CN105164152B - 作为靶向试剂的gla结构域 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及重组Gla结构域蛋白和它们靶向细胞（特别是表达升高水平的PtdS的细胞，诸如处于细胞凋亡中的细胞）的表面上的磷脂酰丝氨酸(PtdS)部分的用途。这些蛋白可以连接至诊断和治疗有效载荷，由此允许鉴别和治疗表达升高的PtdS的细胞。

Description

作为靶向试剂的GLA结构域

背景

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/787,753和2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/791,537的优先权权益，其整个内容特此通过引用并入。

1. 领域

本公开内容涉及使用Gla结构域肽和多肽对细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PtdS)的靶向。公开了这些肽和多肽作为诊断剂和治疗剂的用途。

2. 相关技术

磷脂酰丝氨酸(PtdS)是经常定位于细胞膜的内小叶(细胞质侧)的带负电荷的磷脂组分。但是，PtdS可以被爬行酶(翻转酶家族的一个成员)从内小叶运输至外小叶且暴露于细胞表面上。对于极少的例外，PtdS的该活跃外化是对细胞损伤的应答(van den Eijnde等人，2001; Erwig和Henson, 2008)。例如，组织损害给血小板、白细胞和内皮细胞发出信号以快速地和可逆地重新分布PtdS，其导致凝固的促进和细胞表面上的补体激活。类似地，细胞凋亡信号导致PtdS的外化，但是以更逐渐的和持续的方式。该外部PtdS会提供关键识别标志物，其使巨噬细胞能够从周围组织摄入垂死细胞(Erwig和Henson, 2008)。该除去过程对于组织体内稳态而言是必要的，且在“健康的”环境中，它是非常有效的。实际上，尽管每天损失>10⁹个细胞，细胞凋亡的细胞的组织学检测是正常组织中的罕见事件(Elltiot和Ravichandran, 2010; Elltiot等人，2009)。但是，有证据表明，在许多病理学状况下，细胞凋亡的细胞的除去过程被压倒、延迟或缺少(Elltiot和Ravichandran, 2010; Lahorte等 人，2004)。例如，几项肿瘤学研究提示，高细胞凋亡指数与较高等级的肿瘤、增加的转移速率和患者的预后不良有关(Naresh等人，2001; Loose等人，2007; Kurihara等人，2008;Kietselaer等人，2002)。这些研究和与它们类似的其它研究提示，细胞凋亡和外部PtdS表达可以是疾病的强效标志物(Elltiot和Ravichandran, 2010)。

存在几种对阴离子磷脂表面具有高亲和力的蛋白，其中膜联蛋白-V被最广泛地用作PtdS靶向探针(Lahorte等人，2004)。由于对含有PtdS的囊泡的高亲和力(K_d = 0.5-7nM)和低于肾过滤阈值(大约60 kDa)的分子量(37 kDa)，膜联蛋白-V已经显示出在临床中作为细胞凋亡探针的前途(Lin等人，2010; Tait和Gibson, 1992)。此外，它已经被用于广范围的适应症，包括在肿瘤学、神经病学和心脏病学中的那些(Lahorte等人，2004;Boersma等人，2005; Blankenberg, 2009; Reutelingsperger等人，2002)。已经在体外和在体内证实了靶向PtdS细胞表面表达的生物探针的应用。尽管它们在临床中的实用性是有前途的，它们通常尚未得到开发。

发明内容

因而，根据本公开内容，提供了靶向细胞膜磷脂酰丝氨酸(PtdS)的方法，其包括：(a)提供分离的多肽，其包含γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域；和(b)使所述肽与细胞表面接触，其中所述多肽结合细胞膜上的PtdS。所述细胞膜可以是心脏细胞膜、神经元细胞膜、内皮细胞膜、病毒感染的细胞膜、细胞凋亡细胞膜、血小板膜或癌细胞膜。所述多肽可以进一步包含EGF结合结构域、Kringle结构域和/或芳族氨基酸堆叠结构域。所述Gla结构域可以来自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白S或蛋白C。

所述多肽可以进一步包含可检测标记物，诸如荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶、染料或配体。所述多肽可以进一步包含治疗剂，诸如抗癌剂，包括化疗剂、放疗剂、细胞因子、激素、抗体或抗体片段或毒素或抗病毒剂。所述治疗剂可以是酶，诸如前药转换酶、细胞因子、生长因子、凝固因子或抗凝剂。所述多肽可以是300个残基或更少、200个残基或更少或100个残基或更少，包括100-200个和100-300个残基的范围。

所述多肽可以包含5-15个Gla残基、9-13个Gla残基，包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个Gla残基。所述多肽可以包含超过13个Gla残基，但是小于30%的总Gla残基。所述多肽的大小可以是在约4.5至30 kD之间。所述多肽可以包含至少一个二硫键或2-5个二硫键。所述多肽可以包含蛋白S Gla结构域。所述多肽可以包含蛋白S Gla结构域+蛋白SEGF结构域、凝血酶原Gla结构域、凝血酶原Gla结构域+ 凝血酶原Kringle结构域、蛋白ZGla结构域、蛋白Z Gla结构域+ 凝血酶原Kringle结构域、因子VII Gla结构域或因子VIIGla结构域+ 凝血酶原Kringle结构域。所述多肽可以进一步包含抗体Fc区。任意前述多肽可以含有前述蛋白的天然序列的保守置换，和/或表现出与所述的天然结构域的同源性百分比。

在另一个实施方案中，提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括给所述受试者施用分离的多肽，其包含γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域，其中所述多肽连接至治疗有效载荷。所述治疗有效载荷可以是化疗剂、放疗剂或毒素。所述癌症可以是乳腺癌、脑癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、结肠癌、皮肤癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、肝癌、胰腺癌、头颈癌或食管癌。

在另一个实施方案中，提供了一种治疗受试者的病毒性疾病的方法，所述方法包括给所述受试者施用分离的多肽，其包含γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域，其中所述多肽连接至抗病毒剂。所述病毒性疾病可以是流感、人免疫缺陷病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、天花病毒、呼吸道合胞体病毒、韩国出血热病毒、水痘、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒1或2、爱泼斯坦-巴尔病毒、马尔堡病毒、汉坦病毒属、黄热病病毒、甲、乙、丙或戊型肝炎、埃博拉病毒、人乳头瘤病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒、轮状病毒、HTLV-1和-2。

预见到，关于本文描述的任意其它方法或组合物，可以实现本文描述的任意方法或组合物。

从下述详细描述将会明白本公开内容的其它目的、特征和优点。但是，应当理解，尽管指示本公开内容的具体实施方案，详细描述和具体实施例仅仅作为例证来给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本公开内容的精神和范围内的各种变化和修改。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，且被包括以进一步证实本公开内容的某些方面。通过与详细描述组合地参考这些附图中的一个或多个，可以更好地理解本公开内容。

图1–一组Gla和Gla-EGF/Kringle结构域蛋白的构建。

图2 -用于表达的Gla结构域蛋白构建体的试验. 使用293cellFectin瞬时转染进293细胞。含有还原的样品的10%凝胶，加载23.3µl培养基。

图3 -用于表达的Gla结构域蛋白构建体的试验. 在BHK21细胞中的瞬时转染。含有还原的样品的10%凝胶，加载20µl (1/100总细胞沉淀物)。

图4 - 改变信号序列会改变分泌. 在BHK21细胞中的瞬时转染。含有还原的样品的10%凝胶，加载13.3µl。

图5 - 蛋白S Gla + EGF序列。

图6 -蛋白S Gla + EGF的纯化. F1-F4是柱色谱法级分。10%凝胶，非还原条件。

图7 - 关于蛋白S Gla + EGF的细胞凋亡测定. 上图和下图代表相同的重复操作，但是减小了蛋白S Gla + EGF的量，且减小了抗-His结构域抗体的量。

图8 - 关于蛋白S Gla + EGF的细胞凋亡测定. 除了使用的膜联蛋白V的量（该量在下图中加倍）以外，上图和下图代表相同的重复操作。

示例性实施方案的描述

象膜联蛋白一样，γ-羧基谷氨酸(Gla)-结构域蛋白诸如因子II、VII、IX、X、蛋白C和蛋白S结合阴离子膜。实际上，Gla-结构域已经被用作理性地设计为细胞凋亡特异性探针的小分子的模型(Cohen等人，2009)。在这里，发明人提出这些Gla-结构域蛋白的膜靶向部分作为对细胞凋亡和疾病特异性的新生物探针类别的应用。这些天然存在的和靶向的蛋白的应用可以导致与当前探针有关的增强的特异性，具有较小尺寸(<30 kDa)的额外优点。即使在较大的实施方案（其包括EGF和/或Kringle结构域）中，这些蛋白仍然可以小于膜联蛋白V (37 kDa)，且可能小至<5 kDa。这些生物探针可以在体外和在体内靶向PtdS细胞表面表达。因而，可能开发在亲和力、特异性和大小方面优于膜联蛋白V的细胞凋亡/疾病靶向探针，其具有用作治疗剂的额外潜力。在下面更详细地描述本公开内容的这些和其它方面。

在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数形式，反之亦然。为了解释本说明书和它的有关权利要求的目的，在下面阐述的任何定义与该词语在任何其它文件（包括通过引用并入本文的任何文件）中的用法冲突的情况下，总是以下面阐述的定义为准，除非清楚地指出相反的含义(例如在最初使用该术语的文件中)。除非另外说明，否则“或”的使用是指“和/或”。“一个”在本文中的应用是指“一个或多个”，除非另外说明，或在“一个或多个”的使用是明显不适当的情况下。“包含”和“包括”的应用是可互换的，且不是限制性的。例如，术语“包括”应当是指“包括、但不限于”。词语“约”是指所述的数字加或减5%。

本文中使用的“分离的肽或多肽”意图表示基本上不含有其它生物分子的肽或多肽，包括具有不同序列的肽或多肽。在某些实施方案中，按干重计，所述分离的肽或多肽具有至少约75%、约80%、约90%、约95%、约97%、约99%、约99.9%或约100%的纯度。在某些实施方案中，通过方法诸如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析，可以测量纯度。

