JP2022505139A - ゲノム編集の方法及び構築物 - Google Patents
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Abstract
Description
性をもたらすその存在によって、両方のメカニズムが構成的に活性化される。P23Hを保有するいくつかの動物モデル、特にmRho-P23Hノックイン[15]及びhRHO-P23Hトランスジェニック[16]のマウスは研究に広く使用されている。
こされる希少なリソソーム蓄積症(LSD)であり、これは、毒性グリコサミノグリカン(GAG)の広範な蓄積及び尿中排泄をもたらす。臨床的には、MPS VI表現型は、一次認知障害のない状態で、発育遅延、粗な顔貌、骨格の変形、関節硬直、角膜混濁、心臓弁肥厚及び臓器肥大によって特徴付けられる[24]。MPSの治療法は、正常なリソソーム加水分解酵素が分泌され、次いで、マンノース-6-リン酸受容体経路を介してほとんどの細胞に取り込まれること、に依拠する。本発明者らは、肝臓特異的チロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター(AAV2/8.TBG.hARSB)の転写制御下でARSBをコードする組換えAAVベクター血清型8(AAV2/8)の単回全身投与によって、MPS VI動物モデルで持続的な肝臓形質導入と表現型改善がもたらされることを実証した[25-31]。本発明者らはまた、上記単回全身投与が、MPS VIマウスにおいて、この状態に対する現在の標準治療である酵素補充療法(ERT)の毎週投与と少なくとも同程度に効果的であることを示した[32-34]。本発明者らは最近、MPS VI患者における本アプローチの安全性と有効性の双方を試験するために、フェーズI/II治験(ClinicalTrials.gov識別子:NCT03173521)を開始した。高度に転写性のアルブミン遺伝子座でのHITIは、AAVによる本来なら安全で効果的な肝臓遺伝子治療のいくつかの限定を克服する潜在力を持ち、これには:i.アルブミン遺伝子座から特に高い、導入遺伝子発現のレベル;ii.肝細胞の細胞喪失が生じた場合に複製されるであろう、ゲノム遺伝子座での治療用コード配列の挿入によって保証される導入遺伝子発現の安定性が挙げられる。リソソーム蓄積症のモデル、MPS VIにおけるこのアプローチの有効性に関する発明者らの好結果の証明によって、とりわけ血友病、アルファ-l-アンチトリプシン欠乏症、糖尿病、慢性炎症性腸疾患等の、全身性治療用タンパク質の安定した発現が必要である他のLSD又は他の慢性衰弱状態に対する新規な遺伝子治療戦略の基盤が築かれる。したがって、治療用タンパク質の安定した全身発現を必要とする疾患に対する遺伝子治療戦略が依然として求められている。
児において又は肝臓の損傷時)に、目的の遺伝子の発現が失われることはない。
細胞を:
a)- 少なくとも1つのストップコドン及び翻訳開始配列(TIS)又は
- リボソームスキッピング配列、及び
- 前記外来性DNA配列
を含み、逆位の標的化配列が5'及び3'にて隣接する、ドナー核酸;
b)標的化配列と相同な相補鎖オリゴヌクレオチド、並びに
c)標的化配列を認識するヌクレアーゼ
と接触させる工程を含む、方法である。
- 少なくとも1つのストップコドン、及び
- コザック配列であるか又は60~70bpの、好ましくは約50bpの、より好ましくは50bpの合成配列であるIRES配列である、翻訳開始配列(TIS)、及び
- 前記外来性DNA配列
を含む。
コザックコンセンサス配列は:
- 配列番号54(gccacc)と少なくとも98%の同一性を有する配列若しくはその機能的断片又は
- 配列番号55(gccncc)の配列(配列中、nはgであってもaであってもよい)
を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は
IRES配列は、
配列番号24(TgACAAACTgTACATgCCgTTAACTgTAATTTTgCgTgATTTTTTTgTAg)若しくは配列番号23(AggTggTAgCCgCAAACATAgTTCAATACAAACTTgCTgTCTCggCgg)と少なくとも95%の同一性を有する配列又はその機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は、
リボソームスキッピングT2A配列は、配列番号32(ggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacct)又は配列番号25~28をコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列又はそれらの機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は
標的化配列は、配列番号29(GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、配列番号30(AGTACTGCGGATACTCAAAG)、配列番号31(ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)と少なくとも95%の同一性を有する配列又はその機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は、
標的化配列と相同な相補鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号56(CCAGGTAGTACTGCGGCTGC)、配列番号57(CTTTGAGTATCCGCAGTACT)、配列番号58(ATGGGCGATCTCACTCTTGT)と少なくとも95%の同一性を有する配列又はその機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有する。
- 好ましくはヒト、マウス又はブタからのRHO遺伝子の第1のエクソン、
- 好ましくはヒト又はマウスからのアルブミン遺伝子の第2のエクソン、
又はその機能的断片
内に含まれる。
a)- 少なくとも1つのストップコドン及び翻訳開始配列(TIS)又は
- リボソームスキッピング配列、及び
- 前記外来性DNA配列
を含み、逆位の標的化配列が5'及び3'にて隣接する、ドナー核酸;
b)標的化配列と相同な相補鎖オリゴヌクレオチド、並びに
c)標的化配列を認識するヌクレアーゼ
を含む、システムである。
説明文:
外来性DNA配列
上述の外来性DNA配列は、標的ゲノムのゲノムDNAへと組み込まれるDNAの断片を含む。一部の実施形態では、外来性DNAは遺伝子の少なくとも一部を含む。外来性DNAは、コード配列を、例えば、野生型遺伝子に、又は発現する必要がある因子の「コドン最適化」配列に、関連したcDNAを含むことができる。一部の実施形態では、外来性DNAは、遺伝子の少なくともエクソン及び/又は遺伝子の少なくとも1つのイントロンを含む。一部の実施形態では、外来性DNAは、遺伝子のエンハンサーエレメント又はプロモーターエレメントを含む。一部の実施形態では、外来性DNAは、遺伝子の3'部分に融合された遺伝子の5'部分を含む遺伝子の不連続配列を含む。一部の実施形態では、外来性DNAは、野生型遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、外来性DNAは突然変異遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、外来性DNAは、野生型遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、外来性DNA配列は、レポーター遺伝子を含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びβ-グルクロニダーゼのうちの少なくとも1つから選択される。一部の実施形態では、外来性DNA配列は、例えば、プロモーター配列又はエンハンサー配列を含むことができる遺伝子転写調節エレメントを含む。一部の実施形態では、外来性DNA配列は、1つ又は複数のエクソン又はそれらの断片を含む。一部の実施形態では、外来性DNA配列は、1つ又は複数のイントロン又はそれらの断片を含む。一部の実施形態では、外来性DNA配列は、3'非翻訳領域又は5'非翻訳領域の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、外来性DNA配列は、人工DNA配列を含む。一部の実施形態では、外来性DNA配列は、核局在化配列及び/又は核外搬出配列を含む。外来性DNA配列は、一部の実施形態では、標的ゲノム遺伝子座にて組み込まれる核酸のセグメントを含む。外来性DNA配列は、一部の実施形態では、目的の1つ又は複数のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態での外来性DNA配列は、1つ又は複数の発現カセットを含む。かかる発現カセットは、一部の実施形態では、目的の外来性DNA配列、選択マーカー及び/又はレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド、
並びに発現に影響を及ぼす調節成分を含む。外来性DNA配列は、一部の実施形態では、ゲノム核酸を含む。ゲノム核酸は、動物、マウス、ヒト、非ヒト、げっ歯類、非ヒト、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類(例えばマーモセット、アカゲザル)、家畜哺乳動物若しくは農業哺乳動物、鳥類、細菌、古細菌、ウイルス、又は目的のその他生物体、或いはそれらの組合せに由来する。適切な任意のサイズの外来性DNA配列が標的ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、ゲノムに組み込まれる外来性DNA配列は、長さが、3キロベース(kb)未満、約3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500キロベースであり、又は500キロベース超である。一部の実施形態では、ゲノムに組み込まれる外来性DNA配列は、長さが、少なくとも約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500(kb)であり、又は500(kb)超である。
一部の実施形態では、標的化構築物(逆位の標的化配列が5'及び3'にて隣接するドナー核酸を含む)は、少なくとも2つの標的化配列を含む。本明細書の標的化配列は、ヌクレアーゼによって認識及び切断される核酸配列である。一部の実施形態では、標的化配列は、長さが約9から約12ヌクレオチドまで、長さが約12から約18ヌクレオチドまで、長さが約18から約21ヌクレオチドまで、長さが約21から約40ヌクレオチドまで、長さが約40から約80ヌクレオチドまで、又は部分範囲の任意の組合せ(例えば、9~18、9~21、9~40、及び9~80ヌクレオチド)、である。一部の実施形態では、標的化配列は、ヌクレアーゼ結合部位を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、ニック/切断部位を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を含む。一部の実施形態では、標的核酸配列(例えば、プロトスペーサー)は、20ヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的核酸は、20ヌクレオチド未満である。一部の実施形態では、標的核酸は、少なくとも5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30又はそれ超のヌクレオチドである。標的核酸は、一部の実施形態では、多くても5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30又はそれ超のヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的核酸配列は、PAMの第1のヌクレオチドの5'間近の16、17、18、19、20、21、22、又は23塩基である。一部の実施形態では、標的核酸配列は、PAMの最後のヌクレオチドの3'間近の16、17、18、19、20、21、22、又は23塩基である。一部の実施形態では、標的核酸配列は、PAMの最初のヌクレオチドの5'間近の20塩基である。一部の実施形態では、標的核酸配列は、PAMの最後のヌクレオチドの3'間近の20塩基である。一部の実施形態では、標的核酸配列は、PAMの5'又は3'である。一部の実施形態では、標的化配列は、相補鎖核酸の核酸-標的化セグメントが結合する標的核酸に存在する核酸配列を含む。例えば、標的化配列は、一部の実施形態では、相補鎖核酸がそれに対して塩基対を有するように設計されている配列を含む。一部の実施形態での標的化配列は、例えば、細胞の核若しくは細胞質に、又はミトコンドリアや葉緑体等の細胞の細胞小器官内に、存在する任意のポリヌクレオチドを含む。標的化配列は、ヌクレアーゼ向けの切断部位を含む。標的化配列は、一部の実施形態では、ヌクレアーゼ向けの切断部位に隣接する。ヌクレアーゼは、一部の実施形態では、相補鎖の核酸-標的化配列が結合する標的核酸に存在する核酸配列の内の又は外側の部位にて、核酸を切断する。切断部位は、一部の実施形態では、ヌクレアーゼが一本鎖切断又は二本鎖切断を生成する核酸の位置を含む。例えば、プロテアーゼ認識配列にハイブリダイズし、プロテアーゼと複合体を形成した相補鎖核酸を含むヌクレアーゼ複合体の形成は、相補鎖核酸のスペーサー領域が結合する標的核酸に存在する核酸配列において、又はその近傍で(例えば、核酸配列からの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、19、20、23、50、又はそれ超の塩基対内で)の一方又は両方の鎖の切断をもたらす。切断部位は、一部の実施形態では、核酸の一方の鎖上のみに又は両方の鎖上にある。一部の実施形態では、切断部位は、核酸の両方の鎖上の同じ位置にあるか(平滑末端を生成する)、又は各鎖上の異なる部位にある(付着末端を生成する)。付着末端は、一部の実施形態では、5'又は3'のオーバーハング粘着末端である。付着末端は、一部の実施形態では、粘着末端を生成するヌクレアーゼ(例えば、Cpfl)によって生成される。一部の実施形態では、付着末端は、例えば2つのヌクレアーゼを使用することによって生成され、ヌクレアーゼのそれぞれが、各鎖上の異なる切断部位にて一本鎖切断を生成し、それにより二本鎖切断を生成する。例えば、第1のニッカーゼが、二本鎖DNA(dsDNA)の第1の鎖の上に一本鎖切断を創り出し、第2のニッカーゼは、オーバーハング配列が創り出されるようにdsDNAの第2の鎖の上に一本鎖切断を創り出す。場合によっては、第1の鎖上のニッカーゼのヌクレアーゼ認識配列は、第2の鎖上のニッカーゼのヌクレアーゼ認識配列から、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、250、500、又は1000塩基対、によって隔てられている。ヌクレアーゼによる標的核酸の部位特異的切断は、一部の実施形態では、相補鎖核酸と標的核酸との間の塩基対合相補性によって決定される位
