KR20240030592A - 인비보 세포외 신경다발절 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법 - Google Patents

인비보 세포외 신경다발절 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인비보(in-vivo) 세포외(extracellular) 신경다발절(DRG) 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법을 개시한다.

Description

인비보 세포외 신경다발절 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법 {ELECTROPHYSIOLOGICAL EVALUATION METHOD FOR DRUG EFFICACY BASED ON IN VIVO EXTRACELLULAR DORSAL ROOT GANGLION RECORDING METHOD}
본 발명은 인비보(in-vivo) 세포외(extracellular) 신경다발절 (dorsal root ganglion; DRG) 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법에 대한 것으로서, 구체적으로는 활동전위 표준화된 발화율의 감소 정도 및/또는 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율의 증가 정도의 확인을 통해 약효(통증의 억제 효과)를 평가하는 방법에 관한 것이다.
이온채널 (ion channels)에 대한 연구가 활발해지고 이에 대한 중요한 생리적인 기능이 밝혀짐에 따라서 이온채널 매개의 질병을 치료하기 위한 시도가 점차 확대되어 가고 있다.
이온채널을 표적으로 한 치료제를 개발하기 위해서는 전기생리학 실험 장비 및 기술이 필수적이며, 그 방법에는 여러가지가 있을 수 있다.
전기생리학적 실험 기법은 패치클램프 기록법 (patch-clamp recording method), 세포 접촉 기록법 (cell-attached recording method), 세포외 기록법 (extracellular recording method) 등으로 구분될 수 있고, 기초연구 분야에서는 신경계 연구를 위한 목적으로 여러가지 전기생리학 기법을 이용하고 있다.
제약산업 분야에서는 전기생리학 플랫폼 (electrophysiological platform)을 도입하여 신약 개발 연구에 사용하는 것이 초기 단계이기 때문에 제약사 대부분이 현재까지 다양한 전기생리학 실험 기법을 구현하여 신약 개발에 이용하기는 어려운 실정이다.
통증 (pain)을 포함한 많은 신경계 질환 (neurological diseases) 치료제를 개발하기 위해서는 단순한 세포 수준에서부터 보다 복잡한 조직 수준, 그리고 살아있는 개체 수준까지 여러 단계에 거쳐 연구가 수행되어야 한다.
특히 이온채널과 관련이 있는 신경계 질환의 경우 전기생리학 기법을 이용한 연구가 필수적이라고 할 수 있지만, 화합물의 인비트로 (in-vitro) 활성 평가에만 전기생리학 기법을 사용하는 수준에 그치는 실정이다.
최근 한 논문을 보면, 마우스에서 전압 의존성 소디움 채널 1.7 (voltage-dependent sodium channel 1.7; Nav1.7)의 돌연변이를 유도하고, 이러한 돌연변이가 나타내는 기능적인 변화를 신경다발절(DRG)에서 인비보 세포외 신경다발절 기록법(in vivo extracellular DRG recording method)을 이용하여 전기생리학적으로 확인한 바 있다.
그러나, 이 연구는 단지 이온채널의 변이에 의해 나타나는 전기생리학적인 특성을 인비보(in-vivo) 수준에서 확인 한 것이기에 약물의 투여 방법, 약물의 효과를 판단하기 위한 기준, 그리고 약효 평가를 위한 세부 절차와 핵심 요소 등은 고려되어 있지 않아서 신약 개발을 위한 인비보 전기생리학적 약효 평가에는 그대로 적용될 수 없다는 문제가 있다.
본 발명자들은 기초 연구에만 사용되어져 온 인비보 세포외 신경다발절 기록법(in vivo extracellular DRG recording method)을 최초로 신약 개발을 위한 연구에 적용하여, 전기생리학적으로 살아있는 동물로부터 약물의 효과를 실시간으로 평가할 수 있도록 세부적인 방법을 수립하였고, 이 방법을 이용하여 실제 도출한 약효 평가 결과를 근거로 제시하고자 한다.
Neuron, Vol 109, Issue 9, Pages 1411-1582 (5 May 2021)
본 발명의 목적은 인비보(in-vivo) 세포외 신경다발절(DRG) 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법을 신약 개발 연구에 적용하여, 살아있는 동물에게 약물을 주입하고 전기생리학적으로 약물의 효과를 실시간으로 평가할 수 있도록 인비보(in-vivo) 세포외 신경다발절(DRG) 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기와 같은 수단을 개시한다.
일 양태에서, 본 발명은 인비보(in-vivo) 세포외(extracellular) 신경다발절(DRG) 기록법을 이용하여 전압 의존성 소디움 채널 억제제가 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제함으로써 세포막 전위가 활동전위를 유발하기 위한 역치(threshold)에 도달하는 것을 억제하거나 혹은 지연시켜 활동전위(AP)의 발생 빈도를 줄여주는 기전의 약물에 대한 약효를 평가하는 전기생리학적 약효 평가법에 있어서, (S1) 비히클(vehicle)을 투여하여 대조군 발화율(control firing rate) 구간의 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)를 측정하는 단계; (S2) 전압 의존성 소디움 채널 억제제를 투여하여 약물 발화율(firing rate) 구간의 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)를 측정하는 단계; 및 (S3) (S1)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율 대비 (S2)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율의 억제 정도를 통계적으로 확인하는 단계를 포함하고, 상기 (S1) 및 (S2)에서 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)은 하기 일반식 1을 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 약효 평가법을 제공한다.
[일반식 1]
상기 일반식 1에서, X는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)이고, A는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 전 각각의 von frey 그램 자극에 반응하여 발생되는 활동전위 발생 빈도(Hz)이며, B는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 직후인 전압 의존성 소디움 채널 억제제 발화율(firing rate) 구간의 각각의 von frey 그램 자극에 반응하여 발생되는 활동전위 발생 빈도(Hz)이다.
