BR112020000995A2

BR112020000995A2 - métodos e usos de aférese

Info

Publication number: BR112020000995A2
Application number: BR112020000995-4A
Authority: BR
Inventors: John Fraser Wright; Marcus Eugene Carr, Jr.
Original assignee: Spark Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2020-09-08
Also published as: US20200164008A1; AU2018304194A1; CN111225677A; EP3655001A1; EP3655001A4; CA3069880A1; JP2023179414A; MX2020000713A; WO2019018439A1; JP2020530834A

Abstract

São fornecidos métodos de tratamento de um paciente que necessite de tratamento para uma doença causada por uma perda de função ou atividade de uma proteína. Também são fornecidos métodos de tratamento de um paciente que necessite de tratamento para uma doença causada por um ganho de função, atividade ou expressão, de uma proteína.

Description

“MÉTODOS E USOS DE AFÉRESE” PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício da prioridade ao pedido de patente nº 62/533.579, depositado em 17 de julho de 2017. Todo o conteúdo do pedido anterior é incorporado aqui por referência, incluindo todos os textos, tabelas, figuras e sequências.

INTRODUÇÃO

[0002] A terapia genética (transferência de genes) utilizando o vírus associado ao adeno recombinante (rAAV) demonstrou potencial promissor para responder a necessidades médicas não satisfeitas. Por exemplo, a terapia genética que utiliza o AAV que expressa os fatores VIII e IX de coagulação revelou segurança e eficácia promissoras nos ensaios clínicos humanos (referências).

[0003] A infecção por AAV é comum na população humana, e não é conhecida por causar doença. A maioria dos pacientes humanos que podem se beneficiar de terapia genética baseada no AAV foram previamente infectados pelo AAV. Enquanto infecções podem ocorrer mais tarde na vida, mais frequentemente elas ocorrem na infância. Tal como acontece com qualquer infecção viral, a resposta imune do hospedeiro a uma infecção por AAV resulta na formação de anticorpos contra a AAV (anticorpos AAV). Após a exposição à AAV, é bem conhecido (referências) o curso temporal da rápida formação de anticorpos AAV (semanas), os picos de anticorpos de grau elevado atingidos, seguidos pelo declínio gradual dos níveis de anticorpos AAV (anos). Os graus de pico típicos dos anticorpos AAV após a infecção AAV são > 1:100, e podem facilmente exceder 1:1000 (Calcedo et al, 2009).

[0004] Em promissores estudos clínicos de hemofilia até a presente data (George et al 2016, American Society for Hematology, San Diego CA, Plenary Lecture; George et al 2017, International Society for Thrombosis and Hemostasis, Berlin, Alemanha), os melhores resultados foram observados após sistêmica (e.g. intravenosa) administração da vetores VAA que expressam a terapêutica transgene (FVIII ou FIX) em seres humanos que não têm existência prévia de anticorpos (grau < 1:1). Pode também obter-se um bom resultado no caso de um grau muito baixo de anticorpos pré-existentes (1:1 – 1:2), e resultados modestos podem ser obtidos no caso de anticorpos pré-existentes com baixo grau (1:3-1:5). Os níveis de anticorpos pré-existentes que excedem estes níveis correspondem a uma transdução genética marginal a pobre. O mecanismo deste declínio na eficiência de transferência de genes em função de grau de anticorpo pré-existente é a ligação e neutralização do vetor de terapia genética AAV por anticorpos AAV pré-existentes. Quando ligado por anticorpos anti-AAV, o vetor é impedido de atingir e transduzir tecidos e células alvo, tais como células do fígado, incluindo hepatócitos e células endoteliais que são alvo de transferência genética terapêutica. Dependendo do sorotipo específico de AAV, até e e acima de 50% dos pacientes com hemofilia podem não ser elegíveis para beneficiarem-se de tratamento de terapia genética baseada em AAV por causa de anticorpos AAV pré-existentes (Calcedo et al 2009).

SUMÁRIO

[0005] São aqui divulgados métodos e usos para remover, esgotar, capturar e/ou inativar anticorpos AAV em mamíferos potenciais, tais como pacientes humanos que podem se beneficiar da terapia genética AAV. Em certos aspectos, os anticorpos AAV estão presentes em níveis que reduzem ou bloqueiam a transdução de vetor de transferência genética terapêutica de células alvo. Em certos aspectos, os anticorpos AAV são pré- existentes e podem estar presentes em níveis que reduzem ou bloqueiam a transdução de vetor de transferência genética terapêutica de células alvo. Em certos aspectos, os anticorpos AAV podem desenvolver-se após exposição a AAV ou administração de um vetor AAV para terapia genética. Se estes anticorpos desenvolverem-se após a administração de um vetor AAV para terapia genética, estes pacientes também podem ser tratados de acordo com a invenção.

[0006] O método baseia-se num procedimento/dispositivo médico, geralmente referido como aférese e, mais particularmente, plasmaferese em que estão envolvidos produtos sanguíneos. Em certas modalidades, a aférese é usada para beneficiar a terapia genética AAV, particularmente num paciente que tem anticorpos AAV pré-existentes ou desenvolve anticorpos AAV após a terapia genética.

[0007] Em termos gerais, aférese ou plasmaferese, é um processo em que o plasma de um paciente humano circula ex vivo (extracorpóreo) através de um dispositivo que modifica o plasma através da adição, remoção e/ou substituição de componentes, antes do seu retorno para o paciente. A plasmaferese pode ser usada para remover imunoglobulinas humanas (por exemplo, IgG, IgE, IgA, IgD) de um produto sanguíneo (por exemplo, plasma). Este procedimento esgota, captura, inativa, reduz ou remove imunoglobulinas (anticorpos) que se ligam AAV, reduzindo assim o grau de anticorpos AAV no paciente tratado, reduzindo assim os anticorpos AAV que podem contribuir para a neutralização de AAV. Um dispositivo útil na prática da invenção poderia na forma de uma coluna de matriz de afinidade de capsídeo AAV. A passagem de um produto sanguíneo (por exemplo, plasma) de um paciente humano através de uma matriz de afinidade de capsídeo AAV resultaria na ligação apenas de anticorpos AAV, e de todos os isotipos (incluindo IgG, IgM, etc.).

[0008] É previsto que uma quantidade suficiente de plasmaferese usando uma matriz de afinidade de capsídeo AAV remova substancialmente os anticorpos de capsídeo AAV, e reduza o grau de anticorpo de capsídeo AAV (carga) no ser humano assim tratado. Em certas modalidades, o grau num paciente tratado é reduzido substancialmente para níveis baixos (para < 1:5, ou menos, tais como < 1:4, ou < 1:3, ou <1:2, ou < 1:1). A redução do grau de anticorpos será temporária, uma vez que se espera que os linfócitos B que produzem os anticorpos capsídeos AAV façam com que o grau de anticorpos capsídeos AAV se recupere gradualmente para o nível de estado estacionário antes da intervenção no procedimento de plasmaferese. Cinética desta recuperação com base na meia-vida de IgG (20h) e nesta taxa sintética é igual à taxa de decaimento dos sistemas no estado estacionário (correspondente ao grau de capsídeo AAV no estado estacionário antes do método de plasmaferese.

[0009] No caso em que um grau de anticorpo de capsídeo pré- existente foi reduzido de 1:100 para 1:1, o grau de anticorpo AAV recupera-se para aproximadamente 0,15% (correspondente a um grau de 1:1,2) 0,43% (1:1,4), 0,9% (1:1,9), 1,7% (1:2,7), e 3,4% (1:4,4) , ocorrem em 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas, respectivamente, após a conclusão do método de plasmaferese. A remoção temporária de anticorpos AAV (por exemplo, que se ligam ao capsídeo AAV) de tal paciente corresponderia a uma janela de tempo (por exemplo, de cerca de 24 horas ou menos, como 12 horas ou menos, ou 6 horas ou menos, ou 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos, ou 1 hora ou menos) durante a qual um vetor AAV terapêutico poderia ser administrado para o paciente e previsto para transduzir eficientemente tecidos alvos, sem neutralização substancial do vetor AAV com os anticorpos AAV.

[0010] No caso em que um grau de anticorpo de capsídeo pré- existente foi reduzido de 1:1000 para 1:1, o grau de anticorpo AAV recupera-se para aproximadamente 0,15% (correspondente a um grau de 1:2,5) 0,4% (1:5,3), 0,9% (1:9,7), 1,7% (1:18), e 3,4% (1:35) , ocorrem em 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas, respectivamente, após a conclusão do método de plasmaferese. Assim, uma janela para a administração do vetor AAV será comparativamente mais curta.

[0011] Parâmetros como o tipo de matriz de afinidade de capsídeo AAV podem ser variados, de acordo com o(s) sorotipo(s) do anticorpo AAV num paciente. Assim, uma matriz de afinidade de capsídeo AAV pode ser ajustada (aumentada ou diminuída) de acordo com o(s) sorotipo(s) de anticorpo AAV num paciente. Por exemplo, se os anticorpos se ligam a um ou mais sorotipos, tais como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8,

AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 proteína(s) de capsídeo, anticorpos específicos a um ou mais de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 proteína(s) de capsídeo podem ser usados como a matriz de afinidade.

[0012] Parâmetros como a quantidade de matriz de afinidade de capsídeo AAV podem ser variados de acordo com o grau de anticorpo de AAV num paciente. Por exemplo, a quantidade de matriz de afinidade de capsídeo AAV pode ser ajustada (aumentada ou diminuída) de acordo com a quantidade de anticorpo AAV num paciente. Para graus elevados de anticorpo AAV, pode aumentar-se a quantidade de matriz de afinidade de capsídeo AAV. Para graus inferiores de anticorpo AAV, a quantidade de matriz de afinidade de capsídeo AAV pode ser relativamente menor.

[0013] Parâmetros como a quantidade de matriz de afinidade de capsídeo AAV também podem ser variados de acordo com o volume de um produto sanguíneo tratado a partir de um paciente. Por exemplo, a quantidade de matriz de afinidade de capsídeo AAV pode ser ajustada (aumentada ou diminuída) de acordo com o volume de produto sanguíneo ao qual a matriz entra em contato.

[0014] Além disso, o período de tempo após o esgotamento, captura, inativação ou remoção de anticorpos AAV pode variar dependendo da rapidez com que os anticorpos AAV se recuperam. Por exemplo, em certos pacientes, a recuperação de anticorpo AAV pode ser mais rápida ou mais lenta. No caso de recuperação mais rápida de anticorpos AAV, a janela de tempo durante a qual um vetor AAV terapêutico poderia ser administrado ao paciente será comparativamente mais curta. No caso de recuperação mais lenta de anticorpos AAV, a janela de tempo durante a qual um vetor AAV terapêutico poderia ser administrado ao paciente será comparativamente mais longa.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0015] Vetores AAV possuem uma série de características desejáveis para tais aplicações, incluindo tropismo para células que se dividem e não se dividem. A experiência clínica inicial com estes vetores demonstrou expressão de longo prazo em seres humanos tratados. Além disso, os ensaios clínicos iniciais não demonstraram toxicidade sustentada e as respostas imunes foram mínimas ou indetectáveis. Sabe-se que AAV infecta uma grande variedade de tipos celulares in vivo e in vitro por endocitose mediada por receptores ou por transcitose. Estes sistemas vetoriais têm sido testados em seres humanos visando muitos tecidos, tais como, epitélio da retina, fígado, músculo esquelético, vias aéreas, cérebro, articulações e células-tronco hematopoiéticas.

[0016] A invenção fornece composições e métodos para remover, esgotar, capturar e/ou inativar anticorpos de ligação AAV. Tais anticorpos podem ser pré-existentes em um paciente como um mamífero, por exemplo, humano. Alternativamente, esses anticorpos de ligação AAV podem desenvolver-se num paciente como um mamífero, por exemplo, um ser humano devido à exposição a AAV ou ao tratamento/administração do paciente com um vetor AAV. As composições e métodos da invenção empregam uma matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV.

[0017] Em algumas modalidades, os anticorpos de ligação AAV são removidos, esgotados, capturados e/ou inativados de um produto sanguíneo obtido de um paciente através de um processo que compreende a aférese. Exemplos não limitantes de aférese incluem aférese, plasmaferese, citaferese ou combinações das mesmas. A aférese refere-se a um método de manipulação extracorpórea (ex vivo), remoção, esgotamento e/ou inativação de componentes presentes no sangue ou produto sanguíneo de um paciente. Em algumas modalidades, após a aférese o sangue ou o produto sanguíneo é devolvido a um paciente.

[0018] Num método típico de aférese, o sangue é obtido diretamente de uma veia ou artéria de um paciente. Em algumas modalidades,

o sangue é separado em dois ou mais produtos sanguíneos, um componente (por exemplo, uma célula ou uma proteína) é removido de um dos produtos sanguíneos, os produtos sanguíneos são opcionalmente combinados. O sangue é opcionalmente devolvido diretamente para a artéria ou veia do paciente.

[0019] Mais especificamente, por exemplo, em um método de aférese de sangue periférico é removido de um paciente por meio de uma coluna ou máquina de aférese adequadas; agentes anticoagulantes, opcionalmente, são adicionados ao sangue; o sangue é separado em um fração celular (por exemplo, compreendendo glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas) e uma fração líquida (por exemplo, plasma). A fração líquida é então submetida a aférese em que um componente (anticorpos de ligação AAV) da fração líquida é removido, esgotado, capturado e/ou inativado. Em seguida, o plasma sanguíneo tratado pode ser combinado com os componentes sanguíneos sólidos previamente separados e reinjetado no paciente. Métodos e aparelhos adequados para separar o plasma do sangue total são conhecidos por aqueles técnicos no assunto, por exemplo, como descrito na Patente dos EUA 4.619.639, qualquer perda de volume devido à aférese pode ser posteriormente substituído por uma solução adequada, como uma solução salina isotônica.

[0020] Em certas modalidades, um método de aférese remove, esgota, captura e/ou e inativa, pelo menos 20% a 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de anticorpos de ligação AAV a partir de um produto sanguíneo obtido a partir de um paciente. Em certas modalidades, um método remove, esgota, captura e/ou inativa pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% dos anticorpos de ligação AAV de um produto sanguíneo obtido de um paciente. Exemplos não limitantes de um produto sanguíneo incluem sangue total, soro, plasma e uma combinação destes. Um produto sanguíneo pode ser desprovido de células, ou pode incluir células (por exemplo, glóbulos vermelhos, plaquetas e/ou linfócitos).