置で生じる。ヌクレアーゼタンパク質による標的核酸の部位特異的切断は、一部の実施形態では、標的核酸のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれる短いモチーフによって決定される位置で生じる。例えば、PAMは、認識配列の3'末端にてヌクレアーゼ認識配列に隣接する。例えば、ヌクレアーゼの切断部位は、一部の実施形態では、PAM配列の約1~約25、又は約2~約5、又は約19~約23塩基対(例えば、3塩基対)、上流又は下流にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの切断部位は、PAM配列の3塩基対上流にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの切断部位は、(+)鎖上の19塩基及び(-)鎖上の23塩基であり、5'オーバーハングの長さ5個のヌクレオチド(nt)を生成する。場合によっては、切断によって平滑末端が生成される。場合によっては、切断によって、5'オーバーハングを有する付着末端又は粘着末端が生成される。場合によっては、切断によって、3'オーバーハングを有する付着末端又は粘着末端が生成される。種々のヌクレアーゼタンパク質のオルソログが、異なるPAM配列を利用する。例えば、異なるCasタンパク質が、一部の実施形態では、異なるPAM配列を認識する。例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)では、PAMは、配列5'-XRR-3'を含む標的核酸中の配列である(配列中、Rは、A又はGのいずれかであり、ここで、Xは任意のヌクレオチドであり、且つXは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列の3'間近にある)。S.ピオゲネスのCas9(SpyCas9)のPAM配列は、5'-XGG-3'である(配列中、Xは任意のDNAヌクレオチドであり、標的DNAの非相補鎖のヌクレアーゼ認識配列の3'間近にある)。CpflのPAMは5'-TTX-3'である(配列中、Xは任意のDNAヌクレオチドであり、ヌクレアーゼ認識配列の5'間近にある)。好ましくは、Cas9/sgRNA複合体は、ゲノム標的配列のPAM配列の3塩基対上流にDSBを導入し、その結果、2つの平滑末端をもたらす。正確に同じCas9/sgRNA標的配列がドナーDNA上へと逆位方向でロードされる。標的化ゲノム遺伝子座並びにドナーDNAは、Cas9/gRNAによって切断され、線形化ドナーDNAは、NHEJ DSB修復経路を介して標的部位に組み込まれる。ドナーDNAが正常な方向に組み込まれる場合、接合配列はCas9/gRNAによる更なる切断から保護される。ドナーDNAが逆位方向に組み込まれる場合、Cas9/gRNAは、インタクトなCas9/gRNA標的部位が存在することに起因して、組み込まれたドナーDNAを切除することになる。
相補鎖核酸、例えば相補鎖オリゴヌクレオチド又は相補鎖RNAとは、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的核酸にハイブリダイズする核酸を指す。相補鎖核酸は、例えば、RNAであってもDNAであってもよい。相補鎖核酸は、一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログ及び/又は改変ヌクレオチドを含む。相補鎖核酸は、一部の実施形態では、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラム又は設計されている。相補鎖核酸は、一部の実施形態では、核酸に新規な又は改善された特徴を提供するために1つ又は複数の改変を含む。一部の実施形態では、相補鎖核酸は、核酸親和性タグ及び/又は合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、及び/又は改変ヌクレオチドを含む。相補鎖核酸は、一部の実施形態では、例えば、標的核酸中の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列(例えば、スペーサー)を、5'末端又は3'末端にて又はその近傍に含む。一部の実施形態では、相補鎖核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション(すなわち、塩基対合)を介して配列特異的な様式で標的核酸と相互作用する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5'又は3'に位置する標的核酸(例えば、プロトスペーサー配列)にハイブリダイズする。一部の実施形態では、相補鎖核酸は、二本相補鎖核酸と呼ばれる別々の2つの核酸分子を含む。一部の実施形態では、相補鎖核酸は、一本相補鎖核酸と呼ばれる単一の核酸分子を含む。一部の実施形態では、相補鎖核酸は、crRNAを含む一本相補鎖核酸である。一部の実施形態では、相補鎖核酸は、融合構築物を含む一本相補鎖核酸である。相補鎖核酸の核酸-標的化領域は、一部の実施形態では、標的核酸中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。核酸-標的化領域は、一部の実施形態では、スペーサー領域を含む。スペーサー領域のヌクレオチド配列は変化し、相補鎖核酸が相互作用する標的核酸内の位置を決定する。相補鎖核酸のスペーサー領域は、一部の実施形態では、標的核酸内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変される。相補性とは二者択一的に、完全であるか又は実質的/十分である。2つの核酸間の完全な相補性とは、2つの核酸が、二重鎖の中にあるあらゆる塩基がワトソン-クリック対合により相補的塩基に結合している二重鎖を形成することを意味する。実質的又は十分である相補性とは、一本鎖中の配列が対向する鎖中の配列に対して完璧に及び/又は完全に相補性というわけではないが、2つの鎖上の塩基間で十分な結合が生じて、ハイブリダイゼーション条件(例えば塩の濃度及び温度)の設定において安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、ハイブリダイズされた鎖のTmを予測するための配列及び標準の数学的計算を使用することによって、又は、慣例的な方法を使用することによるTmの経験的決定によって予測することができる。一部の実施形態では、相補鎖核酸の核酸-標的化領域(例えば、スペーサー領域)は、長さが18~72の間のヌクレオチドである。相補鎖核酸の核酸-標的化領域(例えば、スペーサー領域)は、約12ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまでの長さを有する。例えば、相補鎖核酸の核酸-標的化領域(例えば、スペーサー領域)は、約12ヌクレオチド(nt)から約80ntまで、約12ntから約50ntまで、約12ntから約40ntまで、約12ntから約30ntまで、約12ntから約25ntまで、約12ntから約20ntまで、約12ntから約19ntまで、約12ntから約18ntまで、約12ntから約17ntまで、約12ntから約16ntまで、又は約12ntから約15ntまでの長さを有する。或いは、DNA-標的化セグメントは、約18ntから約20ntまで、約18ntから約25ntまで、約18ntから約30ntまで、約18ntから約35ntまで、約18ntから約40ntまで、約18ntから約45ntまで、約18ntから約50ntまで、約18ntから約60ntまで、約18ntから約70ntまで、約18ntから約80nt、約18ntから約90ntまで、約18ntから約100ntまで、約20ntから約25ntまで、約20ntから約30ntまで、約20ntから約35ntまで、約20ntから約40ntまで、約20ntから約45ntまで、約20ntから約50ntまで、約20ntから約60ntまで、約20ntから約70ntまで、約20ntから約80ntまで、約20ntから約90ntまで、又は約20ntから約100ntまでの長さを有する。
キング;タンパク質又はタンパク質複合体に対する結合部位等)を提供する、改変又は配列を含む。かかる改変の例には以下が挙げられる:例えば、5'キャップ(例えば、7-メチルグアニル酸キャップ(m7G));3'ポリアデニル化テール(すなわち、3'ポリ(A)テール);リボスイッチ配列(例えば、タンパク質及び/又はタンパク質複合体による安定性の調節及び/又はアクセシビリティの調節を可能にするため);安定性制御配列;dsRNA二重鎖を形成する配列(すなわち、ヘアピン));RNAを細胞内の位置(例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体等)へと標的化する改変又は配列;トラッキング(例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列等)を提供する改変又は配列;或いは、タンパク質(例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、及びそれらの組合せを含めて、DNAに作用するタンパク質)に対する結合部位を提供する改変又は配列。相補鎖核酸は、任意の形態で、例えば、2つの分子(例えば、別々のcrRNA及びtracrRNA)として又は1つの分子(例えば、sgRNA)としてのいずれかで、RNAの形態で、提供される。一部の実施形態では、相補鎖核酸は、ヌクレアーゼタンパク質との複合体の形態で提供される。或いは、相補鎖核酸は、RNAをコードするDNAの形態でも提供される。相補鎖核酸をコードするDNAは二者択一的に、単一の相補鎖核酸(例えば、sgRNA)又は別々のRNA分子(例えば、別々のcrRNA及びtracrRNA)をコードする。後者の場合、相補鎖核酸をコードするDNAは、それぞれ、crRNA及びtracrRNAをコードする別々のDNA分子として提供される。一部の実施形態では、相補鎖核酸をコードするDNAは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、任意選択で、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結されている。相補鎖核酸をコードするDNAは、一部の実施形態では、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結されている。相補鎖核酸は、適切な任意の方法によって調製される。例えば、相補鎖核酸は、例えば、T7RNAポリメラーゼを使用してin vitro転写によって調製される。一部の実施形態では、相補鎖核酸はまた、化学合成によって調製される合成的に産生された分子である。
標的化配列を認識するヌクレアーゼは、当業者に知られており、それらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復(CRISPR)ヌクレアーゼ、及びメガヌクレアーゼが含まれる。組成物中に見いだされ且つ本明細書に開示されている方法において有用なヌクレアーゼを、以下により詳細に説明する。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ZFN」とは、Foklの切断ドメインと3つ以上のジンクフィンガーモチーフを含有するDNA認識ドメインとの間の融合物である。精密な配向及び間隔で個々の2つのZFNがDNAの特定の位置でヘテロ二量体化すると、DNAの二本鎖切断がもたらされる。場合によっては、ZFNは切断ドメインを各ジンクフィンガードメインのC末端に融合させる。2つの切断ドメインが二量体化しDNAを切断することを可能とするために、個々の2つのZFNは、ある特定の距離隔てて、DNAの対向している鎖をそれらのC末端に結合する。場合によっては、ジンクフィンガードメインと切断ドメインの間のリンカー配列は、各結合部位の5'末端が約5~7bpだけ隔てられている必要がある。本発明において有用である例示的なZFNには、それらに限定されないが、Urnovら、Nature Reviews Genetics、2010、11:636~646頁;Gajら、Nat Methods、2012、9(8):805~7頁;各米国特許、第6,534,261号;第6,607,882号;第6,746,838号;第6,794,136号;第6,824,978号;第6,866,997号;第6,933,113号;第6,979,539号;第7,013,219号;第7,030,215号;第7,220,719号;第7,241,573号;第7,241,574号;第7,585,849号;第7,595,376号;第6,903,185号;第6,479,626号;並びに各米国特許出願公開、第2003/0232410号及び第2009/0203140号、に記載のものが挙げられる。一部の実施形態では、ZFNはジンクフィンガーニッカーゼであり、これは、一部の実施形態では、部位特異的な一本鎖DNA切断又はニックを誘導する操作されたZFNである。ジンクフィンガーニッカーゼに関する説明については、例えば、Ramirezら、Nucl Acids Res、2012、40(12):5560~8頁; Kimら、Genome Res、2012、22(7):1327~33頁に見られる。
「TALEN」又は「TALエフェクターヌクレアーゼ」とは、DNA結合タンデム反復の中央ドメイン、核局在化シグナル、及びC末端転写活性化ドメインを含有する、操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。場合によっては、DNA結合タンデム反復は、長さが33~35個のアミノ酸を含み、1つ又は複数の特定のDNA塩基対を認識する、12位及び13位に2個の超可変アミノ酸残基を含有する。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって産生される。例を挙げると、TALEタンパク質は、野生型又は突然変異Foklエンドヌクレアーゼ又はFoklの触媒ドメインといったヌクレアーゼに融合され得る。Foklに対するいくつかの突然変異が、TALENでのFokl使用のためになされるが、これによって、例えば、切断特異性や活性が改善される。かかるTALENは、任意の所望のDNA配列に結合するように操作されている。TALENは、次いでNHEJ又はHDRを受ける、標的DNA配列に二本鎖切断を創り出すことによって遺伝子改変を生成するのによく使用される。場合によっては、HDRを促進するために一本鎖ドナーDNA修復鋳型が提供される。TALENと遺伝子編集へのその使用に関する詳細な説明については、例えば、各米国特許、第8,440,431号;第8,440,432号;第8,450,471号;第8,586,363号;及び第8,697,853号;Scharenbergら、Curr Gene Ther、2013、13(4):291~303頁;Gajら、Nat Methods、2012、9(8):805~7頁;Beurdeleyら、Nat Commun、2013、4:1762頁;及びJoung and Sander、Nat Rev Mol Cell Biol、2013、14(l):49~55頁、に見られる。