,
또 다른 양태에서, 본 발명은 인비보(in-vivo) 세포외(extracellular) 신경다발절(DRG) 기록법을 이용하여 전압 의존성 소디움 채널 억제제가 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제함으로써 세포막 전위가 활동전위를 유발하기 위한 역치(threshold)에 도달하는 것을 억제하거나 혹은 지연시켜 활동전위의 발생 빈도를 줄여주는 기전의 약물에 대한 약효를 평가하는 전기생리학적 약효 평가법에 있어서, (S1') 비히클(vehicle)을 투여하여 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)을 측정하는 단계; (S2') 전압 의존성 소디움 채널 억제제를 투여하여 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)을 측정하는 단계; 및 (S3') (S1')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율 대비 (S2')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율의 증가 정도를 통계적으로 확인하는 단계를 포함하고, 상기 (S1') 및 (S2')에서 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)은 하기 일반식 2를 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 약효 평가법을 제공한다.
[일반식 2]
상기 일반식 2에서, Y는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)이고, C는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 전 활동전위를 발생시키는 최소의 von frey 그램 수이며, D는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 활동전위를 발생시키는 최소의 von frey 그램 수이다.
본 발명에 따른 인비보(in-vivo) 세포외 신경다발절(DRG) 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법은 신약 개발을 위한 인비보 (in-vivo) 전기생리학적 약효 평가에 그대로 적용될 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 이하에서 설명할 내용으로부터 통상의 기술자에게 자명한 범위 내에서 다양한 효과들이 포함될 수 있다.
도 1은 경구투여를 위한 삽관술 진행 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 인비보 세포외 신경다발절(DRG) 기록법 (in vivo extracellular DRG recording method)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 인비보 세포외 신경다발절(DRG) 기록법 (in vivo extracellular DRG recording method)을 이용한 전기생리학적 약효평가 실시예를 설명한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 인비보 세포외 신경다발절(DRG) 기록법 (in vivo extracellular DRG recording method)을 이용한 전기생리학적 약효평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 인비보 세포외 신경다발절(DRG) 기록법 (in vivo extracellular DRG recording method)을 이용한 전기생리학적 약효평가 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어 (open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해 연구 개발하던 중, 종래 이온채널의 변이에 의해 나타나는 전기생리학적인 특성을 인비보(in-vivo) 수준에서 확인 한 것이기에 약물의 투여 방법, 약물의 효과를 판단하기 위한 기준, 그리고 약효 평가를 위한 세부 절차와 핵심 요소 등은 고려되어 있지 않아서 신약 개발을 위한 인비보(in-vivo) 전기생리학적 약효 평가에는 그대로 적용될 수 없는 문제를 해결하기 위해 연구 개발 하였고, 인비보(in-vivo) 세포외 신경다발절 기록법을 이용할 경우 전압 의존성 소디움 채널 억제제의 임상시험에서의 예측 가능성을 높일 수 있고, 생체를 통해 임상에 상당히 유사한 환경에서 채널 레벨에서의 약효를 평가할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
인비보( in-vivo ) 세포외 신경다발절(DRG) 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가법
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기와 같은 수단을 개시한다.
일 양태에서, 본 발명은 인비보(in-vivo) 세포외(extracellular) 신경다발절(DRG) 기록법을 이용하여 전압 의존성 소디움 채널 억제제가 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제함으로써 세포막 전위가 활동전위를 유발하기 위한 역치(threshold)에 도달하는 것을 억제하거나 혹은 지연시켜 활동전위(AP)의 발생 빈도를 줄여주는 기전의 약물에 대한 약효를 평가하는 전기생리학적 약효 평가법에 있어서, (S1) 비히클(vehicle)을 투여하여 대조군 발화율(control firing rate) 구간의 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)를 측정하는 단계; (S2) 전압 의존성 소디움 채널 억제제를 투여하여 약물 발화율(firing rate) 구간의 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)를 측정하는 단계; 및 (S3) (S1)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율 대비 (S2)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율의 억제 정도를 통계적으로 확인하는 단계를 포함하고, 상기 (S1) 및 (S2)에서 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)은 하기 일반식 1을 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 약효 평가법을 제공한다.
[일반식 1]
상기 일반식 1에서, X는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)이고, A는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 전 각각의 von frey 그램 자극에 반응하여 발생되는 활동전위 발생 빈도(Hz)이며, B는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 직후인 전압 의존성 소디움 채널 억제제 발화율(firing rate) 구간의 각각의 von frey 그램 자극에 반응하여 발생되는 활동전위 발생 빈도(Hz)이다.
, .
본 발명에서 사용하는 용어는 다음과 같다.
본 발명에 있어서, 용어 「인비보(in-vivo) 세포외 신경다발절 기록법」이란, 마취된 상태의 마우스를 대상으로 신경다발절 뉴런 및 신경다발절 필라멘트 영역에서 발생되는 활동전위를 미세유리 파이펫을 이용하여 세포 외부에서 기록하는 방법을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 「전압 의존성 소디움 채널 억제제」란, 특정 범위의 막전압에서 소디움 이온의 이동 통로가 되는 채널의 활성을 억제하는 저분자 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 「발생 빈도」란, 활동전위(action potential) 발생에 대한 빈번함의 정도를 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 「대조군 발화율(control firing rate)」이란, 비히클(vehicle)을 투여한 후 각각 30분, 60분, 90분, 120분째에 폰 프레이(von frey) 자극을 통해 발생되는 2초 동안의 활동전위 발생 구간으로 비히클(vehicle) 투여 직전 시점과 비교하여 차이값을 도출하기위한 비히클(vehicle) 효과 구간을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 「약물 발화율(firing rate) 구간」이란, 약물을 투여한 후 각각 30분, 60분, 90분, 120분째에 폰 프레이(von frey) 자극을 통해 발생되는 2초 동안의 활동전위 발생 구간으로 약물 투여 직전 시점과 비교하여 차이값을 도출하기위한 약효 구간을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 「표준화된 발화율(normalized firing rate, %)」이란, von frey 자극에 반응하여 약물을 투여하기 전을 기준으로 약물을 투여 후 발생되는 활동전위 발화율의 변화 값을 백분율로 환산한 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약효 평가법은 하기 조건을 만족하는 것일 수 있다.