[0021] Qualquer matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV pode ser ligada ou imobilizada num substrato para a fabricação das composições ou para uso num método de aférese usando qualquer método adequado. Por exemplo, numa modalidade um anticorpo que se liga a anticorpos de ligação AAV pode ser ligado ou imobilizado num substrato para uma coluna de aférese ou método de aférese, como aqui divulgados. Em outra modalidades, uma proteína de capsídeo AAV ou fragmento de capsídeo AAV pode ser ligado ou mobilizado em um substrato para uma coluna de aférese ou método de aférese, conforme divulgados aqui. Essas fragmentos e proteínas de capsídeo AAV incluem VP1, VP2 e/ou VP3 de qualquer sorotipo AAV adequado para a fabricação das composições ou para uso num método de aférese.

[0022] A matriz de afinidade que se liga aos anticorpos AAV pode ser imobilizada num substrato usando qualquer método adequado e qualquer substrato adequado. Em algumas modalidades, a matriz de afinidade imobilizada num substrato numa coluna de afinidade é adequada para aplicações de aférese. Em algumas modalidades, um processo de aférese compreende um método de aférese, dispositivo ou coluna como o divulgado nas Patentes dos EUA 9.726.666 e 8.877.177.

[0023] Substratos aos quais a matriz de afinidade que se liga aos anticorpos AAV está imobilizada são tipicamente substratos sólidos. Um "substrato sólido" refere-se, por exemplo, a um material com uma superfície ou superfícies rígidas ou semi-rígidas, que podem ser regulares ou irregulares em configuração geométrica, podendo assumir a forma de contas, resinas, géis, esferas, microesferas, partículas, fibras ou outras configurações geométricas ou formas físicas. Um substrato sólido tipicamente compreende um material que é aplicável em ensaios médicos, bioquímicos ou biológicos, por exemplo,

substrato usado em aférese, cromatografia em coluna para a purificação ou separação de moléculas biológicas ou moléculas orgânicas e ensaios ELISA. Os substratos sólidos podem ser porosos ou não porosos.

[0024] Substratos sólidos para imobilizar a matriz de afinidade que se liga aos anticorpos AAV da invenção são conhecidos na técnica. Exemplos não-limitantes de substratos sólidos incluem, por exemplo, polímeros como polissacarídeos. Exemplos não limitantes de polissacarídeos são polissacarídeos de elevada massa molecular, em particular polissacarídeos com uma massa molecular igual ou superior a 100 kDa, como a agarose. A agarose pode apresentar-se sob a forma de partículas que, opcionalmente, podem estar ligadas entre si ("cross-linked"). Um exemplo particular de agarose é SepharoseTM. Outro exemplo não limitante de um polissacarídeo é a celulose, que opcionalmente pode ser reticulada ("cross-linked").

[0025] Outros polímeros adequados como substrato incluem, por exemplo, poliestireno carboxilado. Os substratos sólidos podem ser fornecidos sob a forma de esferas magnéticas. O vidro é também um material de substrato adequado.

[0026] Qualquer coluna ou sistema adequado de filtração de sangue ou plasma pode ser adaptado para uma coluna de aférese ou método de aférese divulgado aqui. Exemplos não limitantes incluem colunas descritas na Patente dos EUA 4.619.639, sistemas de filtração de membrana (por exemplo, MDF) usados com partículas, superfícies ou substratos adequados, e filtros de sangue PlasmaFlo.RTM.OP-05(W)L e RheoFilter.RTM.AR2000, fabricados pela Asahi Medical Company, Ltd. do Japão.

[0027] Uma coluna de aférese ou método da invenção para remoção, esgotamento, captura e/ou inativação de anticorpos de ligação AAV do sangue de um paciente pode ser realizada uma vez ou repetidamente, conforme necessário, a fim de alcançar um resultado desejado. Em algumas modalidades, um método de aférese é realizado diariamente, em dias alternados, a cada 3 dias, a cada 4 dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, duas vezes por mês, uma vez por mês, em meses alternados, ou uma combinação destes num esforço para obter um efeito terapêutico benéfico.

[0028] Em certas modalidades, um vetor de terapia genética AAV descrito aqui é administrado após a remoção, esgotamento, captura e/ou inativação de anticorpos de ligação AAV de um produto sanguíneo de um paciente. O vetor de terapia genética AAV pode ser administrado a um paciente imediatamente após um método de aférese. Em algumas modalidades, um vetor de terapia genética AAV é administrado dentro de pelo menos 1 minuto, dentro de pelo menos 10 minutos, cdentro de pelo menos 20 minutos, dentro de pelo menos 60 minutos, dentro de pelo menos 1 hora, dentro de pelo menos 4 horas, dentro de pelo menos 8 minutos, dentro de pelo menos 12 minutos, dentro de pelo menos 24 horas depois de anticorpos de ligação AAV serem removidos, esgotados, capturados e/ou inativados do produto sanguíneo de um paciente. Em algumas modalidades, um vetor de terapia genética AAV é administrado dentro de 1 minuto a 24 horas, dentro de 1 minuto a 8 horas, ou dentro de 1 minuto a 4 horas após os anticorpos de ligação AAV serem removidos, esgotados, capturados e/ou inativados do produto sanguíneo de um paciente.

[0029] Em certas modalidades, uma matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende uma ligação covalente que une a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV ao substrato. Em algumas modalidades, uma ligação covalente adequada compreende uma ligação peptídica.

[0030] Em certas modalidades, uma matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende um ligante (linker) que une a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV ao substrato. Um ligante pode fornecer um mecanismo para ligar covalentemente uma matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV ao substrato. Qualquer ligante adequado pode ser usado em uma composição ou método divulgado aqui. Qualquer ligante ou ligação covalente adequada pode ser usada para juntar uma matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV ao substrato.

[0031] Em algumas modalidades, um ligante compreende um ou mais aminoácidos, como um peptídeo ligante. Um peptídico ligante pode incluir qualquer número adequado de aminoácidos. Em algumas modalidades, um peptídeo ligante compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos 10 aminoácidos. Em certas formas, um peptídeo ligante é composto por 1 a 50, 1 a 20, 1 a 10, ou 1 a 5 aminoácidos. Em algumas modalidades, um peptídeo ligante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Os exemplos não limitantes de aminoácidos e de peptídeos incluem um ou mais resíduos de glicina, um ou mais resíduos de serina, ou uma combinação destes. Outros invólucros adequados incluem um ou mais carbonos, silanos, tióis, ácido fosfônico e polietilenoglicol (PEG), combinações dos mesmos.

[0032] Uma ligação covalente pode ser unida ao terminal N ou terminal C da matriz de afinidade de anticorpo de ligação de AAV. Um ligante pode ser unido ao terminal N ou terminal C da matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV.

[0033] Métodos de ligação de duas ou mais moléculas usando uma ligação covalente ou ligante são bem conhecidos na técnica e são por vezes referidos como "crosslinking". Exemplos não limitantes de reticulação (crosslinking) incluem uma amina reagindo com um éster de N- hidroxissuccinimida (NHS), um imidoéster, um éster pentafluorofenilo (PFP), uma hidroximetil fosfina, um oxirano ou qualquer outro composto carbonil; um carboxil reagindo com uma carbodiimida; um sulfidril reagindo com uma maleimida, um haloacetil, um piridildissulfeto e/ou uma vinil sulfona; um aldeído reagindo com uma hidrazina; qualquer grupo não seletivo reagindo com diazirina e/ou aril azida; um hidroxilo reagindo com isocianato; uma hidroxilamina reagindo com um composto carbonil; e combinações dos mesmos.

[0034] O termo "vetor" refere-se a moléculas de ácido nucleico transportadoras pequenas, um plasmídeo, vírus (por exemplo, vetor AAV), ou outro veículo que pode ser manipulado pela inserção ou incorporação de um ácido nucleico. Vetores podem ser usados para manipulação genética (ou seja, "vetores de clonagem"), para introduzir/transferir polinucleotídeos em células, e para transcrever ou traduzir o polinucleotídeo inserido em células. Um "vetor de expressão" é um vetor especializado que contém um gene ou sequência de ácido nucleico com as regiões regulatórias necessárias para a expressão em uma célula hospedeira. Um sequência de ácido nucleico de vetor, geralmente, contém, pelo menos, uma origem de replicação para a propagação de uma célula e, opcionalmente, elementos adicionais, tais como uma sequência polinucleotídica heteróloga, elemento de controle de expressão (por exemplo, um promotor, potenciador), íntron, uma repetição terminal invertida (ITR), marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos), sinal de poliadenilação.

[0035] Um vetor viral é derivado ou baseado em um ou mais elementos de ácido nucleico que compreendem um genoma viral. Um vetor viral particular é um vetor de vírus adeno-associado (AAV).

[0036] O termo "recombinante", como um modificador do vetor, tal como o vetor AAV recombinante, bem como um modificador de sequências tais como polipeptídeos e polinucleotídeos recombinantes, significa que as composições foram manipuladas (ou seja, projetadas) de uma forma que geralmente não ocorre na natureza. Um exemplo particular de um vetor AAV recombinante seria onde uma sequência de ácido nucleico que não está normalmente presente no genoma AAV de tipo selvagem é inserida dentro do genoma AAV. Embora o termo "recombinante" nem sempre seja usado aqui em referência a vetores AAV, bem como sequências como polinucleotídeos, formas recombinantes incluindo polinucleotídeos heterólogos são expressamente incluídos, apesar de qualquer omissão.

[0037] Um "vetor AAV recombinante" ou "rAAV" é derivado do genoma de tipo selvagem de AAV usando métodos moleculares para remover o genoma de tipo selvagem do genoma AAV, e substituindo-o por uma sequência de ácido nucleico não-nativo, referido como um ácido nucleico heterólogo. Tipicamente, para AAV, uma ou ambas sequências de repetição terminal invertida (ITR) de genoma AAV são retidas. rAAV é distinto de um genoma AAV, uma vez que a totalidade ou uma parte do genoma AAV foi substituída por uma sequência não-nativa em relação ao ácido nucleico AAV genômico. A incorporação de uma sequência heteróloga ou não-nativa, portanto, define o vetor AAV como um vetor "recombinante", que pode ser referido como um "vetor rAAV".

[0038] Uma sequência rAAV pode ser encapsulada - aqui referida como "partícula " - para subsequente infecção (transdução) de uma célula, ex vivo, in vitro ou in vivo. Quando uma sequência de vetor AAV recombinante é encapsidada ou encapsulada em uma partícula AAV, a partícula também pode ser referida como um "vetor rAAV" ou "partícula rAAV".” Tais partículas rAAV incluem proteínas que encapsidam ou encapsulam o genoma vetorial. No caso de AAV, elas são referidas como proteínas de capsídeo.

[0039] Um "genoma" de vetor AAV refere-se à porção da sequência plasmídica recombinante que é finalmente encapsulada ou encapsidada para formar uma partícula viral (por exemplo, AAV). Nos casos em que plasmídeos recombinantes são usados para construir ou fabricar vetores recombinantes, o genoma vetorial não inclui a porção do "plasmídeo" que não corresponde à sequência do genoma vetorial do plasmídeo recombinante. Esta porção do genoma não vetorial do plasmídeo recombinante é referida como a "espinha dorsal plasmídea", que é importante para a clonagem e amplificação do plasmídeo, um processo que é necessário para a propagação e produção do vírus recombinante, mas não é ele próprio encapsulado ou encapsidado em partículas do vírus (por exemplo, AAV).

Assim, um "genoma" de vetor refere-se ao ácido nucleico que é encapsulado ou encapsidado pelo vírus (por exemplo, AAV).

[0040] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados alternadamente para se referir a todas as formas de ácido nucleico, oligonucleotídeos, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Os ácidos nucleicos incluem DNA genômico, cDNA e o DNA anti-sentido, e mRNA emendado ou não emendado (spliced), rRNA tRNA e RNA ou DNA inibitório (RNAi, por exemplo, (sh)RNA hairpin pequeno ou curto, microRNA (miRNA), (si)RNA interferente pequeno ou curto, RNA trans- splicing, ou RNA anti-sentido). Os ácidos nucleicos incluem polinucleotídeos naturais, sintéticos e intencionalmente modificados ou alterados (por exemplo, ácido nucleico variante).

[0041] Polinucleotídeos podem ser simples, duplos ou triplos, lineares ou circulares, e podem ter qualquer comprimento. Ao discutir polinucleotídeos, uma sequência ou estrutura de um polinucleotídeo particular pode ser descrita aqui de acordo com a convenção de fornecer a sequência na direção 5' a 3'.

[0042] Um "transgene" é usado aqui para se referir convenientemente a um ácido nucleico heterólogo que se destina ou foi introduzido em uma célula ou organismo. Os transgenes incluem qualquer ácido nucleico heterólogo, como um gene que codifica um polipeptídeo ou proteína ou codifica um RNA inibitório.

[0043] O termo "transdutor" e suas variações gramaticais referem- se à introdução de uma molécula como um vetor rAAV em uma célula ou organismo hospedeiro. O ácido nucleico heterólogo/transgene pode ou não ser integrado no ácido nucleico genômico da célula receptora. O ácido nucleico heterólogo introduzido também pode existir na célula receptora ou organismo hospedeiro forma extracromossômica, ou apenas transitoriamente.

[0044] Uma "célula transduzida" é uma célula na qual o transgene foi introduzido. Assim, uma célula "transduzida" (por exemplo, em um mamífero, como uma célula ou célula de orgão ou tecido ), significa uma alteração genética em célula após a incorporação de um molécula exógena, por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, um transgene) na célula. Assim, uma célula transduzida é uma célula na qual, ou uma progênie da mesma na qual um ácido nucleico exógeno foi introduzido. A(s) célula(s) pode(m) ser propagada(s) e a proteína introduzida expressa, ou ácido nucleico transcrito. Para usos e métodos de terapia genética, uma célula transduzida ou uma pluralidade de células transduzidas pode estar em um paciente.

[0045] Um "elemento de controle de expressão" refere-se à(s) sequência(s) de ácido nucleico que influenciam a expressão de um ácido nucleico operativamente ligado. Elementos de controle, incluindo elementos de controle de expressão, como os promotores e potenciadores. Sequências vetoriais incluindo vetores AAV podem incluir um ou mais "elementos de controle de expressão.” Normalmente, esses elementos são incluídos para facilitar a transcrição de polinucleotídeos heterólogos adequada e, se for o caso, tradução (por exemplo, um promotor, potenciador, sinal de junção para íntrons, manutenção da fase de leitura correta do gene para permitir a tradução de mRNA na fase e, códons de terminação etc.). Tais elementos normalmente atuam em cis, referidos como um elemento de "atuação cis", mas também podem atuar em trans.