「DNAガイド型ヌクレアーゼ」とは、一本鎖DNA相補的ヌクレオチドを使用して、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的核酸にハイブリダイズすることによって、ヌクレアーゼをゲノム内の正常な場所に誘導するヌクレアーゼである。一部の実施形態では、DNAガイド型ヌクレアーゼは、アルゴノート(Argonaute)ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、DNAガイド型ヌクレアーゼは、TtAgo、PfAgo、及びNgAgoから選択される。一部の実施形態では、DNAガイド型ヌクレアーゼは、NgAgoである。
「メガヌクレアーゼ」とは、ある特定の実施形態では、高度に特異的であるレアカットエンドヌクレアーゼ又はホーミングエンドヌクレアーゼであり、長さが少なくとも12塩基対、例えば長さが12から40塩基対まで又は12から60塩基対までに及ぶDNA標的部位を認識する。
CRISPR(クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復)/Cas(CRISPR関連タンパク質)ヌクレアーゼシステムとは、ゲノム工学に使用される細菌システムをベースとする操作されたヌクレアーゼシステムである。これは、多くの細菌及び古細菌の適応的免疫反応に部分的に基づいている。ウイルス又はプラスミドが細菌に侵入すると、侵入物のDNAのセグメントが「免疫」応答によってCRISPR RNA(crRNA)に変換される。次いで、crRNAは、部分的な相補性の領域を通して、tracrRNAと呼ばれる別のタイプのRNAと会合して、Cas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼを「プロトスペーサー」と呼ばれる標的DNA中のcrRNAと相同な領域に誘導する。Cas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼは、DNAを切断して、crRNA転写物内に含まれる20ヌクレオチドの相補鎖配列によって特定された部位での二本鎖切断にて平滑末端を生じる。Cas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼには、一部の実施形態では、部位特異的DNA認識及び切断にあたってcrRNAとtracrRNAの両方が必要である。ここでは、このシステムを操作するが、ある特定の実施形態では、crRNA及びtracrRNAを1つの分子(「単一ガイドRNA」又は「sgRNA」)に組み合わせ、そして単一ガイドRNAのcrRNA等価部分を操作してCas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼを誘導し、その結果任意の所望の配列を標的化するように操作する(例えば、Jinekら(2012) Science 337:816~821頁;Jinekら(2013) eLife 2:e00471;Segal (2013) eLife 2:e00563を参照されたい)。したがって、CRISPR/Casシステムは、細胞のゲノム内の所望の標的にて二本鎖切断を創り出し、細胞の内因的メカニズムを利用して、相同組換え修復(HDR)又は非相同末端結合(NHEJ)によって誘導された切断を修復するように、操作することができる。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、DNA切断活性を有する。Casヌクレアーゼは、一部の実施形態では、標的DNA配列中の或る位置で一方又は両方の鎖の切断を誘導する。例えば、一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、標的DNA配列の一本鎖を切断する1つ又は複数の不活性化触媒ドメインを有するニッカーゼである。Casヌクレアーゼの非限定的な例として、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (Csnl及びCsxl2としても知られている)、CaslO、Cpfl、C2c3、C2c2及びC2clCsyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpfl、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、それらの相同体、それらのバリアント、それらの突然変異体、並びにそれらの誘導体が挙げられる。Casヌクレアーゼに関しては主要な3つのタイプ(タイプI、タイプII、及びタイプIII)が存在し、5種のタイプI、3種のタイプII、及び2種のタイプIIIのタンパク質を含めて10種のサブタイプが存在する(例えば、Hochstrasser and Doudna、Trends Biochem Sci、2015:40(l):58~66頁を参照されたい)。タイプIIのCasヌクレアーゼには、それらに限定されないが、Casl、Cas2、Csn2、及びCas9が含まれる。これらのCasヌクレアーゼは当業者に知られている。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)の野生型Cas9ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、NBCI Ref. Seq. No. NP 269215に記載されており、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)の野生型Cas9ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、NBCI Ref. Seq. No. WP_011681470に記載されている。Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9ポリペプチドは、一部の実施形態では、様々な細菌種に由来する。「Cas9」とは、RNAガイド型二本鎖DNA結合ヌクレアーゼタンパク質又はニッカーゼタンパク質を指す。野生型Cas9ヌクレアーゼは、異なるDNA鎖を切断する2つの機能ドメイン、例えば、RuvC及びHNHを有する。Cas9は、両方の機能ドメインが活性である場合、ゲノムDNA(標的DNA)の二本鎖切断を誘導することができる。Cas9酵素は、一部の実施形態では、コリネバクター(Corynebacter)、サテレラ(Sutterella)、レジオネラ(Legionella)、トレポネーマ(Treponema)、フィリファクター(Filif actor)、ユーバクテリウム(Eubacterium)、連鎖球菌(Streptococcus)、ラクトバチラス(Lactobacillus)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、バクテロイド(Bacteroides)、フラビイボラ(Flaviivola)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、スフェロケタ(Sphaerochaeta)、アゾスピリルム(Azospirillum)、グルコナセトバクター(Gluconacetobacter)、ナイセリア(Neisseria)、ロゼブリア(Roseburia)、パルビバクラム(Parvibaculum)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ニトラティフラクター(Nitratifractor)、及びカンピロバクター(Campylobacter)からなる群に属する細菌に由来するCas9タンパク質の1つ又は複数の触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、Cas9は融合タンパク質であり、例えば、2つの触媒ドメインは、異なる細菌種に由来する。Cas9ヌクレアーゼの有用なバリアントは、RuvC-又はHNH-酵素又はニッカーゼ等の単一の不活性な触媒ドメインを含む。Cas9ニッカーゼは、1つの活性機能ドメインのみを有し、一部の実施形態では、標的DNAの1つの鎖のみを切断し、それにより、一本鎖切断又はニックを創り出す。一部の実施形態では、少なくともD10A突然変異を有する突然変異型Cas9ヌクレアーゼは、Cas9ニッカーゼである。他の実施形態では、少なくともH840A突然変異を有する突然変異型Cas9ヌクレアーゼは、Cas9ニッカーゼである。Cas9ニッカーゼに存在する突然変異の他の例には、限定されないが、N854A及びN863Aが含まれる。対向しているDNA鎖を標的化する少なくとも2つのDNA-標的化RNAを使用する場合、Cas9ニッカーゼを使用して二本鎖切断が導入される。ダブルニッキング(double-nicked)誘導性の二本鎖切断は、NHEJ又はHDRによって修復される。こういった遺伝子編集戦略はHDRに有利であり、オフターゲットDNA部位でのインデル突然変異の頻度を減少させる。Cas9ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、一部の実施形態では、標的細胞又は標的生物体に対してコドン最適化されている。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、RuvClドメイン及びHNHヌクレアーゼドメイン(D10A及びH840A)の2つのサイレンシング突然変異を含有するCas9ポリペプチドであり、これは、dCas9と呼ばれる。一実施形態では、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のdCas9ポリペプチドは、位置D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、A987、又はそれらの任意の組合せにて少なくとも1つの突然変異を含む。かかるdCas9ポリペプチド及びそれらのバリアントに関する説明については、例えば、国際特許出願公開第WO2013/176772号に提供されている。一部の実施形態でのdCas9酵素は、D10、E762、H983、又はD986にての突然変異、並びにH840又はN863にての突然変異を含有する。場合によっては、dCas9酵素はD10A又はDION突然変異を含有する。また、dCas9酵素は代替的に、突然変異H840A、H840Y、又はH840Nを含む。一部の実施形態では、本発明のdCas9酵素は、D10A及びH840A;D10A及びH840Y;D10A及びH840N;DION及びH840A;DION及びH840Y;又はDION及びH840Nの置換を含む。置換は、Cas9ポリペプチドを触媒的に不活性とし且つ標的DNAに結合することができるように、代替的に保存的置換又は非保存的置換である。ゲノム編集法では、一部の実施形態でのCasヌクレアーゼは、dCas9に連結されたIIS型制限酵素Foklの触媒ドメインを含むポリペプチド等のCas9融合タンパク質を含む。FokI-dCas9融合タンパク質(fCas9)は、2つのガイドRNAを使用して、標的DNAの一本鎖に結合し、その結果、二本鎖切断を生じることができる。
本発明の遺伝子送達ビヒクルは、患者に投与することができる。前記投与は、「in vivo」投与であっても、「ex vivo」投与であってもよい。当業者であれば、適切な投薬割合を決定することができるであろう。「投与される」という用語には、ウイルス技法又は非ウイルス技法による送達が含まれる。ウイルス送達メカニズムには、それらに限定されないが、上記の、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクター等が含まれる。非ウイルス送達システムには、電気穿孔、脂質媒介トランスフェクション、圧縮DNA媒介トランスフェクション;リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性両面親媒性物質(CFA)及びそれらの組合せ、等のDNAトランスフェクションが含まれる。本発明によるベクターシステムでの1つ又は複数の治療用遺伝子の送達については、単独で、又は他の処置若しくは処置の成分と組合せで、使用することができる。
現在までに、数十の様々なAAVバリアント(血清型)が特定及び分類されている(Srivastava A、Curr Opin Virol.2016年12月;21:75~80頁)。既知の血清型のすべてが多重の多様な組織タイプ由来の細胞に感染することができる。組織特異性はカプシドの血清型によって決定され、AAVベクターを偽型化して指向性の範囲を変化させることは、治療上でのその使用にとって重要となる可能性がある。偽型AAVベクターとは、第2のAAV血清型のカプシドに一方のAAV血清型のゲノムを含有するものである;例えば、AAV2/8ベクターはAAV8カプシドとAAV2ゲノムを含有する(Auricchioら(2001) Hum. Mol. Genet. 10(26):3075~81頁)。このようなベクターは、キメラベクターとしても知られている。
血清型2(AAV2)については、これまでに最も広範に調べられてきた。AAV2は、骨格筋、ニューロン、血管平滑筋細胞、及び肝細胞に向けた天然の指向性を提示する。AAV2については、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)、aVβ5インテグリン、線維芽細胞成長因子受容体1(FGFR-1)の3種の細胞受容体が記載されている。第1の受容体は一次受容体として機能し、後2種の受容体は補助受容体活性を有し、受容体媒介エンドサイトシスによってAAVが細胞に侵入するのを可能にする。これらの研究結果については、Qju、Handaらが議論してきたところである。HSPGは一次受容体として機能するが、細胞外マトリックスにこれが多量に存在すると、AAV粒子を除去し、感染効率を損なう場合がある。
AAV2は様々なAAVベースの研究の中で最も一般的な血清型であるが、その他の血清型が遺伝子送達ベクターとしてより効果的な場合もあることが示されてきた。例を挙げると、AAV6は気道上皮細胞に感染する上ではるかに良好であるように見え、AAV7はマウス骨格筋細胞で形質導入率が極めて高いことを示し(AAV1及びAAV5と同様に)、AAV8は肝細胞及び光受容体に形質導入する上で卓越しており、AAV1及びAAV5は血管内皮細胞への遺伝子送達において極めて効率的であることが示された。脳では、ほとんどのAAV血清型がニューロン指向性を示すが、AAV5は星状細胞にも形質導入する。AAV1とAAV2のハイブリッドであるAAV6は、AAV2よりも低い免疫原性も示す。血清型は、それらが結合する受容体に対して異なることができる。例えば、AAV4及びAAV5の形質導入は、(これらの血清型のそれぞれについて異なる形態の)可溶性シアル酸によって阻害される場合もあり、AAV5は血小板由来増殖因子受容体を介して細胞に侵入することが示された。4つの変異を持つチロシン突然変異体やAAV 2/7m8等の新規AAVバリアントは、小動物モデルで硝子体から外側網膜に形質導入することが示された(Dalkara Dら、Sci Transl Med. 2013年6月12日;5(189):189ra76;Petrs-Silva Hら、Mol Ther. 2011年2月;19(2):293~301頁)。ShH10と命名された別のAAV突然変異体は、硝子体内投与後のグリア指向性が改善されたAAV6バリアントである(Klimczak RRら、PLoS One. 2009年10月14日;4(10):e7467)。網膜に対して特に有利な指向性を有する更なるAAV突然変異体は、AAV2(クワッドY-F)である(Hickey DGら、Gene Ther. 2017年12月;24(12):787~800頁)。本発明の意味の範囲内で、AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及びAAV10からなる群のうちの1つ又は複数から、好ましくはAAV2血清型又はAAV8血清型から選択される血清型のAAVのカプシドタンパク質を含む。