조건 1: 상기 일반식 1에서 전압 의존성 소디움 체널 억제제를 투여한 경우, B 값은 A 값보다 작음 (B 값 < A 값)
조건 2: 상기 일반식 1에서, (S2)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율은 (S1)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율보다 작으며, 그 차이가 통계적으로 유의미한 경우임.
구체적으로, 통계적으로 유의미한 경우란, 아래에 설정한 통계적 검증을 통해 규정된 유의수준을 통과한 경우를 의미한다.
통계의 귀무가설(null hypothesis)은 "(S2)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율은 (S1)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율보다 작지 않다." 이며, 대립가설(alternative hypothesis)은 "(S2)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율은 (S1)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율보다 작다." 이다. 유의수준은 보편적 기준인 p-값(p-value)<0.05로, 상기 조건을 만족한 경우 귀무가설을 기각하여 유의수준을 통과한 것으로 규정하였으며, 일반적으로 설정하는 P<0.05, P<0.01, P<0.001 3단계로 나누어 유의수준의 정도를 구분하였다. 실험 결과들을 mean ± SEM으로 나타내고, 대조군(S1)과 실험군(S2)에서 얻어진 결과 값들은 이원배치 분산분석(Two-way ANOVA)을 이용하여 사후 검정(post-hoc)을 거쳐 쌍별 비교(pairwise comparison)를 프리즘에서 제공하는 통계분석프로그램을 이용하여 시행하였다.
상기 조건 1과 조건 2를 만족함으로써, 비히클(vehicle) 대비 활동전위 표준화된 발화율을 억제하여 이온채널의 활성을 변화시킴으로써 통증의 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 Nav1.7 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 1 mg/kg 내지 100 mg/kg를 투여할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 30 mg/kg를 투여할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 30 mg/kg을 투여할 때 상기 일반식 1에서, X, A 및 B는 하기와 같을 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
X: 0 % 내지 99.36306 %
A: 1.583333 내지 61.08333 Hz
B: 0 내지 49.83333 Hz
본 발명에 있어서, 약효 평가법은, (S1) 단계 이전에 설치류 마취 후 척수(spinal cord)의 특정 타겟 부위에서 세포외 기록법을 수행하기 위해 척수 클램퍼(spinal cord clamper)를 이용하여 척추뼈를 고정하는 단계를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 「설치류」란, 마우스 (mouse) 또는 랫드 (rat)와 관련된 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 von frey 그램은 1 내지 100 g일 수 있고, 구체적으로는 1 g, 2 g, 4 g, 10 g 및 100 g 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 일 양태로서, 본 발명은 인비보(in-vivo) 세포외(extracellular) 신경다발절(DRG) 기록법을 이용하여 전압 의존성 소디움 채널 억제제가 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제함으로써 세포막 전위가 활동전위를 유발하기 위한 역치(threshold)에 도달하는 것을 억제하거나 혹은 지연시켜 활동전위의 발생 빈도를 줄여주는 기전의 약물에 대한 약효를 평가하는 전기생리학적 약효 평가법에 있어서, (S1') 비히클(vehicle)을 투여하여 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)을 측정하는 단계; (S2') 전압 의존성 소디움 채널 억제제를 투여하여 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)을 측정하는 단계; 및 (S3') (S1')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율 대비 (S2')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율의 증가 정도를 통계적으로 확인하는 단계를 포함하고, 상기 (S1') 및 (S2')에서 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)은 하기 일반식 2를 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 약효 평가법을 제공한다.
[일반식 2]
상기 일반식 2에서, Y는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)이고, C는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 전 활동전위를 발생시키는 최소의 von frey 그램 수이며, D는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 활동전위를 발생시키는 최소의 von frey 그램 수이다.
본 발명에 있어서, 용어 「표준화된 활동전위의 역치값의 변화율 (normalized action potential threshold, %)」이란, 약물을 투여하기 전을 기준으로 약물을 투여 후 활동전위를 유발하기 위해 필요한 최소의 자극의 변화값을 백분율로 환산한 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약효 평가법은 하기 조건을 만족하는 것일 수 있다.
조건 3: 상기 일반식 2에서, 전압 의존성 소디움 체널 억제제를 투여한 경우, D 값은 C 값보다 큼 (D 값 > C 값)
조건 4: 상기 일반식 2에서, (S2')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율은 (S1')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율보다 크며, 그 차이가 통계적으로 유의미한 경우임.
구체적으로, 통계적으로 유의미한 경우란, 아래에 설정한 통계적 검증을 통해 규정된 유의수준을 통과한 경우를 의미한다.
통계의 귀무가설(null hypothesis)은 "(S2')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율은 (S1')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율보다 크지 않다." 이며, 대립가설(alternative hypothesis)은 "(S2')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율은 (S1')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율보다 크다." 이다. 유의수준은 보편적 기준인 p-값(p-value)<0.05로, 상기 조건을 만족한 경우 귀무가설을 기각하여 유의수준을 통과한 것으로 규정하였으며, 일반적으로 설정하는 P<0.05, P<0.01, P<0.001 3단계로 나누어 유의수준의 정도를 구분하였다. 실험 결과들을 mean ± SEM으로 나타내고, 대조군(S1')과 실험군(S2')에서 얻어진 결과 값들은 이원배치 분산분석(Two-way ANOVA)을 이용하여 사후 검정(post-hoc)을 거쳐 쌍별 비교(pairwise comparison)를 프리즘에서 제공하는 통계분석프로그램을 이용하여 시행하였다.
