味する。「含む」、「含み」、「包含
する」および「包含し」の使用は互換的であり、限定的ではない。例えば、「含む」なる
語は「〜を含むが、〜に限定されない」ことを意味するものとする。「約」なる語は、示
されている数のプラスまたはマイナス５％を意味する。
本明細書中で用いる「単離されたペプチドまたはポリペプチド」は、異なる配列を有す
るペプチドまたはポリペプチドを含む、他の生物学的分子を実質的に含有しないペプチド
またはポリペプチドを意味すると意図される。幾つかの実施形態においては、単離された
ペプチドまたはポリペプチドは乾燥重量で少なくとも約７５％、約８０％、約９０％、約
９５％、約９７％、約９９％、約９９．９％または約１００％純粋である。幾つかの実施
形態においては、純度は例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動またはＨＰＬＣ分析のような方法により測定されうる。
本明細書中で用いる「保存的置換」は、ポリペプチドの修飾であって、１以上のアミノ
酸を、該ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の喪失を引き起こさない類似生化学
的特性を有するアミノ酸で置換することを含むものを意味する。「保存的アミノ酸置換」
は、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似側鎖
を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定められている。これらのファ
ミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、
酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖
を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン
、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、
ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）
、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および
芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、
ヒスチジン）を含む。本開示の抗体は１以上の保存的アミノ酸置換を有することが可能で
あり、尚も抗原結合活性を保有しうる。
核酸およびポリペプチドの場合、「実質的な相同性」なる語は、２つの核酸または２つ
のポリペプチドまたは示されているそれらの配列が、最適にアライメント（整列）され比
較された場合に、適当なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入または欠失を伴って、ヌクレ
オチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、通常は少なくとも約８５％、幾つかの実施
形態においては、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、少なくとも
１つの実施形態においては、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約９６％、９７％
、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％または９９．５％
において同一であることを示す。あるいは、核酸に関する実質的な相同性が存在するのは
、選択的なハイブリダイゼーション条件下、鎖の相補体に断片がハイブリダイズする場合
である。また、本明細書中に挙げられている特定の核酸配列およびアミノ酸配列に対する
実質的な相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列も含まれる。
２つの配列の間の同一性（％）は、それらの２つの配列の最適アライメントのために導
入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した場合の、それらの配
列により共有される同一位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総
数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性（％）の決定は、限定的
なものではないがＶｅｃｔｏｒＮＴＩＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸＴＭモジュールのような数学的アルゴリズムを使用し
て達成されうる。ＡｌｉｇｎＴＭの場合、多重アライメントのデフォルトパラメータはギ
ャップ・オープニング・ペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャッ
プ分離ペナルティ範囲：８；アライメント遅延に関する％同一性：４０である（更なる詳
細は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ＬＩＮＮＥＡ
−Ｏｎｌｉｎｅ−Ｇｕｉｄｅｓ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ／Ｖｅｃｔｏｒ
−ＮＴＩ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｎａｌｙｓｉｓ−ａｎｄ−ｄａｔ
ａ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｓｏｆｔｗａｒｅ−ｆｏｒ−ＰＣｓ／ＡｌｉｇｎＸ−Ｍｏｄ
ｕｌｅ−ｆｏｒ−Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ａｄｖａｎｃｅ．ｒｅｇ．ｕｓ．ｈｔｍｌにお
けるワールド・ワイド・ウェブを参照されたい）。
クエリー（問い合わせ）配列（本開示の配列）と対象配列との間の最良の全体的マッチ
（グローバル配列アライメントとも称される）を決定するためのもう１つの方法は、ＣＬ
ＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ，１９９４，２（２２）：４６７３−４６８０）を使用して決定されることが
可能であり、これはＨｉｇｇｉｎｓら，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ），１９９２，８（２）：１８９
−１９１のアルゴリズムに基づく。配列アライメントにおいては、クエリーおよび対象配
列は共にＤＮＡ配列である。グローバル配列アライメントの結果は同一性（％）で表され
る。ペアワイズアライメントにより同一性（％）を計算するためにＤＮＡ配列のＣＬＵＳ
ＴＡＬＷアライメントにおいて使用されうるパラメータはマトリックス＝ＩＵＢ、ｋ−タ
プル（ｔｕｐｌｅ）＝１、上部対角線（Ｔｏｐ Ｄｉａｇｏｎａｌｓ）の数＝５、ギャッ
プ・ペナルティ＝３、ギャップ・オープン・ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ
＝０．１である。多重アライメントには、以下のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメータが使用され
うる：ギャップ・オープニング・ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．０５
；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アライメント遅延に関する％同一性＝４０。
核酸は全細胞中に、細胞ライセート中に、または部分精製された若しくは実質的に純粋
な形態として存在しうる。核酸が「単離されている」または「実質的に純粋にされている
」と言えるのは、それが天然環境で通常付随している他の細胞成分から精製されている場
合である。核酸を単離するためには、以下のような標準的な技術が用いられうる：アルカ
リ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳
動および当技術分野でよく知られている他の技術。
Ｉ．ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）
Ａ．構造および合成
ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ、Ｐｔｄ−Ｌ−ＳｅｒまたはＰＳと略される）は、フ
リッパーゼと称される酵素により細胞膜の内部小葉（サイトゾル側）上で通常は維持され
るリン脂質成分である。細胞がアポトーシスを受けると、ホスファチジルセリンはもはや
膜のサイトゾル部分に局在せず、細胞の表面上に露出されるようになる。ＰｔｄＳの化学
式はＣ１３Ｈ２４ＮＯ１０Ｐであり、３８５．３０４の分子量を有する。その構造は以下
のとおりである。
Figure 2019069994
ホスファチジルセリンは、アミノ酸セリンをＣＤＰ（シチジン二リン酸）活性化ホスフ
ァチジン酸と縮合させることにより、細菌において生合成される。哺乳類においては、ホ
スファチジルセリンはホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンとの
塩基交換反応により産生される。逆に、ホスファチジルセリンはまた、ホスファチジルエ
タノールアミンおよびホスファチジルコリンを与えうる。尤も、動物においては、ホスフ
ァチジルセリンからホスファチジルコリンを産生する経路は肝臓内でのみ機能するのであ
るが。
Ｂ．機能
ホスファチジルセリンの初期研究はウシの脳から化学物質を蒸留した。現在の研究およ
び商業的に入手可能な製品は、狂牛病に関する懸念ゆえに、ダイズから製造される。ダイ
ズ製品におけるセリンに結合している脂肪酸はウシ製品におけるものと同一ではなく、そ
してまた、不純物である。ラットにおける予備的研究は、ダイズ製品が少なくともウシ由
来製品と同程度に強力であることを示している。
米国ＦＤＡはホスファチジルセリンに「限定的健康強調表示（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｈ
ｅａｌｔｈ ｃｌａｉｍ）」のステータスを付与しており、「ホスファチジルセリンの摂
取は高齢者における痴呆のリスクを低減しうる」および「ホスファチジルセリンの摂取は
高齢者における認知機能障害のリスクを低減しうる」と述べている。
ホスファチジルセリンは、サイクリング、ウェイトトレーニングおよび持久走に関わる
運動選手における回復を加速し、筋肉痛を予防し、健康状態を改善することが実証されて
おり、そのような運動選手におけるエルゴジェニック特性を有しうるであろう。ダイズ−
ＰｔｄＳは用量依存的（４００ｍｇ）に、コルチゾールレベルの運動誘発性上昇を鈍化さ
せることにより運動誘発性ストレスに対処するのに有効なサプリメントであることが報告
されている。ＰｔｄＳの補給は運動選手にとっての望ましいホルモンバランスを促し、過
剰トレーニングおよび／または過剰ストレッチングに伴う生理的悪化を低減しうるであろ
う。最近の研究において、ＰｔｄＳは精神的ストレス中の若者のコホートにおける気分を
向上させ、ゴルファーのストレス抵抗性を増強することによりティーショット中の精度を
改善することが示されている。最初の予備研究は、ＰｔｄＳ補給が、注意欠陥多動性障害
を有する子供に有益でありうることを示している。
伝統的に、ＰｔｄＳサプリメント（補給物）はウシ大脳皮質（ＢＣ−ＰＳ）に由来する
ものであったが、感染性疾患の伝染の可能性ゆえに、ダイズ由来ＰＳ（Ｓ−ＰＳ）が潜在
的な安全な代替物として確立されている。ダイズ由来ＰＳは米国食品医薬局により一般に
安全だと認定されており（ＧＲＡＳ）、１日３回、２００ｍｇまでの投与量で摂取されれ
ば、高齢者用の安全な栄養サプリメントとなる。ホスファチジルセリンはマウスにおける
特異的免疫応答を低減することが示されている。
ＰｔｄＳは肉において見出されうるが、脳内ならびに肝臓および腎臓のような内臓内に
最も豊富に存在する。乳製品においては、または白豆を除く植物においては、少量のＰＳ
が見出されうるに過ぎない。
アネキシン−Ａ５は、ＰｔｄＳに対する強力な結合アフィニティを有する天然に存在す
るタンパク質である。標識アネキシン−Ａ５はインビトロまたはインビボで細胞の初期な
いし中期のアポトーシス状態における細胞の可視化を可能にする。もう１つのＰｔｄＳ結
合タンパク質はＭｆｇｅ８である。テクネチウム標識アネキシン−Ａ５は悪性腫瘍と良性
腫瘍との識別を可能にし、それらの病理は、良性腫瘍における低率のアポトーシスと比較
された場合の、悪性腫瘍における高率の細胞分裂およびアポトーシスを含む。
ＩＩ．Ｇｌａドメインタンパク質
Ａ．Ｇｌａドメイン
Ｇｌａ−ドメインタンパク質の一般構造はＧｌａドメインおよびそれに続くＥＧＦドメ
インおよびそれに続くＣ末端セリンプロテアーゼドメインの構造である。例外は、ＥＧＦ
ドメインの代わりにクリングルドメインを含有するプロトロンビン、およびセリンプロテ
アーゼドメインを有さないが、その代わりに性ホルモン結合性グロブリン様（ＳＨＢＧ）
ドメインを有するプロテインＳである（ＨａｎｓｓｏｎおよびＳｔｅｎｆｌｏ，２００５
）。アニオン性膜に対するＧｌａ−ドメインタンパク質のアフィニティは様々である。大
雑把に言うと、それらは以下の３つの範疇に含まれる：１）３０〜５０ｎＭのＫｄを有す
る高アフィニティ結合体、２）１００〜２００ｎＭのＫｄを有する中アフィニテイ結合体
、および３）１０００〜２０００ｎＭのＫｄを有する低アフィニティ結合体。高アフィニ
ティＧｌａドメインタンパク質は、プロテインＳを含有するアニオン性膜に結合すること
が示されており、このことは特に、アポトーシス細胞への、ＰｔｄＳとのその相互作用を
介した結合を示している（Ｗｅｂｂら，２００２）。低アフィニティＧｌａドメインタン
パク質は、細胞膜に結合するために二次受容体を用いる。例えば、ＦＶＩＩは組織因子（
ＴＦ）を用いる。Ｇｌａドメイン／第１ ＥＧＦドメインはＦＶＩＩの高アフィニティＴ
Ｆ結合ドメインを構成すると考えられている。このアプローチに関して重要なことに、結
腸直腸癌、ＮＳＣＬ癌および乳癌を含む癌細胞の表面上のＴＦアップレギュレーションを
示している多数の研究が存在し、これらの高いＴＦレベルは予後不良に関連づけられてい
る（Ｙｕら，２００４）。アニオン性膜に対するアフィニティはＦＶＩＩに関しては比較
的低いが、癌における実証されているＴＦアップレギュレーションと共に高アフィニティ
ＴＦ相互作用の付加はそれを潜在的に興味深い癌特異的プローブにする。
Ｂ．Ｇｌａドメイン含有タンパク質
１．第ＩＩ因子
凝固第ＩＩ因子としても公知であるプロトロンビンはタンパク質分解切断されて凝固カ
スケードにおいてトロンビンを形成し、これは最終的に出血の抑制をもたらす。トロンビ
ンは今度はセリンプロテアーゼとして作用し、これは可溶性フィブリノーゲンを不溶性フ
ィブリン鎖へと変換し、多数の他の凝固関連反応を触媒する。それは主として肝臓で発現
される。
プロトロンビンをコードする遺伝子は第１１染色体上の動原体の領域内に位置する。そ
れは１４個のエキソンから構成され、２４キロベースのＤＮＡを含有する。該遺伝子はシ
グナル領域、プロペプチド領域、グルタミン酸ドメイン、２個のクリングル領域および触
媒ドメインをコードしている。酵素ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼは、ビタミンＫ
の存在下、Ｎ末端グルタミン酸残基をガンマ−カルボキシグルタミン酸残基へと変換する
。これらのガンマ−カルボキシグルタミン酸残基は血小板膜上のリン脂質へのプロトロン
ビンの結合に必要である。