[0046] O controle de expressão pode estar no nível de transcrição, tradução, "splicing", estabilidade de mensagem, etc. Tipicamente, um elemento de controle de expressão que modula a transcrição é justaposto perto da extremidade 5' (ou seja, "a montante") de um ácido nucleico transcrito. Os elementos de controle de expressão também podem ser localizados na extremidade 3' (ou seja, "a jusante") da sequência transcrita ou dentro da transcrição (ou seja, em um íntron). Os elementos de controle de expressão podem ser localizados adjacentes ou a uma distância da sequência transcrita (por exemplo, 1 a 10, 10 a 25, 25 a 50, 50 a 100, 100 a 500, ou mais nucleotídeos do polinucleotídeo), mesmo a distâncias consideráveis. No entanto, devido às limitações de comprimento dos vetores AAV, os elementos de controle de expressão normalmente estarão dentro de 1 a 1000 nucleotídeos a partir do ácido nucleico transcrito.

[0047] Funcionalmente, a expressão de ácido nucleico ligado operativamente é pelo menos parcialmente controlável pelo elemento (por exemplo, promotor), de modo que o elemento modula a transcrição do ácido nucleico e, se for caso, a tradução da transcrição. Um exemplo específico de um elemento de controle de expressão é um promotor, que está geralmente localizado 5' da sequência de ácido nucleico transcrita. Um promotor aumenta tipicamente uma quantidade expressa a partir de ácido nucleico ligado operativamente em comparação com uma quantidade expressa quando não existe promotor.

[0048] Um "potenciador" como usado aqui pode se referir a uma sequência que está localizada adjacente ao ácido nucleico heterólogo. Elementos potenciadores são tipicamente localizados a montante de um elemento promotor, mas também funcionam e podem ser localizados a jusante ou dentro de uma sequência. Assim, um elemento potenciador pode estar localizado 10 a 50 pares de base, 50 a 100 pares de base, 100 a 200 pares de base, ou 200 a 300 pares de base, ou mais pares de base a montante ou a jusante de uma sequência heteróloga de ácido nucleico. Os elementos potenciadores aumentam tipicamente expressando-se de um ácido nucleico ligado operativamente acima da expressão oferecida por um elemento promotor.

[0049] Um constructo de expressão pode compreender elementos reguladores que servem para acionar a expressão em um determinado tipo de célula ou tecido. Os elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores) incluem aqueles ativos num determinado tipo de tecido ou célula, referidos aqui como "elementos/promotores de controle de expressão específicos de tecido". Os elementos de controle de expressão específicos dos tecidos são tipicamente ativos em células ou tecidos específicos (por exemplo,

fígado). Os elementos de controle de expressão são tipicamente ativos em determinadas células, tecidos ou órgãos porque são reconhecidos por proteínas ativadoras de transcrição, ou outros reguladores de transcrição, que são únicos para um tipo específico de célula, tecido ou órgão. Tais elementos reguladores são conhecidos pelos técnicos no assunto (vide, por exemplo, Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1992)).

[0050] A incorporação de elementos regulatórios de tecido específico nos constructos de expressão prevê pelo menos um tropismo tecidual parcial para a expressão de um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína ou ARN inibitório. Exemplos de promotores ativos no fígado são o promotor TTR, o promotor alfa-1-antitripsina humana (hAAT); albumina, Miyatake, et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997); promotor de núcleo do vírus da hepatite B, Sandig, et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996); alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1503-14 (1996)], entre outros. Um exemplo de um potenciador ativo no fígado é a apolipoproteína E (apoE) HCR- 1 e HCR-2 (Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997)).

[0051] Os elementos de controle de expressão também incluem promotores/potenciadores ubíquos ou promíscuos que são capazes de direcionar a expressão de um polinucleotídeo em muitos tipos diferentes de células. Tais elementos incluem, mas não estão limitados a, sequências promotoras/potenciadoras precoces imediatas de citomegalovírus (CMV), sequências promotoras/potenciadoras do vírus Rous sarcoma (RSV) e outros promotores/potenciadores virais ativos em vários tipos de células de mamíferos ou elementos sintéticos que não estão presentes na natureza (vide, por exemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)), o promotor SV40, o promotor dihidrofolato redutase, o promotor citoplasmático de β-actina e o promotor de fosfoglicerol quinase (PGK).

[0052] Elementos de controle de expressão também podem conferir expressão de uma maneira regulável, ou seja, um sinal ou estímulo aumenta ou diminui a expressão do polinucleotídeo heterólogo ligado operativamente. Um elemento regulável que aumenta a expressão do polinucleotídeo ligado operativamente em resposta a um sinal ou estímulos também é referido como um "elemento de indução" (isto é, é induzido por um sinal). Exemplos particulares incluem, mas não se limitam a, um promotor induzido por hormônio (por exemplo, esteróide). Tipicamente, a quantidade de aumento ou diminuição conferida por tais elementos é proporcional à quantidade de sinal ou estímulos presentes; quanto maior a quantidade de sinal ou estímulos, maior o aumento ou diminuição na expressão. Alguns exemplos não limitantes particulares incluem o promotor da metalotionina ovina induzida por zinco (MT); o promotor do vírus tumoral mamário do rato induzido por hormônio esteróide (MMTV); o sistema promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o sistema repressivo da tetraciclina (Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)); o sistema indutível da tetraciclina (Gossen, et al., Science. 268:1766-1769 (1995); ver também Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998)); o sistema de indução de RU486 (Wang, et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) e Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; e o sistema de indução de rapamicina (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)). Outros elementos reguláveis de controle que podem ser úteis neste contexto são os que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda, desenvolvimento.

[0053] Os elementos de controle de expressão também incluem os elementos nativos para o polinucleotídeo heterólogo. Pode utilizar-se um elemento de controle nativo (por exemplo, promotor) quando se desejar que a expressão do polinucleotídeo heterólogo imite a expressão nativa. O elemento nativo pode ser usado quando a expressão do polinucleotídeo heterólogo é para ser regulada temporariamente ou desenvolvidamente, ou de uma maneira de tecido específico, ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Outros elementos de controle de expressão nativos, tais como íntrons, locais de poliadenilação ou sequências de consenso de Kozak também podem ser usados.

[0054] O termo "ligados operativamente" significa que as sequências reguladoras necessárias para a expressão de uma sequência de ácido nucleico são colocadas nas posições adequadas em relação à sequência, de modo a efetuar a expressão da sequência de ácido nucleico. Esta mesma definição é às vezes aplicada ao arranjo de sequências de ácido nucleico e elementos de controle de transcrição (por exemplo, promotores, potenciadores e elementos de terminação) em um vetor de expressão, por exemplo, vetor rAAV.

[0055] No exemplo de um elemento de controle de expressão em ligação operável com um ácido nucleico, a relação é tal que o elemento de controle modula a expressão do ácido nucleico. Mais especificamente, por exemplo, duas sequências de DNA ligadas operativamente significam que os dois DNAs estão dispostos (cis ou trans) em uma relação tal que pelo menos uma das sequências de DNA é capaz de exercer um efeito fisiológico sobre a outra sequência.

[0056] Assim, elementos adicionais para vetores incluem, sem limitação, um elemento de controle de expressão (por exemplo, promotor/potenciador), um sinal de terminação de transcrição ou um códon de terminação, regiões não traduzidas de 5' ou 3' (por exemplo, sequências de poliadenilação (polyA)) que flanqueiam uma sequência, como uma ou mais cópias de uma sequência ITR AAV, ou um íntron.

[0057] Outros elementos incluem, por exemplo, sequências de polinucleotídeo de "filler" ou "stuffer", por exemplo, para aprimorar o encapsulamento e reduzir a presença de ácido nucleico contaminante. Vetores AAV tipicamente aceitam inserções de DNA com uma faixa de tamanho que é geralmente de cerca de 4 kb a cerca de 5,2 kb, ou um pouco mais. Assim, para sequências mais curtas, a inclusão de um "stuffer" ou "filler" para ajustar o comprimento para perto ou no tamanho normal da sequência genômica de vírus aceitável para o encapsulamento de vetor AAV em partícula do vírus. Em várias modalidades, uma sequência de ácido nucleico de "filler"/"stuffer" é um segmento de ácido nucleico não traduzido (codificação não proteica). Para uma sequência de ácido nucleico inferior a 4,7 Kb, a sequência de polinucleotídeos de "filler" ou "stuffer" tem um comprimento que, quando combinado (por exemplo, inserido em um vetor) com a sequência, tem um comprimento total entre cerca de 3,0 a 5,5 Kb, ou entre cerca de 4,0 a 5,0 Kb, ou entre cerca de 4,3 a 4,8 Kb.

[0058] O termo "isolado", quando usado como um modificador de uma composição, significa que as composições são feitas pela mão do homem ou são separadas, completamente ou pelo menos em parte, de seu ambiente in vivo que ocorre naturalmente. Geralmente, as composições isoladas são substancialmente livres de um ou mais materiais com os quais normalmente se associam na natureza, por exemplo, uma ou mais proteína, ácido nucleico, lipídio, carboidrato, membrana celular.

[0059] O termo "isolado" não exclui combinações produzidas pela mão do homem, por exemplo, uma sequência rAAV, ou partícula rAAV que que encapsula ou encapsida um genoma vetorial AAV e uma formulação farmacêutica. O termo "isolado" também não exclui formas físicas alternativas da composição, tais como híbridos/quimeras, multímeros/oligômeros, modificações (por exemplo, fosforilação, glicosilação, lipidação) ou formas derivadas, ou formas expressas em células hospedeiras produzidas pela mão do homem.

[0060] A expressão "consistindo essencialmente de" quando se refere a uma sequência nucleotídica particular ou sequência de aminoácidos significa uma sequência com as propriedades de uma dada sequência de referência. Por exemplo, quando usado em referência a uma sequência de aminoácido, a frase inclui a sequência per se e modificações moleculares que não afetariam as características básicas e novas da sequência.

[0061] O termo "identidade", "homologia" e suas variações gramaticais significam que duas ou mais entidades referenciadas são as mesmas, quando elas são sequências "alinhadas". Assim, por exemplo, quando duas sequências de proteínas são idênticas, elas têm a mesma sequência de aminoácidos, pelo menos dentro da região ou porção referenciada. Quando duas sequências de ácido nucleico são idênticas, elas têm a mesma sequência de ácido nucleico, pelo menos dentro da região ou porção referenciada. A identidade pode ser sobre uma área definida (região ou domínio) da sequência.

[0062] Uma "área" ou "região" de identidade refere-se a uma porção de duas ou mais entidades referenciadas que são as mesmas. Assim, quando duas sequências de proteína ou ácido nucleico são idênticas em uma ou mais áreas de sequência ou regiões, elas compartilham identidade dentro dessa região. Uma sequência "alinhada" refere-se a múltiplas sequências de proteína (aminoácidos) ou ácidos nucleicos, muitas vezes contendo correções para bases ou aminoácidos adicionais ou ausentes (lacunas), em comparação com uma sequência de referência.

[0063] A identidade pode estender-se por todo o comprimento ou parte da sequência. Em certas modalidades, o comprimento da seqüência compartilhando a identidade percentual é 2, 3, 4, 5 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc. aminoácidos ou ácidos nucleicos contíguos. Em modalidades adicionais, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é de 21 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, etc. ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos. Em outras modalidades, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é de 41 ou mais aminoácidos contíguos ou ácidos nucleicos, por exemplo, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50, etc., aminoácidos contíguos ou ácidos nucleicos. Em ainda outras modalidades, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é de 50 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 50 a 55, 55 a 60, 60 a 65, 65 a 70, 70 a 75, 75 a 80, 80 a 85, 85 a 90, 90 a 95, 95 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 500, 500 a 1.000, etc. ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos.

[0064] A extensão da identidade (homologia) ou "identidade percentual" entre duas sequências pode ser determinada usando um programa de computador e/ou algoritmo matemático. Para fins desta invenção, comparações de sequências de ácido nucleico são realizadas usando o GCG Wisconsin Package version 9.1, disponível do Genetics Computer Group em Madison, Wisconsin. Por conveniência, os parâmetros padrão (penalidade de criação de lacuna = 12, penalidade de extensão de lacuna = 4) especificados por esse programa são destinados a serem usados aqui para comparar a identidade da sequência. Alternadamente, o programa Blastn 2.0 fornecido pelo National Center for Biotechnology Information (encontrado na rede mundial de computadores em ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215: 403-410) usando um alinhamento de lacunas com parâmetros padrão, pode ser usado para determinar o nível de identidade e semelhança entre sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácido. Para comparações de sequência de polipeptídeo, um algoritmo BLASTP é tipicamente usado em combinação com uma matriz de pontuação, como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 ou BLOSUM 50. Os programas de comparação de sequência FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) e SSEARCH também são usados para quantificar a extensão da identidade (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); e Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Também foram desenvolvidos programas para quantificar similaridades estruturais proteicas usando mapeamento topológico baseado em Delaunay (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).

[0065] Moléculas de ácido nucleico, vetores de expressão (por exemplo, genomas vetoriais AAV), plasmídeos e ácidos nucleicos heterólogos podem ser preparados usando-se métodos de tecnologia de DNA recombinante. A disponibilidade de informação de sequência nucleotídica permite a preparação de moléculas de ácido nucleico isoladas da invenção por uma variedade de meios. Por exemplo, sequências de ácido nucleico que codificam uma proteína terapêutica podem ser feitas usando várias técnicas padrão de clonagem, tecnologia de DNA recombinante, via expressão celular ou tradução in vitro e síntese química. A pureza dos polinucleotídeos pode ser determinada através de sequenciamento, eletroforese em gel e similares. Por exemplo, ácidos nucleicos podem ser isolados usando técnicas de hibridização ou triagem de banco de dados computadorizada. Tais técnicas incluem, mas não se limitam a: (1) hibridização de bibliotecas de cDNA ou DNA genômico com sondas para detectar sequências nucleotídicas homólogas; (2) triagem de anticorpos para detectar polipeptídeos tendo características estruturais compartilhadas, por exemplo, usando uma biblioteca de expressão; (3) reação em cadeia de polimerase (PCR) no cDNA ou DNA genômico usando iniciadores capazes de emparelhar com uma sequência de ácidos nucleicos de interesse; (4) pesquisas em computador de bancos de dados de sequências para sequências relacionadas; e (5) triagem diferencial de uma biblioteca de ácido nucleico subtraída.