상기 조건 3과 조건 4를 만족함으로써, 비히클(vehicle) 대비 활동전위 표준화된 발화율을 억제함으로써 전압 의존성 소디움 채널 억제제의 투여로 인하여 활동전위(AP)를 발생시킬 수 있는 자극의 역치값을 높여줌으로써 통증의 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 Nav1.7 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 1 mg/kg 내지 100 mg/kg를 투여할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 30 mg/kg를 투여할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 30 mg/kg을 투여할 때 상기 일반식 2에서, Y, C 및 D는 하기와 같을 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
Y: 50 % 내지 1000 %
C: 0.04 내지 4 g
D: 0.02 내지 10 g.
본 발명에 있어서, 상기 약효 평가법은, (S1') 단계 이전에 설치류 마취 후 척수(spinal cord)의 특정 타겟 부위에서 세포외 기록법을 수행하기 위해 척수 클램퍼(spinal cord clamper)를 이용하여 척추뼈를 고정하는 단계를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 「설치류」란, 마우스 (mouse) 또는 랫드 (rat)와 관련된 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 실험동물(마우스)의 준비
본 발명에 따른 인비보(in-vivo) 세포외 신경다발절(DRG) 기록법을 이용한 전기생리학적 약효평가를 위해서, 마우스를 사용하였다. 사용된 마우스의 품종은 ICR이고, 10 마리를 사용하였으며, 성별은 숫컷이고, 대상 연령은 5~7주였으며, 초기 체중은 25~40 g 이였고, ㈜코아텍에서 공급받아 사용하였다.
마취는 멸균된 1cc 주사기(26 gage)를 이용하여 우레탄(urethane)을 1.2 g/kg 용량으로 복강 주사하여 신경다발절(DRG) 노출을 위한경정맥 삽관을 위한 준비를 하였다.
실시예 2: 경구투여를 위한 삽관
약물 투여 경로를 확보하기 위해서 경구 투여용 삽관술을 수행하였고, 도 2에 나타내었다. 도 2를 참조하면, 경구 투여용 삽관을 위한 의료용 폴리에틸렌 튜빙은 내경 0.011인치, 외경 0.024인치의 PE 10을 사용하였다. 마취된 마우스의 위(stomach)에 폴리에틸렌 튜빙(PE 10)을 위치시키기 위해서 경구 투여용 주사침(zonde for oral administration, 마우스용, 1.2 in X 1.9 mm, 20 G)를 가이드로 이용한 뒤 폴리에틸렌 튜빙(PE 10) 만을 남기고 경구 투여용 주사침을 다시 제거하였다.
실시예 3: 전기생리학적 기록을 위한 신경다발절(DRG) 노출
인비보(in-vivo) 세포외 신경다발절(DRG) 기록법을 이용한 전기생리학적 기록을 위해서 마우스 추궁절제술(laminectomy)을 수행하였다. 추궁절제술을 위해서 마우스 등쪽 표피 중심부를 절개하여 척추뼈를 노출시키고, 척수 클램퍼(spinal cord clamper)를 이용하여 마우스의 척추뼈를 움직이지 않도록 단단히 고정시켰다. 이때 척추뼈는 L4와 L5 척추뼈 사이로 척수(spinal cord)가 보이도록 각도를 조절하여 고정하였고, 이 중심부를 기준으로 미니 드릴(mini-drill)을 사용하여 바깥쪽으로 척수(spinal cord)와 연결된 신경다발절(DRG)이 보이도록 노출시켰다. 마우스의 배쪽 부분에는 온열 패드(heating pad)를 깔아 차가운 바닥과 직접 닿지 않고 체온이 유지되도록 하였으며, 양쪽 눈은 마르지 않도록 안연고(eye ointment)를 충분히 도포해주었다. 노출된 척수(spinal cord)와 신경다발절(DRG) 조직이 마르는 것을 예방하고, 실험 진행 시 주변 조직으로부터 발생되는 전기적인 노이즈를 차단하기 위해서 마우스 등쪽 표피의 사방을 실로 묶어 수조를 만든 뒤 미네랄 오일(mineral oil)로 채워주었다.
실시예 4: 인비보( in-vivo ) 세포외 신경다발절(DRG) 기록
인비보(in-vivo) 세포외 기록법(extracellular recording method)을 진행하기 위해, 직경 1 ~ 2 μm 정도의 미세한 유리 피펫을 사용하였다. 저항은 10~20 MΩ 정도 되는 유리 피펫을 풀러(puller)로 만들어 준비하였으며, 피펫 안에는 인공뇌척수액 (artificial cerebrospinal fluid; ACSF) 용액 (124 mM NaCl, 1.3 mM MgSO4, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 2.4 mM CaCl2, 및 10 mM glucose)을 채워서 기록에 사용하였다. 먼저 신경다발절(DRG)을 감싸고 있는 경막(dura)을 미세 유리 피펫을 이용하여 미세하게 찢어서 세포외 기록법(extracellular recording method)을 진행 시 피펫 끝의 손상을 예방하였고, 인공뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid; ACSF)이 채워진 피펫을 신경다발절(DRG) 영역에 위치시킨 후, 미세조작기(micromanipulator)를 이용하여 수직으로 피펫을 내려서 신경다발절(DRG) 뉴런(neuron)으로부터 발생되는 활동전위(AP)를 기록하였다. 무작위로 많은 신경다발절(DRG) 뉴런(neuron) 중 하나에 피펫을 근접시킨 후 자극에 대한 반응이 있는지를 확인하기 위하여 마우스의 무릎 또는 발바닥을 붓으로 쓸면서 활동전위(AP) 발생을 관찰하였다. 자극에 대한 반응이 없는 경우, 피펫을 이동시켜서 다른 신경다발절(DRG) 뉴런(neuron)에 위치시키고, 다시 붓(Brush)으로 자극하여 활동전위(AP)가 발생되는 뉴런(neuron)을 찾아 실험을 수행하였다 (도 2 참조).