遺伝性第ＩＩ因子欠乏症は、低プロトロンビン血症としてプロトロンビンの全体的合成
の低減を、またはプロトロンビン異常症として機能不全プロトロンビンの合成を現しうる
常染色体劣性遺伝疾患である。ホモ接合個体は一般に無症候性であり、２〜２５％の機能
的プロトロンビンレベルを有する。しかし、症候性個体は、あざができやすくなること、
鼻出血、軟部組織出血、過剰術後出血および／または月経過多を示しうる。
プロトロンビンは慢性蕁麻疹、自己免疫疾患および種々の血管障害における役割におい
て或る役割を果たしている。青色皮斑血管障害は免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｍ抗ホスファチ
ジルセリン−プロトロンビン複合体抗体に関連している。上部ないし中央真皮における組
織病理学的壊死性血管炎症および抗ホスファチジルセリン−プロトロンビン複合体抗体の
存在は皮膚結節性多発動脈炎ではなくアレルギー性皮膚血管炎を示す。
プロトロンビン欠乏症のほかに、プロトロンビンのもう１つの障害としてプロトロンビ
ン２０２１０ａ突然変異が挙げられる。静脈血栓塞栓症の家族性の原因であるプロトロン
ビン２０２１０ａ突然変異は血漿プロトロンビンのレベルの上昇およびそれに伴う血栓症
発生のリスク増大をもたらす。この障害の厳密なメカニズムは解明されていないが、プロ
トロンビン２０２１０ａ突然変異はプロトロンビン遺伝子の３’非翻訳領域内の２０２１
０におけるグアニンからアデニンへの置換を含む。この突然変異は該遺伝子のポリアデニ
ル化部位を変化させ、ｍＲＮＡ合成の上昇およびそれに続くタンパク質発現の上昇をもた
らす。
２．第ＶＩＩ因子
第ＶＩＩ因子（かつてはプロコンベルチンとして公知）は、凝固カスケードにおいて血
液凝固を引き起こすタンパク質の１つである。第ＶＩＩ因子の遺伝子は第１３染色体（１
３ｑ３４）に位置する。それはセリンプロテアーゼクラスの酵素であり、ヒト第ＶＩＩａ
因子の組換え形態（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）は血友病患者における無制御な出血に関して米
国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ
）の承認を受けている。それは、安全性の懸念が存在するものの、重篤な制御不能な出血
においては無認可で使用されることもある。組換え活性化第ＶＩＩ因子の生物類似（Ｂｉ
ｏｓｉｍｉｌａｒ）形態（ＡｒｙｏＳｅｖｅｎ）はＡｒｙｏＧｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ
により製造されている。
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の主要役割は、組織因子（ＴＦ／第ＩＩＩ因子）と共に凝固
の過程を始動させることである。組織因子は血管の外側に見出され、通常は血流にさらさ
れない。血管損傷に際して、組織因子は血液および循環する第ＶＩＩ因子にさらされる。
ＦＶＩＩは、ＴＦに結合すると、トロンビン（第ＩＩａ因子）、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因
子、第ＸＩＩａ因子およびＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体自体を含む種々のプロテアーゼにより
ＦＶＩＩａへと活性化される。ＦＶＩＩａ−ＴＦの最も重要な基質は第Ｘ因子および第Ｉ
Ｘ因子である。第ＶＩＩ因子は組織因子（ＴＦ）と相互作用することが示されている。
該因子の作用は、凝固の開始のほぼ直後に放出される組織因子経路インヒビター（ＴＦ
ＰＩ）により阻害される。第ＶＩＩ因子はビタミンＫ依存的であり、それは肝臓で産生さ
れる。ワルファリンまたは類似抗凝固剤の使用はＦＶＩＩの肝合成を低減する。
欠乏症は稀であり（先天性プロコンベルチン欠乏症）、劣性遺伝する。第ＶＩＩ因子欠
乏症は血友病様出血障害として現れる。それは組換え第ＶＩＩａ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅ
ｎまたはＡｒｙｏＳｅｖｅｎ）で治療される。組換え第ＶＩＩａ因子は、置換凝固因子に
対するインヒビターを生じるようになった血友病患者（第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子
欠乏症を伴う）にも使用される。それは制御不能な出血の状況においても使用されている
が、この状況におけるその役割は、臨床試験以外でのその使用を支持する証拠が不十分で
あるため、議論の的となっている。出血におけるその使用の最初の報告は、１９９９年に
おける制御不能な出血を伴うイスラエル兵士におけるものであった。その使用のリスクは
動脈血栓症の増加を含む。
３．第ＩＸ因子
第ＩＸ因子（またはクリスマス因子）は凝固系のセリンプロテアーゼの１つである。そ
れはペプチダーゼファミリーＳ１に属する。第ＩＸ因子の遺伝子は第１０染色体（Ｘｑ２
７．１−ｑ２７．２）に位置し、したがって、Ｘ染色体連鎖劣性である。この遺伝子にお
ける突然変異は女性より男性において遥かに頻繁に影響を及ぼす。このタンパク質の欠乏
は血友病Ｂを引き起こす。第ＩＸ因子は、不活性前駆体であるチモーゲンとして産生され
る。それは、シグナルペプチドを除去するようにプロセシングされ、グリコシル化され、
ついで（接触経路の）第ＸＩａ因子または（組織因子経路の）第ＶＩＩａ因子により切断
されて、ジスルフィド架橋により鎖が連結された二本鎖形態を生成する。Ｃａ２＋、膜リ
ン脂質および第ＶＩＩＩ補因子の存在下、第ＩＸａ因子へと活性化されると、それは第Ｘ
因子における１つのアルギニン−イソロイシン結合を加水分解して第Ｘａ因子を生成する
。第ＩＸ因子はアンチトロンビンにより抑制される。
第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子は全て、血液凝固において中心的役割を果た
し、共通のドメイン構造を有する。第ＩＸ因子タンパク質は４つのタンパク質ドメインか
ら構成される。これらはＧｌａドメイン、ＥＧＦドメインの縦列コピーの２つ、および触
媒的切断を行うＣ末端トリプシン様ペプチダーゼドメインである。Ｎ末端ＥＧＦドメイン
は、少なくとも部分的に、組織因子への結合をもたらすことが示されている。Ｗｉｌｋｉ
ｎｓｏｎらは、第２ＥＧＦドメインの残基８８〜１０９が血小板への結合および第Ｘ因子
活性化複合体の構築をもたらすと結論づけている。全４個のドメインの構造は解明されて
いる。２つのＥＧＦドメインおよびトリプシン様ドメインの構造はブタタンパク質に関し
て決定された。Ｃａ（ＩＩ）依存的リン脂質結合をもたらすＧｌａドメインの構造もＮＭ
Ｒにより決定された。「超活性」突然変異体の幾つかの構造が解明されており、これらは
凝固カスケードにおける他のタンパク質による第ＩＸ因子活性化の性質を明らかにしてい
る。
第ＩＸ因子の欠乏はクリスマス病（血友病Ｂ）を引き起こす。第ＩＸ因子の１００個を
超える突然変異が記載されており、幾つかは症状を引き起こさないが、多くは有意な出血
障害を招く。組換え第ＩＸ因子が、クリスマス病を治療するために使用されており、Ｂｅ
ｎｅＦＩＸとして商業的に入手可能である。第ＩＸ因子の幾つかの希少突然変異は凝固活
性の上昇をもたらし、深部静脈血栓症のような凝固疾患を引き起こしうる。
４．第Ｘ因子
第Ｘ因子（スチュアート−プロワー因子；プロトロンビナーゼ）は凝固カスケードの酵
素である。ヒト第Ｘ因子遺伝子は第１３染色体（１３ｑ３４）に位置する。それはセリン
エンドペプチダーゼ（プロテアーゼ群Ｓ１）である。第Ｘ因子は肝臓で合成され、その合
成にビタミンＫを要する。第Ｘ因子は第ＩＸ因子（内因性Ｘアーゼとして公知の複合体に
おいて、その補因子である第ＶＩＩＩ因子を伴う）および第ＶＩＩ因子［その補因子であ
る組織因子（外因性Ｘアーゼとして公知の複合体）を伴う］の両方により第Ｘａ因子へと
活性化される。第Ｘ因子の半減期は４０〜４５時間である。したがって、それは最終共通
経路またはトロンビン経路の最初のメンバーである。それは、２つの位置（ａｒｇ−ｔｈ
ｒ結合およびついでａｒｇ−ｉｌｅ結合）でプロトロンビンを切断することにより作用し
、これは活性トロンビンを生成する。この過程は、第Ｘａ因子がプロトロンビナーゼ複合
体において活性化補因子Ｖと複合体形成した場合に最適化される。第Ｘ因子は新鮮凍結血
漿およびプロトロンビナーゼ複合体の一部である。唯一の商業的に入手可能な濃縮物は、
ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇにより製造された「第Ｘ因子Ｐ Ｂｅｈｒｉｎｇ」である。
第Ｘａ因子は、セリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）であるプロテインＺ依存
的プロテアーゼインヒビター（ＺＰＩ）により不活性化される。第Ｘａ因子に対するこの
タンパク質のアフィニティはプロテインＺの存在により１０００倍増加するが、第ＸＩ因
子の不活性化にはそれはプロテインＺを要しない。プロテインＺの欠損は第Ｘａ因子活性
の上昇および血栓症の傾向につながる。
第Ｘ因子の先天的欠乏症は非常に稀（１：５００，０００）であり、鼻出血（鼻血）、
関節血症（関節内への出血）および胃腸出血を示しうる。先天的欠乏症のほかに、低い第
Ｘ因子レベルが幾つかの病態において時々見られうる。例えば、第Ｘ因子欠乏症はアミロ
イドーシスにおいて見られることがあり、この場合、第Ｘ因子は血管系におけるアミロイ
ド線維に吸着される。また、ビタミンＫの欠乏またはワルファリン（または類似医薬）に
よる拮抗は不活性な第Ｘ因子の産生を招く。ワルファリン療法においては、これは、血栓
症を予防するために望ましい。２００７年後半の時点で、新たに出現した５個の抗凝固治
療薬のうちの４個がこの酵素を標的化した。直接的なＸａインヒビターは評判のよい抗凝
固剤である。
１９６０年代に開発された凝固の伝統的モデルは２つの別々のカスケード、すなわち、
外因性（組織因子（ＴＦ））経路および内因性経路を想定していた。これらの経路は共通
の一点、すなわち、第Ｘａ因子／第Ｖａ因子複合体の形成に収束し、これは、カルシウム
と共に、そしてリン脂質表面上に結合して、プロトロンビン（第ＩＩ因子）からトロンビ
ン（第ＩＩａ因子）を生成する。抗凝固の細胞ベースモデルである新規モデルは凝固にお
ける段階を更に詳細に説明するようである。このモデルは以下の３つの段階を有する：１
）ＴＦ含有細胞上の凝固の開始、２）該ＴＦ含有細胞上で産生されたトロンビンによるプ
ロコアグラントシグナルの増幅、および３）血小板表面上のトロンビン産生の伝播。
第１段階では、第ＶＩＩ因子は細胞の表面上の膜貫通タンパク質ＴＦに結合し、第ＶＩ
Ｉａ因子に変換される。それにより第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体が生じ、これは第Ｘ因子
および第ＩＸ因子の活性化を触媒する。ＴＦ含有細胞の表面上で生じた第Ｘａ因子は第Ｖ
ａ因子と相互作用してプロトロンビナーゼ複合体を形成し、これはＴＦ含有細胞の表面上
で少量のトロンビンを生成する。増幅段階である第２段階では、十分なトロンビンが生成
していれば、血小板および血小板関連補因子の活性化が生じる。トロンビン生成の第３段
階では、第ＸＩａは活性化血小板の表面上の遊離第ＩＸ因子を活性化する。活性化第ＩＸ
ａ因子は第ＶＩＩＩａ因子と共に「テナーゼ」複合体を形成する。この複合体はより多く
の第Ｘ因子を活性化し、今度はこれが第Ｖａ因子との新たなプロトロンビナーゼ複合体を
形成する。第Ｘａ因子は、大量のプロトロンビンを変換（「トロンビン・バースト（ｔｈ
ｒｏｍｂｉｎ ｂｕｒｓｔ）」）するプロトロンビナーゼ複合体の主要成分である。第Ｘ
ａ因子の各分子は１０００個のトロンビン分子を生成しうる。トロンビンのこの大発生は
フィブリン重合を引き起こして血栓を形成する。
第Ｘ因子の合成または活性の抑制は、現在使用されている多数の抗凝固物質の作用メカ
ニズムである。クマリンの合成誘導体であるワルファリンは米国で最も広く使用されてい
る経口抗凝固物質である。幾つかの欧州諸国においては、他のクマリン誘導体（フェノプ
ロクモン（ｐｈｅｎｐｒｏｃｏｕｍｏｎ）およびアセノクマロール（ａｃｅｎｏｃｏｕｍ
ａｒｏｌ））が使用されている。これらの物質はビタミンＫアンタゴニスト（ＶＫＡ）で
ある。ビタミンＫは第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第
Ｘ因子の肝合成に必須である。ヘパリン（未分画ヘパリン）およびその誘導体である低分
子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、血漿補因子であるアンチトロンビン（ＡＴ）に結合して、
幾つかの凝固因子第ＩＩａ、Ｘａ、ＸＩａおよびＸＩＩａ因子を不活性化する。
最近、第Ｘａ因子の新系統の特異的直接作用インヒビターが開発された。これらには、
薬物リバロキサバン（ｒｉｖａｒｏｘａｂａｎ）、アピキサバン（ａｐｉｘａｂａｎ）、
ベトリキサバン（ｂｅｔｒｉｘａｂａｎ）ＬＹ５１７７１７、ダレキサバン（ｄａｒｅｘ
ａｂａｎ）（ＹＭ１５０）、エドキサバン（ｅｄｏｘａｂａｎ）および８１３８９３が含
まれる。これらの物質は現在の療法に対する幾つかの理論的利点を有する。それらは経口
投与されうる。それらは迅速な作用発現を示す。そしてそれらは遊離第Ｘａ因子およびプ
ロトロンビナーゼ複合体中の第Ｘａ因子の両方を抑制する点で、第Ｘａ因子に対して、よ
り有効でありうる。
５．プロテインＳ
プロテインＳは、内皮において合成されるビタミンＫ依存性血漿糖タンパク質である。
循環中、プロテインＳは、遊離形態と、補体タンパク質Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ
）に結合した複合体形態との２つの形態で存在する。ヒトにおいては、プロテインＳはＰ
ＲＯＳ１遺伝子によりコードされる。プロテインＳの最もよく特徴づけられている機能は
抗凝固経路におけるその役割であり、これにおいて、それは第Ｖａ因子および第ＶＩＩａ
因子の不活性化におけるプロテインＣの補因子として機能する。
プロテインＳはカルボキシル化ＧＬＡドメインを介して負荷電リン脂質に結合しうる。
この特性は、アポトーシスを受けている細胞の除去においてプロテインＳが機能すること
を可能にする。アポトーシスは、望ましくない又は損傷した細胞を組織から除去するため
に身体により用いられる細胞死の一形態である。アポトーシス性である（すなわち、アポ
トーシスの過程にある）細胞は、それらの外膜におけるリン脂質の分布をもはや活発には
達成できず、したがって、ホスファチジルセリンのような負荷電リン脂質を細胞表面上に
提示し始める。健常細胞においては、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）依存的酵素が細胞膜
の外側小葉からこれらを除去する。これらの負荷電リン脂質はマクロファージのような食
細胞により認識される。プロテインＳは負荷電リン脂質に結合し、アポトーシス細胞と食
細胞との間の架橋分子として機能しうる。プロテインＳの架橋特性はアポトーシス細胞の
食作用を増強して、それが炎症のような組織損傷のいずれの徴候の発生をも伴うことなく
「綺麗に」除去されることを可能にする。
ＰＲＯＳ１遺伝子における突然変異は、血栓症のリスクの増大を招きうる稀な血液障害
であるプロテインＳ欠乏症を招きうる。プロテインＳは第Ｖ因子と相互作用することが示
されている。
６．プロテインＣ
オートプロトロンビンＩＩＡおよび血液凝固因子ＸＩＶとしても公知であるプロテイン
Ｃは酵素原（不活性）タンパク質であり、ヒトおよび他の動物において血液凝固、炎症、
細胞死の調節および血管壁の透過性の維持において重要な役割を果たす活性化形態である