本明細書で提供されるのは、分裂することがない非分裂細胞又は最終分化細胞におけるゲノムDNAを含めて、ゲノムDNA等の核酸に変更を加える相同性非依存性標的化組み込み(HITI)方法及び組成物である。本明細書の方法は、少なくとも一部の実施形態では、相同性非依存性であり、非相同末端結合を使用して、非分裂細胞や最終分化細胞等の細胞のゲノムDNA等の標的DNAに外来性DNAを挿入する。一部の実施形態では、本明細書の方法は、非分裂細胞のゲノムに外来性DNA配列を組み込む方法であって、非分裂細胞を、外来性DNA配列と標的化配列を含む標的化構築物、標的化配列と相同である相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む組成物と接触させる工程を含み、ここで、外来性DNA配列は、ゲノムと比較して少なくとも1個のヌクレオチドの違いを含み、標的化配列はヌクレアーゼにより認識される、方法を含む。本明細書に開示されているHITI方法の一部の実施形態では、外来性DNA配列は、標的細胞又は宿主細胞のゲノムに挿入される所望の配列を含有するDNAの断片である。外来性DNA配列の少なくとも一部は、標的細胞又は宿主細胞のゲノムの一部と相同な配列を有し、外来性DNA配列の少なくとも一部は、標的細胞又は宿主細胞のゲノムの一部と相同ではない配列を有する。例えば、一部の実施形態では、外来性DNA配列は、その中に突然変異を伴う宿主細胞ゲノムDNA配列の一部を含むことができる。したがって、外来性DNA配列が宿主細胞又は標的細胞のゲノムに組み込まれると、外来性DNA配列に見られる突然変異が宿主細胞又は標的細胞のゲノムへと保有される。本明細書に開示されているHITI方法の一部の実施形態では、外来性DNA配列は、少なくとも1つの標的化配列が隣接している。一部の実施形態では、外来性DNA配列は、2つの標的化配列が隣接している。標的化配列は、少なくとも1つのヌクレアーゼによって認識される特定のDNA配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、標的化配列と相同な配列を有する相補鎖オリゴヌクレオチドの存在下でヌクレアーゼによって認識される。一部の実施形態では、本明細書に開示されているHITI方法において、標的化配列は、ヌクレアーゼによって認識され、切断されるヌクレオチド配列を含む。標的化配列を認識するヌクレアーゼが当業者によって
知られており、これには、それらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復(CRISPR)ヌクレアーゼが含まれる。ZFNは、一部の実施形態では、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン及びDNA切断ドメインを含み、一緒に融合して、配列特異的ヌクレアーゼを創り出す。TALENは、一部の実施形態では、TALエフェクターDNA結合ドメイン及びDNA切断ドメインを含み、一緒に融合して、配列特異的ヌクレアーゼを創り出す。CRISPRヌクレアーゼは、一部の実施形態では、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復と相同なDNA配列を認識する天然に存在するヌクレアーゼであり、原核生物のDNAに通常見いだされる。CRISPRヌクレアーゼには、それらに限定されないが、Cas9 Cpfl、C2c3、C2c2、及びC2clが含まれる。好都合なことに、本発明のCas9は、以下のもののようなオフターゲット活性が低下しているバリアントである、
SpCas9 D10A(Ran, F.A.ら、Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc、2013. 8(11):2281~2308頁)(RuvCドメイン切断活性の不活性化を伴う)、
SpCas9 N863A(Ran, F.A.ら、Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc、2013. 8(11):2281~2308頁)(HNHドメイン切断活性の不活性化を伴う)、
SpCas9-HF1(Kleinstiver, B.P.ら、High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature、2016. 529(7587):490~5頁)(タンパク質工学によるCas9結合エネルギーの低減)、
eSpCas9(Slaymaker, I.M.ら、Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science、2016. 351(6268):84~8頁)(Cas9の正電荷の低減)、
EvoCas9(Casini, A.ら、A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nat Biotechnol、2018. 36(3):265~271頁)(REC3ドメインの突然変異誘発)、
KamiCas9(Merienne, N.ら、The Self-Inactivating KamiCas9 System for the Editing of CNS Disease Genes. Cell Rep、2017. 20(12):2980~2991頁)(発現後のCas9のノックアウト)。
15~30、20~50、40~80、50~100、100~1000、500~2000、1000~4,700塩基対の範囲の、特定数のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムから少なくとも1つの遺伝子又はそれの断片を排除することを含む。一部の実施形態では、方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムに、外来性遺伝子(本明細書では、外来性DNA配列又は目的の遺伝子としても定義される)又はそれの断片を導入することを含む。一部の実施形態では、方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムにおける突然変異遺伝子又はそれの断片を、野生型遺伝子又はそれらの断片に置き換えることを含む。一部の実施形態では、宿主遺伝子はサイレンシングされ、野生型遺伝子又はそのコード配列によって置き換えられる。一部の実施形態では、方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムの少なくとも1個のヌクレオチドを変化させ、その結果、遺伝子の発現が増加する。一部の実施形態では、方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムの少なくとも1個のヌクレオチドを変化させ、その結果、遺伝子の発現が低下する。一部の実施形態では、方法は、外来性プロモーターを宿主ゲノム又は標的ゲノムに導入し、その結果、遺伝子の発現が変化する。一部の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。本明細書に開示されているHITI方法は、非分裂細胞においてゲノムDNAに変更を加える能力を向上する。非分裂細胞には、それらに限定されないが、以下が含まれる:ニューロン、オリゴデンドロサイト、ミクログリア及び上衣細胞を含めて中枢神経系の細胞;感覚変換器細胞;自律神経細胞;感覚器官と末梢ニューロンの支持細胞;光受容体、杆体及び錐体を含めて網膜の細胞;壁細胞、糸球体有足細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の薄いセグメント細胞のループ、遠位尿細管細胞、集合管細胞を含めて腎臓の細胞;リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、血小板を含めて造血系の細胞;肝細胞、星細胞、クッパー細胞及び肝臓内皮細胞を含めて肝臓の細胞;アルファ、ベータ、デルタ、ガンマ及びイプシロンの各細胞を含めて膵臓の内分泌細胞;繊毛細胞、基底細胞、杯細胞及び肺胞細胞を含めて気道上皮の細胞、卵原細胞/卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞及び精子を含めて生殖細胞;骨細胞、破骨細胞及び骨芽細胞を含めて骨の細胞
;心筋細胞及び心臓ペースメーカー細胞を含めて心臓の細胞;甲状腺の濾胞上皮細胞;漿液細胞、粘液細胞及び味蕾を含めて上部消化管の細胞;壁細胞、主細胞、腸内分泌細胞を含めて胃の細胞;内皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨髄細胞、内耳細胞、真皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞。一部の実施形態では、本明細書に開示されているHITI方法は、分裂細胞においてゲノムDNAに変更を加える方法を提供し、ここで、方法は、当技術分野で開示されている以前の方法よりも高い効率を有する。分裂細胞には、それらに限定されないが、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋サテライト細胞、上皮細胞、膠細胞、及び星状細胞が含まれる。一部の実施形態では、標的化構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び/又は本明細書に記載のHITI法向けのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスによって標的細胞又は宿主細胞に導入される。ウイルスは、一部の実施形態では、標的細胞に感染し、標的化構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを発現し、これにより、標的化構築物の外来性DNAを宿主ゲノムに組み込むことが可能になる。一部の実施形態では、ウイルスは、センダイウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルスを含む。一部の実施形態では、ウイルスは偽型ウイルスである。一部の実施形態では、本明細書に記載の、標的化構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び/又はHITI法向けのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス遺伝子送達法によって標的細胞又は宿主細胞に導入される。非ウイルス遺伝子送達法は、一部の実施形態では、遺伝物質(DNA、RNA及びタンパク質を含めて)を標的細胞に送達し、標的化構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを発現し、これにより、標的化構築物の外来性DNAを宿主ゲノムに組み込むことが可能になる。一部の実施形態では、非ウイルス法は、DNA、mRNA又はタンパク質用のトランスフェクション試薬(ナノ粒子を含めて)、又は電気穿孔を含む。
遺伝的疾患等の疾患を処置するための方法及び組成物も本明細書で提供される。遺伝的疾患は、遺伝性DNAにおける突然変異によって引き起こされるものである。一部の実施形態では、遺伝的疾患は、ゲノムDNAの突然変異によって引き起こされる。遺伝的突然変異は当業者に知られており、これには、単一塩基対の変化又は点突然変異、挿入、及び欠失が含まれる。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、それを必要とする対象において遺伝的疾患を処置する方法を含み、ここで、遺伝的疾患は、野生型遺伝子と比較して少なくとも1個の変更されたヌクレオチドを有する突然変異遺伝子に起因するものであり、ここで、方法は、対象の少なくとも1つの細胞を、野生型遺伝子と相同なDNA配列及び標的化配列を含む標的化構築物、標的化配列と相同な相補鎖オリゴヌクレオチド、並びにヌクレアーゼを含む組成物と接触させる工程を含み、ここで、標的化配列はヌクレアーゼによって認識され、その結果、突然変異遺伝子又はその断片が野生型遺伝子又はその断片に置き換えられる。本明細書に開示されている方法によって処置される遺伝的疾患には、それらに限定されないが、ムコ多糖症(MPSI、MPSII、MPSIIIA、MPSIIIB、MPSIIIC、MPSIVA、MPSIVB、MPS VII)、スフィンゴ脂質症(ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマンピック病、GM1ガングリオシド蓄積症)、リポフスチン沈着症(バッテン病他)及びムコ脂質症を含むリソソーム蓄積症;糖尿病、アデニロコハク酸欠乏症、血友病A及びB、ALAデヒドラターゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、常染色体優性のような、肝臓が治療用タンパク質の産生及び分泌のための工場として使用することができる他の疾患が挙げられる。本発明で処置することができる網膜疾患は、例えば、網膜色素変性症(RHO、AIPL1、IMPDH1、RDS、PDE6B又は他の遺伝子の突然変異による)、錐体杆体ジストロフィー(CRX)、シュタルガルト病(ELOVL4)、フォンヒッペルリンダウ及び網膜芽細胞腫である。