실시예 5: 전기생리학적 약효 평가
약물의 효과를 평가하기 위해서 특정 그램(g)의 von frey 자극(1 g, 2 g, 4 g, 10 g, 100 g; 5초 간격으로 5초간 3번 자극)에 반응하여 신경다발절(DRG) 뉴런(neuron)에서 발생되는 활동전위(AP) 발화율의 변화값(발화율 테스트, firing rate test; FT)과 활동전위(AP) 유발에 필요한 최소 자극(von frey)의 크기에 대한 변화(역치 테스트, threshold test; TT)를 관찰하였다 (도 3 참조).
평가 약물은 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 (iN1011-N17, 30 mg/kg; 경구투여)로서, 다양한 전압 의존성 소디움 채널 중 특정 아형(Nav1.7)의 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제함으로써, 세포막 전위가 활동전위(AP)를 유발하기 위한 역치(threshold)에 도달하는 것을 억제 혹은 지연시켜 활동전위(AP)의 발생 빈도를 줄여주는 기전의 약물을 사용하였다.
[화학식 1]
약효 평가를 위한 첫번째 파라미터는 발화율의 변화값(FT)으로서, von frey 자극에 의한 활동전위(AP)의 발생 빈도 (Hz)를 사용하였다. 한 개체에서 iN1011-N17 (화학식 1 화합물, 실험군) 혹은 vehicle(대조군, 증류수(distilled water)에 1% Tween® 80 (polysorbate)와 0.5% Methylcellulose를 첨가한 것 만을 처리, 이하 동일)을 경구 투여하기 전 각각의 von frey 그램(g) 자극에 반응하여 발생하는 활동전위(AP)의 발생 빈도(before firing rate) 대비, iN1011-N17 (화학식 1 화합물, 실험군) 혹은 vehicle(대조군)의 경구 투여 후 30분, 60분, 90분 및 120분 뒤 von frey 그램(g) 자극에 반응하여 발생하는 활동전위(AP)의 발생 빈도(after firing rate; 30분, 60분, 90분 및 120분)의 변화를 측정하여 약효를 평가하였다 (도 3 및 도 4 참조).
또한 약효 평가를 위한 두번째 파라미터는 최소 자극(von frey)의 크기에 대한 변화(TT)로서, 활동전위(AP)를 발생시키는 최소한의 von frey 그램(g) 자극을 사용하였다. 즉, 한 개체에서 iN1011-N17 (화학식 1 화합물, 실험군) 혹은 vehicle(대조군)을 경구 투여하기 전 활동전위(AP) 발생에 필요한 최소의 von frey 자극에 대한 그램(before threshold)을 측정하고, 투여 후 각각 30분, 60분, 90분 및 120분 뒤 동일하게 활동전위(AP) 발생에 필요한 최소의 von frey 자극 그램(after threshold)을 측정하여 약효를 평가하였다 (도 3 및 도 5 참조).
[일반식 1]
상기 일반식 1에서, A와 B는 하기와 같다.
상기 일반식 1에서 X는 도 4의 결과값을 도출하기 위한 활동전위(AP) 발화율(normalized firing rate, %)이고, A는 비히클(vehicle) 또는 약물 투여 전 구간내 각각의 von frey 그램 자극에(1 g, 2 g, 4 g, 10 g, 100 g) 반응하여 발생되는 활동전위(AP) 발생 빈도(Hz)를 나타내며, B는 비히클(vehicle) 또는 약물 투여 후 30, 60, 90, 120분 구간내에서 각각의 von frey 그램 자극에(1 g, 2 g, 4 g, 10 g, 100 g) 반응하여 발생되는 활동전위(AP) 빈도(Hz)이다. 활동전위(AP)가 1초당 1회 발생한 경우 1 Hz이기 때문에, 2초 동안 각각의 von frey 자극에 의해 발생되는 3구간의 활동전위(AP) 개수의 평균값을 2로 나누어 각각의 구간내 von frey 자극별로 활동전위(AP)의 발생 빈도를 구하였다. 위와 같이 도출된 A값과 B값을 이용하여 비히클(vehicle) 또는 약물 투여 후 활동전위(AP) 발화율(%)인 X값을 도출하였다.
구체적으로, 도 4와 표 1 내지 5를 참조하면, 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 iN1011-N17의 투여군(화학식 1 화합물, 실험군)은 비히클(vehicle)을 투여한 군(대조군)과는 다르게 모든 개체에서 자극의 강도와는 무관하게 투여 전보다 약물 투여 후 더 낮은 신경다발절(DRG)에서의 활동전위(AP) 발생빈도가 기록되었다. 이는 대조군과 비교하여 명확하게 다른 양상으로 그 차이는 통계적으로도 유의미한 감소임이 확인되었다. 더하여, 이러한 실험군의 약물 효과는 약물 투여 후 2 시간까지 그 효과가 지속되었으며, 시간이 지남에 따라 활동전위(AP)의 발생빈도를 억제시키는 정도가 점차 강화되는 경향성을 확인할 수 있었다. 본 결과는 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 iN1011-N17의 투여가 활동전위(AP)의 발생빈도를 억제시킴으로써 통증을 전달하는 신호를 효과적으로 억제시켜 수 시간까지 효과적인 진통 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다. 따라서 본 발명은 이온채널의 활성을 변화시켜 통증을 억제하는 기전을 갖는 약물 개발과정에서 개발 약물작용의 개념 증명(proof of concept; POC) 및 매카니즘 증명(proof of mechanism; POM) 확보에 어려움을 극복할 수 있는 확실한 대안법으로 판단된다.