。活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、主としてタンパク質第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ
因子をタンパク質分解的に不活性化することにより、これらの作用を達成する。ＡＰＣは
、その活性部位にセリンの残基を含有するため、セリンプロテアーゼとして分類される。
ヒトにおいては、プロテインＣはＰＲＯＣ遺伝子によりコードされ、これは第２染色体上
で見出される。
プロテインＣの酵素原形態は、血漿中を循環するビタミンＫ依存性糖タンパク質である
。その構造は、ジスルフィド結合により連結された軽鎖および重鎖からなる二本鎖ポリペ
プチドの構造である。プロテインＣチモーゲンは、凝固に深く関与しているもう１つのタ
ンパク質であるトロンビンにそれが結合した際に活性化され、プロテインＣの活性化はト
ロンボモジュリンおよび内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）の存在により著しく促進さ
れる。ＥＰＣＲの役割ゆえに、活性化プロテインＣは主として内皮細胞（すなわち、血管
壁を構成する細胞）の近傍で見出され、ＡＰＣが影響を及ぼすのはこれらの細胞および白
血球である。抗凝固因子としてプロテインＣが果たす決定的に重要な役割ゆえに、プロテ
インＣの欠乏またはＡＰＣに対する何らかの種類の抵抗性を示す者は、危険な血液凝固（
血栓）を形成する有意に増大したリスクを有する。
活性化ドロトレコギンアルファ（ブランド名Ｘｉｇｒｉｓ）としても公知の活性化プロ
テインＣの臨床使用への研究は議論の的となっている。製造業者であるＥｌｉ Ｌｉｌｌ
ｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙは、重篤な敗血症および敗血性ショックを有する者における
その使用を促進するために積極的な販売促進キャンペーン（例えば、２００４ Ｓｕｒｖ
ｉｖｉｎｇ Ｓｅｐｓｉｓ Ｃａｍｐａｉｇｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓのスポンサー）を
行った。しかし、それは生存を改善しない（そして出血リスクを上昇させる）ため、その
使用は推奨できないことを、２０１１コクラン・レビュー（Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｒｅｖｉ
ｅｗ）は見出した。
ヒトプロテインＣは、プロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子のよ
うな血液凝固に影響を及ぼす他のビタミンＫ依存性タンパク質に構造的に類似したビタミ
ンＫ依存性糖タンパク質である。プロテインＣの合成は肝臓内で生じ、一本鎖前駆体分子
（３２アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドおよびそれに続くプロペプチド）から開始され
る。プロテインＣは、Ｌｙｓ１９８およびＡｒｇ１９９のジペプチドが除去される際に形
成される。これは、各鎖上にＮ結合炭水化物を有するヘテロ二量体への変換を引き起こす
。該タンパク質は、Ｃｙｓ１８３とＣｙｓ３１９との間でジスルフィド結合により連結さ
れた１本の軽鎖（２１ｋＤａ）および１本の重鎖（４１ｋＤａ）を有する。
不活性プロテインＣは以下の複数のドメイン内に４１９アミノ酸を含む：１つのＧｌａ
ドメイン（残基４３〜８８）、ヘリックス芳香族セグメント（８９〜９６）、２つの表皮
増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン（９７〜１３２および１３６〜１７６）、活性化ペプチド
（２００〜２１１）およびトリプシン様セリンプロテアーゼドメイン（２１２〜４５０）
。軽鎖は該ＧｌａおよびＥＧＦ様ドメインならびに該芳香族セグメントを含有する。重鎖
は該プロテアーゼドメインおよび該活性化ペプチドを含有する。活性化されることになる
チモーゲンとしてプロテインＣの８５〜９０％が血漿中を循環するのはこの形態において
である。残存するプロテインＣチモーゲンは該タンパク質の若干修飾された形態を含む。
該酵素の活性化は、トロンビン分子が重鎖のＮ末端から該活性化ペプチドを切断除去する
際に生じる。活性化部位は、セリンプロテアーゼに典型的な触媒三残基（Ｈｉｓ２５３、
Ａｓｐ２９９およびＳｅｒ４０２）を含有する。
プロテインＣの活性化はトロンボモジュリンおよび内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ
）により強く促進され、それらのうちの後者は主として内皮細胞（血管の内側の細胞）上
で見出される。トロンボモジュリンの存在は活性化を数桁加速し、ＥＰＣＲは活性化を２
０倍加速する。これらの２つのタンパク質のいずれかがマウス試料中に存在しない場合、
該マウスは、尚も胚状態のままで、過剰な血液凝固により死亡する。内皮上で、ＡＰＣは
血液凝固、炎症および細胞死（アポトーシス）の調節において重要な役割を果たす。プロ
テインＣの活性化に対するトロンボモジュリンの加速効果ゆえに、該タンパク質はトロン
ビンによってではなくトロンビン−トロンボモジュリン（または更にはトロンビン−トロ
ンボモジュリン−ＥＰＣＲ）複合体によって活性化されると言うこともできる。一旦活性
形態になると、ＡＰＣはＥＰＣＲに結合したままであっても結合していなくてもよく、Ｅ
ＰＣＲに対して、それはタンパク質チモーゲンとほぼ同じアフィニティを有する。
Ｇｌａドメインは抗凝固のための負荷電リン脂質への、そして細胞保護のためのＥＰＣ
Ｒへの結合に特に有用である。１つの特定のエキソサイトが、第Ｖａ因子を効率的に不活
性化するプロテインＣの能力を増強する。トロンボモジュリンとの相互作用には、もう１
つのことが必要である。
チモーゲン形態のプロテインＣは正常成人血漿中に６５〜１３５ ＩＵ／ｄＬの濃度で
存在する。活性化プロテインＣはこれより約２０００倍低いレベルで見出される。軽度の
プロテインＣ欠乏症は、２０ ＩＵ／ｄＬを超えるが正常範囲より低い血漿レベルに対応
する。中等度に重篤な欠乏症は１〜２０ ＩＵ／ｄＬの血液濃度を示し、重篤な欠乏症は
１ ＩＵ／ｄＬ未満の又は検出不能なプロテインＣのレベルを示す。健常正期産児におけ
るプロテインＣレベルの平均は４０ ＩＵ／ｄＬである。プロテインＣの濃度は６カ月ま
で増加し、この時点の平均レベルは６０ ＩＵ／ｄＬであり、該レベルは、思春期後に成
人レベルに達するまでは、小児の間を通じて低く保たれる。活性化プロテインＣの半減期
は約１５分である。
プロテインＣ経路は、ＡＰＣの発現および体内のその活性のレベルを制御する特異的な
化学反応である。プロテインＣは多面的であり、２つの主要クラスの機能、すなわち、抗
凝固および細胞保護（細胞に対するその直接作用）の機能を有する。プロテインＣがどち
らの機能をもたらすかは、それが活性化された後でＡＰＣがＥＰＣＲに結合したままであ
るか否かに左右され、それが結合していない場合にＡＰＣの抗凝固作用が生じる。この場
合、プロテインＣは、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を不可逆的にタンパク質分解に
より不活性化して、それらをそれぞれ第Ｖｉ因子および第ＶＩＩＩｉ因子に変換すること
により、抗凝固物質として機能する。活性化プロテインＣは、尚もＥＰＣＲに結合してい
る場合には、その細胞保護作用をもたらして、エフェクター基質ＰＡＲ−１（プロテアー
ゼ活性化受容体−１）に作用する。ある程度は、ＡＰＣの抗凝固特性はその細胞保護特性
から独立している。なぜなら、一方の経路の発現は他方の存在により影響されないからで
ある。
プロテインＣの活性は、利用可能なトロンボモジュリンまたはＥＰＣＲの量を低減する
ことによりダウンレギュレーションされうる。これは、炎症性サイトカイン、例えばイン
ターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）により行われ
うる。活性化白血球は炎症中にこれらの炎症性メディエーターを放出して、トロンボモジ
ュリンおよびＥＰＣＲの両方の生成を抑制し、内皮表面からのそれらの放出を誘導する。
これらの作用の両方はプロテインＣ活性化をダウンレギュレーションする。トロンビン自
体もＥＰＣＲのレベルに影響を及ぼしうる。また、細胞から放出されるタンパク質はプロ
テインＣ活性化を妨げ（例えば、好酸球）、これは好酸球増多性心疾患における血栓症を
説明しうる。プロテインＣは血小板因子４によりアップレギュレーションされうる。この
サイトカインは、プロテインＣのＧｌａドメインからトロンボモジュリンのグリコサミノ
グリカン（ＧＡＧ）ドメインまでの静電的架橋を形成してそれらの反応に関するミカエリ
ス定数（ＫＭ）を減少させることにより、プロテインＣの活性化を改善すると推測される
。また、プロテインＣはプロテインＣインヒビターにより抑制される。
遺伝的プロテインＣ欠乏症は、単純なヘテロ接合性に関連したその軽度な形態において
は、成人における静脈血栓症の有意に増大したリスクを引き起こす。胎児が該欠乏症に関
してホモ接合または複合ヘテロ接合である場合には、電撃性紫斑病、重度の播種性血管内
凝固および子宮内の同時静脈血栓塞栓症の症状が認められうる。これは非常に重篤であり
、通常は致命的である。マウスにおけるプロテインＣ遺伝子の欠失は誕生時前後に胎児死
亡を引き起こす。プロテインＣを有さない胎児マウスは最初は正常に発生するが、重篤な
出血、凝固障害、フィブリンの沈着および肝臓の壊死を引き起こす。無症候性個体におけ
るプロテインＣ欠乏症の頻度は１／２００〜１／５００である。これに対して、該欠乏症
の有意な症状は１／２０，０００個体で見出されうる。人種や民族による偏りは見出され
ていない。
ＡＰＣがその機能を達成できない場合、活性化プロテインＣ抵抗性が生じる。この疾患
は、プロテインＣ欠乏症に類似した症状を示す。白人において活性化プロテインＣ抵抗性
を招く最も一般的な突然変異はＡＰＣのための第Ｖ因子の切断部位におけるものである。
そこでは、Ａｒｇ５０６はＧｌｎで置換されて、第Ｖ因子ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）を生
成する。この突然変異はＲ５０６Ｑとも称される。この切断部位の喪失を招く突然変異は
、ＡＰＣが第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を有効に不活性化するのを実際に阻止する
。したがって、そのような者の血液は非常に凝固しやすく、彼は永久に、増大した血栓症
リスクを有する。第ＶＬＥＩＤＥＮ因子の突然変異に関してヘテロ接合である個体は、一
般集団の場合より５〜７倍高い、静脈血栓症のリスクを有する。ホモ接合被験者は８０倍
高いリスクを有する。この突然変異は白人における静脈血栓症の最も一般的な遺伝性リス
クでもある。
ＡＰＣ抵抗性の約５％は前記突然変異および第ＶＬｅｉｄｅｎ因子に関連していない。
他の遺伝的突然変異がＡＰＣ抵抗性を引き起こすが、第ＶＬｅｉｄｅｎ因子が引き起こす
程度には程遠い。これらの突然変異は第Ｖ因子の種々の他の形態、第Ｖ因子を標的化する
自己抗体の自然生成、およびＡＰＣの補因子のいずれかの機能不全を含む。また、幾つか
の後天的条件がＡＰＣの抗凝固機能の達成におけるＡＰＣの効力を低減しうる。血栓形成
傾向のある患者の２０％〜６０％はＡＰＣ抵抗性の何らかの形態を有することを、研究は
示唆している。
Ｃ．Ｇｌａドメインペプチドおよびポリペプチド
本開示は種々のＧｌａドメイン含有ペプチドおよびポリペプチドの設計、製造および使
用を含む。これらの分子の構造的特徴は以下のとおりである。第１に、該ペプチドまたは
ポリペプチドは、Ｇｌａドメインを構成する約３０〜４５個の連続的残基を含有するＧｌ
ａドメインを有する。したがって、「「Ｘ」以下の連続的残基を有するペプチド」なる語
は、「含む」なる語を包含する場合でさえも、より多数の連続的残基を含むとは理解され
得ない。第２に、該ペプチドおよびポリペプチドは追加的な非Ｇｌａドメイン残基、例え
ばＥＧＦドメイン、クリングルドメイン、Ｆｃドメインなどを含有しうる。
一般に、該ペプチドおよびポリペプチドは３００残基以下であり、この場合もまた、３
０〜４５個の連続的残基のＧｌａドメインを含む。その全長は３０、４０、５０、６０、
７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５
および３００個までの残基でありうる。５０〜３００残基、１００〜３００残基、１５０
〜３００残基、２００〜３００残基、５０〜２００残基、１００〜２００残基および１５
０〜３００残基および１５０〜２００残基のペプチド長の範囲が想定される。連続的なＧ
ｌａ残基の数は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５
でありうる。
本開示はＬ−配置アミノ酸、Ｄ−配置アミノ酸またはそれらの混合物を使用しうる。Ｌ
−アミノ酸は、タンパク質において見出されるアミノ酸の大多数に相当し、一方、Ｄ−ア
ミノ酸は、外来種海棲生物、例えばイモガイにより産生される幾つかのタンパク質におい
て見出される。それらはまた、細菌のペプチドグリカン細胞壁の豊富な成分である。Ｄ−
セリンは脳内の神経伝達物質として作用しうる。アミノ酸立体配置のＬおよびＤの規約は
アミノ酸自体の光学活性に関するものではなく、そのアミノ酸が理論的に合成されうるグ
リセルアルデヒドの異性体の光学活性に関するものである（Ｄ−グリセルアルデヒドは右
旋光であり、Ｌ−グリセルアルデヒドは左旋光である）。
「全Ｄ」ペプチドの一形態はレトロインベルソペプチドである。天然に存在するポリペ
プチドのレトロインベルソ修飾は、対応Ｌ−アミノ酸に対応するものとは反対のα−炭素
立体化学を有するアミノ酸（すなわち、天然ペプチド配列に対して反対の順序のＤ−アミ
ノ酸）の合成構築を含む。したがって、レトロインベルソ類似体は逆転末端および逆方向
のペプチド結合（ＣＯ−ＮＨではなく、ＮＨ−ＣＯ）を有する一方で、天然ペプチド配列
の場合と同様の側鎖のトポロジーをほぼ維持している。米国特許第６，２６１，５６９号
（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
Ｄ．合成
固相合成技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３）を用いて、ペプチドおよびポリペプ
チドを製造することが好都合であろう。他のペプチド合成技術は当業者によく知られてい
る（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら，１９７６；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８５
；Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｌｉａ，１９８４）。そのよ
うな合成に使用される適当な保護基が前記テキストおよびＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏ
ｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７３）に見出されるであろう
。これらの合成方法は、伸長しつつあるペプチド鎖への１以上のアミノ酸残基または適当
な保護アミノ酸残基の逐次的付加を含む。通常、第１アミノ酸残基のアミノまたはカルボ
キシル基を、選択的に除去可能な適当な保護基で保護する。反応性側鎖を含有する含有す
るアミノ酸、例えばリシンには、選択的に除去可能な異なる保護基を使用する。
一例として固相合成を用いて、保護または誘導体化されたアミノ酸をその非保護カルボ
キシルまたはアミノ基を介して不活性固体支持体に結合させる。ついでアミノまたはカル
ボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護された相補的（アミノまたはカルボキ