リン塩基及び/若しくはピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然の、合成された又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。上記用語にはまた、メチル化による及び/又はキャッピングによる等の改変物、並びに未改変形態のポリヌクレオチドも含まれる。より具体的には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」という用語には、以下が含まれる:ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含む)、ポリリボヌクレオチド(D-リボースを含む)、プリン塩基又はピリミジン塩基のN-又はC-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、及び非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸(PNA))やポリモルホリノ(Anti-Virals, Inc.社製、Corvallis、Oreg.、Neugeneとして市販されている)ポリマー、及び他の合成配列特異的核酸ポリマー、ただし、当該ポリマーは、DNA及びRNAに見られるような、塩基対合及び塩基積重ねを可能にする構成で核酸塩基を含有することを条件とする。一部の実施形態では、核酸は、DNA、RNA、及びそれらのアナログの混合物を含むことができる。特に限定されない限り、当該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を包含する。別記されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント(例えば縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型(SNP)、及び相補的配列並びに明確に示された配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つ又は複数の選択された(又はすべての)コドンの第3の位置が混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって、行うことができる。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、及び遺伝子によってコードされるmRNAと同義的に使用される。「遺伝子」又は「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントを意味する。DNAセグメントは、遺伝子産物の転写/翻訳及び転写/翻訳の調節に関与するコーディング領域に先立つ領域と後
続する領域(リーダーとトレイラー)、並びに個々のコーディングセグメント(エクソン)の間の介在配列(イントロン)を含むことができる。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、1個又は複数のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに、並びに天然型アミノ酸ポリマー及び非天然型アミノ酸ポリマーに、適用される。本明細書で使用される場合、当該用語は、全長タンパク質を含めて、任意の長さのアミノ酸の鎖を包含し、ここで、アミノ酸残基が共有結合のペプチド結合によって連結されている。「組換え発現ベクター」とは、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的又は合成的に生成された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、又は核酸断片の一部とすることができる。通常、発現ベクターは、転写されるポリヌクレオチドを含み、プロモーターに作動可能に連結されている。これに関連して「作動可能に連結されている」とは、ポリヌクレオチドコード配列及びプロモーター等の2つ以上の遺伝子エレメントが、コード配列のプロモーター誘導性転写等の、エレメントの適切な生物学的機能を可能とする相対的な位置で配置されていることを意味する。「プロモーター」という用語は本明細書では、核酸の転写を誘導する核酸制御配列のアレイを指すために使用される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターの場合での、TATAエレメント等の、転写の開始部位の近傍に必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた任意選択で、転写の開始部位から数千塩基対も位置することができる遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含む。発現ベクター中に存在してもよいその他のエレメントとしては、転写を促進するもの(例えば、エンハンサー)、及び転写を終結させるもの(例えば、ターミネーター)、並びに発現ベクターから産生される組換えタンパク質にある特定の結合親和性又は抗原性を付与するものが挙げられる。「一塩基多型」又は「SNP」という用語は、対立遺伝子内を含めて、ポリヌクレオチドについての単一ヌクレオチドの変更を指す。これには、一ヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換、並びに単一のヌクレオチドの欠失又は挿入が含まれ得る。最も一般的には、SNPは二対立遺伝子マーカーであるが、三対立及び四対立遺伝子マーカーが存在する場合もある。非限定的な例として、SNP A\Cを含む核酸分子は、多型位置にC又はAを含むことができる。「対象」、「患者」及び「個体」」という用語は、同義的に本明細書で使用して、ヒト又は動物を含む。例えば、動物対象は、哺乳動物、霊長類(例えばサル)、家畜動物(例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はヤギ)、愛玩動物(例えばイヌ、ネコ)、実験室用試験動物(例えばマウス、ラット、モルモット、トリ)、獣医学的に重要な動物、又は経済的に重要な動物とすることができる。本明細書で使用される場合、「投与する」という用語には、対象への、経口投与、局所的接触、坐薬としての、静脈内、腹腔内、筋肉内、損傷内、クモ膜下腔内、鼻腔内としての各投与、又は皮下投与が含まれる。投与は、非経口及び経粘膜(例えば、口腔、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、又は経皮)を含めて、任意の経路によるものである。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内が含まれる。他の送達様式には、それらに限定されないが、リポソーム製剤、静脈注入、経皮パッチ等の使用が含まれる。「処置する」という用語は、それらに限定されないが、治療効果及び/又は予防効果といった有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の効果とは、処置下にある1つ又は複数の疾患、状態、又は症状における任意の治療上重要な改善又はそれらに及ぼす任意の治療上重要な影響を意味する。予防的効果の場合、疾患、状態又は症状がまだ発現していないとしても、特定の疾患、状態又は症状が進行するリスクのある対象に、又は疾患の1つ又は複数の生理学的症状が報告されている対象に、本発明の組成物を投与することができる。「有効量」又は「十分な量」という用語は、有益な又は所望の結果を達成するのに十分な薬剤(例えば、DNAヌクレアーゼ等)の量を指す。治療有効量とは、処置される対象と疾患の状態、対象の体重と年齢、疾患状態の重度、投与方法等のうちの1つ又は複数に応じて異なることができるが、これらは当業者であれば容易に決定することができる。特定の量とは、選択される個々の薬剤、標的細胞の種類、対象の標的細胞の位置、続いて行われる投薬レジメン、他の化合物と組合せで投与されるか否か、投与のタイミング、及びそれが運ばれる物理的送達システムのうちの1つ又は複数に応じて異なってもよい。
内部リボソーム侵入部位(IRES)エレメントとは、キャップ非依存性メカニズムを使用して翻訳の内部開始を促進するシス作用性RNA領域である。IRESエレメントの平均サイズは500bpである。好都合には、活性を維持する小人工IRESエレメントが報告されている。例を挙げると、[38]に2つの50nt長のIRESエレメントが記載されている:
AggTggTAgCCgCAAACATAgTTCAATACAAACTTgCTgTCTCggCgg(配列番号23)
及び
TgACAAACTgTACATgCCgTTAACTgTAATTTTgCgTgATTTTTTTgTAg(配列番号24)
コザック配列とは、ほとんどのRNA転写物の翻訳開始部位として機能するモチーフであり、同様にリボソームによって翻訳開始部位として認識され、ここからタンパク質がそのmRNA分子によってコードされている。in vivoでは、この部位は異なるmRNAで正確に一致しないことが多く、所定のmRNAから合成されるタンパク質の量はコザック配列の強さに左右される。この配列の一部のヌクレオチドは他のヌクレオチドよりも重要である:AUGは、タンパク質のN末端にあるメチオニンアミノ酸をコードする実際上の開始コドンであるので、最も重要である。(まれに、GUGが、開始コドンとして使用されるが、これは、mRNAに結合する開始複合体のmet-tRNAであるので、メチオニンはなおも第1のアミノ酸である。)「AUG」のAヌクレオチドは番号1と呼ばれる。「強力な」コンセンサスの場合、番号1のヌクレオチドを基準にして、位置+4にあるヌクレオチド(すなわち、コンセンサスの中にあるG)及び位置-3にあるヌクレオチド(すなわち、コンセンサスの中にあるA又はGのいずれか)は両方ともコンセンサスと一致する必要がある(番号0の位置はない)。「十分な」コンセンサスはこれらの部位のうちの1つだけを有し、「弱い」コンセンサスはどちらもない。-1及び-2にあるccは保存されていないが、全体の強さに寄与している。
2Aペプチドとは、細胞内の組換えタンパク質の切断を誘導することができる18~22個のaa長のペプチドである。2Aペプチドは、ウイルスのゲノムの2A領域に由来する。
終止コドンは、タンパク質合成の停止であるとシグナルを送る、メッセンジャーRNA(mRNA)分子内のトリヌクレオチド配列である。遺伝コードには、TAG、TAA、TGAの3つの終止コドンが存在する。本発明の意味の範囲内では、3つの考えられるフレームにストップコドンを挿入するために、2つの終止コドン、例を挙げると、TAATAAATAATAAATAATAA(配列番号1)又は並べ替え又はそれらの組合せを各フレームに挿入する。
プラスミド構築物:
AAVベクタープラスミドの生成
AAV血清型2のITRを含有するpAAV2.1[36]プラスミドに由来するAAVベクター産生に使用されるプラスミド。具体的には、以前の公開にあたって本発明者らのグループが生成したpAAV2.1プラスミドを使用した。
AAVベクターの産生及び特徴付け
AAVベクターを、HEK293細胞の三重トランスフェクションによるTIGEM AAVベクターコアによって産生し、これに続いて、CsCl2精製2ラウンドを行った[40]。各ウイルス調製物について、物理的力価(GC/mL)を、ドットブロット解析[41]によって及びTaqMan(Applied Biosystems社、Carlsbad、CA、米国)を使用したPCR定量化[40]によって行った力価を平均することによって決定した。ドットブロット及びPCR分析に使用するプローブを、pAAV2.1-IRBP-SpCas9-spAベクターについてはIRBPプロモーター、pAAV2.1-HLP-SpCas9-spAベクターについてはHLPプロモーター、及びドナーDNAベクターについてはbGHpA領域、とアニールするように設計した。プローブの長さは200から700bpの間で異なった。
HEK293細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)と2mM L-グルタミン(Gibco社、Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA、米国)を含有するDMEMで維持した。細胞を6ウェルプレート(1×106細胞/ウェル)にプレーティングし、リン酸カルシウム法(1~2mg/l×106細胞)を使用して、16時間後にCas9をコードするプラスミド及び異なるgRNA及びドナーDNAでトランスフェクトした;培地を4時間後に交換した。トランスフェクトした最大材料は3ugであった。すべての場合において、必要な場合には空ベクターを使用して、プラスミドDNAの量をウェル間で平衡化した。
6ウェルプレートにプレーティングした、HEK293細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシン0.05%EDTA(Thermo Fisher Scientific社、Waltham, MA、米国)で剥離し、PBSで2回洗浄し、PBS、5%FBS及び2.5mM EDTAを含有するソーティング溶液に再懸濁した。細胞を、EGFP及びDsRedの適切な励起及び検出設定を使用して、BD FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences社)を備えたBD FACS ARIA III(BD Biosciences社、San Jose、CA、米国)で分析した。蛍光検出のしきい値を、非トランスフェクト細胞に設定し、最低でも10,000細胞/試料を分析した。最低でも50,000個のGFP+又はGFP+/DsRed+細胞/試料をソートし、DNA抽出に使用した。
マウスをTIGEMアニマルハウス(Pozzuoli、イタリア)に収容し、12時間の明/暗サイクル下で維持した。C57BL/6Jマウスを、Envigo Italy SRL社(Udine、イタリア)から購入した。P347SマウスはEnrico Suraceから好意で提供されたものである。P347Sトランスジェニックマウスを、それらをそれら自身と交配することによってF0として維持し、そしてC57BL/6マウスと交配して実験マウスを作出した。
PCR増幅に使用したプライマーは以下の通りである:
Fwd:5'-TGGAAGGTCAATGAGGCTCT-3'(配列番号34)
Rev:5'-GACCCCACAGAGACAAGCTC-3'(配列番号35)
Fwd:5'-TGGGCAGACTAGGTCTGG-3'(配列番号36)
Rev:5'-TGTCTTCCACATGTTGAAGC-3'(配列番号37)
本研究は、the Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research、及び動物処置のためのthe Italian Ministry of Health regulationに従って実行した(Ministry of Health承認番号147/2015-PR)。手術は全身麻酔下で行い、動物の苦痛を最小限に抑えるべくあらゆる努力がなされた。
p1-p2新生児マウスに、Gombash Lampeらが公開したプロトコル[44]に従って注射した。総容量を35uLとした。注射用量を、総用量8×1013GC/Kgについて、各ベクター4×1013GC/Kgとした。
4週齢C57BL/6マウスに、各ベクターについて1.3×1013又は4×1013GC/kgである、総容量360uLの注射用量を、眼窩後叢を介して注射した。
網膜電図検査分析のために、P347S又はP23Hマウスを3時間暗順応させた。マウスを麻酔し、暗赤色灯下で定位固定装置に位置決めした。瞳孔を0.5%トロピカミド(Visufarma社、Rome、イタリア)一滴で散大し、体温を37.5度に維持した。
血清ARSB活性を、以前に記載の通りに[26]、特定の抗hARSBポリクローナル抗体(Covalab社)の使用に基づく免疫捕捉アッセイによって測定した。要約すると、96ウェルプレート(Nunclon)を、0.1M NaHCO3中の5μg/mlでコーティング(100μL/ウェル)し、4℃で一晩(O/N)インキュベートした。翌日、プレートを1%ミルクでブロックした;2時間のインキュベーション後、50μLの標準試料と未知試料(1:10に希釈)を各ウェルに添加した。プレートを4℃でO/Nでインキュベートした。翌日、5mM 4-メチルウンベリフェリルサルフェートカリウム塩(4-MUS;Sigma-Aldrich社)基質100μLを各ウェルに添加し、次いで、37℃で4時間インキュベートした。反応を、停止溶液100μL/ウェル(0.2Mグリシン)を添加することによって停止させた。プレートを、室温で10分間振とうし、マルチプレート蛍光光度計(Infinite F200;TECAN社)で蛍光を読み取った(365nmの励起/460nmの発光)。血清ARSBを、rhARSB(Naglazyme;BioMarin Europe社)標準曲線に基づいて決定したが、ミリリットルあたりのピコグラムとして表す。