von frey 자극
(1 g)		 Vehicle (Hz) Normalized firing rate (%) iN1011-N17 (Hz) Normalized firing rate (%)
Before After Before After
30 min 2.333333 2.333333 100 2.666667 0.5 18.75
3 4.5 150 1.583333 0.333333 21.05263
4.25 4.333333 101.9608 2.083333 1 48
5.833333 5.666667 97.14286 7.833333 6.166667 78.7234
16.16667 18 111.3
13.5 14 103.7
평균 110.6839±8.1 41.632±14.0
60 min 2.333333 2.5 107.1429 2.666667 0.333333 12.5
3 4.166667 138.8889 1.583333 0.166667 10.52632
4.25 4.166667 98.03922 2.083333 1.66667 80
5.833333 5.5 94.28571 7.833333 5.5 70.21277
16.16667 20.83333 128.9
13.5 10.66667 79
평균 107.7095±9.2 43.310±18.5
90 min 2.333333 2.5 107.1429 2.666667 0 0
3 2.833333 94.44444 1.583333 1 63.15789
4.25 4.333333 101.9608 2.083333 1.5 72
5.833333 6.5 111.4286 7.833333 7 89.3617
16.16667 17 105.2
13.5 13 96.3
평균 102.7461±2.7 56.130±19.5
120 min 2.333333 3 128.5714 2.666667 0.166667 6.25
3 3 100 1.583333 0.166667 10.52632
4.25 4.5 105.8824 2.083333 0 0
5.833333 7 120 7.833333 2.666667 34.04255
16.16667 14.75 91.2
13.5 11.33333 84
평균 104.9423±6.9 12.705±7.4
von frey 자극
(2 g)		 Vehicle (Hz) Normalized firing rate (%) iN1011-N17 (Hz) Normalized firing rate (%)
Before After Before After
30 min 4.166667 4 95.99999 8.458333 6.166667 72.90641
7.6875 8.333333 108.4011 7.277778 3.666667 50.38168
5.083333 5.25 103.2787 2.666667 0.666667 25.00001
13.16667 15 113.924 35.41667 16.33333 46.11763
41.25 38.16667 92.52526
17.83333 18.66667 104.6729
평균 103.134±3.2 48.601±9.8
60 min 4.166667 3.5 83.99999 8.666667 5.333333 61.53846
7.6875 8.5 110.5691 7.277778 0.833333 11.45038
5.083333 5 98.36066 2.666667 0.5 18.75
13.16667 11.16667 84.81013 35.41667 29.5 83.29411
41.25 36.66667 88.8889
17.83333 16.5 92.52338
평균 93.192±4.1 43.758±17.2
90 min 4.166667 4.666667 112 8.458333 6.833333 80.78818
7.6875 10 130.0813 7.277778 1.666667 22.90077
5.083333 5 98.36066 2.666667 1.666667 62.5
13.16667 13 98.73415 35.41667 18.83333 53.17646
41.25 39.83333 96.56565
17.83333 15 84.11217
평균 103.309±6.5 54.841±12.1
120 min 4.166667 3.5 83.99999 8.666667 7 80.76923
7.6875 7 91.05691 7.277778 1.166667 16.03054
5.083333 5.5 108.1967 2.666667 0 0
13.16667 15.5 117.7215 35.41667 1.333333 3.764705
41.25 39.5 95.75758
17.83333 15 84.11217
평균 96.807±5.6 25.141±18.9
von frey 자극
(4 g)		 Vehicle (Hz) Normalized firing rate (%) iN1011-N17 (Hz) Normalized firing rate (%)
Before After Before After
30 min 5.611111 5.333333 95.0495 13.25 11.66667 88.05034
12.58333 12.66667 100.6623 10.38889 8.333333 80.21389
6.75 8.833333 130.8642 4.333333 1 23.07692
26.58333 25.66667 96.55175 43 31.16667 72.48063
44.16667 51.33333 116.2264
20.83333 20.5 98.40002
평균 106.292±5.8 65.955±14.6
60 min 5.611111 5.333333 95.0495 13.25 9.833333 74.21383
12.58333 11.33333 90.06622 10.38889 6 57.754
6.75 6.666667 98.76544 4.333333 0.833333 19.23076
26.58333 23.66667 89.02824 43 38 88.37209
44.16667 50 113.2075
20.83333 16.5 79.20001
평균 94.219±4.7 59.893±14.9
90 min 5.611111 4.166667 74.25743 13.25 7.166667 54.08805
12.58333 14 111.2583 10.38889 2.166667 20.85562
6.75 7 103.7037 4.333333 2.333333 53.84615
26.58333 26.16667 98.43263 43 17.5 40.69767
44.16667 46.25 104.717
20.83333 20 96.00002
평균 98.062±5.2 42.372±7.8
120 min 5.611111 6.166667 109.901 13.25 6.333333 47.79874
12.58333 10.66667 84.76826 10.38889 3.333333 32.08555
6.75 7.333333 108.642 4.333333 0.333333 7.692301
26.58333 24.5 92.16302 43 1.333333 3.100774
44.16667 48.33333 109.4339
20.83333 20.5 98.40002
평균 100.551±4.3 22.669±10.5
von frey 자극
(10 g)		 Vehicle (Hz) Normalized firing rate (%) iN1011-N17 (Hz) Normalized firing rate (%)
Before After Before After
30 min 6.166667 7.5 121.6216 13.55556 10.8333 79.91803
14.125 12.16667 86.13572 4.333333 1 23.07692
11.41667 11 96.35034 53.91667 43.16667 80.06183
39.75 33.33333 83.85743 13.91667 9 64.67064
54.66667 53.16667 97.2561
22.5 22.66667 100.7408
평균 97.660±5.5 61.932±13.5
60 min 6.166667 7 113.5135 13.55556 6.833333 50.40982