[0066] Os ácidos nucleicos podem ser mantidos como DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Por exemplo, clones podem ser mantidos em um vetor de clonagem/expressão plasmídica, como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), que é propagado em uma célula hospedeira de E. coli adequada. Alternativamente, os ácidos nucleicos podem ser mantidos em vetores adequado para expressão em células de mamíferos, por exemplo, um vetor AV.

[0067] Como divulgado aqui, atores rAAV podem, opcionalmente, compreender elementos regulatórios necessários para a expressão do ácido nucleico heterólogo em uma célula posicionada de maneira a permitir a expressão da proteína codificada na célula hospedeira. Tais elementos regulatórios necessários para a expressão incluem, mas não se limitam a, sequências promotoras, sequências potenciadoras ("enhancer") e sequências de iniciação de transcrição, como estabelecidas aqui e conhecidas pelo técnico no assunto.

[0068] Os métodos e usos da invenção incluem a entrega de ácido nucleico (transdutor) em células hospedeiras, incluindo células divisoras e/ou não-divisoras. Os ácidos nucleicos, vetor rAAV, métodos, usos e formulações farmacêuticas da invenção são adicionalmente úteis em um método de entrega, administração ou fornecimento de sequência codificada por ácido nucleico heterólogo a um paciente em necessidade, como um método de tratamento. Desta forma, o ácido nucleico é transcrito e uma proteína ou ácido nucleico inibitório pode ser produzido in vivo em um paciente. O paciente pode beneficiar-se da ou precisar da proteína ou do ácido nucleico inibitório porque o paciente tem uma deficiência da proteína, ou porque a produção da proteína ou ácido nucleico inibitório no paciente pode causar algum efeito terapêutico, como um método de tratamento ou de outra forma. Por exemplo, um ácido nucleico inibitório pode reduzir a expressão ou transcrição de uma proteína deletéria aberrante que é expressada em um paciente em que a proteína aparente ou deletéria causa uma doença ou distúrbio, como um distúrbio ou doença neurológica.

[0069] Os vetores rAAV que compreendem um genoma AAV com um ácido nucleico heterólogo permitem o tratamento de doenças genéticas. Para doenças de estado de deficiência, a transferência de gene pode ser usada para trazer um gene normal aos tecidos afetados para terapia de substituição, bem como para criar modelos animais para a doença usando mutações anti-sentido. Para estados de doença desequilibrados, a transferência de gene poderia ser usada para criar um estado de doença em um sistema modelo, que poderia então ser usado em esforços para neutralizar o estado de doença. O uso de integração específica do local de sequências de ácido nucleico para corrigir defeitos também é possível.

[0070] Em várias modalidades, podem ser usados vetores rAAV compreendendo um genoma AAV com um ácido nucleico heterólogo, por exemplo, como agentes terapêuticos e/ou profiláticos (proteínas ou ácido nucleico). Em modalidades particulares, o ácido nucleico heterólogo codifica uma proteína que pode modular a cascata de coagulação sanguínea.

[0071] Por exemplo, um FVIII-BDD ou FVIII codificado pode ter uma atividade de coagulação semelhante a de FVIII de tipo selvagem, ou uma atividade de coagulação alterada em comparação com FVII de tipo selvagem. A administração vetores rAAV codificadores de FVIII-BDD ou FVIII a um paciente resulta na expressão de proteína FVIII-BDD ou FVIII que serve para normalizar a cascata de coagulação.

[0072] Em modalidades adicionais, um ácido nucleico heterólogo codifica uma proteína (enzima) que pode inibir ou reduzir o acúmulo de glicogênio, prevenir o acúmulo de glicogênio ou degradar o glicogênio. Por exemplo, um GAA codificado pode ter atividade similar ao GAA de tipo selvagem. Administração de vetores rAAV codificadores de GAA para um paciente com a doença de Pompe resulta na expressão da proteína de GAA, que serve para inibir ou reduzir o acúmulo de glicogênio, evitar o acúmulo de glicogênio ou degradar o glicogênio, o que pode por sua vez reduzir ou diminuir um ou mais efeitos adversos da doença de Pompe.

[0073] Os vetores rAAV podem ser administrados isoladamente ou em combinação com outras moléculas. De acordo com a invenção, vetores rAAV ou uma combinação de agentes terapêuticos podem ser administrados ao paciente isoladamente ou em composições farmacologicamente aceitáveis ou biologicamente compatíveis.

[0074] A entrega direta de vetores rAAV ou transdução ex-vivo de células humanas seguida de infusão no corpo resultará na expressão do ácido nucleico heterólogo, exercendo assim um efeito terapêutico benéfico sobre a hemostasia. No contexto do fator de coagulação sanguínea, tal como o Fator VIII, a administração melhora a atividade pró-coagulação. No contexto de uma enzima, como a GAA, a administração reduz a quantidade ou acúmulo de glicogênio, previne o acúmulo de glicogênio ou degrada o glicogênio. Isto, por sua vez, pode reduzir ou diminuir um ou mais efeitos adversos da doença de Pompe, tais como promover ou melhorar o tônus muscular e/ou a força muscular e/ou reduzir ou diminuir o fígado aumentado.

[0075] O vetor AAV recombinante, bem como métodos e usos do mesmo, incluem qualquer cepa ou sorotipo viral. Como um exemplo não limitante, um vetor AAV recombinante pode ser baseado em qualquer genoma AAV, como AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -rh74, -rh10 ou AAV-2i8, por exemplo. Tais vetores podem ser baseados na mesma cepa ou sorotipo (ou subgrupo ou variante), ou ser diferentes um do outro. Como exemplo não limitativo, um vetor AAV recombinante baseado em um genoma de sorotipo particular pode ser idêntico ao sorotipo das proteínas de capsídeo que encapsulam o vetor. Além disso, um genoma de vetor AAV recombinante pode ser baseado em um genoma de sorotipo AAV distinto do sorotipo das proteínas de capsídeo AAV que encapsulam o vetor. Por exemplo, o genoma vetorial AAV pode ser baseado no AAV2, enquanto pelo menos uma das três proteínas de capsídeo pode ser uma SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8, ou uma variante das mesmas, por exemplo.

[0076] Em modalidades particulares, os vetores de vírus adeno- associado (AAV) incluem SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 e AAV-2i8, assim como variantes (por exemplo, variantes de capsídeo, tais como inserções, adições, substituições e eliminações de aminoácidos) dos mesmos, por exemplo, como estabelecido nas patentes WO 2013/158879 (Pedido Internacional PCT/US2013/037170), WO 2015/013313 (Pedido Internacional PCT/US2014/047670) e US 2013/0059732 (Patente dos EUA Nº

9.169.299, divulga LK01, LK02, LK03, etc.).

[0077] Como usado aqui, o termo "sorotipo" é uma distinção usada para referir-se a um AAV tendo um capsídeo que é sorologicamente distinto de outros sorotipos de AAV. A distinção sorológica é determinada com base na falta de reatividade cruzada entre anticorpos para um AAV em comparação com outro AAV. Estas diferenças de reatividade cruzada são normalmente devidas a diferenças nos determinantes antigênicos/sequências de proteínas de capsídeo (por exemplo, devido a diferenças nas sequências VP1, VP2 e/ou VP3 dos sorotipos AAV). Apesar da possibilidade de as variantes AAV não serem sorologicamente distintas de um AAV de referência ou de outro sorotipo AAV, diferem pelo menos por um nucleotídeo ou resíduo de aminoácido em comparação com a referência ou outro sorotipo AAV.

[0078] De acordo com a definição tradicional, um sorotipo significa que o vírus de interesse foi testado contra o soro específico para todos os sorotipos existentes e caracterizados para atividade neutralizante e não foram encontrados anticorpos que neutralizem o vírus de interesse. À medida que os isolados de vírus de ocorrência mais natural são descobertos e/ou mutantes de capsídeo são gerados, pode ou não haver diferenças sorológicas com qualquer um dos sorotipos atualmente existentes. Assim, nos casos em que o novo vírus (por exemplo, AAV) não tem diferença sorológica, este novo vírus (por exemplo, AAV) seria um subgrupo ou variante do sorotipo correspondente. Em muitos casos, o teste sorológico para atividade neutralizante ainda tem que ser realizado em vírus mutantes com modificações da sequência de capsídeo para determinar se eles são de outro sorotipo de acordo com a definição tradicional de sorotipo. Assim, por uma questão de conveniência e para evitar repetição, o termo "sorotipo" refere-se amplamente tanto a vírus sorologicamente distintos (por exemplo, AAV), quanto a vírus (por exemplo, AAV) que não são sorologicamente distintos que podem estar dentro de um subgrupo ou uma variante de um determinado sorotipo.

[0079] Como aqui definido, proteínas de capsídeo AAV e ácidos nucleicos que codificam as proteínas de capsídeo apresentam menos do que

100% de identidade de seqüência para com um sorotivo AAV parental ou referência, tal como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, ou AAV-2i8, mas são distintos e não idênticos às proteínas ou genes AAV conhecidos, como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8. Numa modalidade, uma proteína de capsídeo AAV inclui ou consiste numa sequência pelo menos 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, etc., até 99,9% idêntica a uma proteína de capsídeo AAV parental ou de referência, como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8.

[0080] Em certas modalidades, uma proteína de capsídeo AAV modificada tem 1, 2, 3, 4, 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20 ou mais substituições de aminoácidos. Em certas modalidades, uma proteína de capsídeo AAV modificada tem um comprimento de inserção peptídica de 2, 3, 4, 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a 50 ou 50 a 60 aminoácidos.

[0081] Os vetores rAAV podem ser administrados a um doente por infusão num transportador biologicamente compatível, por exemplo, por injeção intravenosa. Os vetores rAAV podem, opcionalmente, ser encapsulados em lipossomas ou misturados com outros fosfolipídios ou micelas para aumentar a estabilidade da molécula.

[0082] Os vetores rAAV podem ser administrados isoladamente ou em combinação com outras composições, agentes, fármacos, biológicos, etc. Consequentemente, os vetores rAAV isoladamente e com outras composições, agentes, fármacos, biológicos (proteínas) podem ser incorporados nas composições farmacêuticas. Tais composições farmacêuticas são úteis para, entre outras coisas, administração e entrega a um paciente in vivo ou ex vivo.

[0083] Em particular, as composições farmacêuticas também contêm um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não induza uma resposta imune prejudicial para o paciente que recebe a composição e que possa ser administrado sem toxicidade indevida.

[0084] Como usado aqui, os termos "farmaceuticamente aceitável" e "fisiologicamente aceitável" significam uma formulação biologicamente aceitável, gasosa, líquida ou sólida, ou mistura das mesmas, que é adequada para uma ou mais vias de administração, entrega ou contato in vivo. Uma composição "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável" é um material que não é biologicamente ou de outra forma indesejável, por exemplo, o material pode ser administrado a um paciente sem causar efeitos biológicos indesejáveis substanciais. Assim, tal composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, na administração de um ácido nucleico, vetor, partícula viral ou proteína a um paciente.

[0085] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, líquidos tais como água, solução salina, glicerol, açúcares e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser incluídos nos mesmos, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH e similares, podem estar presentes em tais veículos.

[0086] A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo, mas não limitado a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros solventes protônicos do que as formas de base livre correspondentes. Em outros casos, uma preparação pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um ou todos os seguintes: 1 a 50 mM de histidina, 0,1% a 2% de sacarose e 2 a 7%

de manitol, a uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinada com o tampão antes do uso.

[0087] Composições farmacêuticas incluem solventes (aquosos ou não- aquosos), soluções (aquosas ou não- aquosas), emulsões (por exemplo, óleo em água ou água em óleo), suspensões, xaropes, elixires, meios de suspensão e dispersão, revestimentos, agentes isotônicos e promotores ou retardadores de absorção, compatíveis com a administração farmacêutica ou contato ou entrega in vivo. Os solventes, soluções e suspensões aquosos e não aquosos podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. Tais transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem comprimidos (revestidos ou não revestidos), cápsulas (duras ou moles), microesferas, pó, grânulos e cristais. Compostos ativos suplementares (por exemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivirais e antifúngicos) também podem ser incorporados nas composições.

[0088] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem compatíveis com uma determinada via de administração ou entrega, como estabelecido aqui ou conhecido por um técnico no assunto. Assim, as composições farmacêuticas incluem transportadores, diluentes ou excipientes adequados para administração por várias vias.

[0089] As composições adequadas para administração parenteral incluem soluções aquosas e não aquosas, suspensões ou emulsões do composto ativo, cujas preparações são tipicamente estéreis e podem ser isotônicas com o sangue do receptor pretendido. Exemplos ilustrativos não limitantes incluem água, solução salina tamponada, solução de Hanks, solução de Ringer, dextrose, frutose, etanol, óleos animais, vegetais ou sintéticos. As suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano.

[0090] Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção de óleo apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de sésamo, ou ésteres sintéticos de ácidos graxos, tais como oleato de etilo ou triglicerídeos, ou lipossomas. Facultativamente, a suspensão pode também conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentem a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[0091] Podem ser adicionados co-solventes e adjuvantes à formulação. Exemplos não limitantes de co-solventes contêm grupos hidroxilo ou outros grupos polares, por exemplo, álcoois, tais como álcool isopropílico; glicóis, tais como propileno glicol, polietileno glicol, polipropileno glicol, éter glicol; glicerol, álcoois de polioxietileno e ésteres de ácidos graxos de polioxietileno. Os adjuvantes incluem, por exemplo, tensioativos tais como a lecitina de soja e ácido oleico; ésteres de sorbitano, tais como o trioleato de sorbitano; e a polivinilpirrolidona.

[0092] Após a preparação das composições farmacêuticas, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e etiquetadas para tratamento. Tal rotulagem pode incluir quantidade, frequência e método de administração.

[0093] As composições farmacêuticas e os sistemas de entrega apropriados para as composições, métodos e usos da invenção são conhecidos na técnica (ver, por exemplo,Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel e Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; e Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315).

[0094] Uma "quantidade eficaz" ou "quantidade suficiente" refere- se a uma quantidade que fornece, em única ou múltiplas doses, sozinhas ou em combinação com uma ou mais outras composições (agentes imunossupressores ou terapêuticos, tais como um fármaco), tratamentos, protocolos, agentes de regime terapêutico, uma resposta detectável por qualquer duração de tempo (de curto ou longo prazo), um resultado esperado ou desejado em ou um benefício para um paciente de qualquer grau detectável ou mensurável ou por qualquer duração de tempo (por exemplo, por minutos, horas, dias, meses, anos, ou curado).