シル）基を有する、配列内の次のアミノ酸を混合し、固体支持体に既に結合している残基
と反応させる。ついでアミノまたはカルボキシル基の保護基をこの新たに付加されたアミ
ノ酸残基から除去し、ついで（適切に保護された）次のアミノ酸を付加し、以下同様であ
る。所望のアミノ酸の全てが適切な順序で連結された後、残存する末端および側鎖基保護
基（および固体支持体）を連続的または同時に除去して、最終ペプチドを得る。本開示の
ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、ベンジル化またはメチルベンジル化アミノ
酸を欠いている。そのような保護基部分は合成の経過中には使用されうるが、それらは、
該ペプチドおよびポリペプチドが使用される前に除去される。どこかに記載されていると
おり、コンホメーションを制限するために分子内結合を形成させるためには、追加的な反
応が必要かもしれない。
２０種の標準的なアミノ酸が使用可能であることに加え、多数の「非標準」アミノ酸が
存在する。これらのうちの２つは遺伝暗号により特定されうるが、タンパク質においては
むしろ稀なものである。幾つかのタンパク質内には、通常は終止コドンであるＵＧＡコド
ンにおいて、セレノシステインが組込まれる。メタンを生成するためにメタン生成アーキ
アが使用する酵素においては、ピロリシンがメタン生成アーキアにより使用される。それ
はコドンＵＡＧでコードされる。タンパク質において見出されない非標準的アミノ酸の例
には、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニンおよび神経伝達物質ガンマ
−アミノ酪酸が含まれる。非標準的アミノ酸は、しばしば、標準的アミノ酸の代謝経路に
おける中間体として存在する。例えば、オルニチンおよびシトルリンは、アミノ酸異化作
用の一部である尿素回路において存在する。非標準的アミノ酸は、通常、標準的アミノ酸
に対する修飾により形成される。例えば、ホモシステインは含硫基移動経路を介して、ま
たは中間代謝産物Ｓ−アデノシルメチオニンを経るメチオニンの脱メチル化により形成さ
れ、一方、ヒドロキシプロリンはプロリンの翻訳後修飾により形成される。
Ｅ．リンカー
Ｇｌａドメインペプチドまたはポリペプチドを他のタンパク質配列（例えば、抗体Ｆｃ
ドメイン）に融合させるためには、リンカーまたは架橋剤が使用されうる。アフィニティ
マトリックスの製造、多様な構造体の修飾および安定化、リガンドおよび受容体結合部位
の特定ならびに構造研究を含む種々の目的に、二官能性架橋試薬が広範に使用されている
。２つの同一官能基を含有するホモ二官能性試薬は、同じ及び異なる巨大分子または巨大
分子のサブユニット間の架橋、ならびにポリペプチドリガンドの、それらの特異的結合部
位への連結の誘発に非常に効率的であることが判明している。ヘテロ二官能性試薬は２つ
の異なる官能基を含有する。それらの２つの異なる官能基の反応性の相違を利用すること
により、選択的かつ連続的に架橋が制御されうる。該二官能性架橋試薬はそれらの官能基
の特異性（例えば、アミノ−、スルフヒドリル−、グアニジノ−、インドール−またはカ
ルボキシル−特異的基）に従い分類されうる。これらのうち、遊離アミノ基に対する試薬
は、それらの商業的入手可能性、合成のし易さ、およびそれらが適用されうる穏和な反応
条件ゆえに、特に好評となっている。大多数のヘテロ二官能性架橋試薬は第一級アミン反
応性基およびチオール反応性基を含有する。
もう１つの例においては、ヘテロ二官能性架橋試薬および該架橋試薬の使用方法は米国
特許第５，８８９，１５５号（その全体を参照により具体的に本明細書に組み入れること
とする）に記載されている。該架橋試薬は求核性ヒドラジド残基と求電子性マレイミド残
基とを併せ持ち、一例においては遊離チオールへのアルデヒドのカップリングを可能にす
る。該架橋試薬は、種々の官能基を架橋するように修飾可能であり、したがって、ポリペ
プチドを架橋するのに有用である。特定のポリペプチドが、与えられた架橋試薬に適した
残基を天然配列内に含有しない場合には、一次配列における遺伝的または合成的な保存的
アミノ酸改変が行われうる。
Ｆ．追加的ペプチド／ポリペプチド配列
薬物開発が達成しようとする１つの要因は適度な循環半減期であり、これは、投薬、薬
物投与および有効性に影響を及ぼし、これは生物学的療法には特に重要である。６０ｋＤ
未満の小さなタンパク質は腎臓により迅速に除去され、したがって、それらの標的に到達
しない。これは、有効性を達成するためには高用量が必要であることを意味する。循環中
のタンパク質の半減期を増加させるために現在用いられている修飾には、ペグ化（ＰＥＧ
ｙｌａｔｉｏｎ）；タンパク質、例えばトランスフェリン（ＷＯ０６０９６５１５Ａ２）
、アルブミン、成長ホルモン（米国特許公開第２００３１０４５７８ＡＡ号）との結合ま
たは遺伝的融合；セルロースとの結合（ＬｅｖｙおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，２００２）；
Ｆｃフラグメントとの結合または融合；グリコシル化および突然変異誘発アプローチ（Ｃ
ａｒｔｅｒ，２００６）が含まれる。
ペグ化の場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、例えば血漿タンパク質、抗体ま
たは抗体フラグメントでありうるタンパク質に結合させる。抗体のペグ化の効果に関する
最初の研究は１９８０年代に行われた。該結合は酵素的または化学的に実施可能であり、
当技術分野で十分に確立されている（Ｃｈａｐｍａｎ，２００２；Ｖｅｒｏｎｅｓｅおよ
びＰａｓｕｔ，２００５）。ペグ化により、全サイズが増大することが可能であり、これ
は腎臓濾過の可能性を低減する。ペグ化は更に、タンパク質分解から保護し、血液からの
クリアランスを遅くする。更に、ペグ化は免疫原性を低減し、溶解度を増加させうること
が報告されている。ＰＥＧの付加による薬物動態の改善は以下の幾つかの異なるメカニズ
ムによるものである：分子のサイズの増加、タンパク質分解からの保護、抗原性の低減、
および細胞受容体からの特定の配列のマスキング。抗体フラグメント（Ｆａｂ）の場合、
血漿半減期における２０倍の増加がペグ化により達成されている（Ｃｈａｐｍａｎ，２０
０２）。
現在のところ、幾つかの承認されたペグ化薬、例えば、２０００年に販売されたＰＥＧ
−インターフェロンアルファ２ｂ（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ）および２００２年に販売され
たアルファ２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ）が存在する。シムジア（Ｃｉｍｚｉａ）またはセルト
リズマブ・ペゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｐｅｇｏｌ）と称される、ＴＮＦアル
ファに対するペグ化抗体フラグメントが、クローン病の治療に関するＦＤＡ承認のために
２００７年に申請され、２００８年４月２２日付けで承認されている。ペグ化の欠点は、
１０００ｋＤを超えるＰＥＧ鎖が必要な場合は特に、長い単分散種を合成するのが困難な
ことである。多数の用途のために、１００００ｋＤを超える鎖長を有する多分散ＰＥＧが
使用されていて、種々の長さのＰＥＧ鎖を有するコンジュゲートの集団が生じ、これは、
製品間のバッチの等価性を確保するためには詳細な分析を要する。ＰＥＧ鎖の長さが異な
れば、それにより生じる生物学的活性も異なることがあり、したがって薬物動態も異なり
うる。ペグ化のもう１つの欠点はアフィニティまたは活性の低下であり、それはアルファ
−インターフェロンＰｅｇａｓｙｓで観察されているとおりであり、これは天然タンパク
質の抗ウイルス活性の僅か７％しか有さないが、血漿半減期の向上により改善された薬物
動態を示す。
もう１つのアプローチは、６７ｋＤでありヒトにおいて１９日の血漿半減期を有するア
ルブミンのような長命タンパク質を薬物に結合（コンジュゲート化）させることである。
アルブミンは血漿中の最も豊富なタンパク質であり、血漿ｐＨ調節に関与しているが、血
漿中の物質の担体としても働く。ＣＤ４の場合、それをヒト血清アルブミンに融合させた
後、血漿半減期の増加が達成されている（Ｙｅｈら，１９９２）。融合タンパク質の他の
例としては、インスリン、ヒト成長ホルモン、トランスフェリンおよびサイトカインが挙
げられる（Ｄｕｔｔａｒｏｙら，２００５；Ｍｅｌｄｅｒら，２００５；Ｏｓｂｏｒｎら
，２００２ａ；Ｏｓｂｏｒｎら，２００２ｂ；Ｓｕｎｇら，２００３、そして、米国特許
公開第２００３１０４５７８Ａ１号、ＷＯ０６０９６５１５Ａ２およびＷＯ０７０４７５
０４Ａ２（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい
）。
血漿半減期およびタンパク質の活性に対するグリコシル化の効果は詳細に研究されてい
る。組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の場合、新たなグリコシル化部位の
付加は血漿クリアランスを低減し、効力を改善した（Ｋｅｙｔら，１９９４）。幾つかの
組換えタンパク質および免疫グロブリンに糖鎖工学が成功裏に適用されている（Ｅｌｌｉ
ｏｔｔら，２００３；ＲａｊｕおよびＳｃａｌｌｏｎ，２００７；Ｓｉｎｃｌａｉｒおよ
びＥｌｌｉｏｔｔ，２００５；Ｕｍａｎａら，１９９９）。更に、グリコシル化は免疫グ
ロブリンの安定性に影響を及ぼす（Ｍｉｍｕｒａら，２０００；ＲａｊｕおよびＳｃａｌ
ｌｏｎ，２００６）。
融合タンパク質に使用されるもう１つの分子はＩｇＧのＦｃフラグメントである（Ａｓ
ｈｋｅｎａｚｉおよびＣｈａｍｏｗ，１９９７）。Ｆｃ融合アプローチは、例えば、Ｒｅ
ｇｅｎｅｒｏｎにより開発されたトラップ技術（Ｔｒａｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（例
えば、ＩＬ１トラップおよびＶＥＧＦトラップ）において利用されている。ペプチドの半
減期を延長させるためのアルブミンの使用は米国特許公開第２００４００１８２７Ａ１号
に記載されており、ＦａｂフラグメントおよびｓｃＦｖ−ＨＳＡ融合タンパク質に関して
も記載されている。アルブミンの血清半減期の延長は、ＦｃＲｎによりもたらされるリサ
イクル・プロセスによるものであることが示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，２００６
；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら，２００３）。
もう１つの方法は、結合特性を改善するために免疫グロブリンの相互作用をその受容体
へ標的化する特異的突然変異誘発技術を用いることである（すなわち、Ｆｃ領域における
アフィニティ成熟）。ＦｃＲｎに対するアフィニティの増大により、半減期の延長がイン
ビボで達成されうる（Ｇｈｅｔｉｅら，１９９７；Ｈｉｎｔｏｎら，２００６；Ｊａｉｎ
ら，２００７；Ｐｅｔｋｏｖａら，２００６ａ；Ｖａｃｃａｒｏら，２００５）。しかし
、アフィニティ成熟法は数ラウンドの突然変異誘発および試験を要する。これは長時間を
要し、高いコストがかかり、突然変異した場合に半減期の延長をもたらすアミノ酸の数に
より制限される。したがって、生物学的療法剤のインビボ半減期を改善するために、簡便
な代替アプローチが必要とされている。延長したインビボ半減期を有する治療剤は、治療
が長期間を要する場合には特に、慢性疾患、自己免疫障害、炎症性、代謝性、感染性およ
び眼疾患ならびに癌の治療に特に重要である。したがって、種々の治療剤の投与量および
／または注射頻度を低減するために、循環中の半減期および持続性が向上した治療剤（例
えば、抗体およびＦｃ融合タンパク質）の開発が尚も必要とされている。
Ｇ．標識
本開示のペプチドおよびポリペプチドは診断目的で、例えば、癌細胞またはウイルス感
染細胞を特定するために（組織化学検査におけるそれらの使用を含む）、標識に結合され
うる。本開示における標識は、アッセイを用いて検出されうるいずれかの部分と定義され
る。受容体分子の非限定的な例には、酵素、放射能標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分
子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子またはリガンド、例えばビオチンが
含まれる。
診断剤としての使用のためには標識コンジュゲート（標識結合体）が一般に好ましい。
診断剤は一般に、インビトロ診断に使用されるものと、インビボ診断法に使用されるもの
（「定方向イメージング（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ）」として一般に公知）と
の２つのクラスに分類される。多数の適当なイメージング剤が、ペプチドおよびポリペプ
チドへのそれらの結合のための方法と同様、当技術分野で公知である（例えば、米国特許
第５，０２１，２３６号、第４，９３８，９４８号および第４，４７２，５０９号を参照
されたい）。使用されるイメージング部分は常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、Ｎ
ＭＲ検出可能物質およびＸ線造影剤でありうる。
常磁性イオンの場合、例えば、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、
鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、
サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウ
ム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）
および／またはエルビウム（ＩＩＩ）のようなイオンが挙げられうるが、ガドリニウムが
特に好ましい。Ｘ線イメージングのような他の状況で有用なイオンには、ランタン（ＩＩ
Ｉ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、および特にビスマス（ＩＩＩ）が含まれるが、これら
に限定されるものではない。
治療および／または診断用途のための放射性同位体の場合、アスタチン２１１、１４炭
素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２ＥＵ、ガリウ
ム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９
鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５硫黄、テクネチウム
９９ｍおよび／またはイットリウム９０が挙げられうるであろう。１２５Ｉは、しばしば
、ある実施形態における使用に好ましく、テクネチウム９９ｍおよび／またはインジウム
１１１も、しばしば、それらの低いエネルギーおよび長距離検出の適合性ゆえに好ましい
。放射性標識ペプチドおよびポリペプチドは、当技術分野でよく知られた方法に従い製造
されうる。例えば、ペプチドおよびポリペプチドは、ヨウ化ナトリウムおよび／またはカ
リウムならびに化学的酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、または酵素酸化剤、例えば
ラクトペルオキシダーゼとの接触によりヨウ素化されうる。ペプチドは、リガンド交換法
により、例えば、ペルテクナートを第一スズ溶液で還元し、該還元テクネチウムをセファ
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム上にキレート化し、このカラムに該ペプチドを適用
することにより、テクネチウム９９ｍで標識されうる。あるいは、例えば、ペルテクナー