14.125 19.33333 136.8731 4.333333 1.833333 42.30769
11.41667 7 61.31385 53.91667 31.16667 57.80526
39.75 40.16667 101.0482 13.91667 8.833333 63.47304
54.66667 49.66667 90.85366
22.5 12.5 55.55556
평균 93.193±12.7 53.499±4.6
90 min 6.166667 6.666667 108.1081 13.55556 4.666667 34.42622
14.125 18.33333 129.7935 4.333333 2.833333 65.38461
11.41667 10.83333 94.89045 53.91667 19 35.23957
39.75 35.83333 90.14674 13.91667 12.5 89.82034
54.66667 53.5 97.86585
22.5 20.33333 90.37036
평균 101.863±6.2 56.218±13.3
120 min 6.166667 6.166667 100 13.55556 8 59.01637
14.125 16.5 116.8142 4.333333 0.5 11.53846
11.41667 11.33333 99.27001 53.91667 1.333333 2.472951
39.75 37.83333 95.17819 13.91667 4.5 32.33532
54.66667 57 104.2683
22.5 24.33333 108.1481
평균 103.946±3.2 26.341±12.6
von frey 자극
(100 g)		 Vehicle (Hz) Normalized firing rate (%) iN1011-N17 (Hz) Normalized firing rate (%)
Before After Before After
30 min 7.722222 7.5 97.1223 21.16667 15.66667 74.01575
18.14583 20.66667 113.8921 26.5 10.83333 40.88049
7.25 9.166667 126.4368 61.08333 49.83333 81.58254
42.58333 41.83333 98.23875 13.08333 13.0 99.36306
54.83333 53 96.65654
27.16667 25 92.02453
평균 104.062±5.4 73.960±12.2
60 min 7.722222 8 103.5971 21.16667 14.66667 69.29134
18.14583 17.83333 98.27784 26.5 16.16667 61.0063
7.25 9 124.1379 61.08333 39.83333 65.21146
42.58333 41.16667 96.67321 13.08333 8.5 64.96817
54.83333 55.5 101.2158
27.16667 24.5 90.18404
평균 102.348±4.7 65.119±1.7
90 min 7.722222 7.166667 92.80576 21.16667 11.33333 53.54328
18.14583 21.16667 116.6476 26.5 23.16667 87.4214
7.25 8.666667 119.5402 61.08333 15.16667 24.82947
42.58333 37.83333 88.8454 13.08333 10 76.43314
54.83333 63 114.8936
27.16667 19 69.93864
평균 100.445±8.1 60.557±13.8
120 min 7.722222 8 103.5971 21.16667 11 51.9685
18.14583 21.83333 120.3215 26.5 16.16667 61.0063
7.25 11.5 158.6207 61.08333 1.166667 1.90996
42.58333 39.16667 91.97653 13.08333 8.166667 62.4204
54.83333 63.75 116.2614
27.16667 29.33333 107.9754
평균 116.459±9.4 44.326±14.3
[일반식 2]
상기 일반식 2에서, C와 D는 하기와 같다.
C는 비히클(vehicle) 또는 약물 투여 전 활동전위를 발생시키는 최소의 von frey 그램수를나타낸 것이고, D는 비히클(vehicle) 또는 약물 투여 후 활동전위를 발생시키는 최소의 von frey 그램수를 나타낸 것이다.
상기 일반식 2에서, Y는 도 5의 결과값을 도출하기 위한 표준화된 활동전위(AP)의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)이고, C는 비히클(vehicle) 또는 약물투여 전 활동전위(AP)를 발생시키는 최소의 von frey 그램 수이며, D는 비히클(vehicle) 또는 약물 투여 후 30분, 60분, 90분 및 120분 구간에서 활동전위(AP)를 발생시키는 최소의 von frey 그램 수이다. 위와 같이 도출된 C값과 각각의 D값을 이용하여, 비히클(vehicle) 또는 약물 투여 후 표준화된 활동전위(AP)의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)인 Y값을 도출하였다.
구체적으로, 도 5 및 표 6을 참조하면, 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 iN1011-N17의 투여군(화학식 1 화합물, 실험군)은 비히클(vehicle)을 투여한 군(대조군)과는 다르게 약물 투여 후 더 큰 자극을 통해서만 신경다발절(DRG)에서 활동전위가 발생됨을 확인하였다. 이러한 결과는 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 iN1011-N17 화합물이 활동전위(AP)를 발생시킬 수 있는 자극의 역치값을 높여줌으로써 통증의 억제 효과를 나타낼 수 있다는 점을 증명한다. 따라서 본 발명은 이온채널의 활성을 변화키켜 통증을 억제하는 기전을 갖는 약물 개발과정에서 개발 약물작용의 개념 증명(proof of concept; POC) 및 매카니즘 증명(proof of mechanism; POM) 확보에 어려움을 극복할 수 있는 확실한 대안법으로 판단된다.
Vehicle (g) Normalized action potential threshold (%) iN1011-N17 (g) Normalized action potential threshold (%)
Before After Before After
30 min 0.16 0.16 100 0.16 0.4 250
0.6 0.6 100 0.07 0.4 571.4286
0.6 0.6 100 4 10 250
0.04 0.02 50 0.6 1 166.6667
0.16 0.16 100 0.04 0.07 175
평균 90±10.0 282.619±74.4
60 min 0.16 0.16 100 0.16 0.4 250
0.6 0.6 100 0.07 0.4 571.4286
0.6 0.6 100 4 10 250
0.04 0.02 50 0.6 1 166.6667
0.16 0.16 100 0.04 0.07 175
평균 90±10.0 282.619±74.4
90 min 0.16 0.16 100 0.16 0.4 250
0.6 0.4 66.66667 0.07 0.16 228.5714
0.6 0.6 100 4 10 250
0.04 0.02 50 0.6 1 166.6667
0.16 0.16 100 0.04 0.07 175
평균 83.333±10.5 214.048±18.1
120 min 0.16 0.16 100 0.16 0.4 250
0.6 0.4 66.66667 0.07 0.4 571.4286
0.6 0.6 100 4 10 250
0.04 0.02 50 0.6 1 166.6667
0.16 0.16 100 0.04 0.4 1000
평균 83.333±10.5 447.619±154.5
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.