[0095] As doses podem variar e depender do tipo, primeiros sintomas, progressão, gravidade, frequência, duração ou probabilidade da doença para qual o tratamento é direcionado, o desfecho clínico desejado, tratamentos anteriores ou simultâneos, a saúde geral, idade, sexo, raça ou competência imunológica do paciente e outros fatores que serão apreciados pelo técnico no assunto. A quantidade, número, frequência ou duração da dose podem ser proporcionalmente aumentadas ou reduzidas, conforme indicado por quaisquer efeitos colaterais adversos, complicações ou outros fatores de risco do tratamento ou da terapêutica e do estado do paciente. O técnico no assunto apreciará os fatores que podem influenciar a dosagem e o tempo necessários para proporcionar uma quantidade suficiente para proporcionar um benefício terapêutico ou profilático.

[0096] A dose para atingir um efeito terapêutico, por exemplo, a dose em genomas de vetor/por quilograma de peso corporal (vg/kg), vai variar de acordo com diversos fatores, incluindo, mas não limitado a: a via de administração, o nível de expressão de polinucleotídeo heterólogo necessária para atingir um efeito terapêutico, a doença específica tratada, qualquer resposta imune do hospedeiro ao vetor viral, uma resposta imune do hospedeiro ao polinucleotídeo heterólogo ou produto de expressão (proteína), e a estabilidade da proteína expressa. Um técnico no assunto pode determinar uma faixa de dose de genoma rAAV/vetor para tratar um paciente com um distúrbio ou doença particular com base nos fatores acima mencionados, bem como outros fatores.

[0097] genomas de vetor por quilograma (vg/kg) do peso do paciente, ou mais, por 9 10 11 12 13 14 , ou mais, de genomas de vetor por quilograma (vg/kg) do peso do paciente, para alcançar 10 - 11 12 13 - vg/kg em cães. As Doses podem ser inferiores, por exemplo, a uma dose inferior a 61012 vg/kg. Mais particularmente, uma dose de 5x1011 vg/kg ou 1x1012 vg/kg.

[0098] Doses do vetor rAAV podem estar em um nível, tipicamente na extremidade inferior do espectro de dose, de modo que não haja uma resposta imune substancial contra a sequência heteróloga de ácido nucleico, a proteína codificada ou ácido nucleico inibitório, ou vetor rAAV. Mais particularmente, uma dose de até, mas menos do que 6x10 12 vg/kg, tal como cerca de 5x1011 a cerca de 5x1012 vg/kg, ou, mais particularmente, cerca de 5x1011 vg/kg ou cerca de 1x1012 vg/kg.

[0099] As doses de uma "quantidade eficaz" ou "quantidade suficiente" para o tratamento (por exemplo, para aliviar ou para fornecer uma melhoria ou benefício terapêutico) normalmente são eficazes para dar resposta a um, vários ou todos os sintomas adversos, consequências ou complicações da doença, um ou mais sintomas adversos, distúrbios, doenças, patologias, ou complicações, por exemplo, causados por ou associados com a doença, em uma medida mensurável, embora a diminuição, redução, inibição, supressão, limitação ou controle da progressão ou agravamento da doença seja um resultado satisfatório.

[0100] Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente pode, mas não precisa, ser fornecida em uma única administração, pode exigir várias administrações, e, pode, mas não precisa, ser administrada sozinha ou em combinação com outra composição (por exemplo, agente), tratamento, protocolo ou regime terapêutico. Por exemplo, a quantidade pode ser proporcionalmente aumentada conforme indicado pela necessidade do paciente, tipo, estado e gravidade da doença tratada ou efeitos colaterais (caso existam) do tratamento.

[0101] Além disso, uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente não precisa ser eficaz ou suficiente se dada em única ou múltiplas doses, sem uma segunda composição (por exemplo, outro fármaco ou agente), tratamento, protocolo ou regime terapêutico, uma vez que duração, quantidades e doses adicionais acima e além de tais doses, ou composições (por exemplo, fármacos ou agentes), tratamentos, protocolos ou regimes terapêuticos adicionais podem ser incluídos para serem considerados eficazes ou suficientes em um determinado paciente. Quantidades consideradas eficazes também incluem as quantidades que resultam em uma redução do uso de um outro tratamento, regime terapêutico ou protocolo, tais como a administração de enzima recombinante (por exemplo, GAA) para o tratamento de uma deficiência enzimática (por exemplo, a doença de Pompe) ou administração de proteína de fator de coagulação recombinante (por exemplo, FVIII) para o tratamento de um distúrbio de coagulação (por exemplo, hemofilia A).

[0102] Assim, métodos e usos da invenção também incluem, entre outras coisas, métodos e usos que resultam em uma necessidade reduzida ou uso de outro composto, agente, fármaco, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo ou remédio. Assim, de acordo com a invenção, são fornecidos métodos e usos para reduzir a necessidade ou o uso de outro tratamento ou terapia.

[0103] Uma quantidade efetiva ou uma quantidade suficiente não precisa ser efetiva em cada paciente tratado, nem na maioria dos pacientes tratados em um determinado grupo ou população. Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente significa eficácia ou suficiência num determinado paciente, não num grupo ou na população em geral. Como é típico para tais métodos, alguns pacientes exibirão uma resposta maior, ou menor ou nenhuma resposta a um determinado uso ou método de tratamento.

[0104] O termo "melhorar" significa uma melhora detectável ou mensurável da doença ou sintoma de um paciente, ou uma resposta celular subjacente. Uma melhora detectável ou mensurável inclui uma diminuição, redução, inibição, supressão, limitação ou controle objetivo ou subjetivo na ocorrência, frequência, gravidade, progressão ou duração da doença ou complicação causada por ou associada com a doença, ou uma melhora de um sintoma ou de uma consequência ou causa subjacente da doença, ou uma reversão da doença.

[0105] Para a doença de Pompe, uma quantidade eficaz seria uma quantidade de GAA que inibe ou reduz a produção ou acúmulo de glicogênio, aprimora ou aumenta a degradação ou remoção do glicogênio, ou melhora o tônus muscular e/ou a força muscular num paciente, por exemplo. Para hemofilia A, uma quantidade efetiva seria uma quantidade que reduz a frequência ou gravidade de episódios hemorrágicos agudos em um paciente, por exemplo, ou uma quantidade que reduz o tempo de coagulação, medido por um ensaio de coagulação, por exemplo.

[0106] As doses terapêuticas dependerão, entre outros fatores, da idade e condição geral do paciente, da gravidade da doença ou distúrbio. Uma quantidade terapeuticamente eficaz em seres humanos cairá em um intervalo relativamente amplo que pode ser determinado por um médico com base na resposta de um paciente individual.

[0107] Composições, tais como composições farmacêuticas podem ser entregues a um paciente, de modo a permitir a produção da proteína codificada ou ácido nucleico inibitório. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas compreendem material genético suficiente para permitir que um recipiente produza uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína ou ácido nucleico inibitório no paciente.

[0108] As composições podem ser administradas isoladamente. Em certas modalidades, uma partícula AAV recombinante fornece um efeito terapêutico sem um agente imunossupressor. O efeito terapêutico é opcionalmente mantido por um período de tempo, por exemplo, 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, 8 a 10, 10 a 14, 14 a 20, 20 a 25, 25 a 30, ou 30 a 50 dias ou mais, por exemplo, 50 a 75, 75 a 100, 100 a 150, 150 a 200 dias ou mais, sem administração de um agente imunossupressor. Consequentemente, é previsto um efeito terapêutico por um período de tempo.

[0109] As composições podem ser administradas em combinação com pelo menos um outro agente. Em certas modalidades, o vetor rAAV é administrado em conjunto com um ou mais agentes imunossupressores antes de, substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração de um vetor rAAV. Em certas modalidades, por exemplo, 1 a 12, 12 a 24 ou 24 a 48 horas, ou 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, 8 a 10, 10 a 14, 14 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 50, ou mais de 50 dias após a administração do vetor rAAV. Tal administração de agentes imunossupressores após um período de tempo após a administração de vetor rAAV, se há um decréscimo na proteína codificada ou ácido nucleico inibitório após os primeiros níveis de expressão, por um período de tempo, por exemplo, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 50, 50 a 75, 75 a 100, 100 a 150, 150 a 200 ou mais que 200 dias seguintes ao vetor rAAV.

[0110] Em certas modalidades, um agente imunossupressor é um agente anti-inflamatório. Em certas modalidades, um agente imunossupressor é um esteróide. Em certas modalidades, um agente imunossupressor é a ciclosporina (por exemplo, ciclosporina A), micofenolato, Rituximabe ou um derivado destes. Outros agentes específicos incluem um composto estabilizador.

[0111] As composições podem ser formuladas e/ou administradas em qualquer transportador farmacêutico estéril e biocompatível, incluindo, mas não limitado a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. As composições podem ser formuladas e/ou administradas a um paciente isoladamente, ou em combinação com outros agentes (por exemplo, co- fatores) que influenciam a hemostasia.

[0112] Os métodos e usos da invenção incluem entrega e administração sistemicamente, regionalmente ou localmente, ou por qualquer via, por exemplo, por injeção ou infusão. A entrega das composições farmacêuticas in vivo pode ser geralmente realizada através de injeção usando uma seringa convencional, embora outros métodos de entrega, tais como a entrega aprimorada por convecção são previstos (ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.720.720). Por exemplo, as composições podem ser fornecidas por via subcutânea, epidérmica, intradérmica, intratecal, intra-orbital, intra- mucosa, intra-peritoneal, endovenosa, intra-pleural, intra-arterial, oral, intra- hepática, através da veia portal, ou por via intramuscular. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações trans-dérmicas. Um clínico especializado no tratamento de doentes com distúrbios de coagulação sanguínea pode determinar a via ideal para a administração dos vetores AAV com base num certo número de critérios, incluindo, mas não se limitando a: a condição do paciente e o propósito do tratamento (por exemplo, coagulação sanguínea aprimorada ou reduzida).

[0113] Os vetores rAAV, métodos e usos da invenção podem ser combinados com qualquer composto, agente, fármaco, tratamento ou outro regime terapêutico ou protocolo com uma atividade ou efeito terapêutico desejado, benéfico, aditivo, sinérgico ou complementar. Os tratamentos e composições combinados exemplares incluem segundos ativos, tais como, biológicos (proteínas), agentes (por exemplo, imunossupressores) e fármacos. Tais biológicos (proteínas), agentes, fármacos, tratamentos e terapias podem ser administrados ou realizados antes, substancialmente simultaneamente com ou seguindo qualquer outro método ou uso da invenção.

[0114] O composto, agente, fármaco, tratamento ou outro regime terapêutico ou protocolo podem ser administrados como uma composição combinada, ou administrados separadamente, tais como concomitantemente ou em série ou sequencialmente (antes ou após) a entrega ou administração de um ácido nucleico, vetor ou partícula rAAV. A invenção, portanto, fornece combinações em que um método ou uso da invenção está em uma combinação com qualquer composto, agente, fármaco, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo, remédio ou composição, estabelecido aqui ou conhecido por um técnico no assunto. O composto, agente, fármaco, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo, remédio ou composição podem ser administrados ou realizados antes, substancialmente contemporaneamente com ou após a administração de um ácido nucleico, vetor ou partícula rAAV da invenção, a um paciente.

[0115] A invenção é útil em animais, incluindo aplicações médicas humanas e veterinárias. Os pacientes adequados incluem, portanto, mamíferos, tais como humanos, bem como mamíferos não humanos. O termo "paciente" refere-se a um animal, normalmente um mamífero, tais como humanos, primatas não humanos (símios, gibões, gorilas, chimpanzés, orangotangos, macacos), um animal doméstico (cães e gatos), uma animal de fazenda (aves tais como galinhas e patos, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos), e animais experimentais (camundongo, rato, coelho, porquinho-da- índia). Os pacientes humanos incluem pacientes fetais, neonatais, infantis, juvenis e adultos. Os pacientes incluem modelos de doenças animais, por exemplo, ratos e outros modelos animais de deficiências proteicas/enzimáticas, tais como a doença de Pompe, doenças de coagulação do sangue, tais como HemA e outras conhecidas por aqueles técnicos no assunto.

[0116] Os pacientes adequados para o tratamento de acordo com a invenção incluem aqueles com ou em risco de produzir uma quantidade insuficiente ou ter uma deficiência em um produto genético funcional ou produzir um produto genético aberrante, parcialmente funcional ou não- funcional, o que pode levar à doença. Os pacientes apropriados para o tratamento de acordo com a invenção também incluem aqueles com ou em risco de produzir um produto genético (proteína) aberrante ou defeituoso

(mutante), que leva a uma doença tal que a redução de quantidades, expressão ou função do produto genético (proteína) aberrante ou defeituoso (mutante) levaria ao tratamento da doença, ou reduzir um ou mais sintomas ou mitigar a doença.

[0117] Os pacientes podem ser testados para uma resposta imune, por exemplo, anticorpos contra a AAV. Os pacientes candidatos podem, portanto, ser examinados antes do tratamento, de acordo com um método da invenção. Os pacientes também podem ser testados para detecção de anticorpos contra a AAV após o tratamento e, opcionalmente, monitorados durante um período de tempo após o tratamento. Os pacientes que desenvolvem anticorpos AAV podem ser tratados com um agente imunossupressor, ou podem ser administradas uma ou mais quantidades adicionais de vetor AAV.

[0118] Os pacientes adequados para tratamento de acordo com a invenção também incluem aqueles que têm ou estão em risco de produzir anticorpos contra AAV. Vetores rAAV podem ser administrados ou entregues a estes pacientes usando várias técnicas. Por exemplo, o capsídeo vazio de AAV (isto é, AAV sem um ácido nucleico heterólogo) pode ser entregue para se ligar aos anticorpos AAV no paciente, permitindo assim que o vetor rAAV compreendendo o ácido nucleico heterólogo transduza as células do sujeito.

[0119] A proporção de capsídeos vazios de AAV para o vetor rAAV pode ser entre cerca de 2:1 para cerca de 50:1, ou entre cerca de 2:1 para cerca de 25:1, ou entre cerca de 2:1 para cerca de 20:1, ou entre cerca de 2:1 para cerca de 15:1, ou entre cerca de 2:1 para cerca de 10:1. As proporções também podem ser de cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, ou 10:1.