本文中使用的“保守置换”表示多肽的修饰，其涉及用一个或多个氨基酸置换具有类似生物化学特性的氨基酸，且不导致所述多肽的生物学或生物化学功能的损失。“保守氨基酸置换”是其中用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的置换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例 如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例 如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。本公开内容的抗体可以具有一个或多个保守氨基酸置换，仍然保留抗原结合活性。

对于核酸和多肽，术语“实质同源性”指示，在最佳比对和对比时，两个核酸或两个多肽或其指定序列在至少约80%的核苷酸或氨基酸（通常至少约85%，在某些实施方案中，约90%、91%、92%、93%、94%或95%，在至少一个实施方案中，至少约96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%或99.5%的核苷酸或氨基酸）中是相同的，具有适当的核苷酸或氨基酸插入或缺失。可替换地，当区段在选择性杂交条件下与该链的补体杂交时，存在核酸的实质同源性。也包括与本文中列举的特定核酸序列和氨基酸序列具有实质同源性的核酸序列和多肽序列。

两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数×100)，考虑缺口的数目和每个缺口的长度，所述缺口为了两个序列的最佳比对而需要引入。使用数学算法，诸如但不限于VectorNTI™(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)的AlignX™模块，可以实现两个序列之间的序列对比和同一性百分比测定。对于AlignX™，多重比对的默认参数是：缺口开放罚分：10；缺口延伸罚分：0.05；缺口分开罚分范围：8；比对延迟的%同一性：40。(其它细节在环球网invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html)。

使用基于Higgins等人，Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191)的算法的CLUSTALW计算机程序(Thompson等人，Nucleic Acids Res, 1994, 2(22): 4673-4680)，可以确定用于确定查询序列(本公开内容的序列)与主题序列之间的最好总匹配的另一种方法(也称为全局序列比对)。在序列比对中，查询和主题序列都是DNA序列。所述全局序列比对的结果按同一性百分比计。在DNA序列的CLUSTALW比对中可以用于经由逐对比对来计算同一性百分比的参数是：矩阵＝IUB，k-元组＝1，顶部对角线的数目＝5，缺口罚分＝3，缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝0.1。对于多重比对，可以使用下述CLUSTALW参数：缺口开放罚分＝10，缺口延伸参数＝0.05；缺口分开罚分范围＝8；比对延迟的％同一性＝40。

核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中，或者呈部分纯化的或基本上纯的形式。当从在天然环境中通常伴随核酸的其它细胞组分纯化开时，所述核酸是“分离的”或“基本上纯的”。为了分离核酸，可以使用标准技术诸如以下的：碱/SDS处理、CsCl显带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其它技术。

I. 磷脂酰丝氨酸(PtdS)

A. 结构和合成

磷脂酰丝氨酸(缩写PtdS、Ptd-L-Ser或PS)是一种磷脂组分，经常通过称作翻转酶的酶保持在细胞膜的内小叶(细胞溶质侧)上。当细胞经历细胞凋亡时，磷脂酰丝氨酸不再限于膜的细胞溶质部分，而是变得暴露于细胞的表面上。PtdS的化学式是C₁₃H₂₄NO₁₀P，且具有385.304的分子质量。结构显示在下面：

磷脂酰丝氨酸在细菌中通过将氨基酸丝氨酸与CDP (二磷酸胞苷)-活化的磷脂酸缩合而生物合成。在哺乳动物中，磷脂酰丝氨酸通过与磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的碱交换反应而产生。相反，磷脂酰丝氨酸还可以产生磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱，尽管在动物中从磷脂酰丝氨酸产生磷脂酰胆碱的途径仅仅在肝脏中起作用。

B. 功能

磷脂酰丝氨酸的早期研究从牛脑蒸馏化学物质。因为关于疯牛病的担忧，从大豆制备现代研究和商购可得的产品。在大豆产品中与丝氨酸连接的脂肪酸与牛产品中的脂肪酸不同，且也是不纯的。在大鼠中的初步研究指示，大豆产品至少与牛起源的产品一样有效。

美国FDA已经将“合格的健康声明”状态授予磷脂酰丝氨酸，叙述称，“磷脂酰丝氨酸的消费可能降低老年人的痴呆风险”和“磷脂酰丝氨酸的消费可能降低老年人的认知功能障碍风险”。

已经证实磷脂酰丝氨酸会加速恢复、预防肌肉酸痛、改善健康，且可能在涉入周期工作、重量训练和耐力跑的运动员中具有生力性能。已经报道，大豆-PtdS以剂量依赖性的方式(400 mg)是用于对抗锻炼诱导的应激（通过钝化锻炼诱导的皮质醇水平增加）的有效补充剂。PtdS补充会促进运动员的合乎需要的激素平衡，且可能减弱伴随训练和/或过度牵张的生理学衰退。在最近的研究中，已经证实PtdS会增强处于精神紧张中的年轻人群体的情绪，并通过增加高尔夫球手的应激抗性而改善在从球座开球过程中的准确度。第一个初步研究指示，PtdS补充对于具有注意力缺陷伴多动障碍的儿童可能是有益的。

传统地，从牛皮质(BC-PS)衍生出PtdS补充物；但是，由于感染性疾病的潜在转移，已经将大豆衍生的PS (S-PS)确立为潜在的安全替代物。大豆衍生的PS是公认为安全的(GRAS)，且是老年人的安全营养补剂（如果每天3次摄入200 mg的剂量）。已经证实磷脂酰丝氨酸会减小小鼠中的特异性免疫应答。

PtdS可以存在于肉中，但是在脑中和在内脏（诸如肝脏和肾）中最丰富。在乳制品中或在蔬菜（除了白豆以外）中仅可以发现少量的PS。

膜联蛋白-A5是对PtdS具有强结合亲和力的天然存在的蛋白。标记的膜联蛋白-A5能够在体外或在体内使处于细胞凋亡早期至中期状态的细胞显影。另一种PtdS结合蛋白是Mfge8。锝标记的膜联蛋白-A5能够区分恶性和良性肿瘤，其病理学包括与良性肿瘤中的低细胞凋亡速率相比在恶性肿瘤中的高细胞分裂和细胞凋亡速率。

II. Gla结构域蛋白

A. Gla结构域

Gla-结构域蛋白的通式结构是这样的：Gla结构域之后是EGF结构域，然后是C端丝氨酸蛋白酶结构域。例外是：凝血酶原，其含有Kringle结构域替代EGF结构域；和蛋白S，其不具有丝氨酸蛋白酶结构域，而是具有结合性激素的球蛋白样(SHBG)结构域(Hansson和Stenflo, 2005)。Gla-结构域蛋白对阴离子膜的亲和力会变化。大致上，它们分成3类：1)具有30-50 nM的Kd的高亲和力结合剂，2)具有100-200 nM的K_d的中亲和力结合剂，和3)具有1000-2000 nM的Kd的低亲和力结合剂。已经证实高亲和力Gla结构域蛋白结合具有蛋白S的阴离子膜，明确地证实经由它与PtdS的相互作用而结合细胞凋亡的细胞(Webb等人，2002)。低亲和力Gla结构域蛋白使用第二受体结合细胞膜。例如，FVII利用组织因子(TF)。认为Gla结构域/第1个EGF结构域构成FVII的高亲和力TF结合结构域。对于该方案而言重要的是，许多研究已经证实了癌细胞（包括结直肠癌、NSCL癌和乳腺癌）的表面上的TF上调，并且这些高TF水平已经与预后不良相关联(Yu等人，2004)。尽管阴离子膜对FVII的亲和力是相对较低的，癌症中高亲和力TF相互作用的添加以及记载的TF的上调使它成为潜在地令人感兴趣的癌症特异性的探针。

B. 含有Gla结构域的蛋白

1. 因子II

凝血酶原（也被称作凝固因子II）被蛋白水解地切割以形成凝血级联中的凝血酶，所述凝血级联最终导致失血的填塞（stemming）。凝血酶又充当丝氨酸蛋白酶，其将可溶性的纤维蛋白原转化成纤维蛋白的不溶性链，以及催化许多其它的凝固相关的反应。它主要在肝脏中表达。

编码凝血酶原的基因位于着丝粒区域中的染色体11上。它由14个外显子组成，且含有24千碱基的DNA。该基因编码1个信号区域、1个前肽区域、1个谷氨酸结构域、2个Kringle区域和1个催化结构域。在有维生素K存在下，酶γ-谷氨酰基羧化酶将N- 端谷氨酸残基转化成γ-羧基谷氨酸残基。这些γ-羧基谷氨酸残基是凝血酶原与血小板膜上的磷脂的结合所必需的。

遗传性因子II缺乏是一种常染色体隐性障碍，其可以显现为低凝血酶原血症（凝血酶原的总合成的下降）或异常凝血酶原血症（功能失调性凝血酶原的合成）。纯合的个体通常是无症状的，且具有2-25%的功能性凝血酶原水平。但是，有症状的个体可能经历容易碰伤、鼻出血、软组织出血、过度手术后出血和/或月经过多。

凝血酶原在慢性荨麻疹、自身免疫病和不同血管障碍中起作用。青斑血管病变与免疫球蛋白(Ig)M抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体有关。抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体和组织病理学坏死性血管炎在上至中真皮中的存在指示皮肤白细胞分裂性脉管炎而不是皮肤结节性多动脉炎。

除了凝血酶原缺乏以外，凝血酶原的另一种障碍是凝血酶原20210a突变。静脉血栓栓塞的家族成因（即凝血酶原20210a突变）导致增加的血浆凝血酶原水平和同时增加的血栓症发展的风险。尽管尚未阐明该障碍的确切机制，凝血酶原20210a突变涉及腺嘌呤对凝血酶原基因的3' 非翻译区内的位置20210处的鸟嘌呤的置换。该突变会改变该基因的多腺苷酸化位点，并导致增加的mRNA合成和随后的蛋白表达的增加。