Claims (15)

  1. 인비보(in-vivo) 세포외(extracellular) 신경다발절(DRG) 기록법을 이용하여 전압 의존성 소디움 채널 억제제가 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제함으로써 세포막 전위가 활동전위를 유발하기 위한 역치(threshold)에 도달하는 것을 억제하거나 혹은 지연시켜 활동전위(AP)의 발생 빈도를 줄여주는 기전의 약물에 대한 약효를 평가하는 전기생리학적 약효 평가법에 있어서,
    (S1) 비히클(vehicle)을 투여하여 대조군 발화율(control firing rate) 구간의 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)를 측정하는 단계;
    (S2) 전압 의존성 소디움 채널 억제제를 투여하여 약물 발화율(firing rate) 구간의 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)를 측정하는 단계; 및
    (S3) (S1)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율 대비 (S2)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율의 억제 정도를 통계적으로 확인하는 단계를 포함하고,
    상기 (S1) 및 (S2)에서 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)은 하기 일반식 1을 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 약효 평가법:
    [일반식 1]

    상기 일반식 1에서, X는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 활동전위 표준화된 발화율(normalized firing rate, %)이고, A는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 전 각각의 von frey 그램 자극에 반응하여 발생되는 활동전위 발생 빈도(Hz)이며, B는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 직후인 전압 의존성 소디움 채널 억제제 발화율(firing rate) 구간의 각각의 von frey 그램 자극에 반응하여 발생되는 활동전위 발생 빈도(Hz)이다.
    , .
  2. 제1항에 있어서, 상기 약효 평가법은 하기 조건을 만족하는 것을 특징으로 하는 약효 평가법:
    조건 1: 상기 일반식 1에서, 전압 의존성 소디움 체널 억제제를 투여한 경우, B 값은 A 값보다 작음 (B 값 < A 값)
    조건 2: 상기 일반식 1에서, (S2)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율은 (S1)에서 측정된 활동전위 표준화된 발화율보다 작으며, 그 차이가 통계적으로 유의미한 경우임.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것인 약효 평가법:
    [화학식 1]
  4. 제1항에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 1 mg/kg 내지 100 mg/kg를 투여하는 것인 약효 평가법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 30 mg/kg을 투여하는 것인 약효 평가법.
  6. 제5항에 있어서, 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 30 mg/kg을 투여할 때 상기 일반식 1에서, X, A 및 B는 하기와 같은 것인 약효 평가법:
    X: 0 % 내지 99.36306 %
    A: 1.583333 내지 61.08333 Hz
    B: 0 내지 49.83333 Hz.
  7. 제1항에 있어서, 상기 약효 평가법은, (S1) 단계 이전에 설치류 마취 후 척수(spinal cord)의 특정 타겟 부위에서 세포외 기록법을 수행하기 위해 척수 클램퍼(spinal cord clamper)를 이용하여 척추뼈를 고정하는 단계를 포함하는 약효 평가법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 von frey 그램은 1 내지 100 g인 것을 특징으로 하는 약효 평가법.
  9. 인비보(in-vivo) 세포외(extracellular) 신경다발절(DRG) 기록법을 이용하여 전압 의존성 소디움 채널 억제제가 소디움 채널의 활성을 선택적으로 억제함으로써 세포막 전위가 활동전위를 유발하기 위한 역치(threshold)에 도달하는 것을 억제하거나 혹은 지연시켜 활동전위의 발생 빈도를 줄여주는 기전의 약물에 대한 약효를 평가하는 전기생리학적 약효 평가법에 있어서,
    (S1') 비히클(vehicle)을 투여하여 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)을 측정하는 단계;
    (S2') 전압 의존성 소디움 채널 억제제를 투여하여 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)을 측정하는 단계; 및
    (S3') (S1')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율 대비 (S2')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율의 증가 정도를 통계적으로 확인하는 단계를 포함하고,
    상기 (S1') 및 (S2')에서 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)은 하기 일반식 2를 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 약효 평가법:
    [일반식 2]

    상기 일반식 2에서, Y는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율(normalized action potential threshold, %)이고, C는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 전 활동전위를 발생시키는 최소의 von frey 그램 수이며, D는 비히클(vehicle) 또는 전압 의존성 소디움 채널 억제제 투여 후 활동전위를 발생시키는 최소의 von frey 그램 수이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 약효 평가법은 하기 조건을 만족하는 것을 특징으로 하는 약효 평가법:
    조건 3: 상기 일반식 2에서, 전압 의존성 소디움 체널 억제제를 투여한 경우, D 값은 C 값보다 큼
    조건 4: 상기 일반식 2에서, (S2')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율은 (S1')에서 측정된 표준화된 활동전위의 역치값의 변화율보다 크며, 그 차이가 통계적으로 유의미한 경우임.
  11. 제9항에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것인 약효 평가법:
    [화학식 1]
  12. 제9항에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 1 mg/kg 내지 100 mg/kg를 투여하는 것인 약효 평가법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 30 mg/kg을 투여하는 것인 약효 평가법.
  14. 제13항에 있어서, 전압 의존성 소디움 채널 억제제인 화학식 1로 표시되는 화합물을 30 mg/kg을 투여할 때 상기 일반식 2에서, Y, C 및 D는 하기와 같은 것인 약효 평가법:
    Y: 50 % 내지 1000 %
    C: 0.04 내지 4 g
    D: 0.02 내지 10 g.
  15. 제9항에 있어서, 상기 약효 평가법은, (S1') 단계 이전에 설치류 마취 후 척수(spinal cord)의 특정 타겟 부위에서 세포외 기록법을 수행하기 위해 척수 클램퍼(spinal cord clamper)를 이용하여 척추뼈를 고정하는 단계를 포함하는 약효 평가법.
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