ト、還元剤、例えばＳＮＣｌ２、バッファー溶液、例えばナトリウム−カリウムフタラー
ト溶液、およびペプチドをインキュベートすることにより、直接標識技術が用いられうる
。金属イオンとして存在する放射性同位体をペプチドに結合させるためにしばしば使用さ
れる中間官能基として、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。
コンジュゲートとしての使用で想定される蛍光標識には、アレクサ（Ａｌｅｘａ）３５
０、アレクサ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０
／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤ
ＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、フルオレセインイソ
チオシアナート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５０
０、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ロー
ダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン
および／またはテキサスレッドが含まれる。
想定されるもう１つのタイプのコンジュゲートは、主としてインビトロでの使用に意図
されるものであり、この場合、二次結合性リガンドに、および／または発色性基質との接
触に際して着色産物を生成する酵素（酵素タグ）に、ペプチドが連結される。適当な酵素
の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホールラディッシュ）水素ペルオキ
シダーゼまたはグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合性リガンドとして
はビオチンおよびアビジンおよびストレプトアビジン化合物が挙げられる。そのような標
識の使用は当業者によく知られており、例えば米国特許第３，８１７，８３７号、第３，
８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，
４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号に記載されている。
ペプチドのコンジュゲート部分への該ペプチドの結合またはコンジュゲート化のための
他の方法は当技術分野で公知である。幾つかの結合方法は、金属キレート錯体、例えば有
機キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、エチレントリア
ミン四酢酸、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミドおよび／またはテトラクロロ−３
α−６α−ジフェニルグリコールウリル−３抗体結合体（米国特許第４，４７２，５０９
号および第４，９３８，９４８号）の使用を含む。ペプチドまたはポリペプチドを、カッ
プリング剤、例えばグルタルアルデヒドまたはペリオダートの存在下、酵素と反応させる
ことも可能である。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリン
グ剤の存在下またはイソチオシアナートとの反応により製造される。
ＩＶ．診断および療法
Ａ．医薬製剤および投与経路
臨床適用が想定される場合には、意図される適用に適した形態の医薬組成物を製造する
ことが必要であろう。一般に、これは、発熱物質およびヒトまたは動物に有害でありうる
他の不純物を実質的に含有しない組成物を製造することを含む。
運搬ベクター（運搬担体）を安定にし、標的細胞による取り込みを可能にするためには
、適当な塩およびバッファーを使用することが一般に望ましいであろう。組換え細胞を患
者内に導入する場合には、バッファーも使用されるであろう。本開示の水性組成物は、医
薬上許容される担体または水性媒体に溶解または分散された、細胞に対するベクターの有
効量を含む。そのような組成物も接種物と称される。「医薬上または薬理学的に許容され
る」なる語は、動物またはヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他
の望ましくない反応をもたらさない分子および組成物に関するものである。本明細書中で
用いる「医薬上許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細
菌および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含む。医薬上活性な物質のためのそのよう
な媒体および物質の使用は当技術分野でよく知られている。いずれかの通常の媒体または
物質が本開示のベクターまたは細胞に不適合である場合を除き、治療用組成物におけるそ
の使用が想定される。補助的な有効成分も該組成物に配合されうる。
本開示の活性組成物は古典的な医薬製剤を含みうる。本開示によるこれらの組成物の投
与は、標的組織に関して有効であるいずれかの一般的な経路によるものとなろう。そのよ
うな経路は経口、鼻腔内、頬側、直腸、膣または局所経路を含む。あるいは、投与は同所
性、皮内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内または静脈内注射によるものでありうる。その
ような組成物は通常、前記の医薬上許容される組成物として投与されるであろう。
活性化合物はまた、非経口的または腹腔内に投与されうる。遊離塩基または薬理学的に
許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面
活性剤と適切に混合された水中で調製されうる。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリ
エチレングリコールおよびそれらの混合物中ならびに油中で調製されうる。通常の保存お
よび使用条件下、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。
注射用途に適した医薬形態には、無菌水溶液または分散液、および無菌注射用溶液また
は分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。全ての場合において、該形態は無菌でなけ
ればならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製
造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作
用に対して防護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例
えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、
それらの適当な混合物および植物油を含む、溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性
は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子
サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持されうる。微生物の作用の防止
は種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、
ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば、糖
または塩化ナトリウムを含有させることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収
は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを該組成
物において使用することによりもたらされうる。
無菌注射用溶液は、必要に応じて、前記に列挙された種々の他の成分と共に、適当な溶
媒中に必要量の活性化合物を配合し、ついで濾過滅菌を行うことにより調製される。一般
に、分散液は、基本的な分散媒と前記のものから選ばれる必要な他の成分とを含有する無
菌ビヒクル中に種々の無菌有効成分を配合することにより調製される。無菌注射溶液の調
製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分およびいずれかの追加的な所
望の成分の粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥技
術である。
本明細書中で用いる「医薬上許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コー
ティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含む。医薬上活性な物質の
ためのそのような媒体および物質の使用は当技術分野でよく知られている。いずれかの通
常の媒体または物質が有効成分に不適合である場合を除き、治療用組成物におけるその使
用が想定される。補助的な有効成分も該組成物に配合されうる。
経口投与の場合、本開示のペプチドおよびポリペプチドは賦形剤と共に配合されること
が可能であり、摂取不能な洗口剤および歯磨剤の形態で使用されうる。洗口剤は、ホウ酸
ナトリウム溶液（ドーベル液）のような適当な溶媒中に必要量の有効成分を配合すること
により調製されうる。あるいは、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸
水素カリウムを含有する防腐性洗浄剤に配合されうる。有効成分は、ゲル剤、ペースト剤
、散剤（粉末）およびスラリーを含む歯磨剤中に分散されうる。有効成分は、水、結合剤
、研磨剤、香味剤、発泡剤、および湿潤剤を含みうるペースト状歯磨剤に治療的有効量で
加えられうる。
本開示の組成物は中性または塩の形態で製剤化されうる。医薬上許容される塩には、酸
付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成されるもの）、および無機酸、例えば塩酸
もしくはリン酸、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などと共に
形成されるものが含まれる。また、遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基
、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄、および
有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど
から誘導されうる。
製剤化されたら、剤形に適合した様態で、そして治療的に有効な量で、溶液は投与され
るであろう。該製剤は注射用溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の剤形で容易に投
与される。例えば水溶液中の非経口投与の場合、必要に応じて溶液は適切に緩衝化される
べきであり、液体希釈剤は、まず、等張にされるべきである。これらの個々の水溶液は静
脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関して、使用されうる無
菌水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知であろう。例えば、１回の投与量を１ｍ
ｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に加えるか又は注入の提示部
位に注射することが可能であろう（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１０３５−１０３８お
よび１５７０−１５８０）。治療される対象の状態に応じて、投与量における幾らかの変
動が必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投与に関して責任を有する者が個々の対象
に対する適当な用量を決定するであろう。更に、ヒトへの投与の場合、製剤は、ＦＤＡオ
フィス・オブ・バイオロジクス・スタンダード（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ｓ ｓｔａｎｄａｒｄ）により要求される無菌性、発熱性、一般的安全性および純度標準
を満たしているべきである。
Ｂ．病態および病状
１．癌
癌は組織からの細胞のクローン集団の増殖により生じる。発癌と称される、癌の発生は
、幾つかの方法でモデル化され、特徴づけられうる。癌の発生と炎症との関連性が古くか
ら認識されている。炎症応答は微生物感染に対する宿主防御に関与し、組織修復および再
生をも導く。相当な証拠が炎症と癌発生リスクとの関連性を指摘している。すなわち、慢
性炎症は異形成を招きうる。数百個の異なるヒト癌形態が存在し、癌の基礎をなす遺伝学
および生物学の理解が深まるにつれて、これらの形態は更に細分され、再分類されている
。
癌の原因の決定は複雑である。喫煙、ある感染症、放射線、運動不足、肥満および環境
汚染を含む多数の事物が癌のリスクを増大させることが知られている。これらは遺伝子を
直接的に損傷し、または細胞内の既存の遺伝的欠損と結びついて、該疾患を引き起こしう
る。癌の約５〜１０％が完全に遺伝性である。
癌は、ある徴候および症状の存在、スクリーニング試験または医学的イメージングを含
む幾つかの方法で検出されうる。可能性のある癌が検出されたら、それは組織サンプルの
顕微鏡検査により診断される。癌は通常、化学療法、放射線療法および手術で治療される
。癌を生き延びる可能性は癌の型および位置ならびに治療開始時の疾患の度合によって大
きく変動する。癌は全年齢の者を冒しうるが、少数の型の癌は小児において、より一般的
であり、癌の発生リスクは一般に年齢と共に増加する。２００７年には、癌は世界中の全
てのヒトの死亡の約１３％（７９０万人）の原因であった。より多くの者が高齢まで生き
るようになり、発展途上世界において大衆の生活様式の変化が生じるにつれて、率は上昇
しつつある。
治療は手術、化学療法、放射線、代替医療および緩和ケアの５つの一般的範疇に分類さ
れる。手術はほとんどの単離した固形癌の治療の主要方法であり、緩和および生存延長に
おいて或る役割を果たしうる。生検が通常要求されるため、それは典型的に、決定的な診
断を行い腫瘍を病期分類する上での重要な部分である。限局した癌においては、手術は典
型的に、全塊および場合によってはその領域内のリンパ節を除去することを試みる。癌の
幾つかの型の場合には、これが、癌を排除するために必要とされる全てである。
手術に加えて、化学療法が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、骨肉腫、精巣癌、卵巣癌、お
よび或る肺癌を含む幾つかの異なる癌型において有用であることが判明している。化学療
法の有効性は体内の他の組織に対する毒性により限定されることが多い。
放射線療法は、癌を治癒させ又は癌の症状を改善するための電離放射線の使用を含む。
それは全症例の約半数で使用され、放射線は近接照射療法の形態での内部線源または外部
線源からのものでありうる。放射線は典型的には手術および化学療法に加えて使用される
が、早期頭頸部癌のような或る型の癌では単独で使用されうる。有痛性骨転移では、約７
０％の者に有効であることが判明している。
代替治療および補完治療は、伝統医療の一部ではない多様な群のヘルスケアシステム、
慣行および製品を含む。「補完医療」は、伝統医療と共に用いられる方法および物質を意
味するが、「代替医療」は、伝統医療に代わりに用いられる化合物を意味する。癌に対す