2. 因子VII

因子VII (以前被称作前转变素)是凝血级联中造成血液凝结的蛋白之一。因子VII的基因位于染色体13 (13q34)上。它是丝氨酸蛋白酶类别的酶，且美国食品和药品管理局批准将重组形式的人因子VIIa (NovoSeven)用于血友病患者中的失控出血。它有时未经许可地用于严重的不可控制的出血，尽管已经存在安全性担忧。重组活化的因子VII的生物类似形式(AryoSeven)由AryoGen Biopharma制造。

因子VII (FVII)的主要作用是与组织因子(TF/因子III)一起引发凝固过程。组织因子存在于血管的外侧上——通常不暴露于血流。在血管损伤后，组织因子暴露于血液和循环因子VII。结合至TF以后，FVII被不同的蛋白酶活化成FVIIa，所述蛋白酶包括凝血酶(因子IIa)、因子Xa、IXa、XIIa和FVIIa-TF复合物本身。FVIIa-TF的最重要的底物是因子X和因子IX。已经证实因子VII与组织因子(TF)相互作用。

该因子的作用被组织因子途径抑制剂(TFPI)阻碍，所述抑制剂几乎在凝固开始以后立即释放。因子VII是维生素K依赖性的；它在肝脏中产生。华法林或类似的抗凝血剂的应用会减少FVII的肝合成。

缺乏是罕见的(先天性前转变素缺乏)，并隐性遗传地遗传。因子VII缺乏呈现为血友病-样出血障碍。用重组因子VIIa (NovoSeven或AryoSeven)治疗它。重组因子VIIa也用于具有血友病(具有因子VIII或IX缺乏)的人，其已经形成针对替换凝固因子的抑制剂。它还已经用在不可控制的出血场合，但是它在该场合中的作用是有争议的，没有足够的证据支持它在临床试验之外的应用。它在出血中的应用的首个报道是在1999年在具有不可控制的出血的以色列士兵中。它的应用风险包括动脉血栓形成的增加。

3. 因子IX

因子IX (或Christmas因子)是凝固系统的丝氨酸蛋白酶之一；它属于肽酶家族S1。因子IX的基因位于X染色体(Xq27.1-q27.2)上，且因此是X连锁隐性的：该基因中的突变对男性的影响频率远高于女性。该蛋白的缺乏会造成血友病B。因子IX作为酶原（一种无活性的前体）而产生。它经过加工以除去信号肽，糖基化，然后被因子XIa (属于接触途径)或因子VIIa (属于组织因子途径)切割以产生双链形式，其中所述链通过二硫键连接。当在有Ca²⁺、膜磷脂和因子VIII辅因子存在下活化成因子IXa时，它水解因子X中的一个精氨酸-异亮氨酸键以形成因子Xa。因子IX被抗凝血酶抑制。

因子VII、IX和X都在血液凝固中起关键作用，且也共有共同的结构域构造。因子IX蛋白由4个蛋白结构域组成。这些是1个Gla结构域、2个串联的EGF结构域拷贝和1个执行催化裂解的C-端胰蛋白酶-样肽酶结构域。已经证实N-端EGF结构域至少部分地负责结合组织因子。Wilkinson等人得出结论：第二个EGF结构域的残基88-109介导与血小板的结合和因子X活化复合物的组装。已经揭示了所有4个结构域的结构。确定了猪蛋白的2个EGF结构域和胰蛋白酶样结构域的结构。还通过NMR确定了负责Ca(II)依赖性的磷脂结合的Gla结构域的结构。已经解析了“超活性”突变体的几种结构，其揭示了凝固级联中的其它蛋白的因子IX活化的性质。

因子IX的缺乏会造成Christmas病(血友病B)。已经描述了因子IX的超过100个突变；有些不会造成症状，但是许多会导致显著的出血障碍。使用重组因子IX来治疗Christmas病，且作为BeneFIX商购得到。因子IX的一些罕见突变导致升高的凝固活性，且可以导致凝固疾病，诸如深静脉血栓形成。

4. 因子X

因子X (Stuart-Prower因子；凝血酶原酶)是凝血级联的一种酶。人因子X基因位于第十三染色体(13q34)上。它是一种丝氨酸内肽酶(蛋白酶组S1)。因子X在肝脏中合成，且它的合成需要维生素K。因子X被因子IX (与它的辅因子因子VIII一起，在被称作内在Xase的复合物中)和因子VII(与它的辅因子组织因子一起，在被称作外在Xase的复合物中)活化成因子Xa。因子X的半衰期是40-45小时。它因此是最终的共同途径或凝血酶途径的第一个成员。它通过在两个位置(arg-thr键，然后是arg-ile键)切割凝血酶原而起作用，这产生有活性的凝血酶。当因子Xa与凝血酶原酶复合物中的活化的辅因子V形成复合物时，会优化该过程。因子X是新鲜冷冻血浆和凝血酶原酶复合物的组成部分。唯一商购可得的浓缩物是CSL Behring制造的“因子X P Behring”。

因子Xa被蛋白Z依赖性的蛋白酶抑制剂(ZPI) (丝氨酸蛋白酶抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)灭活。蛋白Z的存在会使该蛋白对因子Xa的亲和力增加1000倍，而因子XI的灭活不需要蛋白Z。蛋白Z中的缺陷会导致增加的因子Xa活性和血栓形成倾向。

因子X的先天性缺乏是非常罕见的(1:500,000)，且可能与鼻出血(鼻衄)、关节积血(出血进关节中)和胃肠失血一起存在。除了先天性缺乏以外，低因子X水平可能偶尔发生在许多疾病状态中。例如，因子X缺乏可能见于淀粉样变性中，其中因子X吸附至脉管系统中的淀粉样蛋白纤丝。并且，维生素K的缺乏或华法林(或类似药物)的拮抗作用会导致无活性的因子X的产生。在华法林疗法中，这是阻止血栓形成所需要的。截止至2007年晚期，5种新出现的抗-凝固治疗剂中的4种靶向该酶。直接Xa抑制剂是流行的抗凝血剂。

在二十世纪六十年代开发的传统凝固模型预见到2个单独的级联：外在(组织因子(TF))途径和内在途径。这些途径会聚至一个共同点：因子Xa/Va复合物的形成，其与钙一起并结合到磷脂表面上从凝血酶原(因子II)产生凝血酶(因子IIa)。抗凝固的一种新模型（基于细胞的模型）似乎会更充分地解释凝固中的步骤。该模型具有3个阶段：1)在带有TF的细胞上的凝固起始，2)在带有TF的细胞上产生的凝血酶对促凝信号的放大，和3)血小板表面上的凝血酶产生的传播。因子Xa在所有这三个阶段中起关键作用。

在阶段1中，因子VII结合至细胞表面上的跨膜蛋白TF且转化成因子VIIa。结果是催化因子X和因子IX的活化的因子VIIa/TF复合物。在带有TF的细胞的表面上形成的因子Xa与因子Va相互作用以形成凝血酶原酶复合物，其在带有TF的细胞的表面上产生少量凝血酶。在阶段2（放大阶段）中，如果已经产生足够的凝血酶，那么发生血小板和血小板有关的辅因子的活化。在阶段3（凝血酶产生）中，因子XIa活化在活化的血小板的表面上的游离因子IX。活化的因子IXa与因子VIIIa一起形成“tenase”复合物。该复合物活化更多的因子X，其又与因子Va一起形成新的凝血酶原酶复合物。因子Xa是转化大量凝血酶原（“凝血酶爆发”）的凝血酶原酶复合物的主要组分。每个因子Xa分子可以产生1000个凝血酶分子。该大凝血酶爆发负责纤维蛋白聚合以形成血栓。

因子X的合成或活性的抑制是目前使用中的许多抗凝血剂的作用机理。华法林（香豆素的一种合成的衍生物）是在美国最广泛地使用的口服抗凝血剂，在某些欧洲国家使用其它的香豆素衍生物(苯丙香豆素和醋硝香豆素)。这些药剂是维生素K拮抗剂(VKA)。维生素K是因子II (凝血酶原)、VII、IX和X的肝合成所必需的。肝素(未分级分离的肝素)及其衍生物低分子量肝素(LMWH)结合血浆辅因子抗凝血酶(AT)以灭活几种凝固因子IIa、Xa、XIa和XIIa。

最近，已经开发了因子Xa的特异性的、直接起作用的抑制剂的新系列。这些包括药物利伐沙班、阿派沙班、贝曲沙班、LY517717、darexaban (YM150)、艾多沙班和813893。这些药剂具有几个胜过当前疗法的理论优点。它们可以口服地施用。它们具有快速的作用开始，且它们可能对因子Xa是更有效的，因为它们会抑制凝血酶原酶复合物中的游离因子Xa和因子Xa。

5. 蛋白S

蛋白S是在内皮中合成的一种维生素K依赖性的血浆糖蛋白。在循环中，蛋白S以两种形式存在：游离形式和与补体蛋白C4b-结合蛋白(C4BP)结合的复合形式。在人类中，蛋白S由PROS1基因编码。最佳表征的蛋白S的功能是它在抗凝固途径中的作用，其中它作为蛋白C的辅因子在因子Va和VIIIa的灭活中起作用。仅游离形式具有辅因子活性。

蛋白S可以经由羧酸酯化的GLA结构域结合至带负电荷的磷脂。该性质允许蛋白S在经历细胞凋亡的细胞的除去中起作用。细胞凋亡是身体用于从组织除去不希望的或损伤的细胞的细胞死亡形式。处于细胞凋亡(即，在细胞凋亡过程中)的细胞不再活跃地处理磷脂在它们的外膜中的分布，且因此开始在细胞表面上展示带负电荷的磷脂，诸如磷脂酰丝氨酸。在健康细胞中，ATP (腺苷三磷酸)依赖性的酶从细胞膜的外小叶除去这些。这些带负电荷的磷脂被吞噬细胞诸如巨噬细胞识别。蛋白S可以结合至带负电荷的磷脂，并在细胞凋亡的细胞和吞噬细胞之间作为桥连分子起作用。蛋白S的桥连性质会增强细胞凋亡的细胞的吞噬作用，从而允许它被“干净地”除去，而不发生任何组织损伤的症状诸如炎症。