[0120] As quantidades de capsídeos vazios AAV a administrar podem ser calibradas com base na quantidade (grau) de anticorpos AAV produzidos num determinado paciente. Capsídeos vazios AAV podem ser de qualquer sorotipo, por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, AAV1, AAV2,

AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8.

[0121] Alternativamente ou em adição a, o vetor rAAV pode ser administrado por injeção intramuscular direta (por exemplo, uma ou mais fibras de um músculo com contração lenta). Em outra alternativa, um cateter introduzido na artéria femoral pode ser usado para administrar vetores rAAV ao fígado via artéria hepática. Meios não cirúrgicos também podem ser empregados, como colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (ERCP), para entregar vetores rAAV diretamente ao fígado, ignorando assim a corrente sanguínea e anticorpos AAV. Outros sistemas de dutos, tais como os de dutos da glândula submandibular, também podem ser usados como portais para administrar vetores rAAV em um paciente que desenvolve ou tem anticorpos anti-AAV pré-existentes.

[0122] A administração ou entrega in vivo a um paciente pode ser realizada antes do desenvolvimento de um sintoma adverso, condição, complicação, etc. causada pela doença ou associada a ela. Por exemplo, uma triagem (por exemplo, genética) pode ser usada para identificar tais pacientes como candidatos para composições, métodos e usos de invenção. Estes pacientes incluem, por conseguinte, os pacientes positivos examinados para uma quantidade insuficiente ou uma deficiência num produto genético funcional, ou que produzem um produto genético aberrante, parcialmente funcional ou não funcional.

[0123] Administração ou entrega in vivo a um paciente de acordo com os métodos e usos da invenção tal como divulgados aqui podem ser praticados no prazo de 1 a 2, 2 a 4, 4 a 12, 12 a 24 ou de 24 a 72 horas após o paciente ter sido identificado como tendo a doença alvo do tratamento, com um ou mais sintomas da doença, ou tendo sido examinado e identificado como positivo, conforme estabelecido aqui, mesmo que o paciente não tenha um ou mais sintomas da doença. É claro, métodos e usos da invenção podem ser praticados de 1 a 7, 7 a 14, 14 a 24, 24 a 48, 48 a 64 ou mais dias, meses ou anos depois de um paciente ter sido identificado como tendo a doença alvo do tratamento, com um ou mais sintomas da doença, ou tendo sido examinado e identificado como positivo, conforme estabelecido neste documento.

[0124] Uma "forma de dosagem unitária", como aqui usado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o paciente ser tratado; cada unidade contém uma quantidade pré- determinada, opcionalmente, em associação com um transportador farmacêutico (excipiente, diluente, agente de enchimento ou de veículo) que, quando administrada em uma ou mais doses, é calculada para produzir um efeito desejado (por exemplo, efeito profilático ou terapêutico). As formas de dosagem unitária podem estar dentro, por exemplo, de ampolas e frascos, que podem incluir uma composição líquida, ou uma composição em estado congelado a vácuo ou liofilizado; um transportador líquido estéril, por exemplo, pode ser adicionado antes da administração ou entrega in vivo. As formas de dosagem unitária individuais podem ser incluídas em kits ou recipientes de dose múltipla. As partículas rAAV e as suas composições farmacêuticas podem ser embaladas sob a forma de dosagem unitária única ou múltipla para facilitar a administração e uniformidade da dosagem.

[0125] Os pacientes podem ser testados para atividade proteica para determinar se tais pacientes são apropriados para o tratamento, de acordo com um método da invenção. Os pacientes também podem ser testados para quantidades de proteína de acordo com um método da invenção. Estes pacientes tratados podem ser monitorados periodicamente após o tratamento, por exemplo, a cada 1 a 4 semanas, 1 a 6 meses, 6 a 12 meses, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou mais anos.

[0126] Os pacientes podem ser testados para uma ou mais enzimas hepáticas para uma resposta adversa ou para determinar se tais pacientes são apropriados para o tratamento de acordo com um método da invenção. Os pacientes candidatos podem, portanto, ser testados para quantidades de uma ou mais enzimas hepáticas antes do tratamento de acordo com um método da invenção. Os pacientes também podem ser testados para a quantidade de uma ou mais enzimas hepáticas após o tratamento de acordo com um método da invenção. Estes pacientes tratados podem ser monitorados periodicamente após o tratamento por elevação de enzimas hepáticas, por exemplo, a cada 1 a 4 semanas, 1 a 6 meses, 6 a 12 meses, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou mais anos.

[0127] Enzimas hepáticas exemplares incluem alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e lactato desidrogenase (LDH), mas outras enzimas indicadoras de danos hepáticos também podem ser monitoradas. Um nível normal destas enzimas na circulação é tipicamente definido como um intervalo que tem um nível superior, acima do qual o nível enzimático é considerado elevado, e, portanto, indicativo de lesão hepática. Uma faixa normal depende, em parte, dos padrões usados pelo laboratório clínico responsável pela realização do ensaio.

[0128] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos aqui.

[0129] Todas as patentes, pedidos de patentes, publicações e outras referências, citações GenBank e citações ATCC aqui citados são incorporados por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá.

[0130] Vários termos relacionados às moléculas biológicas da invenção são usados acima e também em todo o relatório descritivo e reivindicações.

[0131] Todas as características aqui divulgadas podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica divulgada no relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que serve a uma mesma finalidade, equivalente ou similar. Assim, salvo indicação expressa em contrário, características divulgadas são um exemplo de um gênero de características equivalentes ou similares.

[0132] Conforme usado na presente invenção, as formas singulares "um(a)", "e" e "o(a)" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um ácido nucleico" inclui uma pluralidade de tais ácidos nucleicos, a referência a "um vetor" inclui uma pluralidade de tais vetores, e a referência a "um vírus" ou "partícula" inclui uma pluralidade de tais vírus/partículas.

[0133] Conforme usado na presente invenção, todos os valores numéricos ou faixas numéricas incluem números inteiros dentro de tais faixas e frações dos valores ou os números inteiros dentro das faixas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, referência a 80% ou mais de identidade, inclui 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% etc., bem como 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5%, etc., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5%, etc., e assim por diante.

[0134] A referência a um número inteiro com mais (maior) ou menos que inclui qualquer número maior ou menor que o número de referência, respectivamente. Assim, por exemplo, uma referência a menos de 100, inclui 99, 98, 97, etc. até o número um (1); e menos de 10, inclui 9, 8, 7, etc. até o número um (1).

[0135] Conforme usado na presente invenção, todos os valores ou faixas numéricos incluem frações dos valores e números inteiros dentro dessas faixas e frações dos números inteiros dentro de tais faixas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a uma faixa numérica, tal como 1 a 10 inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., e assim por diante. Por conseguinte, a referência a uma faixa de 1 a 50 inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, etc., até 50 inclusive, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, etc., e assim por diante.

[0136] A referência a uma série de faixas inclui faixas que combinam os valores dos limites de diferentes faixas dentro da série. Assim, para ilustrar, a referência a uma série de faixas, por exemplo, de 1 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 75, 75 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 400, 400 a 500, 500 a 750, 750 a 850, inclui faixas de 1 a 20, 1 a 30, 1 a 40, 1 a 50, 1 a 60, 10 a 30, 10 a 40, 10 a 50, 10 a 60, 10 a 70, 10 a 80, 20 a 40, 20 a 50, 20 a 60, 20 a 70, 20 a 80, 20 a 90, 50 a 75, 50 a 100, 50 a 150, 50 a 200, 50 a 250, 100 a 200, 100 a 250, 100 a 300, 100 a 350, 100 a 400, 100 a 500, 150 a 250, 150 a 300, 150 a 350, 150 a 400, 150 a 450, 150 a 500, etc.

[0137] A invenção é geralmente divulgada aqui usando linguagem afirmativa para descrever as inúmeras modalidades e aspectos. A invenção também inclui especificamente modalidades em que determinado assunto é excluído, total ou parcialmente, tais como substâncias ou materiais, etapas e condições de método, protocolos ou procedimentos. Por exemplo, em certas modalidades ou aspectos da invenção, materiais e/ou etapas de métodos são excluídos. Assim, mesmo que a invenção geralmente não seja aqui expressa em termos do que a invenção não inclui, aspectos que não são expressamente excluídos na invenção, são, no entanto, aqui divulgados.

[0138] Um número de modalidades da invenção foi descrito. No entanto, um técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção, pode fazer várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Assim, os exemplos a seguir são destinados a ilustrar, mas não limitar o escopo da invenção reivindicada de qualquer forma.

EXEMPLOS

[1] Os seguintes são exemplos representativos não limitantes de resinas de afinidade (GE Healthcare) que podem ser usados para gerar uma matriz de afinidade de anticorpo específico de capsídeo AAV. As proteínas de capsídeo AAV contêm aminoácidos que podem ser reticulados ("cross linked") com os vários meios cromatográficos descritos a seguir. Materiais comparáveis e/ou adequados de outros fabricantes de resinas de afinidade aos quais os capsídeos AAV podem estar ligados também podem ser usados ou fabricados em conformidade. EXEMPLO 1 Fluxo Rápido de Sepharose 4 Ativado por CNBr ("CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow")

[2] O Fluxo Rápido de Sepharose 4 Ativado por CNBr é um meio cromatográfico pré-ativado para acoplar ligantes grandes contendo amino.  Meio Bioprocess ativado por CNBr ("CNBr-activated BioProcess medium"), concebido para o acoplamento de ligantes grandes contendo amino.  Acoplamento rápido e eficiente  Esta resina permite a ligação multi-pontos de ligantes proteicos que minimiza a fuga de ligantes  Meio BioProcess suportado para aplicações industriais e bem estabelecido em processos aprovados

[3] O Fluxo Rápido de Sepharose 4 ativado por CNBr baseia-se na plataforma de Fluxo Rápido de Sepharose estabelecida. A resina é composta por esferas de agarose reticuladas ("cross-linked") a 4% que foram pré- ativadas com brometo de cianogênio. O Fluxo Rápido de Sepharose 4 ativado por CNBr é concebido para a fixação multiponto de ligantes de proteína contendo grupos amino.

[4] A preparação e utilização de meios de cromatografia de afinidade por acoplamento de ligantes bioespecíficos a Fluxo Rápido de Sepharose 4 Ativado por CNBr é uma abordagem amplamente usada e bem documentada, com um procedimento de acoplamento fácil, rápido e eficiente.

[5] O Fluxo Rápido de Sepharose 4 Ativado por CNBr está disponível numa faixa de diferentes tamanhos de embalagem a granel e formatos pré- embalados convenientes para um fácil aumento de escala e desenvolvimento do processo.

[6] Como membro da gama de meios de BioProcess, o Fluxo Rápido de Sepharose 4 Ativado por CNBr atende as demandas industriais com segurança de fornecimento e suporte técnico e regulatório abrangente. EXEMPLO 2 Tiol Sepharose 4B Ativada ("Activated Thiol Sepharose 4B")

[7] Tiol Sepharose 4B Ativada é um meio utilizado para a imobilização reversível de moléculas que contêm grupos tiol em condições moderadas. Optimizado para a imobilização de grandes moléculas  Acoplamento reversível de proteínas e biomoléculas grandes com grupos tiol à Sefarose 4B através de um braço de espaçamento de glutationa  O ligante é um dissulfureto misto formado entre o dissulfureto de 2,2'-dipiridilo e a glutationa acoplada à Sefarose 4B ativada por CNBr.  Adequado para cromatografia covalente de grandes moléculas, tais como enzimas e ácidos nucleicos  O gel também reage com íons de metal pesado e com halogenetos de alquilo e arilo. Reações de adição ocorrem com compostos contendo ligações C=O, C=C, e N=N  Separar as proteínas que contêm tiol das proteínas que não contêm tiol

[8] A Tiol Sepharose 4B Ativada é um dissulfureto misto formado entre o dissulfureto de 2,2'-dipiridilo e a glutationa acoplada à Sefarose 4B ativada por CNBr. A Tiol Sepharose 4B Ativada reage com solutos contendo grupos tiol em condições moderadas de modo a formar dissulfuretos mistos. Esta reação forma a base da cromatografia covalente e um procedimento para imobilizar tiol contendo biomoléculas.

EXEMPLO 3 EAH Sepharose 4B

[9] O meio pré-ativado de EAH Sepharose é usado para acoplar compostos contendo grupos carboxilo para Sepharose 4B através de acoplamento à base de carbodiimida através de um braço espaçador de 11 átomos.  O acoplamento estável à base de carbodiimida de grupos carboxilo à Sefarose 4B através de um braço hidrofílico de 11 átomos permite acoplamento muito estável EXEMPLO 4 Sepharose 6B ativada por Epóxi ("Epoxy-Activated Sepharose 6B")

[10] A Sepharose 6B ativada por Epóxi é um meio pré-ativado para a imobilização de vários ligantes, incluindo açúcares através do acoplamento de grupos hidroxi, amino ou tiol no ligante à Sepharose 6B através de um braço espaçador hidrofílico de 12 átomos.  A Sepharose 6B ativada por Epóxi pode ser usada para acoplar açúcares e outros carboidratos através de ligações de éter estáveis a grupos hidroxila.

[11] A Sepharose 6B ativada por Epóxi é um meio pré-ativado para a imobilização de vários ligantes. A Sepharose 6B ativada por Epóxi pode ser usada para acoplar açúcares e outros carboidratos através de ligações de éter estáveis a grupos hidroxila. Outros ligantes podem ser acoplados através de grupos hidroxila, amino ou tiol. O meio tem um longo braço de espaçamento hidrofílico, o que o torna particularmente adequado para a imobilização de pequenas moléculas. A Sepharose 6B ativada por Epóxi é formada pela reação da Sepharose 6B com 1,4-bis(2,3-epóxi-propoxi-)butano.

EXEMPLO 5 Capsídeo AAV purificado, pode ser essencialmente do grau GMP

[12] Uma característica típica da proteína de capsídeo AAV a ser usada em combinação com uma resina ou matriz apropriada para gerar uma matriz de afinidade de capsídeo AAV é a pureza. A geração de AAV na cultura de células é complexa, e a sua separação dos abundantes componentes não AAV (impurezas e contaminantes) co-gerados é importante. Especificamente, as partículas de capsídeo AAV são purificadas a partir de impurezas derivadas de células de produção e de meios de cultura de células. A presença de elevados níveis de impureza na preparação de capsídeo AAV usado para gerar matrizes de afinidade resultará em menor eficiência e menor especificidade de ligação quando usada no contexto da aférese. Uma purificação exemplar das partículas AAV está sob as Boas Práticas de Fabricação (GMP) para produtos parenterais humanos, uma vez que a matriz de afinidade prevista estará em contato com produto sanguíneo de paciente humano no processo de plasmaferese.