るほとんどの補完および代替医療は厳密には研究も試験もされていない。幾つかの代替治
療が研究され、無効であることが示されているが、尚も販売され宣伝され続けている。
最後に、緩和ケアは、患者の気分を良くするために試みる治療を意味し、癌を攻撃する
試みと組合されても組合されなくてもよい。緩和ケアは、癌患者が被る物理的、感情的、
精神的および心理社会的苦痛を軽減するための行為を含む。癌細胞を直接的に殺すことを
目的とする治療とは異なり、緩和ケアの主な目的は、患者の生活の質を改善することであ
る。
２．ウイルス感染
ウイルスは、生物の生きた細胞内でのみ複製可能な小さな感染因子である。ウイルスは
動物および植物から細菌および古細菌にわたる全てのタイプの生物に感染しうる。数百万
の異なるタイプが存在するが、約５，０００のウイルスが詳細に記載されている。ウイル
スは地球上のほとんど全ての生態系に見られ、生物学的実体の最も豊富なタイプである。
ウイルス粒子（ビリオンとして公知）は以下の２つ又は３つの部分からなる：ｉ）遺伝
情報を運ぶ長い分子であるＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成される遺伝物質；ｉｉ
）これらの遺伝子を保護するタンパク膜；そして幾つかの場合には、ｉｉｉ）細胞の外部
に存在する場合にタンパク膜を包囲する脂質のエンベロープ。ウイルスの形状は、単純な
ラセン形態および正二十面体形態から、より複雑な構造体まで、多岐にわたる。平均的な
ウイルスは平均的な細菌のサイズの約１００分の１である。ほとんどのウイルスは、光学
顕微鏡で直接見ることができないほど小さい。
ウイルスは多数の様態で伝染する。植物におけるウイルスは、しばしば、植物の樹液を
吸う昆虫、例えばアブラムシにより、植物から植物へと伝染する。動物におけるウイルス
は吸血昆虫により運ばれうる。これらの病原体保有生物はベクターとして公知である。イ
ンフルエンザウイルスは咳およびくしゃみによって拡散する。ウイルス性胃腸炎の一般的
原因であるノロウイルスおよびロタウイルスは糞口経路で伝染し、接触によって人から人
へと移り、食料または水に含まれて体内に侵入する。ＨＩＶは、性的接触および感染血液
への曝露により伝染する幾つかのウイルスの１つである。ウイルスが感染しうる宿主細胞
の範囲は「宿主域」と称される。これは狭いこともあり、あるいはウイルスが多数の種に
感染しうる場合には広くなりうる。
動物におけるウイルス感染は、感染ウイルスを通常は排除する免疫応答を惹起する。免
疫応答は、特定のウイルス感染に対する人工獲得免疫を付与するワクチンによっても生成
されうる。しかし、エイズおよびウイルス性肝炎を引き起こすウイルスを含む幾つかのウ
イルスはこれらの免疫応答を回避し、慢性感染を引き起こす。抗生物質はウイルスには無
効であるが、幾つかの抗ウイルス薬が開発されている。
種々の疾患は、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウ
イルス、天然痘ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、朝鮮出血熱ウイルス、水痘、水痘帯状
疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１または２、エプスタイン−バーウイルス、マール
ブルグウイルス、ハンタウイルス、黄熱病ウイルス、Ａ、Ｂ、ＣまたはＥ型肝炎、エボラ
ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウ
イルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ロ
タウイルス、ＨＴＬＶ−１および２を含むウイルス感染により助長される。
Ｃ．治療方法
ペプチドおよびポリペプチドは、単独で又は前記疾患を治療する他の薬物と共に、哺乳
動物対象（例えば、ヒト患者）に投与されうる。必要な投与量は投与経路の選択；該ポリ
ペプチドに伴う追加的物質を含む製剤の性質；患者の疾患の性質；対象のサイズ、体重、
表面積、年齢および性別；更なる組合せ療法；ならびに担当医師の判断に左右される。適
当な投与量は０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。種々の化合物が利用可能であ
ること、および種々の投与経路が様々な効率を示すことを考慮すると、必要な投与量の広
範な変動が予想される。例えば、経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を要す
ると予想される。これらの投与量レベルの変動は、当技術分野で十分に理解されていると
おり、最適化のための標準的な経験的常套手段を用いて調節されうる。投与は１回または
複数回（例えば、２回、３回、４回、６回、８回、１０回、２０回、５０回、１００回、
１５０回またはそれ以上）でありうる。適当な運搬媒体（例えば、高分子微粒子または移
植可能な装置）内へのポリペプチドの封入は、経口運搬の場合には特に、運搬の効率を増
加させうる。
癌細胞への治療用ペイロード（例えば、放射性核種、化学療法ジアまたは毒素）の運搬
のための標的化剤として、操作されたＧｌａドメインタンパク質が使用されうる。具体的
な化学療法剤には以下のものが含まれる：テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、
エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルム
スチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ロムスチン（ｌ
ｏｍｕｓｔｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダカ
ルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ポリフェプロザン（ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ）
、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉ
ｌ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌ
ｆａｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、カルボプラチン
（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、チオテパ（ｔｈｉ
ｏｔｅｐａ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒ
ｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、フルタミド（ｆｌ
ｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐ
ｒｏｌｉｄｅ）、塩酸ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、硫酸ブレオマイシン
（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、塩酸ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノ
マイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、リポソームクエン酸ダウノルビシン（ｄａｕｎ
ｏｒｕｂｉｃｉｎ）、リポソーム塩酸ドキソルビシン（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｏｘｏｒ
ｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、塩酸エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉ
ｎ）、塩酸イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉ
ｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉ
ｎ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅ
ｍｉｆｅｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒ
ｏｕｒａｃｉｌ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌ
ｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、インターフェロンα−２ｂ、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃ
ｉｎ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メトトレキサート（ｍｅ
ｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、インターフェロンα−２ａ、酢酸メドロキシプロゲステロン（
ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｒｓｔｅｒｏｎｅ）、リン酸エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍ
ｕｓｔｉｎｅ）ナトリウム、エストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、酢酸ロイプロリ
ド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、酢酸オクト
レオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、ジエチルスチルベステロール（ｄｅｉｔｈｙｌｓｔ
ｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）二リン酸、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、酢酸ゴ
セレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リン酸エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、硫酸ビン
クリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンブラ
スチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、硫酸ビンクリ
スチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トラスツズ
マブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ・オゾガミシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ
ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、エキセメスタン（ｅ
ｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、塩酸イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、アスパラギナーゼ
（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、塩酸ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、アルト
レタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、塩酸トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ヒドロ
キシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ミトタ
ン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、塩酸プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、酒石酸ビ
ノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ペントロスタチン（ｐｅｎｔｒｏｓｔａｔｉｎ
）ナトリウム、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ペガスパルガーゼ（ｐ
ｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆ
ｔｉｔｉｘ）、アリトレチノイン（ａｌｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、ポルフィマー（ｐｏｒｆ
ｉｍｅｒ）、ベキサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａ
ｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、三酸化ヒ素またはトレチノイン（ｔｒ
ｅｔｉｎｏｉｎ）。毒素には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ
３８）、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、ビサイド（Ｂｅｓｉｄｅ）ＰＥおよびＲＴ、ヤマ
ゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリンおよびゲロニンが含まれる。癌治療の
ための放射性核種には、Ｙ−９０、Ｐ−３２、Ｉ−１３１、Ｉｎ−１１１、Ｓｒ−８９、
Ｒｅ−１８６、Ｓｍ−１５３およびＳｎ−１１７ｍが含まれる。
ウイルス感染に対する療法に適した物質または因子には以下のものが含まれる：アバカ
ビル（Ａｂａｃａｖｉｒ）、アシクロビル（Ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（Ａｃ
ｙｃｌｏｖｉｒ）、アデフォビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）、アマンタジン（Ａｍａｎｔａｄ
ｉｎｅ）、アンプレナビル（Ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、アンプリジェン（Ａｍｐｌｉｇｅ
ｎ）、アルビドール（Ａｒｂｉｄｏｌ）、アタザナビル（Ａｔａｚａｎａｖｉｒ）、アト
リプラ（Ａｔｒｉｐｌａ）、ボセプレビレルテット（Ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒｅｒｔｅｔ）
、シドフォビル（Ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、コンビビル（Ｃｏｍｂｉｖｉｒ）、ダルナビル
（Ｄａｒｕｎａｖｉｒ）、デラビルジン（Ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）、ジダノシン（Ｄｉ
ｄａｎｏｓｉｎｅ）、ドコサノール（Ｄｏｃｏｓａｎｏｌ）、エドクスジン（Ｅｄｏｘｕ
ｄｉｎｅ）、エファビレンツ（Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）、エムトリシタビン（Ｅｍｔｒｉｃ