PROS1基因中的突变可以导致蛋白S缺乏，其是一种罕见的血液障碍，其可以导致增加的血栓形成风险。已经证实蛋白S与因子V相互作用。

6. 蛋白C

蛋白C（也被称作自身凝血酶原IIA和血液凝固因子XIV）是一种酶原(无活性)蛋白，其活化形式在调节血液凝固、炎症、细胞死亡和维持人类和其它动物的血管壁的渗透性中起重要作用。活化的蛋白C (APC)主要通过蛋白水解地灭活蛋白因子V_a和因子VIII_a而执行这些操作。APC被归类为丝氨酸蛋白酶，因为它在它的活性部位中含有丝氨酸残基。在人类中，蛋白C由存在于染色体2中的PROC基因编码。

蛋白C的酶原形式是在血浆中循环的维生素K依赖性的糖蛋白。它的结构是由通过二硫键连接的轻链和重链组成的双链多肽的结构。蛋白C酶原当结合凝血酶（另一种深入参与凝固的蛋白）时会被活化，且血栓调节蛋白和内皮蛋白C受体(EPCR)的存在会极大地促进蛋白C的活化。因为EPCR的作用，活化的蛋白C主要存在于内皮细胞(即，构成血管壁的那些)附近，且APC影响这些细胞和白细胞(白血细胞)。因为蛋白C作为抗凝血剂所起的重要作用，具有蛋白C缺乏或某类APC抗性的那些人遭受显著增加的形成危险血块(血栓形成)的风险。

关于活化的蛋白C（也被称作α-活化的替加色罗(商标为Xigris)）的临床应用的研究已经被争论包围。生产商Eli Lilly and Company发起了攻击性的销售运动来促进它在具有严重脓毒症和脓毒性休克的人中的应用，包括2004 Surviving Sepsis CampaignGuidelines的资助。但是，2011 Cochrane综述发现，不可以推荐它的应用，因为它不会改善存活(和增加出血风险)。

人蛋白C是一种维生素K依赖性的糖蛋白，其在结构上类似于影响血液凝固的其它维生素K依赖性的蛋白，诸如凝血酶原、因子VII、因子IX和因子X。蛋白C合成发生在肝脏中，且开始于单链前体分子：在前肽前面的32个氨基酸的N-端信号肽。当除去Lys¹⁹⁸和Arg¹⁹⁹的二肽时，形成蛋白C；这造成向异源二聚体的转化，在每条链上具有N-连接的碳水化合物。所述蛋白具有通过Cys¹⁸³和Cys³¹⁹之间的二硫键连接的一条轻链(21 kDa)和一条重链(41kDa)。

无活性蛋白C包含在多个结构域中的419个氨基酸：一个Gla结构域(残基43-88)；一个螺旋芳族区段(89-96)；两个表皮生长因子(EGF)-样结构域(97-132和136-176)；一个活化肽(200-211)；和一个胰蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶结构域(212-450)。所述轻链含有Gla-和EGF-样结构域和芳族区段。所述重链含有蛋白酶结构域和活化肽。在该形式，85-90%的蛋白C在血浆中作为酶原循环，等待被活化。剩余的蛋白C酶原包含所述蛋白的轻微修饰形式。当凝血酶分子从重链的N-端切掉活化肽时，发生酶的活化。活性部位含有丝氨酸蛋白酶的典型催化三联体(His²⁵³、Asp²⁹⁹和Ser⁴⁰²)。

蛋白C的活化由血栓调节蛋白和内皮蛋白C受体(EPCR)强烈促进，后者主要存在于内皮细胞(血管内侧的细胞)上。血栓调节蛋白的存在会使活化加速几个数量级，且EPCR使活化加速20倍。如果这两种蛋白中的任一种不存在于鼠样本中，那么小鼠当还处于胚胎状态时死于过度血液凝固。在内皮上，APC在调节血液凝固、炎症和细胞死亡(细胞凋亡)中起重要作用。因为血栓调节蛋白对蛋白C的活化的加速作用，可以说成该蛋白不是被凝血酶活化，而是被凝血酶-血栓调节蛋白(或甚至凝血酶-血栓调节蛋白-EPCR)复合物活化。一旦处于活性形式，APC可以保持或不保持结合至EPCR，所述APC对EPCR的亲和力大约与蛋白酶原相同。

Gla结构域对于结合带负电荷的磷脂（用于抗凝固）和结合EPCR（用于细胞保护）而言是特别有用的。一个特定外部会有效地增进蛋白C的灭活因子V_a的能力。另一个是与血栓调节蛋白的相互作用所必需的。

酶原形式的蛋白C以65-135 IU/dL之间的浓度存在于正常成年人血浆中。活化的蛋白C以比此低大约2000倍的水平存在。轻度蛋白C缺乏对应于20 IU/dL以上的血浆水平，但是低于正常范围。中等严重的缺乏描述了1-20 IU/dL之间的血液浓度；严重的缺乏产生低于1 IU/dL或不可检测的蛋白C水平。健康足月儿中的蛋白C水平平均为40 IU/dL。蛋白C的浓度增加直到6个月，此时平均水平是60 IU/dL；该水平在儿童期保持较低，直到它在青春期以后达到成年水平。活化的蛋白C的半衰期是约15分钟。

蛋白C途径是控制APC的表达水平和它在体内的活性的特异性化学反应。蛋白C是多效的，具有两大类功能：抗凝固和细胞保护(它对细胞的直接作用)。蛋白C执行哪种功能取决于APC在活化后是否保持结合至EPCR；当它不结合时，发生APC的防止凝血作用。在该情况下，蛋白C如下作为抗凝血剂起作用：不可逆地蛋白水解地灭活因子V_a和因子VIII_a，使它们分别转化成因子V_i和因子VIII_i。当仍然结合至EPCR时，活化的蛋白C执行它的细胞保护作用，作用于效应物底物PAR-1，即蛋白酶活化的受体-1。在一定程度上，APC的抗凝血性能独立于它的细胞保护性能，因为一种途径的表达不受另一种途径的存在影响。

通过减小可利用的血栓调节蛋白或EPCR中的任一种的量，可以下调蛋白C的活性。这可以通过炎症性细胞因子诸如白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)来实现。活化的白细胞在炎症过程中释放这些炎症介质，从而抑制血栓调节蛋白和EPCR的产生，并诱导它们从内皮表面的脱落。这两种作用下调蛋白C活化。凝血酶本身也可能对EPCR水平具有影响。另外，从细胞释放的蛋白可以阻碍蛋白C活化，例如嗜酸性粒细胞，其可以解释高嗜酸粒细胞性心脏病中的血栓形成。血小板因子4可以上调蛋白C。推测该细胞因子如下改善蛋白C的活化：形成从蛋白C的Gla结构域至血栓调节蛋白的糖胺聚糖(GAG)结构域的静电桥，从而减小它们的反应的米氏常数(K_M)。另外，蛋白C抑制剂会抑制蛋白C。

遗传性蛋白C缺乏（处于它的与简单杂合性有关的轻度形式）会造成成年人中显著增加的静脉血栓形成风险。如果胎儿对于缺乏而言是纯合的或混合杂合的，可能存在暴发性紫癜、严重的弥漫性血管内凝血和子宫中的同时静脉血栓栓塞的呈现；这是非常严重的和经常致命的。小鼠中蛋白C基因的缺失会造成在出生时间附近的胎儿死亡。不具有蛋白C的胎儿小鼠最初正常地发育，但是经历严重出血、凝血病、纤维蛋白沉积和肝脏坏死。在无症状个体中蛋白C缺乏的频率是1/200和1/500。相反，缺乏的显著症状在1/20,000的个体中是可检测的。尚未检测到种族或民族偏倚。

当APC不能执行它的功能时，发生活化的蛋白C抗性。该疾病具有与蛋白C缺乏类似的症状。在高加索人中最常见的导致活化的蛋白C抗性的突变是在APC对因子V的切割位点处。在该处，Arg⁵⁰⁶被Gln替代，从而产生因子V Leiden。该突变也被称为R506Q。导致该切割位点的丢失的突变实际上停止APC免于有效地灭活因子V_a和因子VIII_a。因而，人的血液非常容易地凝固，且他永久处于增加的血栓形成风险中。因子V_Leiden突变杂合的个体具有静脉血栓形成的风险比在一般群体中高5-7倍。纯合受试者具有高80倍的风险。该突变也是高加索人中的静脉血栓形成的最常见遗传风险。

约5%的APC抗性与以上突变和因子V_Leiden无关。其它基因突变会造成APC抗性，但是都没有达到因子V_Leiden所达到的程度。这些突变包括因子V的各种其它形式、靶向因子V的自身抗体的自发产生和APC的任何辅因子的功能障碍。并且，一些获得性病症可能减小APC在执行它的防止凝血功能中的效力。研究提示，20%至60%的具有血栓形成倾向的患者遭受某种形式的APC抗性。

C. Gla结构域肽和多肽

本公开内容预见到多种含有Gla结构域的肽和多肽的设计、生产和应用。这些分子的结构特征如下。首先，所述肽或多肽具有Gla结构域，其含有约30-45个构成Gla结构域的连续残基。因而，即使当包括术语“包含”时，术语“具有不超过“X”个连续残基的肽”不可理解为包含更大数目的连续残基。其次，所述肽和多肽可以含有另外的非-Gla结构域残基，诸如EGF结构域、Kringle结构域、Fc结构域等。

一般而言，所述肽和多肽将是300个残基或更少，再次包含Gla结构域的30-45个连续残基。总长度可以是30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275和至多300个残基。预见到50-300个残基、100-300个残基、150-300个残基、200-300个残基、50-200个残基、100-200个残基和150-300个残基和150-200个残基的肽长度范围。连续Gla残基的数目可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