以前に記載の通りに[45]、GAGアッセイのために、尿試料を水で1:50に希釈してGAG含有量を測定した。GAG濃度を、デルマタン硫酸標準曲線(Sigma-Aldrich社)に基づいて決定した。組織GAGを、タンパク質1ミリグラムあたりのGAGのマイクログラムとして表した。尿中GAGを、クレアチニンアッセイキット(Quidel社、San Diego、米国)で測定したクレアチニン含有量に対して標準化した。したがって、尿中GAGの単位を、クレアチニン1マイクロモルあたりのGAGのマイクログラムで与える。尿中GAGを、AF対照マウスのパーセンテージとして報告する。最新の観察時点での、尿中GAGレベルを各群について平均した。
血清試料を、製造元の取扱説明書に従ってマウスアルブミンELISAキット(Abcam社、Cambridge、英国)を用いて、分析した。試料を30,000倍に希釈し、プレートに結合するビオチン化アルブミンの競合に基づいて、アルブミンを決定した。血清アルブミンを、血清1ミリリットルあたりのアルブミンのミリグラムとして表した。
網膜の耳側部及び鼻部を分離するために、マウス屠殺後、眼の耳側域を焼灼した。採眼後、ライカM205FA実体顕微鏡(Leica社、Wetzlar、ドイツ)の下で眼を解剖して、耳側域のGFP蛍光を確認した。耳側域及び鼻域を解剖して2つの別々のチューブに入れた。
in vitro蛍光イメージング
in vitroでHITI後のDsRed発現を評価するために、1×106の密度で6ウェルにプレーティングした、HEK293細胞を、以前に記載の通りにトランスフェクトした。トランスフェクション48時間後、細胞をPBSで1回洗浄し、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で10分間固定し、PBSで3回洗浄し、DAPIを含むVectashield(Vector Lab社、Peterborough、英国)でマウントした。ZENソフトウェア(Carl Zeiss社)を備えたAxio Observer Z1(Carl Zeiss社、Oberkochen、ドイツ)の下で、EGFP、DsRed、及びDAPI向けの適切な励起及び検出設定を使用して、細胞を分析した。
組織切片におけるHITI後の網膜におけるDsRed発現を評価するために、C57BL/6Jマウス及び大ヨークシャー種ブタ[43]にIRBP-Cas9ベクター及びドナーDNA AAVベクターを網膜下に注射した。1カ月後、マウス及びブタを屠殺し、眼を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、30%スクロースを一晩浸透させた:次いで、角膜及び水晶体を解剖し、眼杯を最適な切断温度のコンパウンド(OCTマトリックス;Kaltek社、Padua、イタリア)に包埋した。10マイクロメートル厚の連続網膜凍結切片を水平軸に沿って切り出し、スライド上で漸次分散させ、DAPIを含んだVectashield(Vector Lab社、Peterborough、英国)でマウントした。次いで、適切な励起及び検出設定を使用して、共焦点LSM-700顕微鏡(Carl Zeiss社、Oberkochen、ドイツ)の下で凍結切片を分析した。AAV投与の後のマウス網膜凍結切片におけるHITI効率の評価の場合、2切片/眼に関して最も高い形質導入領域を40倍率で選択及び取得し、次いでImageJソフトウェア(http://rsbweb.nih.gov/ij/)を使用して分析した。DAPI染色によって特定した最低でも500PRを各画像についてカウントした。DsRed発現に適合するシグナルを持つPRを、分析切片のzスタックで観察したそれらの形状、並びにDsRed+外節の存在に基づいて一意に特定した。
HITI処置後の網膜外顆粒層の厚さを評価するために、P23HマウスにIRBP-Cas9ベクター及びドナーDNA AAVベクターを網膜下に注射した。3カ月後、マウスを屠殺し、眼を、Davidsonの固定液(脱イオン水、10%酢酸、20%ホルマリン、35%エタノール)及び連続エタノール中一晩脱水で固定し、次いで、パラフィンブロックに包埋した。10マイクロメートル厚のマイクロ切片を水平軸に沿って切り出し、スライド上で漸次分散させ、ヘマトキシリン-エオジンで染色した。次いで、切片を顕微鏡(Leica Microsystems GmbH社;DM5000)の下で分析し、倍率20×で取得した。各眼について、眼の中央部におけるスライスの耳側の注射した側からの1画像を分析のために使用した。ImageJソフトウェアの「フリーハンドライン」手段を使用して、遺伝子型/処置群にマスクした状態で、ONL厚さに関して3つの測定値を各画像で取った。
HITI後の肝臓でのDsRed発現を評価するために、C57BL/6Jマウスにp2にて又は4週齢にてのいずれかで注射し、心臓灌流によって注射1カ月後に屠殺した。肝臓を採取し、ライカ実体顕微鏡(Leica社、Wetzlar、ドイツ)で倍率25×で撮影した。次いで、各葉の小片を解剖し、すべての片を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、15%スクロースを終日及び30%スクロースを一晩浸透させた後、凍結切片用にO.C.T.マトリックス(Kaltek社、Padua、イタリア)に含めた。5マイクロメートル厚の網膜凍結切片を切り出し、スライド上で分散し、DAPIを含んだVectashield(Vector Lab社、Peterborough、英国)でマウントした。次いで、適切な励起及び検出設定を使用して、共焦点LSM-700顕微鏡(Carl Zeiss社、Oberkochen、ドイツ)下で凍結切片を分析した。マウス肝臓凍結切片におけるHITI効率を評価するために、各肝臓の3画像を20倍率で取得し、次いで、ImageJソフトウェア(http://rsbweb.nih.gov/ij/)を使用して分析した。核のDAPI染色によって特定した最低でも850個の肝細胞を各画像についてカウントした。DsRedの発現に適合するシグナルを持つ肝細胞を、その形状に基づいて一意に特定した。
DNA抽出
試料(GFP+又はGFP+/DsRed+で選別したHEK293細胞、網膜組織又は肝組織)を、それぞれ、市販の溶解緩衝液(GeneArt(商標)Genomic Cleavage Detection Kit、Invitrogen社、Carlsbad、California、米国)又は組織からのDNA抽出用の従来の溶解緩衝液(400mM NaCl、1%SDS、20mM TRIS-CL(pH8.0)、5mM EDTA(pH8.0))で溶解した。溶解緩衝液にプロテイナーゼKを補充し、これは、80度で15分間溶解した後に不活化させた。それぞれ、pCMV-mRho-P23Hプラスミドからの又はマウスゲノムからのCas9標的部位(RHOの第1のエクソン)を含む領域のPCR増幅に、DNA 50~200ngを使用した。使用したプライマーをTable 4(表26)に示す。
GeneArt(商標)Genomic Cleavage Detection Kitの製造元の推奨に従って、PCR産物1~3uL(PCR効率による)をSurveyorアッセイに使用した。要するに、DNAを99℃で脱アニールし、サーモサイクラーで緩徐な温度勾配によって再アニールした。再アニール後、検出酵素(T7エンドヌクレアーゼ)1uLを添加し、試料を37度で1時間インキュベートした。インキュベーション後、インデルの存在に起因するDNA切断産物を検出するために、試料を2%アガロースゲルでランした。
mRho-HITI-Indel、pRHO-Indel及びmAlb-HITI-Indelの各PCR産物もサンガー配列決定に使用した。次いで、配列を、インデル頻度のTIDEソフトウェア(https://tide.deskgen.com/)分析に使用した。
接合部PCR増幅
網膜又は肝組織から抽出したDNAを、HITI接合部のPCR増幅に使用した。組み込みの5'と3'の両方の接合部を増幅した。5'接合部の場合、mRho遺伝子又はmAlb遺伝子の第1のエクソンの上流の領域を認識するフォワードプライマー及びDsRedコード配列を認識するリバースプライマーを使用した。3'接合部の場合、ドナーDNAのbGHポリA配列を認識するフォワードプライマー、及び切断部位の後の、mRhoの第1のエクソン又はmAlbの第2のエクソンを認識するリバースプライマーを設計した。Table 5(表27)に使用したプライマーを示す。
ライブラリー調製の場合、HITI接合部PCR産物からのDNA計47.5ngを、配列決定用のSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit(Takara Bio USA社、Mountain View、CA、米国)を用いたDNAライブラリーの合成向けのインプットとして使用した。軽微な修正を加えて、製造元の推奨プロトコルに従った。SMART-Seq v4 Kitで生成したcDNA 75pgを、推奨プロトコルに従って、NEXTERA XT DNA Library Preparation kit (Illumina社、San Diego、CA、米国)を使用したライブラリー調製に使用した。ライブラリーの品質を、DNA高感度チップ(Agilent Technologies社、Santa Clara、CA、米国)でBioanalyzer DNA Analysisを使用することによって評価し、Qubit 4 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA、米国)を使用することによって定量化した。試料を、NextSeq 500/550 Mid Output v2 kitを使用して150+150ペアエンドランで配列決定した。データをGEO:GSE10717に寄託した。Illuminaベースコールの生データを、bcl2fastqソフトウェア(バージョンv2.20.0.422、Illumina社、San Diego、米国)を通してfastqファイルに変換した。
網膜におけるHITI
光受容体におけるHITIによる優性網膜色素変性症の遺伝子治療
ほとんどの努力が、AAVを使用して、機能喪失に起因する劣性状態において本来なら突然変異である遺伝子の正常なコピーを供給することに、歴史的には着目してきた。しかし、RHO突然変異(RP4)に起因するadRPでは、治療効果を達成するためには、正常なRHOコピーを付加するよりもむしろRHO突然変異型対立遺伝子をノックアウトする必要がある[47、48]。対立遺伝子非依存的又は対立遺伝子特異的方法で突然変異型RHOをノックダウンするために、様々な戦略が使用されてきた。対立遺伝子非依存的戦略には、AAV媒介RHO発現と一体となった短ヘアピンRNAによるRHOサイレンシング[49-51]及び不活性転写因子を使用したRHOサイレンシング[21]が含まれる。対立遺伝子特異的戦略には、対立遺伝子特異的サイレンシング及び対立遺伝子特異的ゲノム編集が含まれる。CRISPR/Cas9(Cas9)によるゲノム編集が、優性IRDの処置向けの汎用性且つ効率的な戦略としてここ数年で浮上してきた[4、48]。PRは最終分化細胞であるので、切断後のHDR修正の効率は低い[10、52]。一方、NHEJは、PRにおける主要なDNA修復メカニズムである。生じるインデルは通常、標的遺伝子をノックアウトするために使用される[3]。このことが、網膜色素変性症の種々のモデルの網膜で対立遺伝子特異的RHOノックアウトを誘導するのに使用されてきた。2つの異なるグループが、それぞれmRho遺伝子座及びRHO遺伝子座における一般的P23H突然変異を標的化した。どちらの場合も、マウスモデルの網膜における対立遺伝子特異的ゲノム編集により、RP4の部分修正が得られた[23、53]。同様に、Bakondiらは、トランスジェニックラットモデルにおいてmRhoのSer334-Ter突然変異を標的化した[22]。Yuらは、NRL遺伝子座を標的化し、マウスにおいて網膜変性の予防を認めた[54]。この方法は、Burnrightらによってもex vivoで使用されて、遺伝子修正の人工多能性幹細胞を作出したが、この細胞は、網膜治療に潜在的に使用可能性である[55]。しかし、このようなアプローチは、GOF対立遺伝子での双方のgRNA/PAMの組合せのアベイラビリティによって限定されるとともに、突然変異特異的であり、このことが、RP4の遺伝的異質性に起因してその臨床的適用性を限定している[19、48]。
光受容体においてHITIがいかに精密であるかをよりよく理解するために、本発明者らは、組み込みの5'接合部及び3'接合部を増幅するために2つのプライマーペアを設計した(図5A)。両方のプライマーペアは、gRNA処理網膜から抽出したDNAでのみ予想サイズのPCR産物を増幅することができたが、スクランブル処理網膜からのDNAでは増幅できなかった。(図5B)。
ヒトの眼に関する解剖学をよりよく再現する動物モデルにおいてHITI効率を特徴付けるために、本発明者らは、重要な前臨床モデルであるブタの眼を使用することにした。このために、本発明者らは、ブタロドプシン(pRho)遺伝子の第1のエクソンに特異的なgRNA、及び以前の実験で使用したものと同一であるがpRho標的部位が隣接しているドナーDNAを設計した。これらを用いて、本発明者らは、図14に示したベクターの同じタイプを生成した。各ベクター2.5×1011GC/ブレブの網膜下注射を、各網膜あたり2ブレブで3カ月齢大ヨークシャー種で実施した。注射の1カ月後、網膜凍結切片の蛍光顕微鏡検査では、gRNA処理網膜の注射域にDsRed+光受容体が存在すること、スクランブル処理網膜では存在しないことが示された。(図7A)。この場合も、IRESは、コザックよりもかなり良好な成績であった(図7B)。
HITI効率がAdRP表現型を修正するのに十分であるかどうかを評価するために、本発明者らは、IRES配列及びhRHO遺伝子のコード配列(hRHO CDS)を備えるドナーDNA、並びにmRho gRNA又はスクランブルgRNAを保有する2つのAAV2/8ベクターを生成した(図9A)。これらのベクターを、AAV2/8-IRBP-SpCas9ベクターと一緒に注射した。
本発明者らのアプローチに関する重要な問題とは、本発明者らがマウス及びブタのRho配列を標的化したことである。臨床適用性のためには、ヒトRHO遺伝子を標的にする必要がある。本発明者らは、ヒトRHO遺伝子を標的化するgRNA及びドナーDNAを開発した。本発明者らは、HEK-293細胞においてin vitroでこのアプローチについて試験した。mRNAからのdsREDの翻訳を最適化するために、発明者らは2つの異なる翻訳開始配列について試験した:コザック配列及び小50bp IRES配列[38]。本発明者らはまた、リボソームスキッピングT2A配列についても試験した(図11A)。CMVプロモーターの制御下でhRHOをコードするプラスミド、hRHO特異的gRNAを含むCas9-GFPをコードする第2のプラスミド、及びドナーDNAを保有する第3のプラスミドを、HEK293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後の蛍光顕微鏡検査及びFACSソーティングが示したところは、特にdsREDの強度に関して、IRESとT2Aの両方がコザックより控えめに成績が良かったことである(35.6%に対して39.4%及び40.3%)(図11B、図11C)。