EXEMPLO 6 Material de capsídeo AAV para a produção da matriz de afinidade

[13] Uma forma típica de material de capsídeo para uso na geração de uma matriz de afinidade de capsídeo AAV para plasmaferese é a de capsídeos "vazios" AAV, que são partículas AAV que não possuem um transgene. O capsídeo vazio de AAV ligado à matriz de afinidade seria previsto para exibir os mesmos epítopos de superfície que o vetor AAV correspondente.

[14] Por exemplo, o capsídeo vazio altamente purificado derivado do capsídeo AAV variante SEQ ID NO:1 ou 2 poderia ser acoplado à resina Sepharose ativada por CNBr. Em um paciente humano com hemofilia A grave e com um grau de anticorpo AAV-SEQ ID NO:1 ou 2 de 1:100, plasmaferese suficiente como aqui definido com matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV preparada usando capsídeos vazios de AV-SEQ ID

NO:1 ou 2 altamente purificados é previsto que se reduza o grau de anticorpo AAV-SEQ ID NO:1 ou 2 do paciente, por exemplo, para 1:1. Menos de cerca de doze horas ou tipicamente menos de cerca de seis horas após a conclusão do protocolo de plasmaferese, esse paciente seria então tratado com AAV-AAV- SEQ ID NO:1 ou 2 expressando um Fator VIII de coagulação humana, alcançando transferência genética eficiente e, subsequentemente, expressando níveis terapêuticos de FVIII circulante. Com graus de AAV iniciais superiores (maiores que 1:100), o tratamento após protocolo de plasmaferese ocorre mais cedo.

[15] Alternativamente, os capsídeos vazios preparados para qualquer outro sorotipo de capsídeo AAV conhecido ou variante de capsídeo poderiam similarmente ser usados para reduzir os graus de anticorpo para esse sorotipo de capsídeo AAV específico ou variante de capsídeo, permitindo assim a transferência de gene eficiente com um vetor AAV correspondente que expressa qualquer transgene terapêutico.

[16] Ainda em outra alternativa, qualquer uma das proteínas de capsídeo AAV VP1, VP2 e VP3 de qualquer sorotipo de capsídeo AAV que ocorre naturalmente ou variante de capsídeo AAV sintética, usada isoladamente ou em combinação em qualquer estequiometria, poderia similarmente ser usada para reduzir os graus de anticorpo AAV para permitir a transferência genética eficiente com um vetor viral correspondente expressando qualquer gene terapêutico.

EXEMPLO 7 Outros vetores virais materiais para a produção da matriz de afinidade

[17] Alternativamente, outro vetor viral ou proteína de vetor viral, a partir de vírus que podem ser usados para efetuar a transferência de gene, pode ser usado para desenvolver uma matriz de afinidade de anticorpo e implementar os métodos estabelecidos aqui. Como exemplo, os vírus são das seguintes famílias de vírus: Picornaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paromyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Etroviridae, Papoviridae, Adenoviridae, Parvoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae, podem ser usados para reduzir os respectivos graus de anticorpo de vírus para permitir a eficiente transferência de gene com um correspondente vetor que expressa qualquer gene terapêutico. EXEMPLO 8 Re-administração e/ou administração em série de vetores para benefício terapêutico

[18] Para além da inibição da transferência terapêutica de gene por vetores AAV por anticorpos pré-existentes que surjam naturalmente na população humana, os anticorpos específicos de capsídeo podem aumentar após a administração dos próprios vetores AAV (e de outros vetores, como aqui se indica). O uso de plasmaferese de afinidade de capsídeo AAV pode similarmente reduzir os anticorpos de capsídeo AAV causados por uma administração prévia de um vetor de terapia genética, permitindo uma transferência de gene eficiente após a re-administração. Este processo poderia ser realizado em série durante um longo período de tempo para aumentar gradualmente o nível de expressão genética terapêutica em pacientes humanos. Por exemplo, acredita-se que o nível sanguíneo de fator de coagulação FVIII após a transferência de gene baseada em AAV em uma criança jovem com hemofilia A grave irá diminuir gradualmente à medida que a criança cresce. A re-administração periódica durante a infância e a adolescência usando o protocolo de plasmaferese de afinidade de capsídeo AAV, divulgado aqui, permitirá a manutenção dos níveis terapêuticos de FVIII à medida que a criança cresce e até a idade adulta. EXEMPLO 9 Cálculo da taxa de recuperação de anticorpos Semi-vida de IgG (humana) = 20 dias

A concentração de IgG no soro humano varia entre 8 a 18 mg/ml, irá usar 12 mg/mlm Fórmula de decaimento expo HID = No (1/2)t/t 1/2 em que t em dias Demonstração da fórmula: H(0) = 12 (1/2)0/20 = 12(1) = 12 mg/ml H(20) = 12 (1/2)20/20 = 12(1/2) = 6 mg/ml N = perda de IgG 1d = 24h N (t = 1) = 12 (1/2)1/20 = 12 (0,5)0,05 = 11.591 mg/ml 0,5d = 12h N (0,5) = 12 (1/2)0,5/20 = 12 (0,5)0,025 = 11.794 mg/ml 0,25d = 6h N (0,25) = 12 (1/2)0,25/20 = 12 (0,5)0,0125 = 11.896 mg/ml = 3h H (0,125) = 12 (1/2)0,125/20 = 12 (0,5)0,00625 = 11.948 mg/ml =1h N (0,042) = 12 (1/2)^0,042/20 = 12 (0,5)^0,00208 = 11.983 mg/ml

12 mg/ml em estado estacionário significa uma taxa de síntese igual Síntese de IgG 24h 12 – 11.591 = 0,409 mg/m2 ÷ 12 = 3,41% 12h 12 – 11.794 = 0,206 mg/m2 ÷ 12 = 1,72% 6h 12 – 11.896 = 0,104 mg/m2 ÷ 12 = 0,87% 3h 12 – 11.948 = 0,052 mg/m2 ÷ 12 = 0,43% 1h 12 – 11.983 = 0,017 mg/ml / 12 = 0,15% Assuma que a taxa de síntese se distribui de forma comparável em todos os IgGs um IgG de capsídeo AAV com início a 1:100 reduzido para 1:1 pela plasmaferese de capsídeo se recupera para 1:4,4 às 24 horas 1:0,7 às 12 horas 1:1,9 às 6 horas

1:1,43 às 3 horas 1:1,15 à 1 hora

[19] A tabela 1 mostra uma gama mais ampla de taxas de recuperação do grau em função dos graus iniciais de IgG de capsídeo AAV (a saber, 1:10. 1:230, 1:100 como acima, 1:300, 1:1000, 1:3000, 1:10000). Em particular, a Tabela 1 mostra que pacientes com um grau de anticorpo AAV de até 1:1000, podem ser administrados com um vetor AAV para terapia genética dentro de cerca de 1 hora após a plasmaferese; pacientes com um grau de anticorpo AAV de até 1:300, podem ser administrados com um vetor AAV para terapia genética dentro de cerca de 3 horas após a plasmaferese; pacientes com um grau de anticorpo AAV de até 1:100, podem ser administrados com um vetor AAV para terapia genética dentro de cerca de 6 horas após a plasmaferese; pacientes com um grau de anticorpo AAV de até 1:100, podem também ser administrados com um vetor AAV para terapia genética dentro de cerca de 12 horas após a plasmaferese; e pacientes com um grau de anticorpo AAV de até 1:30, podem ser administrados com um vetor AAV para terapia genética dentro de cerca de 24 horas após a plasmaferese. Tabela 1 Tempo após a plasmaferese (horas) Grau de Anticorpo AAV

EXEMPLO 9 Proteínas representativas do capsídeo AAV (VP1) Capsídeo AAV-SPK VP1 (SEQ ID NO:1) 1

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGY

KYLGPFNGLD 61

KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFG

GNLGRAVFQ 121

AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRL

NFGQTGDS 181

ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWH

CDSTWLGDRV 241

ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHC

HFSPRDWQ 301

RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLP

YVLGSA 361

HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNF

EFSYNFED 421

VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNN MSAQAKNW LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKD

DEERFFPSS 541

GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNA

APIVGAVNS 601

QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIK

NTPVPADP 661

PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNV

DFAVNTE 721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL Capsídeo AAV-LK03 VP1 (SEQ ID NO:2)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNAR GLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYN HADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPV DQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTS LGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ RLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLP YVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQM LRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGT TNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTA ASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDN VMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQD RDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTF SPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTV DTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento de um paciente que necessite de tratamento para uma doença causada por uma perda de função ou atividade de uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: a) remover, reduzir, esgotar, inibir, inativar ou capturar anticorpos de ligação AAV de um produto sanguíneo obtido do paciente por um processo compreendendo aférese; e b) administrar uma quantidade de um vetor vírus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína ou peptídeo que fornece ou complementa uma função ou atividade da proteína.

2. Método de tratamento de um paciente que necessite de tratamento para uma doença causada por um ganho de função, atividade ou expressão, de uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: a) remover, reduzir, esgotar, inibir, inativar ou capturar anticorpos de ligação AAV de um produto sanguíneo obtido do paciente por um processo compreendendo aférese; e B) administrar uma quantidade de um vetor vírus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que é transcrito num ácido nucleico que inibe, diminui ou reduz a expressão do ganho de função, atividade ou expressão da proteína.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o processo de aférese compreende uma matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV fixada ou imobilizada num substrato.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende um fragmento de capsídeo AAV ou capsídeo AAV fixado ou imobilizado num substrato que se liga aos anticorpos de ligação AAV no produto sanguíneo.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV imobilizada num substrato é disposta dentro de uma coluna, aparelho, câmara, dispositivo, filtro, cartucho, tubo com uma entrada e uma saída para remoção extracorpórea ou intracorpórea ou depleção de anticorpos de ligação AAV do produto sanguíneo após contato com a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende capsídeos vazios de AAV intactos, sintéticos ou não naturais ou que ocorrem naturalmente.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV inclui uma proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3 ou um fragmento da mesma.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende uma proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, sintética ou não natural ou que ocorre naturalmente.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende um monômero de proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, sintético ou não natural ou que ocorre naturalmente.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende um polímero de proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, sintético ou não natural ou que ocorre naturalmente.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, com 60% ou mais da identidade sequencial de uma proteína de capsídeo AAV sintética, não natural ou que ocorre naturalmente.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3 com 60% ou mais de identidade sequencial de uma proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3 selecionada a partir do grupo que consiste de proteínas de capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 VP1, VP2 e/ou VP3.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 12, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, com 60% ou mais da identidade sequencial de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende um anticorpo anti-idiotipo que se liga aos anticorpos de ligação AAV no produto sanguíneo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-idiotipo que se liga aos anticorpos de ligação AAV se liga às proteínas de capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2, ou um derivado ou aminoácido de substituição de proteína(s) de capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2.

16. Método, de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-idiotipo que se liga aos anticorpos de ligação AAV é um fragmento de anticorpo.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-idiotipo que se liga aos anticorpos de ligação AAV é um IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV é de grau GMP.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a lixiviação da matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV no produto sanguíneo obtido do paciente, se o produto sanguíneo for reintroduzido no paciente, não prejudica substancialmente o paciente.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de ligação AAV compreende um IgG, IgM, IgA ou IgD que se liga à proteína de capsídeo AAV.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o substrato e/ou coluna, aparelho, câmara, dispositivo, filtro, cartucho ou tubo é configurado a partir de plástico ou vidro.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, substrato e/ou coluna, aparelho, câmara, dispositivo, filtro, cartucho, tubo são estéreis.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que os anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo antes do processo de aférese são superiores a cerca de 1:100, em que 1 parte do produto sanguíneo diluído em 100 partes do tampão isotônico resulta em 50% de neutralização de AAV.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que os anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo antes do processo de aférese são superiores a cerca de 1:1000, em que 1 parte do produto sanguíneo diluído em 1000 partes do tampão isotônico resulta em 50% de neutralização de AAV.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que 20 a 50%, 50 a 75%, 75 a 90%, 90 a 95% ou 95% ou mais dos anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo são removidos.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que os anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo após o processo de aférese é inferior a cerca de 1:10, em que 1 parte do produto sanguíneo diluído em 10 partes do tampão isotônico resulta em 50% de neutralização de AAV.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que os anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo após o processo de aférese é inferior a cerca de 1:5, em que 1 parte do produto sanguíneo diluído em 5 partes do tampão isotônico resulta em 50% de neutralização de AAV.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a proporção de anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo após o processo de aférese é inferior a cerca de 1:4, em que 1 parte do produto sanguíneo diluído em 4 partes do tampão isotônico resulta em 50% de neutralização de AAV.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a proporção de anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo após o processo de aférese é inferior a cerca de 1:3, em que 1 parte do produto sanguíneo diluído em 3 partes do tampão isotônico resulta em 50% de neutralização de AAV.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a proporção de anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo após o processo de aférese é inferior a cerca de 1:2, em que 1 parte do produto sanguíneo diluído em 2 partes do tampão isotônico resulta em 50% de neutralização de AAV.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a proporção de anticorpos de ligação AAV presentes no produto sanguíneo após o processo de aférese é inferior a cerca de 1:1, em que 1 parte do produto sanguíneo diluído em 1 parte do tampão isotênico resulta em 50% de neutralização de AAV.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a totalidade ou uma parte do produto sanguíneo é reintroduzida ou reinfundida no paciente.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o paciente, após a etapa (b), recebe um produto sanguíneo de um doador.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 72 horas após a etapa (a).

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 48 horas após a etapa (a).

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 1 a 48 horas após a etapa (a).

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 36 horas após a etapa (a).

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 24 horas após a etapa (a).

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 1 a 24 horas após a etapa (a).

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 12 horas após a etapa (a).

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 6 horas após a etapa (a).

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 3 horas após a etapa (a).

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 30 minutos a 6 horas após a etapa (a).

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada dentro de cerca de 30 minutos a 3 horas após a etapa (a).