本公开内容可以利用L-构型氨基酸、D-构型氨基酸或其混合物。尽管L-氨基酸代表在蛋白中发现的绝大部分氨基酸，在外来海洋生物（诸如锥蜗牛）生产的某些蛋白中发现了D-氨基酸。它们也是细菌的肽聚糖细胞壁的丰富组分。D-丝氨酸可以充当脑中的神经递质。氨基酸构型的L和D惯例不指氨基酸本身的光学活性，而是指可以在理论上合成该氨基酸的甘油醛的异构体的光学活性(D-甘油醛是右旋的；L-甘油醛是左旋的)。

“所有-D”肽的一种形式是反-倒位肽。天然存在的多肽的反-倒位修饰涉及具有与对应L-氨基酸相反的α-碳立体化学的氨基酸的合成装配，即，就天然肽序列而言处于倒序的D-氨基酸。反-倒位类似物因而具有反转的末端和肽键的反向(NH-CO，而不是CO-NH)，同时如在天然肽序列中一样大致维持侧链的拓扑学。参见美国专利6,261,569，通过引用并入本文。

D. 合成

有利的是，使用固相合成技术(Merrifield, 1963)来生产肽和多肽。其它肽合成技术是本领域技术人员众所周知的(Bodanszky等人，1976; Peptide Synthesis, 1985;Solid Phase Peptide Synthelia, 1984)。用在这样的合成中的适当保护基见于以上的正文中，以及在Protective Groups in Organic Chemistry (1973)中。这些合成方法涉及将一个或多个氨基酸残基或合适的保护的氨基酸残基相继添加至延长中的肽链。通常，将第一个氨基酸残基的任一个氨基或羧基用合适的、可选择性地除去的保护基保护。将一种不同的、可选择性地除去的保护基用于含有反应性侧基（诸如赖氨酸）的氨基酸。

使用固相合成作为一个例子，将受保护的或衍生化的氨基酸通过它的未保护的羧基或氨基连接至惰性固体支持物。然后选择性地除去氨基或羧基的保护基，并将具有适当地保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中的下一个氨基酸混合，并与已经连接至固体支持物的残余物反应。然后从该新添加的氨基酸残基除去氨基或羧基的保护基，然后添加下一个氨基酸(被适当地保护)，诸如此类。已经以适当的次序连接所有期望的氨基酸以后，依次或并行地除去任何残余的末端和侧基保护基(和固体支持物)，以提供最终的肽。本公开内容的肽和多肽优选地没有苄基化的或甲基苄基化的氨基酸。这样的保护基部分可以用在合成过程中，但是它们在使用肽和多肽之前被除去。另外的反应可能是必要的，如别处所述，以形成分子内键来限制构象。

除了可以使用20个标准氨基酸以外，存在巨大数目的“非标准”氨基酸。这些中的两个可以通过遗传密码来指定，但是在蛋白中是相当罕见的。硒代半胱氨酸在UGA密码子（其通常是终止密码子）处掺入一些蛋白中。吡咯赖氨酸被一些产甲烷的古细菌用在它们用于生产甲烷的酶中。它用密码子UAG编码。在蛋白中未发现的非标准氨基酸的例子包括羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸和神经递质γ-氨基丁酸。非标准氨基酸经常作为中间体存在于标准氨基酸的代谢途径中，例如鸟氨酸和瓜氨酸存在于尿素循环（即氨基酸分解代谢的一部分）中。非标准氨基酸经常通过对标准氨基酸的修饰而形成。例如，高半胱氨酸通过转硫途径或通过经由中间代谢物S-腺苷基甲硫氨酸对甲硫氨酸的脱甲基化而形成，而羟脯氨酸通过脯氨酸的翻译后修饰而产生。

E. 接头

接头或交联剂可以用于将Gla结构域肽或多肽融合至其它蛋白序列(例如，抗体Fc结构域)。双功能交联剂已经被广泛地用于多种目的，包括亲和基质的制备、不同结构的修饰和稳定化、配体和受体结合位点的鉴别、以及结构研究。携带两个相同官能团的同双功能试剂被证实在诱导相同和不同大分子或大分子亚基之间的交联和多肽配体与它们的特异性结合位点的连接中是非常有效的。异双功能试剂含有两个不同的官能团。通过利用两个不同官能团的差别反应性，可以选择性地和依次控制交联。根据它们的官能团（例如，氨基-、巯基-、胍基-、吲哚-或羧基-特异性的基团）的特异性，可以分开双功能交联剂。在这些中，针对游离氨基的试剂已经变得特别普及，因为它们的商业可用性、合成的容易和它们可以应用的温和反应条件。大部分异双功能交联剂含有伯胺反应基团和巯基反应基团。

在另一个实施例中，异双功能交联剂和使用所述交联剂的方法描述在美国专利5,889,155中，其明确地通过引用整体并入本文。所述交联剂将亲核的酰肼残基与亲电子的马来酰亚胺残基组合，从而在一个实施例中允许醛与游离巯基的偶联。可以修饰交联剂以交联不同官能团，且因而可用于交联多肽。在特定肽在它的天然序列中不含有适合给定交联剂的残基的情况下，可以利用基本序列中的保守遗传或合成氨基酸变化。

F. 另外的肽/多肽序列

一种因子药物开发是实现适当的循环半衰期，其影响剂量、药物施用和效力，且这对于生物治疗剂而言是特别重要的。低于60 kD的小蛋白被肾迅速地清除，且因此不会到达它们的靶标。这意味着需要高剂量才能达到效力。目前用于增加蛋白在循环中的半衰期的修饰包括：聚乙二醇化；与蛋白（例如转铁蛋白(WO06096515A2)、白蛋白、生长激素(美国专利公开2003104578AA)）的缀合或基因融合；与纤维素的缀合(Levy和Shoseyov, 2002)；与Fc片段的缀合或融合；糖基化和诱变方案(Carter, 2006)。

在聚乙二醇化的情况下，将聚乙二醇(PEG)缀合至蛋白，所述蛋白可以是例如血浆蛋白、抗体或抗体片段。在二十世纪八十年代进行了关于抗体的聚乙二醇化的作用的第一个研究。可以酶促地或化学地进行缀合，且在本领域中充分确立(Chapman, 2002;Veronese和Pasut, 2005)。由于聚乙二醇化，可以增加总大小，这会减小肾过滤的机会。聚乙二醇化进一步保护免于蛋白水解降解，并减慢从血液中的清除。此外，已经报道，聚乙二醇化可以降低免疫原性和增加溶解度。通过PEG的添加而改善的药代动力学是由于几种不同的机制：分子大小的增加，保护免于蛋白酶解，降低的抗原性，和掩蔽特定序列免于细胞受体。在抗体片段(Fab)的情况下，已经通过聚乙二醇化实现了血浆半衰期的20倍增加(Chapman, 2002)。

迄今为止，存在几种经批准的聚乙二醇化的药物，例如，在2000年销售的PEG-干扰素α2b (佩乐能)和在2002年销售的α2a (派罗欣)。针对TNFα的聚乙二醇化抗体片段（被称作Cimzia或培化舍珠单抗）在2007年提交FDA批准用于治疗克罗恩氏病，且已经在2008年4月22日被批准。聚乙二醇化的一个限制是合成长单分散物质的困难，特别是当需要超过1000 kD的PEG链时。对于许多应用而言，使用具有超过10000 kD的链长度的多分散PEG，从而产生具有不同长度PEG链的缀合物群体，其需要广泛分析来确保生产之间的等同批次。PEG链的不同长度可能导致不同的生物活性，且因此导致不同的药代动力学。聚乙二醇化的另一个限制是亲和力或活性的下降，如已经用α-干扰素派罗欣观察到的，其仅具有天然蛋白的抗病毒活性的7%，但是由于增强的血浆半衰期而具有改善的药代动力学。

另一个方案是将药物与长存活蛋白（例如，白蛋白，其为67 kD，且在人类中具有19天的血浆半衰期）缀合。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白，且参与血浆pH调节，但是也充当血浆中的物质的载体。在CD4的情况下，在将它与人血清白蛋白融合以后，已经实现了增加的血浆半衰期(Yeh等人，1992)。融合蛋白的其它例子是胰岛素、人生长激素、转铁蛋白和细胞因子(Duttaroy等人，2005; Melder等人，2005; Osborn等人，2002a; Osborn等人，2002b;Sung等人，2003)，且参见(美国专利公开2003104578A1、WO06096515A2和WO07047504A2，在本文中通过引用整体并入)。

还已经广泛地研究了糖基化对血浆半衰期和蛋白活性的影响。在组织型纤溶酶原激活物(tPA)的情况下，新糖基化位点的添加会降低血浆清除率和提高效能(Keyt等人，1994)。糖工程改造已经成功地应用于许多重组蛋白和免疫球蛋白(Elliott等人，2003;Raju和Scallon, 2007; Sinclair和Elliott, 2005; Umana等人，1999)。此外，糖基化会影响免疫球蛋白的稳定性(Mimura等人，2000; Raju和Scallon, 2006)。

用于融合蛋白的另一种分子是IgG的Fc片段(Ashkenazi和Chamow, 1997)。Fc融合方案已经用在例如Regeneron开发的Trap Technology中(例如，IL1阱和VEGF阱)。白蛋白用于延长肽的半衰期的用途已经描述在美国专利公开2004001827A1中，Fab片段和scFv-HSA融合蛋白也是如此。已经证实，白蛋白的延长的血清半衰期是由于由FcRn介导的重复利用过程(Anderson等人，2006; Chaudhury等人，2003)。

另一个策略是使用靶向免疫球蛋白与它们的受体的相互作用的定向诱变技术来改善结合性能，即，在Fc区中的亲和力成熟。由于增加的与FcRn的亲和力，可以在体内实现延长的半衰期(Ghetie等人，1997; Hinton等人，2006; Jain等人，2007; Petkova等人，2006a; Vaccaro等人，2005)。但是，亲和力成熟策略需要几轮诱变和试验。这需要时间，是昂贵的，且受到当突变时产生延长的半衰期的氨基酸的数目的限制。因此，需要简单的替代方案来改善生物治疗剂的体内半衰期。具有延长的体内半衰期的治疗剂对于慢性疾病、自身免疫障碍、炎症性疾病、代谢疾病、传染性疾病和眼疾病和癌症的治疗是特别重要的，特别当需要经历长时间段的治疗时。因此，仍然需要开发在循环中具有增强的持久性和半衰期的治疗剂(例如，抗体和Fc融合蛋白)，以便减小多种治疗剂的剂量和/或注射频率。