AAVによる肝臓指向遺伝子治療には、肝細胞の細胞分裂過程でのベクター希釈に起因していくつかの限定がある。このようなことが、最も重度な症状の一部を回避又は少なくとも調整する可能性がある、いくつかの遺伝性疾患の新生児又は小児の処置を妨げている。これ及びその他の理由のため、ゲノム編集の分野は、肝臓からの導入遺伝子の安定した発現を達成する戦略の開発に着目してきた。治療用タンパク質の発現のためにアルブミン遺伝子座でZFN媒介HDRを使用する2つの治験が、それぞれMPSI及びMPSIIに対して承認されてきた(治験番号NCT02702115及びNCT03041324)。肝臓からの治療用タンパク質の組み込み及び発現のための「セーフハーバー」としてアルブミン遺伝子座を標的化する本アプローチは、他のいくつかの疾患の動物モデルに適用されてきたが[9、57-59]、小児患者において使用可能であった従来のGTの代替法として将来おおいに有望である。
新生児マウスにおいてアルブミン遺伝子座でのHITIが実行可能かどうかを判定するために、2日齢C57BL/6マウスにAAV2/8の静脈内注射を投与した(各ベクターの用量:4×1013GC/Kg)。注射の1カ月後に肝臓を採取し、蛍光実体顕微鏡の下で観察した。gRNA処理肝臓は、DsRed+フォーカスが多数存在することを示し、これは、注射後の肝細胞の予想されるクローン増殖と一致した(図13A)。スクランブル処理肝臓は、DsRed+フォーカスを示さなかった。肝臓凍結切片の蛍光顕微鏡検査では、gRNA処理肝臓においてDsRed+肝細胞が3.26%であること、及びスクランブル処理肝臓においてそれらが非存在であることが示された(図13B、図13C)。興味深いことに、DsRed+肝細胞はクローン増殖と一致するクラスターを形成しているようであった。(図13B)。本発明者らはまた、IRES-DsRedドナーDNAを保有するAAV2/8ベクターを生成し、これらを同じ条件に従って注射した。この場合、gRNA処理肝臓とスクランブル処理肝臓の両方がDsRed+肝細胞の存在を示したが、これは、Hepa1.6細胞で確認したIRES配列の肝細胞限定のプロモーター活性(promotorial activity)が原因である可能性がある(データ示さず)。この理由ため、本発明者らは、以下の実験についてはスタートシグナルとしてコザックのみを使用した。
DsRed+肝細胞の存在とアルブミン遺伝子座のCas9媒介切断を関連付けるために、本発明者らは、注射した肝臓からDNAを抽出し、Cas9標的部位周辺の領域のPCR増幅を実施した。続いて、PCR断片をSurveyorアッセイに使用したが、アッセイでは、gRNA処理肝臓においてのみインデルが存在し、スクランブル処理肝臓においては存在しないことを示された(図14A)。次いで、本発明者らは、TIDE分析を使用して、生じたインデルの頻度及びタイプを評価した。本発明者らは、gRNA処理肝臓で9.9%のインデル効率を、PBSを注射した肝臓のスクランブル処理で無視できるインデルを観察した(図14B)。興味深いことに、NHEJ修復によるほとんどの欠失が1から6bpの間であると思われる場合でも、すべてのgRNA処理肝臓において、本発明者らは7bp欠失が非常に高頻度であることを観察した(図20A、青色矢印)。インデル予測のためのShenらが使用したモデルに基づく配列分析[61]よって、DSBの両サイドに2つの小4bpマイクロホモロジー領域を特定することができたが、これらはこの7bpの欠失を介して効率的なMMEJ修復をもたらす(図14C)。
次に、本発明者らは、標的化組み込み後に5'接合部及び3'接合部を増幅するためにPCRプライマーを設計した。5'接合部の場合、Fwdプライマーはアルブミンの第1のイントロンを認識し、一方、RevプライマーはドナーDNAを認識した。3'接合部の場合、FwdプライマーはドナーDNAを認識し、一方、Revプライマーはアルブミンの第2のエクソンを認識した(図15A)。両方の場合において、本発明者らは、インデルとDsRed+肝細胞の両方の存在と一致して、gRNA処理肝臓においてのみ予想サイズのPCR産物の増幅を観察した。スクランブル処理肝臓より抽出したDNAから、PCR産物は増幅されなかった(図15B、図15C)。次いで、増幅PCR産物を精製して、次世代配列決定分析に使用した。各接合部について80,000から350,000の間のリードが得られた。細菌クローン配列決定からのデータと一致して、5'接合部において、本発明者らは、挿入頻度が低いこと及び欠失頻度が38%であることを観察した(図16A)。ほとんどの挿入はlbpのものであったが、欠失は1から47bpまでに大部分が範囲し、lbpの欠失が最も共通のものであった(図16C)。3'接合部では、本発明者らは、切断部位でlbp挿入が高頻度であること(図16B、図16C)、並びに2bp挿入がいくつかあることを観察した。全体的に見て、欠失はより頻度が高いが(52%)、また切断部位の周りにより多く分布しており、切断部位より1bpから38bpまでの範囲に及んだ。(図16B)。最も共通の欠失は1から18bpの間であり、本発明者らはまた、共通の42bp欠失を特定した。
次に、本発明者らは、HITIが、新生児マウスにおけるのと同様の効率で成体マウスの肝臓においても実施され得るかどうかを評価することを望んだ。この理由のために、4週齢C57BL/6マウスに、各ベクターについて、新生児マウスで使用した同じ用量4×1013GC/Kg(高用量、HD)、又は低用量、1.3×1013GC/kg(低用量、LD)を静脈内注射した。注射の1カ月後、本発明者らは、蛍光顕微鏡検査を使用して、DsRed+肝細胞の存在を評価した。本発明者らは、DsRed+肝細胞がHD群で2.76%、LD群で1.25%であることを観察した。DsRed+肝細胞は、使用したベクター用量とは無関係に、スクランブル処理肝臓では存在しなかった(図17A、図17B)。しかし、HITIの効率は、どちらの場合も新生児注射で得られたものよりも低かった。これは、新生児肝臓でのより良好な形質導入効率によって又は改変肝細胞のクローン増殖によって説明可能であるが、理論的には、アルブミン遺伝子座でのDsRedのHITIは選択優位性を付与しないはずである。
次に、本発明者らは、HITIを使用して、MPS VIマウスのアルブミン遺伝子座にアリールスルファターゼB(ARSB)のコード配列を組み込むことにした。そのために、本発明者らは、既に記述のAAV2/8-HLP-Cas9-shpolyAベクターを使用したが、本発明者らは、アルブミン特異的gRNA又はスクランブルgRNA向けの発現カセット、並びに3つのフレームのSTOPシグナル、翻訳を開始するコザックシグナル、ARSBのコード配列、及びbGHポリAをコードする標的隣接ドナーDNAを保有する別のベクターを生成した(図18)。本発明者らは、DsRedドナーDNAを使用して3'接合部において観察していた欠失を考慮して、bGH配列における望ましくない欠失を回避するために、bGHとCas9標的部位との間に200bpスタッファーDNAを付加した。2日齢MPS VI-/-マウスに、各ベクターについて、6×1013GC/Kgを静脈内注射した。ARSBの血中レベルの毎月測定では、gRNA処理マウスの血清においてのみARSBが存在することが示されたが、スクランブル処理マウスではARSBはまったく存在しなかった。すべてのgRNA処理マウスが、注射後1カ月でARSB発現を示した(図19)。2匹のマウスが1カ月目と2カ月目の間でARSBレベルの相対的な減少を示したが、2カ月目以後はARSBレベルは安定した。得られたレベルは、非罹患マウスにおいて内因性レベルである、AAV2/8-TBG-ARSB 2×1011GC/Kgの注射後に得られたレベルの1/6から1/3の間の範囲であり、最高の成績であったマウスは2572pg/mLに達した(図19)。成体MPS VIマウスにおいてAAV2/8-TBG-ARSBベクター2×1011GC/Kgの注射後に得られたレベル[29]が、HITIアプローチで観察されたものよりも高かったため、本発明者らは、HITIに使用したのと同じ用量でこの同じベクターを新生児に注射することによってより高いレベルのARSB発現を達成することができるかどうかを試験することにした。このために、新生児MPS VI-/-マウスにAAV8-TBG-ARSBベクター6×1013GC/Kgを注射した。予想通り、p30でのARSBレベルは分析した3匹のマウスで非常に高かったが、p60で減少し、次いでp90で安定した状態のままであった(図19)。この減少が後の時点で継続するかどうかを評価するために、且つこの戦略で得られたレベルをHITIで得られたレベルと比較するために、更なる解析が実施されている。到達した血清ARSBレベルがMPS VI表現型を修正するのに十分であるかどうかを判定するために、著者らは注射の3カ月後に尿中GAGレベルを定量化し、スクランブル処理マウスと比較してgRNA処理マウスでGAGレベルが46%減少することを観察したが(図20)、このことから、得られた血清ARSBレベルは、組織内のGAG消失をヘテロ接合MPS VI+/-マウスに匹敵するレベルまでに回復するのに十分であることが、示唆される。同様に、AAV8-TBG-ARSBを注射したマウスはGAGの50%減少を示し、gRNA処理マウスに対して統計的有意差は観察されなかった。心臓弁のような組織におけるGAG蓄積を定量化するために、より長い時点でのMPS VI表現型修正の更なる特徴付けが屠殺時に実行されるであろう。
Albを標的化するために提案されている戦略に関連した重大な懸念とは、ゲノム編集後のAlbのノックアウトが考えられることである。この理由のため、Cas9及びAlb特異的gRNAによる処理が、処理されたMPS VIマウスにおいて血清アルブミンレベルを減少する恐れがあるかどうかを評価することにした。このために、血清アルブミンレベルをp90にて測定した。スクランブル処理又は非注射のマウスと比較した場合、gRNA処理マウスではアルブミンレベルの相対的な低下が観察されたが、この低下は有意ではなく、観察されたレベルはこの年齢のマウスにとって正常範囲にあると思われた(図21)。
優性遺伝性疾患は、遺伝子治療により標的化することが常に困難であった。ゲノム編集は、GOF突然変異の処置戦略を開発するための重要な手段となる可能性がある。
広がりつつあり、数年間以内に実施される研究が、ヒト使用へのその適用可能性の景観を定めることになるであろう。
まとめると、これらの結果が示すところは、ロドプシン遺伝子座でのHITIは、異なる種の網膜でin vivoで効率的であり、両方のAAVベクターによる形質導入並びにgRNAの効率に高度に依存していることである。HITIは、両方の対立遺伝子をノックアウトし、ドナーDNAからの正常な対立遺伝子に置き換えることにより、優性遺伝性疾患の対立遺伝子非依存的治療に使用することができる。
Claims (36)
- 外来性DNA配列を細胞のゲノムに組み込む方法であって、
細胞を:
a)- 少なくとも1つのストップコドン及び翻訳開始配列(TIS)又は
- リボソームスキッピング配列、及び
- 前記外来性DNA配列
を含み、逆位の標的化配列が5'及び3'にて隣接する、ドナー核酸;
b)標的化配列と相同な相補鎖オリゴヌクレオチド、並びに
c)標的化配列を認識するヌクレアーゼ
と接触させる工程を含む、方法。 - 翻訳開始配列(TIS)は、コザックコンセンサス配列又はIRES配列である、請求項1に記載の方法。
- リボソームスキッピング配列は、T2A、P2A、E2A、F2A、好ましくはT2A配列であり、好ましくは、前記IRES配列は、60~70bpの、好ましくは約50bpの、より好ましくは50bpの合成配列である、請求項1に記載の方法。
- ドナー核酸は:
- 少なくとも1つのストップコドン、及び
- コザック配列であるか又は60~70bpの、好ましくは約50bpの、より好ましくは50bpの合成配列であるIRES配列である、翻訳開始配列(TIS)、及び
- 前記外来性DNA配列
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - ドナー核酸は、3つの考えられるフレームにストップコドンを含み、好ましくは、3つの考えられるフレームの前記ストップコドンは、各フレームに挿入された2つの終止コドンを含むか又はそれからなり、好ましくは、3つの考えられるフレームの前記ストップコドンは、配列番号1の配列(TAATAAATAATAAATAATAA)又はその並べ替えを含むか又はそれからなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- a)コザックコンセンサス配列は:
- 配列番号54(gccacc)と少なくとも98%の同一性を有する配列若しくはその機能的断片又は
- 配列番号55(gccncc)の配列(配列中、nはgであってもaであってもよい)
を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は
b)IRES配列は、配列番号24(TgACAAACTgTACATgCCgTTAACTgTAATTTTgCgTgATTTTTTTgTAg)又は配列番号23(AggTggTAgCCgCAAACATAgTTCAATACAAACTTgCTgTCTCggCgg)と少なくとも95%の同一性を有する配列又はその機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は、
c)リボソームスキッピング配列は、配列番号32(ggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacct)又は配列番号25~28をコードする配列と少なくとも80%の同一性を有する配列又はそれらの機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は
d)標的化配列は、配列番号29(GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、配列番号30(AGTACTGCGGATACTCAAAG)、配列番号31(ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)と少なくとも95%の同一性を有する配列又はその機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は、
e)標的化配列と相同な相補鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号56(CCAGGTAGTACTGCGGCTGC)、配列番号57(CTTTGAGTATCCGCAGTACT)、配列番号58(ATGGGCGATCTCACTCTTGT)と少なくとも95%の同一性を有する配列又はその機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有する、