ｉｔａｂｉｎｅ）、エンフビルチド（Ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、エンテカビル（Ｅｎｔ
ｅｃａｖｉｒ）、侵入インヒビター、ファムシクロビル（Ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ホ
ミビルセン（Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）、ホスアンプレナビル（Ｆｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉ
ｒ）、ホスカルネット（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）、ホスホネット（Ｆｏｓｆｏｎｅｔ）、ガ
ンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、イバシタビン（Ｉｂａｃｉｔａｂｉｎｅ）、
イムノビル（Ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン（Ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、イミ
キモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、インジナビル（Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、イノシン（Ｉｎ
ｏｓｉｎｅ）、インテグラーゼインヒビター、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェ
ロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、インターフェロン、ラミブジン（Ｌａｍｉｖｕｄｉ
ｎｅ）、ロピナビル（Ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）、ロビリド（Ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、マラビロ
ク（Ｍａｒａｖｉｒｏｃ）、モロキシジン（Ｍｏｒｏｘｙｄｉｎｅ）、メチサゾン（Ｍｅ
ｔｈｉｓａｚｏｎｅ）、ネルフィナビル（Ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）、ネビラピン（Ｎｅｖ
ｉｒａｐｉｎｅ）、ネキサビル（Ｎｅｘａｖｉｒ）、ヌクレオシド類似体、オセルタミビ
ル（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペンシクロビル
（Ｐｅｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ペラミビル（Ｐｅｒａｍｉｖｉｒ）、プレコナリル（Ｐｌ
ｅｃｏｎａｒｉｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、プロテ
アーゼインヒビター、ラルテグラビル（Ｒａｌｔｅｇｒａｖｉｒ）、逆転写酵素インヒビ
ター、リバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、リマンタジン（Ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）、
リトナビル（Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、ピラミジン（Ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サキナビル
（Ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、スタブジン（Ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、相乗的増強剤（抗レト
ロウイルス）、ティーツリーオイル（Ｔｅａ ｔｒｅｅ ｏｉｌ）、テラプレビル（Ｔｅ
ｌａｐｒｅｖｉｒ）、テノホビル（Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）、テノホビルジソプロキシル（
Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ）、チプラナビル（Ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）
、トリフルリジン（Ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トリジビル（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、ト
ロマンタジン（Ｔｒｏｍａｎｔａｄｉｎｅ）、ツルバダ（Ｔｒｕｖａｄａ）、バラシクロ
ビル（Ｖａｌａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、バルガンシクロビル（Ｖａｌｇａｎｃｉｃｌｏｖｉ
ｒ）、ビクリビロック（Ｖｉｃｒｉｖｉｒｏｃ）、ビダラビン（Ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）
、ビラミジン（Ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン（Ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ザ
ナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）およびジドブジン（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）。
当業者は“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｃｈａｐｔｅｒ ３３、特にｐ．６２４−６５２を参照
することが可能である。治療される対象の状態に応じて、投与量における幾らかの変動が
必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投与に関して責任を有する者が個々の対象に対
する適当な用量を決定するであろう。更に、ヒトへの投与の場合、製剤は、ＦＤＡオフィ
ス・オブ・バイオロジクス・スタンダード（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ
ｓｔａｎｄａｒｄ）により要求される無菌性、発熱性、一般的安全性および純度標準を満
たしているべきである。
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために記載されている。以下の実
施例に開示されている技術は、本開示の実施において十分に機能することが本発明者によ
り見出された技術の代表例であり、したがって、その実施のための好ましい形態を構成す
るとみなされうる、と当業者に理解されるべきである。しかし、本開示の精神および範囲
から逸脱することなく、開示されている特定の実施形態には多数の変更が施されることが
可能であり、同様または類似の結果を尚も与えうる、と当業者は本開示を考慮して理解す
べきである。
実施例１
細胞膜に対するＧｌａ−ドメインタンパク質のアフィニティは、調製されたリン脂質小
胞を使用することにより、インビトロで決定されている（Ｓｈａｈら，１９９８；Ｎｅｌ
ｓｅｓｔｕｅｎ，１９９９）。しかし、これらのインビトロ値がインビボ状況にどのよう
な置き換わるかについては十分には解明されていない。例えば、ＴＦとのＦＶＩＩの相互
作用は、これらのタンパク質のＧｌａドメインは非常に相同であるが、それらの細胞膜結
合特異性およびアフィニティにおける追加的相違はそれらのＥＧＦおよび／またはクリン
グルドメインによってもたらされうることを強調している。残念ながら、これらの相互作
用は、リン脂質小胞のみに基づく研究によっては再現され得ず、依然として未特定のまま
であろう。
したがって、本発明者らは、以下のパネルのタンパク質からＧｌａ＋ＥＧＦ／クリング
ルドメインおよびＧｌａドメインのみを作製し試験することを提示した：ｈＳ（高アフィ
ニティ結合体）、ｈＺ（中アフィニティ結合体）、ｈＰＴ（中アフィニティ−クリングル
含有）、ｈＦＶＩＩ（低アフィニテイ − 癌においてアップレギュレーションもされる
二次「受容体」を利用）、およびＢ０１７８（増加したリン脂質アフィニティを有するｈ
ＦＶＩＩ）。これらのタンパク質は、プローブとして（そして、実証され選択的であれば
、潜在的に治療剤として）のそれらの使用に有益でありうる、そして現在のところ認識さ
れないままとなっている種々のインビボ結合特性を潜在的に有する。
一般的アプローチは、組換えタンパク質を構築しそれらを発現に関して試験することで
あった。ついで、結合を評価するためにアッセイが開発されるであろう。ついで、発現お
よび精製方法が最適化され、ついでガンマ−カルボキシル化の品質管理が行われるであろ
う。
図１は、カルボキシル化部位を含む種々のＧｌａドメインタンパク質からの配列を示す
。図２は、操作され２９３細胞内で一過性発現された種々の異なるＧｌａドメインタンパ
ク質の発現を示す。図３はＢＨＫ２１細胞における類似研究を示す。最良発現構築物の１
つがプロテインＳ＋ＥＧＦ構築物であると仮定して、プロテインＳからのシグナル配列を
プロトロンビンＧｌａ＋クリングルおよびプロテインＺ＋ＥＧＦと共に利用した。しかし
、発現は細胞内でのみ観察された（図４）。
プロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦを更なる研究に選択した。該配列を図５に示す。ＲＦ２
８６培地を使用して、タンパク質をＢＨＫ２１細胞内で産生させた。６００ｍｌを集め、
４×濃縮した。精製は以下の３工程を用いた。
１．Ｎｉ−ＮＴＡカラム、１０ｍｌ、新鮮充填。媒体をカラムにローディングし、イミ
ダゾール勾配で溶出する。画分の全てをＧｌａウエスタンブロットに付してＨｉｓタグ付
きＧｌａプロテインＳ Ｇ＋Ｅを特定する。
２．ＣａＣｌ２設定溶出を伴うＨｉｔｒａｐ Ｑ。Ｇｌａ陽性画分をプールし、１０ｍ
Ｍ ＣａＣｌ２溶出を伴う１ｍｌのＨｉｔｒａｐ Ｑに付す。
３．ＣａＣｌ２勾配（０〜１０ｍＭ シャドウ（ｓｈａｄｏｗ）勾配）を伴うＨｉｔｒ
ａｐ Ｑ。段階精製Ｇｌａタンパク質をＱに付して、勾配ＣａＣｌ２（１０ｍＭまで）で
溶出した。９５％の純度レベルの合計０．９ｍｇのタンパク質が産生された。図６は還元
条件および非還元条件の両方における精製画分を示す。図７および８は、ＦＡＣに基づく
種々のアポトーシスアッセイを示す。どちらも、プロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦ構築物が
、アネキシンＶと同様にアポトーシスを受けている細胞に特異的であること（図７）、お
よびアネキシンＶがプロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦ結合と競合することを示している。
要約すると、プロテインＳ Ｇｌａ＋ＥＧＦを発現させ、精製した。精製された物質に
関する分析は、それが高度にガンマ−カルボキシル化されていることを示唆した。ＦＡＣ
に基づくアポトーシスアッセイは、プロテインＳ Ｇ＋Ｅ（１１ Ｇｌａ）が「アポトー
シス」細胞に結合しうること、およびアネキシンＶ競合アッセイにより示されるとおり、
細胞へのこの結合がホスファチジルセリンの標的化によるものであることを示した。
本明細書に開示され特許請求されている組成物および／または方法の全ては、本開示を
考慮すると、過度な実験を行うことなく製造され実施されうる。本開示の組成物および方
法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載されている組成物およ
び／または方法に対して、および該方法の工程において、または該工程の順序において、
本開示の概念、精神および範囲から逸脱することなく、変更が施されうることが、当業者
に明らかであろう。より詳細には、本明細書に記載されている物質の代わりに、化学的か
つ生理的に関連している或る物質が使用可能であり、その場合にも同一または類似の結果
が達成されるであろうことが明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似置
換および修飾は、添付の特許請求の範囲により定められる本開示の精神、範囲および概念
の範囲内であるとみなされる。
ＶＩ．参考文献
以下の参考文献を、本明細書に記載されているものを補足する典型的な方法または他の
詳細をそれらが提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み入れることと
する。
Figure 2019069994
Figure 2019069994
Figure 2019069994
Figure 2019069994
Figure 2019069994
Figure 2019069994
癌細胞への治療用ペイロード（例えば、放射性核種、化学療法剤または毒素）の運搬のための標的化剤として、操作されたＧｌａドメインタンパク質が使用されうる。具体的な化学療法剤には以下のものが含まれる：テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ポリフェプロザン（ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、塩酸ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、硫酸ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、塩酸ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、リポソームクエン酸ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、リポソーム塩酸ドキソルビシン（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、塩酸エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、塩酸イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、インターフェロンα−２ｂ、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、インターフェロンα−２ａ、酢酸メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｒｓｔｅｒｏｎｅ）、リン酸エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）ナトリウム、エストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、酢酸ロイプロリド