G. 标记

本公开内容的肽和多肽可以缀合至用于诊断目的的标记，诸如以鉴别癌细胞或病毒感染的细胞，包括它们在组织化学中的应用。根据本公开内容的标记被定义为使用测定可以检测到的任何部分。报告分子的非限制性例子包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、光亲和性分子、有色的颗粒或配体，诸如生物素。

标记缀合物对于用作诊断剂而言通常是优选的。诊断剂通常分成两类：用于体外诊断的那些，和用于体内诊断方案（通常被称作“定向成像”）的那些。许多适当的成像剂是本领域已知的，它们与肽和多肽的连接方法也是本领域已知的(参见，例如，美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。使用的成像部分可以是顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR-可检测的物质和X-射线成像剂。

在顺磁离子的情况下，作为示例可能提及离子诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中钆是特别优选的。在其它背景（诸如X-射线成像）中有用的离子包括、但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)和特别是铋(III)。

在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可能提及砹²¹¹、¹⁴碳、⁵¹铬、³⁶氯、⁵⁷钴、⁵⁸钴、铜⁶⁷、¹⁵²Eu、镓⁶⁷、³氢、碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、⁵⁹铁、³²磷、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、⁷⁵硒、³⁵硫、锝^99m和/或钇⁹⁰。¹²⁵I对于在某些实施方案中的应用而言经常是优选的，且锝^99m和/或铟¹¹¹由于它们的低能量和对长范围检测的适合性也经常是优选的。根据本领域中众所周知的方法，可以生产放射性地标记的肽和多肽。例如，通过与钠和/或碘化钾和化学氧化剂（诸如次氯酸钠）或酶促氧化剂（诸如乳过氧化物酶）接触，可以碘化肽和多肽。通过配体交换过程，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合至Sephadex柱上和将该肽应用于该柱，可以用锝^99m标记肽。可替换地，可以使用直接标记技术，例如，通过温育高锝酸盐、还原剂诸如SNCl₂、缓冲溶液诸如邻苯二甲酸钠-钾溶液和肽。经常用于将放射性同位素（其作为金属离子存在）结合至肽的中间官能团是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

预见到用作缀合物的荧光标记包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂（Renographin）、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红。

预见到的另一类缀合物是主要意图用于体外应用的缀合物，其中肽连接至第二结合配体和/或酶(酶标签)，其在与生色底物接触后将产生有色产物。合适的酶的例子包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和抗生物素蛋白和链霉亲和素化合物。这样的标记的应用是本领域技术人员众所周知的，且描述在例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中。

用于将肽连接或缀合至它的缀合物部分的其它方法是本领域已知的。一些连接方法包括金属螯形络合物的应用，其采用例如有机螯合剂诸如二乙烯三胺五乙酸酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或与抗体连接的四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3 (美国专利4,472,509和4,938,948)。在有偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐存在下，肽或多肽也可以与酶反应。在有这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸盐的反应，制备具有荧光素标志物的缀合物。

IV. 诊断和疗法

A. 药物制剂和施用途径

在预见到临床应用的情况下，必须以适于预期应用的形式制备药物组合物。通常，这需要制备基本上不含热原以及可能对人类或动物有害的其它杂质的组合物。

通常希望采用适当的盐和缓冲液以使递送载体稳定并允许被靶细胞摄取。当将重组细胞引入患者中时，也采用缓冲液。本公开内容的水性组合物包含有效量的载体或细胞，其溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。这样的组合物也被称作接种物。短语“药学上或药理学上可接受的”表示当施用给动物或人时不会产生不利的、变应性的或其它不良的反应的分子实体和组合物。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与本公开内容的载体或细胞不相容以外，预见到它在治疗组合物中的应用。补充性活性成分也可以掺入组合物中。

本公开内容的活性组合物可以包括典型的药物制剂。根据本公开内容的这些组合物的施用将是经由任何常见途径，只要经由该途径可达到靶组织即可。这样的途径包括口服、鼻、含服、直肠、阴道或局部途径。可替换地，施用可以是通过常位（orthotopic）、真皮内、皮下、肌肉内、肿瘤内、腹膜内或静脉内注射。这样的组合物通常作为上述的药学上可接受的组合物来施用。

也可以胃肠外地或腹膜内地施用活性化合物。可以在与表面活性剂（诸如羟丙基纤维素）适当地混合的水中制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在贮存和使用的普通条件下，这些制品含有防腐剂以阻止微生物的生长。

适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体，和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，且必须是达到容易注射的程度的流体。它必须在制备和贮存的条件下是稳定的，且必须保存免于微生物（诸如细菌和真菌）的污染作用。所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣，诸如卵磷脂，通过维持所需的颗粒尺寸（在分散体的情况下）和通过使用表面活性剂。通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以防止微生物的作用。在许多情况下，优选地包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延长吸收的试剂（例如，单硬脂酸铝和明胶），可以延长可注射组合物的吸收。

如下制备无菌可注射溶液：将所需量的活性化合物掺入适当的溶剂中，所述溶剂含有如上列举的各种其它成分（根据需要），随后过滤除菌。通常，如下制备分散体：将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和选自上面列举的那些的所需的其它成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术会产生活性成分加上来自其早前已无菌过滤的溶液的任意额外期望成分的粉末。

本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性成分不相容外，预见到其在治疗组合物中的应用。还可以将补充性活性成分掺入组合物中。

就口服施用而言，可以将本公开内容的肽和多肽与赋形剂一起掺合，并以不可摄取的漱口液和洁齿剂的形式使用。可以制备漱口液，其包含在适当溶剂诸如硼酸钠溶液(Dobell氏溶液)中的所需量的活性成分。可替换地，可以将活性成分掺入含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的杀菌洗剂中。所述活性成分也可以分散在洁齿剂中，包括凝胶、糊剂、粉剂和浆剂。所述活性成分可以以治疗有效量加入糊剂洁齿剂中，所述糊剂洁齿剂可以包括水、粘合剂、研磨剂、矫味剂、起泡剂和保湿剂。

本公开内容的组合物可以以中性或盐形式配制。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，且其用无机酸（诸如例如，盐酸或磷酸）或有机酸（诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等）形成。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱（例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁）和异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。

配制后，以与剂量制剂相容的方式且以治疗上有效的量施用溶液。所述制剂以多种剂型（诸如可注射的溶液、药物释放胶囊剂等）容易地施用。对于在水溶液中的胃肠外施用，例如，如果必要的话，应当将溶液适当缓冲，并首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。这些特定水溶液尤其适合用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这方面，本领域技术人员考虑到本公开内容会知道可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1 ml等渗NaCl溶液中，并加入1000 ml皮下输液流体或在提议的输注部位注射(参见例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”，第15版, 第1035-1038和1570-1580页)。剂量上的一些变化必然随所治疗的受试者的情况而出现。负责施用的人在每种情况下将确定各个受试者的适当剂量。此外，对于人施用而言，制剂应当满足食品和药品管理局办公室（FDA Office）对生物制品标准要求的无菌度、致热原性、一般安全性和纯度标准。

B. 疾病状态和情况

1. 癌症

癌症由来自组织的细胞的克隆群体的生长物引起。癌症的发生(被称作致癌作用)可以以多种方式模型化和表征。早已明白癌症的发展和炎症之间的关系。炎症应答涉入宿主对微生物感染的防御，且也驱动组织修复和再生。相当多的证据指出炎症和发生癌症的风险之间的联系，即，慢性炎症可以导致发育异常。存在数百种不同形式的人癌症，且随着对癌症的根本遗传学和生物学的理解的增加，将这些形式进一步细分和重新分类。

确定癌症的成因是复杂的。已知许多物品会增加癌症的风险，包括烟草使用、某些感染、辐射、体育活动缺乏、肥胖和环境污染物质。这些可以直接损伤基因或将细胞内的现有遗传缺陷组合以造成疾病。大约5-10%的癌症是完全遗传性的。

可以以许多方式检测癌症，包括某些征象和症状的存在、筛查试验或医学成像。一旦检测到可能的癌症，通过组织样品的显微镜检查来诊断它。经常用化学疗法、辐射疗法和外科手术来治疗癌症。从该疾病存活的机会随癌症的类型和位置以及治疗开始时疾病的程度而极大地变化。尽管癌症可以影响所有年龄的人且几种癌症类型在儿童中更常见，发生癌症的风险通常随年龄增加。在2007年，癌症造成全世界所有人死亡的约13%(790万)。随着更多的人生存至老年，且随着在发展中国家发生大量生活方式变化，比例在增加中。

治疗分成五大类：外科手术、化学疗法、辐射、替代医学和姑息疗法。外科手术是治疗大多数孤立的实体癌症的主要方法，且可能在减轻和存活期延长中起作用。它通常是做出确定诊断和将肿瘤分期的一个重要部分，因为经常需要活组织检查。在局限性癌症中，外科手术通常尝试除去整块，在某些情况下与该区域中的淋巴结一起。对于某些类型的癌症，这是消除癌症所需的全部操作。

与外科手术联用的化学疗法已经被证实可用在许多不同的癌症类型中，包括：乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、成骨性肉瘤、睾丸癌、卵巢癌和某些肺癌。化学疗法的有效性经常受对身体中的其它组织的毒性所限。

辐射疗法涉及电离辐射在治愈或改善癌症症状的尝试中的用途。将它用在所有病例的约半数中，且所述辐射可以来自内部来源（以近距离放射疗法的形式）或外部来源。辐射通常与外科手术和/或化学疗法联合使用，但是对于某些类型的癌症诸如早期头颈癌，可以单独使用。对于疼痛性骨转移，已经发现它在约70%的人中是有效的。