請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - ドナー核酸は、ポリアデニル化シグナル、好ましくはウシ成長ホルモンポリAを更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 標的化配列は、ロドプシン(Rho)遺伝子に含まれている配列又は肝臓で発現される遺伝子、例えばアルブミン遺伝子に含まれている配列である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 標的化配列は、肝臓で発現される遺伝子に含まれる配列であり、ドナーDNA配列は、分泌性治療用タンパク質、例えば、アリールスルファターゼB(ARSB)のコード配列である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 標的化配列は:
- 好ましくはヒト、マウス又はブタ由来のRHO遺伝子の第1のエクソン、
- 好ましくはヒト又はマウス由来のアルブミン遺伝子の第2のエクソン、
又はその機能的断片
内に含まれる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。 - 標的化配列はガイドRNA(gRNA)標的部位であり、標的化配列と相同な前記相補鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子の標的化配列にハイブリダイズするガイドRNAである、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記gRNA標的部位は、配列番号29(GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、配列番号30(AGTACTGCGGATACTCAAAG)、配列番号31(ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)と少なくとも95%の同一性を有する配列又はその機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有し、且つ/又は、前記ガイドRNAは、配列番号29(GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、配列番号30(AGTACTGCGGATACTCAAAG)、配列番号31(ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)と少なくとも95%の同一性を有する配列又はその機能的断片を含むか又はそれらを本質的に有する、請求項11に記載の方法。
- 前記外来性DNA配列は、レポーター遺伝子を含み、好ましくは、前記レポーター遺伝子は、ディスコソマレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ及びβ-グルクロニダーゼのうちの少なくとも1つから選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼは、CRISPRヌクレアーゼ、TALEN、DNAガイド型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択され、好ましくは、前記ヌクレアーゼは、Cas9、Cpfl、Casl2b(C2cl)、Casl3a(C2c2)、Cas3、Csf1、Casl3b(C2c6)及びC2c3、又はSaCas9やVQR-Cas9-HF1等のそれらのバリアントからなる群から選択されるCRISPRヌクレアーゼである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 相補鎖オリゴヌクレオチド、ドナー核酸及びヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターに含まれており、好ましくは、前記ウイルスベクターは:アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス及びアデノウイルスから選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、幹細胞、造血幹細胞、造血前駆幹細胞のうちの1種又は複数からなる群から選択され、好ましくは、細胞は、対象の眼の網膜の細胞又は肝細胞である、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞。
- 医学的使用のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞。
- 遺伝的疾患の処置に使用するための、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞。
- 突然変異型対立遺伝子と野生型対立遺伝子の両方がドナーDNAによって提供される遺伝子の正常なコピーに置き換えられる、優性遺伝性疾患の処置に使用するための、又は機能喪失に起因する遺伝性疾患及び一般疾患の処置に使用するための、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞であって、好ましくは、前記疾患は、血友病、糖尿病、ムコ多糖症(MPSI、MPSII、MPSIIIA、MPSIIIB、MPSIIIC、MPSIVA、MPSIVB、MPSVII)、スフィンゴ脂質症(ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマンピック病、GM1ガングリオシド蓄積症)、リポフスチン沈着症(バッテン病他)及びムコ脂質症を含むリソソーム蓄積症;アデニロコハク酸欠乏症、血友病A及びB、ALAデヒドラターゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、常染色体優性を含む、細胞。
- 優性遺伝性の眼疾患、例えば網膜変性、好ましくは網膜色素変性症、神経疾患及び肝疾患の処置に使用するための、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞。
- a)- 少なくとも1つのストップコドン及び翻訳開始配列(TIS)又は
- リボソームスキッピング配列、及び
- 外来性DNA配列
を含み、逆位の標的化配列が5'及び3'にて隣接する、ドナー核酸;
b)標的化配列と相同な相補鎖オリゴヌクレオチド、並びに
c)標的化配列を認識するヌクレアーゼ
を含む、システム。 - ドナー核酸及び/又はストップコドン及び/又は翻訳開始配列(TIS)及び/又はリボソームスキッピング配列及び/又は外来性DNA配列及び/又は標的化配列及び/又は相補鎖オリゴヌクレオチド及び/又はヌクレアーゼは、請求項1から14のいずれか一項に規定の通りである、請求項22に記載のシステム。
- 相補鎖オリゴヌクレオチド及び/又はドナー核酸及び/又はヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、1つ又は複数のウイルスベクター又は非ウイルスベクターに含まれており、好ましくは、前記ウイルスベクターは:アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びレンチウイルスから選択される、請求項22又は23に記載のシステム。
- 医学的使用のための、請求項22から24のいずれ一項に記載のシステム。
- 請求項22から24のいずれか一項に記載のシステム、又は請求項22から24のいずれか一項に規定のドナー核酸及び/若しくは標的化配列と相同な相補鎖オリゴヌクレオチド及び/若しくは標的化配列を認識するヌクレアーゼを含む、発現ベクター。
- アデノ随伴ベクター(AAV)、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はネイキッドプラスミドDNAベクターからなる群から選択される、請求項26に記載の発現ベクター。
- 請求項22若しくは23に記載のシステム、又は請求項26若しくは27に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項22若しくは23に記載のシステム、又は請求項26若しくは27に記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
- AAVのカプシドタンパク質を含む、請求項29に記載のウイルス粒子。
- AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及びAAV10からなる群のうちの1つ又は複数から、好ましくはAAV2血清型又はAAV8血清型から選択される血清型のAAVのカプシドタンパク質を含む、請求項30に記載のウイルス粒子。
- 以下:請求項22若しくは23に記載のシステム、又は請求項26若しくは27に記載の発現ベクター、請求項28に記載の宿主細胞、請求項29から31のいずれか一項に記載のウイルス粒子、及び薬学的に許容される担体のうちの1つを含む、医薬組成物。
- 1つ又は複数の容器に含まれる、請求項22若しくは23に記載のシステム、又は請求項26若しくは27に記載の発現ベクター、請求項28に記載の宿主細胞、請求項29から31のいずれか一項に記載のウイルス粒子、又は請求項32に記載の医薬組成物を含み、任意選択で、核酸構築物、ベクター、宿主細胞、ウイルス粒子又は医薬組成物をどのように患者に投与するかについて記載する取扱説明書又はパッケージング材料を更に含む、キット。
- 医薬として使用するための、請求項22若しくは23に記載のシステム、又は請求項26若しくは27に記載の発現ベクター、請求項28に記載の宿主細胞、請求項29から31のいずれか一項に記載のウイルス粒子、又は請求項32に記載の医薬組成物。
- 好ましくは、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、錐体ジストロフィー又は錐体杆体ジストロフィー、シュタルガルト病(ELOVL4)、フォン-ヒッペルリンドウ病、網膜芽細胞腫、神経性疾患、肝疾患、ムコ多糖症(MPSI、MPSII、MPSIIIA、MPSIIIB、MPSIIIC、MPSIVA、MPSIVB、MPSVII)、スフィンゴ脂質症(ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマンピック病、GM1ガングリオシド蓄積症)、リポフスチン沈着症(バッテン病他)及びムコ脂質症を含むリソソーム蓄積症;糖尿病、アデニロコハク酸欠乏症、血友病A及びB、ALAデヒドラターゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、常染色体優性のような、肝臓を治療用タンパク質の産生及び分泌のための工場として使用し得るその他の疾患から選択される、網膜ジストロフィーの処置に使用するための、請求項22若しくは23に記載のシステム、又は請求項26若しくは27に記載の発現ベクター、請求項28に記載の宿主細胞、請求項29から31のいずれか一項に記載のウイルス粒子、及び請求項32に記載の医薬組成物。
- ウイルス粒子の生産のための、請求項22若しくは23に記載のシステム、又は請求項26若しくは27に記載の発現ベクターの使用。
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CN115927470A (zh) * | 2022-11-11 | 2023-04-07 | 北京镁伽机器人科技有限公司 | 腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002070710A1 (en) * | 2001-03-01 | 2002-09-12 | University Of California | Method to identify ires elements |
JP2007238629A (ja) * | 2007-06-08 | 2007-09-20 | Human Genome Sciences Inc | インターロイキン−19 |
WO2016176690A2 (en) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Gene therapy for autosomal dominant diseases |
JP2016533769A (ja) * | 2013-10-07 | 2016-11-04 | プレステージ バイオファーマ プライベート リミテッド | 抗体発現用バイシストロニック発現ベクター及びそれを用いた抗体の生産方法 |
WO2018013932A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Salk Institute For Biological Studies | Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells |
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US4261975A (en) | 1979-09-19 | 1981-04-14 | Merck & Co., Inc. | Viral liposome particle |
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US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
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US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002070710A1 (en) * | 2001-03-01 | 2002-09-12 | University Of California | Method to identify ires elements |
JP2007238629A (ja) * | 2007-06-08 | 2007-09-20 | Human Genome Sciences Inc | インターロイキン−19 |
JP2016533769A (ja) * | 2013-10-07 | 2016-11-04 | プレステージ バイオファーマ プライベート リミテッド | 抗体発現用バイシストロニック発現ベクター及びそれを用いた抗体の生産方法 |
WO2016176690A2 (en) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Gene therapy for autosomal dominant diseases |
WO2018013932A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Salk Institute For Biological Studies | Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells |
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