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que compreende ainda depois da etapa (a) mas antes da etapa (b) analisar uma amostra do paciente para a quantidade de anticorpos de ligação AAV presentes na amostra.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, após a etapa (b) analisar uma amostra do paciente para a quantidade de anticorpos de ligação AAV presentes na amostra.

47. Método, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que a amostra analisada do paciente é um produto sanguíneo.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que o produto sanguíneo é plasma.

49. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 48, caracterizado pelo fato de que o paciente tem uma doença pulmonar (por exemplo, fibrose cística), um distúrbio de sangramento (por exemplo, hemofilia A ou hemofilia B, com ou sem inibidores), talassemia, um distúrbio sanguíneo (por exemplo, anemia), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica (ALS), epilepsia, doenças de armazenamento lisossômico, distúrbios de acúmulo de cobre ou ferro (por exemplo, doença de Wilson ou de Menkes), deficiência de lipase de ácido lisossômico, uma desordem neurológica ou neurodegenerativa, câncer, diabetes tipo 1 ou tipo 2, doença de Gaucher, doença de Hurler, deficiência de adenosina desaminase, um defeito metabólico (por exemplo, doenças de armazenamento de glicogênio), uma doença degenerativa da retina (como deficiência de RPE65, choroideremia e outras doenças dos olhos), uma doença de órgãos sólidos (por exemplo, cérebro, fígado, rins, coração), ou uma doença infecciosa viral (por exemplo, hepatite B e C, HIV, etc.), bacteriana ou fúngica.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que a doença é causada pela expressão perdida ou reduzida de um gene que codifica a proteína.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que a doença é um distúrbio de coagulação do sangue.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que a doença é hemofilia A, pacientes de hemofilia A com anticorpos inibitórios, hemofilia B, uma deficiência em qualquer Fator de coagulação: VII, VIII, IX e X, XI, V, XII, II, fator de Von Willebrand, ou uma deficiência combinada de FV/FVIII, ou talassemia, deficiência de vitamina K epóxido redutase C1 ou deficiência de gama- carboxilase.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que a doença é anemia,

sangramento associado com trauma, lesão, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular disseminada (DIC); sobre-anticoagulação associada com heparina, heparina de baixo peso molecular, pentassacarídeo, varfarina, antitrombóticos de moléculas pequenas (i.e. inibidores de FXa); e distúrbios plaquetários, tais como, síndrome de Bernard Soulier, thromblastemia Glanzman, ou deficiência de pool de armazenamento.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que a doença afeta ou se origina no sistema nervoso central (CNS).

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença neurodegenerativa.

56. Método, de acordo com as reivindicações 54 ou 55, caracterizado pelo fato de que a doença neurodegenerativa ou CNS é doença de Alzheimer, doença de Huntington, ALS, hemiplegia espástica hereditária, esclerose lateral primária, atrofia muscular espinhal, doença de Kennedy, uma doença de repetição de poliglutamina, ou doença de Parkinson.

57. Método, de acordo com as reivindicações 55 ou 56, caracterizado pelo fato de que a doença neurodegenerativa ou CNS é uma doença de repetição de poliglutamina.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a doença de repetição da poliglutamina é uma ataxia espinocerebelar (SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7 ou SCA17).

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 58, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste de insulina, glucagon, hormônio do crescimento (GH), hormônio da paratireóide (PTH), fator de liberação do hormônio do crescimento (GRF), hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), gonadotrofina coriônica humana

(hCG), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiopoietinas, angiostatina, fator estimulante de colônias de granulócitos (GCSF), eritropoietina (EPO), fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF), fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento de fibroblasto ácido (aFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de transformação α (TGFa), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fatores I e II de crescimento de insulina (IGF-I e IGF-II), TGFß, activinas, inibinas, proteína morfogênica óssea (BMP), fator de crescimento do nervo (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 e NT4/5, fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico derivado da linha celular glial (GDNF), neurturina, agrina, netrina-1 e netrina-2, fator de crescimento de hepatócito (HGF), efrinas, noggin, sonic hedgehog e tirosina hidroxilase.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 58, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste de trombopoietina (TPO), interleucinas (IL1 até IL-17), proteína quimioatraente de monócitos, fator inibidor da leucemia, fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos, ligante Fas, fatores de necrose tumoral α e β, os interferons α, β, e γ, fator de células-tronco, ligante flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, imunoglobulinas quiméricas, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única, receptores de célula T, receptores de células T quiméricos, receptores de célula T de cadeia única, moléculas MHC de classe I e classe II.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 58, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica CFTR (proteína reguladora transmembranar de fibrose cística), um fator de coagulação do sangue (coagulação) (Fator XIII, Fator IX, Fator VIII, Fator X, Fator VII, Fator VIIa, proteína C, etc.) um ganho de função do fator de coagulação do sangue, um anticorpo, proteína 65 kDa específica do epitélio pigmentar da retina (RPE65), eritropoietina, receptor de LDL,

lipoproteína lipase, ornitina transcarbamilase, β-globina, α-globina, espectrina, α-antitripsina, adenosina deaminase (ADA), um transportador de metal (ATP7A ou ATP7), sulfamidase, uma enzima envolvida na doença de armazenamento lisossômico (ARSA), hipoxantina guanina fosforibosil transferase, β-25 glucocerebrosidase, esfingomielinase, hexosaminidase lisossômica, cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, um hormônio, um fator de crescimento, fator de crescimento 1 ou 2 semelhante à insulina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento do nervo, fator neurotrófico -3 e -4, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator de crescimento derivado da glia, fator de crescimento de transformação α e β, uma citocina, α-interferon, β-interferon, interferon-γ, interleucina-2, interleucina- 4, interleucina-12, fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos, linfotoxina, um produto de gene suicida, vírus do herpes simplex timidina quinase, citosina deaminase, toxina da difteria, citocromo P450, desoxicitidina quinase, fator de necrose tumoral, uma proteína resistente a fármacos, uma proteína supressora de tumor (por exemplo, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel– Lindau (VHL), adenomatose polipose coli (APC)), um peptídeo com propriedades imunomoduladoras, hCDR1 ou proteína Tregitope ou peptídeo imunogênico ou tolerogênico, insulina, glucocinase,guanilato ciclase 2D (LCA- GUCY2D), proteína de escolta Rab 1 (Coroideremia), LCA 5 (LCA- Lebercilina),ornitina cetoácido aminotransferase (Atrofia Girata), Retinosquisina 1 (Retinosquise ligada ao X), USH1C (Síndrome de Usher 1C), Retinite pigmentosa ligada ao X GTPase (XLRP), MERTK (Formas AR de RP: retinite pigmentosa), DFNB1 (surdez Conexina 26), ACHM 2, 3 e 4 (Acromatopsia), PKD-1 ou PKD-2 (doença renal policística), TPP1, CLN2, um produto de gene implicado em doenças de armazenamento lisossômico (por exemplo, sulfatases, N-acetilglucosamina-1-fosfato-transferase, catepsina A, GM2-AP, NPC1, VPC2, uma proteína ativadora esfingolipídica, um ou mais de nuclease de dedo de zinco para edição de genoma, ou seqüências de doadores usadas como modelos de reparo para edição de genoma.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 58, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica um ácido nucleico inibidor.

63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 58, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibitório é selecionado a partir do grupo que consiste em um siRNA, uma molécula antisense, miRNA, RNAi, uma ribozima e um shRNA.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ácido nucleico liga-se a um gene patogênico, uma transcrição de um gene patogênico, ou uma transcrição de gene associada a uma doença de repetição de polinucletídeo, um gene huntingtina (HTT), um gene associado com atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (atrofina 1, ATN1), receptor de andrógeno no cromossomo X em atrofia muscular espinobulbar, Ataxina-1, -2, -3 e -7 humana, canal de cálcio dependente de tensão Cav2.1 P/Q é codificado pelo (CACNA1A), proteína de ligação a TATA, Ataxina 8 vertente oposta, também conhecido como ATXN8OS, proteína serina/treonina fosfatase 2A 55 kDa de subunidade reguladora B de isoforma beta em ataxia espinocerebelar (tipo 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), FMR1 (retardo mental X frágil 1) na síndrome do X frágil, FMR1 (retardo mental X frágil 1) na síndrome de ataxia/tremor associada à X frágil, FMR1 (retardo mental X frágil 2) ou membro de família 2 AF4/FMR2 fem retardo metal XE frágil; Miotonina-proteína quinase (MT-PK) na distrofia miotônica; Frataxina na ataxia de Friedreich; um mutante do gene de superóxido dismutase 1 (SOD1) na esclerose lateral amiotrófica; um gene envolvido na patogênese da doença de Parkinson e/ou doença de Alzheimer; apolipoproteína B (APOB) e proproteína convertase subtilisina/cexina tipo 9 (PCSK9), hipercolesterolemia; Tat de HIV, gene de transcrição de transativador de vírus de imunodeficiência humana, na infecção pelo HIV; TAR de HIV, TAR de HIV, gene de elemento de resposta de transativador de vírus de imunodeficiência humana na infecção pelo HIV; receptor de quimiocina C-C

(CCR5) na infecção pelo HIV; proteína nucleocapsídica de vírus sarcoma Rous (RSV) na infecção pelo VRS, microRNA específico de fígado (miR-122) na infecção pelo vírus da hepatite C; p53, lesão renal aguda ou função retardada do enxerto de transplante de rim ou insuficiência renal aguda de lesão renal; malignidades sólidas metastáticas ou recorrentes antecipadamente de proteína quinase N3 (PKN3); LMP2, LMP2, também conhecido como proteassoma subunidade beta-tipo 9 (PSMB 9), melanoma metastático; LMP7, também conhecido como proteassoma subunidade beta-tipo 8 (PSMB 8), melanoma metastático; MECL1, também conhecido como proteassoma subunidade beta- tipo 10 (PSMB 10), melanoma metastático; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em tumores sólidos; proteína do fuso de cinesina em tumores sólidos, CLL/linfoma (BCL-2) de células B supressora de apoptose na leucemia mielóide crônica; ribonucleotídeo redutase M2 (RRM2) em tumores sólidos; Furina em tumores sólidos; quinases do tipo polo ("polo-like") (PLK1) em tumores de fígado, o diacilglicerol aciltransferase 1 (DGAT1) na infecção por hepatite C, beta-catenina na polipose adenomatosa familiar; receptor adrenérgico beta2, glaucoma; RTP801/Redd1, também conhecida como proteína 4 de transcrição indutora de dano DAN, em edema macular diabético (DME) ou degeneração macular relacionada à idade; receptor I do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR1) na degeneração macular relacionada à idade ou neivascularização coróide, caspase 2 em neuropatia óptica isquêmica não arterítica; proteína mutante Queratina 6A N17K em paquioníquia congênita; sequências de gene/genoma do vírus influenza A na infecção por influenza; sequências de gene/genoma de coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS) na infecção por SARS; sequências de gene/genoma de vírus sincicial respiratório na infecção por vírus sincicial respiratório; sequência de gene/genoma do filovírus Ebola na infecção por Ebola; sequências de gene/genoma do vírus de hepatite B e C na infecção por hepatite B e C; sequências de gene/genoma do vírus do herpes simplex (HSV) na infecção por HSV; sequências de gene/genoma do vírus de coxsacki B3 na infecção por vírus de coxsacki B3; silenciamento de um alelo patogênico de um gene (silenciamento específico de alelo) como a torsina A (TOR1A) na distonia primária, alelo pan-classe I e alelo HLA específicos em transplante; ou gene de rodopsina mutante (RHO) em retinite pigmentosa hereditária autossômica dominante (adRP).

65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica uma nuclease de edição de genes.

66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a nuclease de edição de genes compreende uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou uma nuclease baseada em efetor do tipo ativador de transcrição (TALEN).

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica um CRISPR-Cas9 Tipo II funcional; e/ou uma sequência de RNA guia; e/ou uma sequência de ácido nucleico doadora para correção ou substituição de um gene alvo.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) e/ou a etapa (b) são realizadas duas ou mais vezes.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizado pelo fato de que o paciente é um humano.

70. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV imobilizada num substrato disposto numa coluna, aparelho, câmara, dispositivo, filtro, cartucho, tubo com uma entrada e uma saída para remoção ou depleção extracorpórea ou intracorpórea de anticorpos de ligação AAV de um produto sanguíneo após contato com a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV.

71. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que compreende capsídeos vazios de AAV intactos, sintéticos ou não naturais ou que ocorrem naturalmente.

72. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3 ou um fragmento das mesmas.

73. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende uma proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, sintética ou não natural ou que ocorre naturalmente.

74. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende um monômero de proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, sintético ou não natural ou que ocorre naturalmente.

75. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende um polímero de proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, sintético ou não natural ou que ocorre naturalmente.

76. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, com 60% ou mais da identidade sequencial de uma proteína de capsídeo AAV sintética, não natural ou que ocorre naturalmente.

77. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3 com 60% ou mais de identidade sequencial de uma proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3 selecionada a partir do grupo que consiste de proteínas de capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 VP1, VP2 e/ou VP3.

78. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende proteína de capsídeo AAV VP1, VP2 e/ou VP3, com 60% ou mais da identidade sequencial de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

79. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV compreende um anticorpo anti-idiotipo que se liga aos anticorpos de ligação AAV no produto sanguíneo.

80. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 79, em que o anticorpo anti-idiotipo que se liga aos anticorpos de ligação AAV se liga à(s) proteína(s) de capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2, ou um derivado ou aminoácido de substituição de proteína(s) de capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2.

81. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti- idiotipo que se liga aos anticorpos de ligação AAV é um fragmento de anticorpo.

82. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti- idiotipo que se liga aos anticorpos de ligação AAV é um IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD.

83. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 82, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV é de grau GMP.

84. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 82, caracterizada pelo fato de que a lixiviação da matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV num produto sanguíneo obtido de um paciente, se o produto sanguíneo for reintroduzido no paciente, não prejudica substancialmente o paciente.

85. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 82, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de ligação AAV compreende um IgG, IgM, IgA ou IgD que se liga à proteína de capsídeo AAV.

86. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 82, caracterizada pelo fato de que o substrato e/ou coluna, aparelho, câmara, dispositivo, filtro, cartucho ou tubo é configurado a partir de plástico ou vidro.

87. Matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 82, caracterizada pelo fato de que a matriz de afinidade de anticorpo de ligação AAV, substrato e/ou coluna, aparelho, câmara, dispositivo, filtro, cartucho, tubo são estéreis.