替代性和补充性治疗包括不是常规医学的组成部分的健康护理系统、实践和产品的不同集合。“补充医学”表示与常规医学一起使用的方法和物质，而“替代医学”表示替代常规医学使用的化合物。大多数用于癌症的补充性和替代性医学尚未得到严格研究或试验。一些替代治疗已经得到研究，且被证实是无效的，但是仍然继续销售和促销。

最后，姑息疗法表示这样的治疗：其尝试使患者感觉更好，可能或不可能与攻击癌症的尝试组合。姑息疗法包括减轻癌症患者所经历的身体、情绪、精神和精神社会痛苦的行为。不同于目的在于直接杀死癌细胞的治疗，姑息疗法的主要目的是改善患者的生活质量。

2. 病毒感染

病毒是仅可以在生物体的活细胞内复制的小传染性病原体。病毒可以感染所有类型的生物体，从动物和植物至细菌和古细菌。已经详细描述了约5,000种病毒，尽管存在数百万种不同的类型。病毒见于地球上的几乎每个生态系统中，且是最丰富的生物实体类型。

病毒颗粒(被称作病毒粒子)由2或3个部分组成：i)从DNA或RNA（即携带遗传信息的长分子）构成的遗传物质；ii)保护这些基因的蛋白外壳；和在某些情况下，iii)包围蛋白外壳的脂质外壳（当它们在细胞外部时）。病毒的形状范围从简单的螺旋和二十面体形式至更复杂的结构。一般病毒是一般细菌的大小的约1/100。大多数病毒太小难以用光学显微镜直接看到。

病毒以许多方式传播；植物中的病毒经常被以植物体液为食的昆虫（诸如蚜虫）在植物之间传播；动物中的病毒可以被吸血昆虫携带。这些携带疾病的生物被称作载体。流感病毒通过咳嗽和喷嚏传播。诺如病毒和轮状病毒（病毒性胃肠炎的常见原因）通过粪-口途径传播，且通过接触在人之间传递，在食品或水中进入身体。HIV是通过性接触和通过暴露于被感染的血液而传播的几种病毒之一。病毒可以感染的宿主细胞的范围被称作它的“宿主范围”。这可以是狭窄的，或者，当病毒能够感染许多物种时，是宽广的。

动物中的病毒感染会引起经常消除传染性病毒的免疫应答。免疫应答还可以由疫苗产生，所述疫苗赋予针对特定病毒感染的人工获得性免疫。但是，有些病毒（包括造成AIDS和病毒性肝炎的那些）会逃避这些免疫应答和导致慢性感染。抗生素对病毒没有作用，但是已经开发了几种抗病毒药。

多种疾病会被病毒感染促进，包括流感、人免疫缺陷病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、天花病毒、呼吸道合胞体病毒、韩国出血热病毒、水痘、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒1或2、爱泼斯坦-巴尔病毒、马尔堡病毒、汉坦病毒属、黄热病病毒、甲、乙、丙或戊型肝炎、埃博拉病毒、人乳头瘤病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒、轮状病毒、HTLV-1和-2。

C. 治疗方法

可以单独地或与治疗上述疾病的其它药物联合地将肽和多肽施用给哺乳动物受试者(例如，人患者)。所需的剂量取决于：施用途径的选择；制剂的性质，包括与多肽连接的另外试剂；患者的疾病的性质；受试者的大小、重量、表面积、年龄和性别；将来的联合治疗；和主治医师的判断。合适的剂量是在0.0001-100 mg/kg的范围内。考虑到可利用的化合物的种类和各种施用途径的不同效率，预见到所需剂量的广泛变化。例如，预见到口服施用需要比静脉内注射施用更高的剂量。使用本领域充分理解的用于优化的标准经验惯例，可以调节这些剂量水平的变化。施用可以是单次或多次(例如2、3、4、6、8、10、20、50、100、150或更多次)。将多肽包封于合适的递送媒介物（例如，聚合微粒或可植入装置）内可以增加递送的效率，尤其对于口服递送而言。

经工程改造的Gla结构域蛋白可以用作靶向试剂以将治疗有效载荷递送至癌细胞，诸如放射性核素、化学治疗剂或毒素。具体的化疗剂包括替莫唑胺、埃博霉素、美法仑、卡莫司汀、白消安、洛莫司汀、环磷酰胺、达卡巴嗪、聚苯丙生、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、环磷酰胺、卡铂、顺铂、塞替派、卡培他滨、链佐星、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸亮丙瑞林、盐酸多柔比星、硫酸博来霉素、盐酸柔红霉素、更生霉素、柔红霉素柠檬酸盐脂质体、盐酸多柔比星脂质体、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、丝裂霉素、多柔比星、戊柔比星、阿那曲唑、柠檬酸托瑞米芬、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、干扰素α-2b、普卡霉素、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、干扰素α-2a、乙酸甲羟孕酮、雌氮芥磷酸钠、雌二醇、醋酸亮丙瑞林、乙酸甲地孕酮、醋酸奥曲肽、二磷酸己烯雌酚、睾内酪、乙酸戈舍瑞林、磷酸依托泊苷、硫酸长春新碱、依托泊苷、长春碱、依托泊苷、硫酸长春新碱、替尼泊苷、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥加米星、利妥昔单抗、依西美坦、盐酸伊立替康、天门冬酰胺酶、盐酸吉西他滨、六甲蜜胺、盐酸托泊替康、羟基脲、克拉屈滨、米托坦、盐酸丙卡巴肼、酒石酸长春瑞滨、喷司他丁钠、米托蒽醌、培门冬酶、地尼白介素diftitix、altretinoin、卟菲尔钠、贝沙罗汀、紫杉醇、多西他赛、三氧化二砷或维A酸。毒素包括假单胞菌属（Pseudomonas exotoxin）外毒素(PE38)、蓖麻蛋白A链、白喉毒素、Besides PE和RT、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、皂草素和白树毒素。用于癌症治疗的放射性核素包括Y-90、P-32、I-131、In-111、Sr-89、Re-186、Sm-153和Sn-117m。

适合用于抗病毒感染疗法的试剂或因子包括阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、氨普那韦、Ampligen、阿比朵尔、阿扎那韦、Atripla、Boceprevirertet、西多福韦、双汰芝、达芦那韦、地拉韦啶、去羟肌苷、二十二醇、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦肽、恩替卡韦、进入抑制剂、泛昔洛韦、福米韦生、呋山那韦、膦甲酸、膦乙酸、更昔洛韦、伊巴他滨、Imunovir、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、干扰素III型、干扰素II型、干扰素I型、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、美替沙腙、奈非那韦、奈韦拉平、Nexavir、核苷类似物、奥司他韦、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、培拉米韦、普来可那立、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、拉替拉韦、逆转录酶抑制剂、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、Pyramidine、沙奎那韦、司他夫定、协同增强剂(抗逆转录病毒)、茶树油、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦酯、替拉那韦、曲氟尿苷、三协唯、曲金刚胺、Truvada、伐昔洛韦、伐昔洛韦、维立韦罗、阿糖腺苷、盐酸他立韦林、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。

技术人员参照“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版，第33章，尤其是第624-652页。剂量上的一些变化必然随所治疗的受试者的情况而出现。负责施用的人在每种情况下将确定各个受试者的适当剂量。此外，对于人施用而言，制剂应当满足食品和药品管理局办公室（FDA Office）对生物制品标准要求的无菌度、致热原性、一般安全性和纯度标准。

V. 实施例

包括下述实施例以展示本公开内容的特定实施方案。本领域技术人员应该理解，在下面实施例中公开的技术代表由发明人发现的在本公开内容的实践中较好地起作用的技术，因此可以视为构成它的实践的优选模式。但是，本领域技术人员考虑到本公开内容以后应该理解，可以对公开的具体实施方案作出许多改变且仍然获得同样或类似的结果，而不脱离本公开内容的精神和范围。

实施例1

通过使用制备的磷脂囊泡(Shah等人，1998; Nelsestuen, 1999)，已经在体外确定了Gla-结构域蛋白对细胞膜的亲和力。但是，尚未充分地阐明如何将这些体外值转移至体内背景。例如，FVII与TF的相互作用证实了以下事实：尽管这些蛋白的Gla结构域是非常同源的，通过它们的EGF和/或Kringle结构域可能介导它们的细胞膜结合特异性和亲和力的额外差异。不幸的是，这些相互作用不可用单独基于磷脂囊泡的研究重演，且可能保持未被识别。

因此，发明人提议独立于以下蛋白集合制备和试验Gla+EGF/Kringle结构域以及Gla结构域：hS (高亲和力结合剂)，hZ(中亲和力结合剂)，hPT (中亲和力-含有三环结构域（kringle）)，hFVII (低亲和力-利用也在癌症中上调的第二“受体”)和B0178 (具有增加的磷脂亲和力的hFVII)。这些蛋白可能具有不同的体内结合特征，所述特征可能对它们作为探针(并且，如果经过验证和选择性的，可能作为治疗剂)的应用是有益的且迄今为止已经确认未被识别（have gone unrecognized）。

一般方案是构建重组蛋白和试验它们的表达。然后开发测定以评估结合。然后，将表达和纯化方法优化，随后进行γ-羧基化的质量控制。

图1显示了来自多种包括羧基化位点的Gla结构域蛋白的序列。图2显示了多种不同的Gla结构域蛋白的表达，所述蛋白经工程改造且在293细胞中短暂表达。图3显示了BHK21细胞中的一种类似研究。鉴于最佳表达构建体之一是蛋白S + EGF构建体，将得自蛋白S的信号序列与凝血酶原Gla + Kringle和蛋白Z + EGF一起使用。但是，仅在细胞内观察到表达(图4)。