（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、酢酸オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、ジエチルスチルベステロール（ｄｅｉｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）二リン酸、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、酢酸ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リン酸エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、硫酸ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、硫酸ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ・オゾガミシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、塩酸イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、塩酸ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、塩酸トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ミトタン
（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、塩酸プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、酒石酸ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ペントロスタチン（ｐｅｎｔｒｏｓｔａｔｉｎ）ナトリウム、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ペガスパルガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｉｘ）、アリトレチノイン（ａｌｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、ポルフィマー（ｐｏｒｆｉｍｅｒ）、ベキサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、三酸化ヒ素またはトレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）。毒素には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ３８）、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、ビサイド（Ｂｅｓｉｄｅ）ＰＥおよびＲＴ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリンおよびゲロニンが含まれる。癌治療のための放射性核種には、Ｙ−９０、Ｐ−３２、Ｉ−１３１、Ｉｎ−１１１、Ｓｒ−８９、Ｒｅ−１８６、Ｓｍ−１５３およびＳｎ−１１７ｍが含まれる。
本明細書に開示され特許請求されている組成物および／または方法の全ては、本開示を考慮すると、過度な実験を行うことなく製造され実施されうる。本開示の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載されている組成物および／または方法に対して、および該方法の工程において、または該工程の順序において、本開示の概念、精神および範囲から逸脱することなく、変更が施されうることが、当業者に明らかであろう。より詳細には、本明細書に記載されている物質の代わりに、化学的かつ生理的に関連している或る物質が使用可能であり、その場合にも同一または類似の結果が達成されるであろうことが明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似置換および修飾は、添付の特許請求の範囲により定められる本開示の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
本発明はある態様において、以下を提供する。
[項目１]
（ａ）ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含みプロテアーゼまたはホルモン結合ドメインを欠く単離されたポリペプチドを準備し、
（ｂ）該ペプチドを細胞表面と接触させて、該ポリペプチドを細胞膜上のホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）に結合させることを含む、細胞膜ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）を標的化する方法。
[項目２]
該細胞膜が心細胞膜、神経細胞膜、内皮細胞膜、ウイルス感染細胞膜、アポトーシス細胞膜、血小板膜または癌細胞膜である、項目１記載の方法。
[項目３]
該ポリペプチドがＥＧＦ結合ドメインを更に含む、項目１記載の方法。
[項目４]
該ポリペプチドがクリングルドメインを更に含む、項目１記載の方法。
[項目５]
該ポリペプチドが芳香族アミノ酸スタックドメインを更に含む、項目１記載の方法。
[項目６]
該Ｇｌａドメインが第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＳまたはプロテインＣからのＧｌａドメインである、項目１記載の方法。
[項目７]
該ポリペプチドが、検出可能な標識を更に含む、項目１記載の方法。
[項目８]
前記の検出可能な標識が蛍光標識、化学発光標識、放射能標識、酵素、色素またはリガンドである、項目７記載の方法。
[項目９]
該ポリペプチドが治療剤を更に含む、項目１記載の方法。
[項目１０]
該治療剤が抗癌剤である、項目９記載の方法。
[項目１１]
該抗癌剤が化学療法剤、放射線療法、サイトカイン、ホルモン、抗体もしくは抗体フラグメントまたは毒素である、項目１０記載の方法。
[項目１２]
該治療剤が抗ウイルス剤である、項目９記載の方法。
[項目１３]
該治療剤がプロドラッグ変換酵素のような酵素である、項目９記載の方法。
[項目１４]
該治療剤がサイトカイン、増殖因子、凝固因子または抗凝固剤である、項目９記載の方法。
[項目１５]
該ポリペプチドが３００残基以下、２００残基以下または１００残基以下である、項目１記載の方法。
[項目１６]
該ポリペプチドが５〜１５個のＧｌａ残基を含む、項目１記載の方法。
[項目１７]
該ポリペプチドが９〜１３個のＧｌａ残基を含む、項目１記載の方法。
[項目１８]
該ポリペプチドが、１３個を超えるＧｌａ残基を含むが、３０％未満の全Ｇｌａ残基しか含んでいない、項目１記載の方法。
[項目１９]
該ポリペプチドが約４．５〜３０ｋＤａのサイズを有する、項目１記載の方法。
[項目２０]
該ポリペプチドが少なくとも１つのジスルフィド結合を含む、項目１記載の方法。
[項目２１]
該ポリペプチドが２〜５個のジスルフィド結合を含む、項目１記載の方法。
[項目２２]
該ポリペプチドがプロテインＳ Ｇｌａドメインを含む、項目１記載の方法。
[項目２３]
該ポリペプチドがプロテインＳ ＧｌａドメインおよびプロテインＳ ＥＧＦドメインを含む、項目１記載の方法。
[項目２４]
該ポリペプチドがプロトロンビンＧｌａドメインを含む、項目１記載の方法。
[項目２５]
該ポリペプチドがプロトロンビンＧｌａとプロトロンビンクリングルドメインを含む、項目１記載の方法。
[項目２６]
該ポリペプチドがプロテインＺ Ｇｌａドメインを含む、項目１記載の方法。
[項目２７]
該ポリペプチドがプロテインＺ Ｇｌａドメインとプロトロンビンクリングルドメインを含む、項目１記載の方法。
[項目２８]
該ポリペプチドが第ＶＩＩ因子Ｇｌａドメインを含む、項目１記載の方法。
[項目２９]
該ポリペプチドが第ＶＩＩ因子Ｇｌａドメインとプロトロンビンクリングルドメインを含む、項目１記載の方法。
[項目３０]
該ポリペプチドが抗体Ｆｃ領域を更に含む、項目１記載の方法。
[項目３１]
ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含み、プロテアーゼまたはホルモン結合ドメインを欠いており、治療用ペイロードに連結された単離されたポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における癌の治療方法。
[項目３２]
該治療用ペイロードが化学療法剤、放射線治療または毒素である、項目３１記載の方法。
[項目３３]
該癌が乳癌、脳癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、結腸癌、皮膚癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌または食道癌である、項目３１記載の方法。
[項目３４]
ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含み、プロテアーゼまたはホルモン結合ドメインを欠いており、抗ウイルス剤に連結された単離されたポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における癌の治療方法。
[項目３５]
該ウイルス疾患がインフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、天然痘ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、朝鮮出血熱ウイルス、水痘、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１または２、エプスタイン−バーウイルス、マールブルグウイルス、ハンタウイルス、黄熱病ウイルス、Ａ、Ｂ、ＣまたはＥ型肝炎、エボラウイルス、ヒトパピローマウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ロタウイルス、ＨＴＬＶ−１および２である、項目３４記載の方法。

Claims (35)

  1. （ａ）ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含みプロテアーゼまたは
    ホルモン結合ドメインを欠く単離されたポリペプチドを準備し、
    （ｂ）該ペプチドを細胞表面と接触させて、該ポリペプチドを細胞膜上のホスファチジ
    ルセリン（ＰｔｄＳ）に結合させることを含む、細胞膜ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ
    ）を標的化する方法。
  2. 該細胞膜が心細胞膜、神経細胞膜、内皮細胞膜、ウイルス感染細胞膜、アポトーシス細
    胞膜、血小板膜または癌細胞膜である、請求項１記載の方法。
  3. 該ポリペプチドがＥＧＦ結合ドメインを更に含む、請求項１記載の方法。
  4. 該ポリペプチドがクリングルドメインを更に含む、請求項１記載の方法。
  5. 該ポリペプチドが芳香族アミノ酸スタックドメインを更に含む、請求項１記載の方法。
  6. 該Ｇｌａドメインが第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＳ
    またはプロテインＣからのＧｌａドメインである、請求項１記載の方法。
  7. 該ポリペプチドが、検出可能な標識を更に含む、請求項１記載の方法。
  8. 前記の検出可能な標識が蛍光標識、化学発光標識、放射能標識、酵素、色素またはリガ
    ンドである、請求項７記載の方法。
  9. 該ポリペプチドが治療剤を更に含む、請求項１記載の方法。
  10. 該治療剤が抗癌剤である、請求項９記載の方法。
  11. 該抗癌剤が化学療法剤、放射線療法、サイトカイン、ホルモン、抗体もしくは抗体フラ
    グメントまたは毒素である、請求項１０記載の方法。
  12. 該治療剤が抗ウイルス剤である、請求項９記載の方法。
  13. 該治療剤がプロドラッグ変換酵素のような酵素である、請求項９記載の方法。
  14. 該治療剤がサイトカイン、増殖因子、凝固因子または抗凝固剤である、請求項９記載の
    方法。
  15. 該ポリペプチドが３００残基以下、２００残基以下または１００残基以下である、請求
    項１記載の方法。
  16. 該ポリペプチドが５〜１５個のＧｌａ残基を含む、請求項１記載の方法。
  17. 該ポリペプチドが９〜１３個のＧｌａ残基を含む、請求項１記載の方法。
  18. 該ポリペプチドが、１３個を超えるＧｌａ残基を含むが、３０％未満の全Ｇｌａ残基し
    か含んでいない、請求項１記載の方法。
  19. 該ポリペプチドが約４．５〜３０ｋＤａのサイズを有する、請求項１記載の方法。
  20. 該ポリペプチドが少なくとも１つのジスルフィド結合を含む、請求項１記載の方法。
  21. 該ポリペプチドが２〜５個のジスルフィド結合を含む、請求項１記載の方法。
  22. 該ポリペプチドがプロテインＳ Ｇｌａドメインを含む、請求項１記載の方法。
  23. 該ポリペプチドがプロテインＳ ＧｌａドメインおよびプロテインＳ ＥＧＦドメイン
    を含む、請求項１記載の方法。
  24. 該ポリペプチドがプロトロンビンＧｌａドメインを含む、請求項１記載の方法。
  25. 該ポリペプチドがプロトロンビンＧｌａとプロトロンビンクリングルドメインを含む、
    請求項１記載の方法。
  26. 該ポリペプチドがプロテインＺ Ｇｌａドメインを含む、請求項１記載の方法。
  27. 該ポリペプチドがプロテインＺ Ｇｌａドメインとプロトロンビンクリングルドメイン
    を含む、請求項１記載の方法。
  28. 該ポリペプチドが第ＶＩＩ因子Ｇｌａドメインを含む、請求項１記載の方法。
  29. 該ポリペプチドが第ＶＩＩ因子Ｇｌａドメインとプロトロンビンクリングルドメインを
    含む、請求項１記載の方法。
  30. 該ポリペプチドが抗体Ｆｃ領域を更に含む、請求項１記載の方法。
  31. ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含み、プロテアーゼまたはホル
    モン結合ドメインを欠いており、治療用ペイロードに連結された単離されたポリペプチド
    を対象に投与することを含む、対象における癌の治療方法。
  32. 該治療用ペイロードが化学療法剤、放射線治療または毒素である、請求項３１記載の方
    法。
  33. 該癌が乳癌、脳癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、結腸癌、皮膚癌、直腸癌
    、子宮頸癌、子宮癌、肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌または食道癌である、請求項３１記載の
    方法。
  34. ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含み、プロテアーゼまたはホル
    モン結合ドメインを欠いており、抗ウイルス剤に連結された単離されたポリペプチドを対
    象に投与することを含む、対象における癌の治療方法。
  35. 該ウイルス疾患がインフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイル
    ウイルス、天然痘ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、朝鮮出血熱ウイルス、水痘、水痘帯
    状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１または２、エプスタイン−バーウイルス、マー
    ルブルグウイルス、ハンタウイルス、黄熱病ウイルス、Ａ、Ｂ、ＣまたはＥ型肝炎、エボ
    ラウイルス、ヒトパピローマウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオ
    ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、
    ロタウイルス、ＨＴＬＶ−１および２である、請求項３４記載の方法。
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