选择蛋白S Gla + EGF用于进一步研究。序列显示在图5中。使用RF286培养基，在BHK21细胞中生产蛋白。收获600 ml并浓缩4倍。纯化利用3个步骤：

1. Ni-NTA柱, 10 ml, 新鲜包装。将培养基加载至柱并用咪唑梯度洗脱。对所有级分进行Gla蛋白质印迹以鉴别His标记的Gla蛋白S G+E。

2. 使用CaCl₂分步洗脱的Hitrap Q。将Gla阳性级分合并和加载至1 ml HitrapQ，用10 mM CaCl₂洗脱。

3. 使用CaCl₂梯度(0-10 mM渐变梯度（shadow gradient）)的Hitrap Q。将分步纯化的Gla蛋白应用至Q，并用梯度CaCl₂ (至多10 mM)洗脱。生产了共计0.9 mg蛋白，其在95%纯度水平。图6显示了在还原和非还原条件下的纯化级分。图7和8显示了不同的基于FAC的细胞凋亡测定。二者表明，蛋白S Gla + EGF构建体正如膜联蛋白V一样对处于细胞凋亡中的细胞是特异性的(图7)，并且膜联蛋白V可以竞争蛋白S Gla + EGF结合。

总之，表达并纯化了蛋白S Gla+EGF。对纯化的材料的分析提示，它是高度γ-甲酸酯化的。基于FAC的细胞凋亡测定证实，蛋白S G+E (11 Gla)可以结合“细胞凋亡的”细胞，并且该结合是经由磷脂酰丝氨酸的靶向而针对细胞，如通过膜联蛋白V竞争测定所证实的。

考虑到本公开内容，无需过多实验，可以制备和执行本文中公开的和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管已经以优选实施方案的方式描述了本公开内容的组合物和方法，但是本领域技术人员显而易见，可以对本文描述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序做出变化，而不背离本公开内容的概念、精神和范围。更具体地，显而易见，在化学上和生理学上均相关的某些药剂可以替代本文描述的药剂，同时实现相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有这样的类似替代和改变都被认为在所附权利要求所限定的本公开内容的精神、范围和概念内。

VI. 参考文献

就它们提供示例性程序细节或其它细节来补充本文阐述的那些而言的程度，以下参考文献具体地通过引用并入本文：

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序列表

<110> Bayer Healthcare, LLC

BAUZON, Maxine

HERMISTON, Terry

<120> 作为靶向试剂的GLA结构域

<130> BAYR.P0003WO

<150> 61/787,753

<151> 2013-03-15

<160> 6

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (32)..(32)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (36)..(36)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 1

Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa

20 25 30

Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu

35 40 45

<210> 2

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(8)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (11)..(11)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (15)..(15)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (17)..(17)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (20)..(21)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (26)..(27)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (30)..(30)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (33)..(33)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (35)..(35)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (40)..(40)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 2

Ala Gly Ser Tyr Leu Leu Xaa Xaa Leu Phe Xaa Gly Asn Leu Xaa Lys

1 5 10 15

Xaa Cys Tyr Xaa Xaa Ile Cys Val Tyr Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe

20 25 30

Xaa Asn Xaa Val Val Thr Asp Xaa Phe Trp Arg Arg Tyr Lys

35 40 45

<210> 3

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (32)..(32)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 3

Ala Asn Thr Phe Leu Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Val Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa

20 25 30

Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr

35 40 45

<210> 4

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (35)..(35)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 4

Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys

20 25 30

Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser

35 40 45

<210> 5

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (32)..(32)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (35)..(35)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 5

Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Gln Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Xaa

20 25 30

Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser

35 40 45

<210> 6

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (32)..(32)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (36)..(36)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 6

Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa

20 25 30

Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu Val Cys Leu

35 40 45

Arg Ser Phe Gln Thr Gly Leu Phe Thr Ala Ala Arg Gln Ser Thr Asn

50 55 60

Ala Tyr Pro Asp Leu Arg Ser Cys Val Asn Ala Ile Pro Asp Gln Cys

65 70 75 80

Ser Pro Leu Pro Cys Asn Glu Asp Gly Tyr Met Ser Cys Lys Asp Gly

85 90 95

Lys Ala Ser Phe Thr Cys Thr Cys Lys Pro Gly Trp Gln Gly Glu Lys

100 105 110

Cys Glu Phe Asp Ile Asn Glu Cys Lys Asp Pro Ser Asn Ile Asn Gly

115 120 125

Gly Cys Ser Gln Ile Cys Asp Asn Thr Pro Gly Ser Tyr His Cys Ser

130 135 140

Cys Lys Asn Gly Phe Val Met Leu Ser Asn Lys Lys Asp Cys Lys Asp

145 150 155 160

Val Asp Glu Cys Ser Leu Lys Pro Ser Ile Cys Gly Thr Ala Val Cys

165 170 175

Lys Asn Ile Pro Gly Asp Phe Glu Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Arg

180 185 190

Tyr Asn Leu Lys Ser Lys Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu

195 200 205

Asn Met Cys Ala Gln Leu Cys Val Asn Tyr Pro Gly Gly Tyr Thr Cys

210 215 220

Tyr Cys Asp Gly Lys Lys Gly Phe Lys Leu Ala Gln Asp Gln Lys Ser

225 230 235 240

Cys Glu Ser Arg His His His His His His

245 250

Claims (28)

1.一种用于结合细胞膜磷脂酰丝氨酸的分离的多肽，其包含：

(a) 蛋白Sγ-羧基谷氨酸(Gla)结构域，

(b) 蛋白S EGF结构域，并且

(c) 缺乏蛋白酶或激素结合结构域；

其中所述多肽连接至选自标记、蛋白和治疗剂的有效载荷。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与所述有效载荷缀合。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述Gla结构域包含5-15个Gla残基。

4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽的大小在4.5至30 kD的范围。

5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含至少一个二硫键。

6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述多肽包含2-5个二硫键。

7.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是300个氨基酸或更少。

8.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽在100-300个氨基酸的范围。

9.根据权利要求1所述的多肽，其中所述有效载荷是可检测标记。

10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述可检测标记是荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶、染料或配体。

11.根据权利要求1所述的多肽，其中所述有效载荷是治疗剂。

12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述治疗剂是抗癌剂。

13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述抗癌剂是化疗剂、放疗剂、细胞因子、激素、抗体或抗体片段或毒素。

14.根据权利要求12所述的多肽，其中所述抗癌剂是化疗剂、放疗剂或毒素。

15.根据权利要求12所述的多肽，其中所述抗癌剂选自替莫唑胺、埃博霉素、美法仑、卡莫司汀、白消安、洛莫司汀、环磷酰胺、达卡巴嗪、聚苯丙生、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、卡铂、顺铂、塞替派、卡培他滨、链佐星、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸亮丙瑞林、盐酸多柔比星、硫酸博来霉素、盐酸柔红霉素、更生霉素、柔红霉素柠檬酸盐脂质体、盐酸多柔比星脂质体、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、丝裂霉素、多柔比星、戊柔比星、阿那曲唑、柠檬酸托瑞米芬、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、干扰素α-2b、普卡霉素、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、干扰素α-2a、醋酸甲羟孕酮、雌氮芥磷酸钠、雌二醇、醋酸甲地孕酮、醋酸奥曲肽、二磷酸己烯雌酚、睾内酯、醋酸戈舍瑞林、磷酸依托泊苷、硫酸长春新碱、依托泊苷、长春碱、替尼泊苷、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥加米星、利妥昔单抗、依西美坦、盐酸伊立替康、天门冬酰胺酶、盐酸吉西他滨、六甲蜜胺、盐酸托泊替康、羟基脲、克拉屈滨、米托坦、盐酸丙卡巴肼、酒石酸长春瑞滨、喷司他丁钠、米托蒽醌、培门冬酶、地尼白介素、阿利维A酸、卟菲尔、贝沙罗汀、紫杉醇、多西他赛、三氧化二砷或维A酸；毒素，和用于癌症治疗的放射性核素。

16.根据权利要求11所述的多肽，其中所述治疗剂是抗病毒剂。

17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述抗病毒剂选自：阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、安普利近、阿比朵尔、阿扎那韦、亚翠佩、波普瑞韦尔特、西多福韦、双汰芝、达芦那韦、地拉韦啶、去羟肌苷、二十二醇、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦肽、恩替卡韦、进入抑制剂、泛昔洛韦、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸、膦乙酸、更昔洛韦、伊巴他滨、异丙肌苷、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、美替沙腙、奈非那韦、奈韦拉平、雷沙韦、核苷类似物、奥司他韦、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、培拉米韦、普来可那立、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、拉替拉韦、逆转录酶抑制剂、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、普控咪定、沙奎那韦、司他夫定、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、替拉那韦、曲氟尿苷、三协唯、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、维立韦罗、阿糖腺苷、他立韦林、扎西他滨、扎那米韦或齐多夫定。

18.根据权利要求17所述的多肽，其中所述干扰素是干扰素III型、干扰素II型或干扰素I型。

19.根据权利要求11所述的多肽，其中所述治疗剂是酶。

20.根据权利要求11所述的多肽，其中所述治疗剂是细胞因子、生长因子、凝固因子或抗凝剂。

21.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽进一步包含抗体Fc区。

22.一种药物制剂，其包含根据权利要求1所述的多肽。

23.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求22所述的药物制剂在制造治疗癌症的药物中的用途。

24.根据权利要求23所述的多肽或药物制剂，其中所述癌症是乳腺癌、脑癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、结肠癌、皮肤癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、肝癌、胰腺癌、头颈癌或食管癌。

25.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求22所述的药物制剂在制造治疗病毒性疾病的药物中的用途。

26.根据权利要求25所述的多肽或药物制剂，其中所述病毒性疾病是流感、人免疫缺陷病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、天花病毒、呼吸道合胞体病毒、韩国出血热病毒、水痘、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒1或2、爱泼斯坦-巴尔病毒、马尔堡病毒、汉坦病毒、黄热病病毒、甲、乙、丙或戊型肝炎、埃博拉病毒、人乳头瘤病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒、轮状病毒、HTLV-1或-2。

27.根据权利要求15所述的多肽，其中所述毒素是假单胞菌属外毒素(PE38)、蓖麻蛋白A链、白喉毒素、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、皂草素或白树毒素。

28.根据权利要求15所述的多肽，其中所述用于癌症治疗的放射性核素是Y-90、P-32、I-131、In-111、Sr-89、Re-186、Sm-153或Sn-117m。

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