TW200533376A - Compositions and methods for treating lung cancer - Google Patents

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TW200533376A
TW200533376A TW094108340A TW94108340A TW200533376A TW 200533376 A TW200533376 A TW 200533376A TW 094108340 A TW094108340 A TW 094108340A TW 94108340 A TW94108340 A TW 94108340A TW 200533376 A TW200533376 A TW 200533376A
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Yusuke Nakamura
Yataro Daigo
Shuichi Nakatsuru
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Oncotherapy Science Inc
Univ Tokyo
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Description

200533376 九、發明說明： 本發明主張美國臨時申請案序號第60/555,757號（於 2004年03月24日提出申請）之優先權，特將該申請案之 全部内容結合於此為參考。 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於生物科學之領域，且特別有關於癌症 研究之領域。特別地，本發明係有關於一種包含具抑制 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 表現之核酸 的組合物。在一些實施例中，該核酸係為對應來自這些基 因之次序列的小型干擾RNA ( smaU interfering RNA， siRNA) 〇 【先前技術】 肺癌疋世界上最常見癌症之一。非小細胞肺癌 (Non-small cell lung cancer，NSCLC)估計佔所有肺癌
近’鮮員然疋隶為常見之類型（American cancer s〇ciety. Cancer Facts and Figures 200 1 (Am. Chem. Soc. Atlanta). 2 0 0 1 )。儘管多學科治療最近有新的進展，但由於大部分的 非小細胞肺癌直到晚期才會被診斷出來，因此總的1 〇年存 活比率仍偏低’為 10% (Fry，w· A.，Phi 11 ips，J. L.，和 Menck， H. R. Ten-year survey of lung cancer treatment and survival in hospitals in the United States: a national cancer data base report, Cancer. 86: 1867-76, 1 999·)。以鉑為基礎的化學治療被認為是治療NSCLC之參 考標準’然而這些藥物只能對晚期非小細胞肺癌（advanced 2125-6960-PF 5 200533376 NSCLC )之病人延長約六星期之存活時間（Chemotherapy i η non-small cell lung cancer: a meta-analysis using updated data on individual patients from 52 randomised clinical trials. Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group, Bmj. 311： 899-909, 1 9 9 5 ·)。對此疾病’現有多種的標的治療正在測試當中， 其中包括酪氨酸激酶抑制劑，然截至目前為止顯著結果僅 侷限於少數病人，而且一些領受者會產生嚴重之副作用 9 (Kris Μ, N. R. , Herbst RS A phase II trial of ZD1839 (’Iressa’） in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients who had failed platinum- and docetaxel-based regimens (IDEAL 2), Proc Am Soc Clin Oncol· iV·· 292a(A1166)，2002·)。因此，發展高效化學 治療藥物及預防策略仍是件緊迫重要的事。 【發明内容】 A 人地發現，抑制 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或NPTX1表現對於抑制各種癌症細胞（包括非小細胞癌症 細胞）之細胞生長是有效的。因此，在某種程度上來說， 本申請案所述之發明係以該發現為基礎。 本發明提供抑制細胞生長之方法。所提供的方法中， 包括使細胞與包含可抑制PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或NPTX1表現之siRNA的組合物接觸。本發明亦提供抑制 個體之腫瘤細胞生長的方法。這樣的方法包括對該個體投 與包含可專一地與 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLcn 或 2125-6960-PF β 200533376 NPTX1中任一者之序列雜交之siRNA的組合物。本發明之 另一形恶係提供抑制生物樣本中細胞内ρΚρ3、CDCA1、 CDCA8、DLX5、URLC11或NPTX1基因表現之方法。基因表
現可藉由導入一定量足以抑制PKP3、CDCA1、cdca8、DLX5、 URLC11或NPTX1基因表現之雙股核糖核酸（rna)分子進 入細胞。本發明之另一形態係有關於在所提供之方法中有 用的產物，包括核酸序列和載體，以及包含它們的組合物。 在所提供的產物中，siRNA分子具有抑制pKp3、CDai、 CDCA8、DLX5、URLC11或NPTX1基因表現之特性，一旦將 siRNA分子導入可表現該基因之細胞時，則可抑制該基因 表現。在這樣的分子中，包含編譯股（sense Shand)及 反義股（antisense strand )，其中該編譯股包含對應 PKP3、CDCM、CDCA8、DLX5、URLC11 或 Νρτχι 標的序列 2 核㈣苷酸序列，而該反義股包含與該編譯股互補之核糖 核脊酸序列。分子之編譯股與反義股可相互雜交形成雙股 分子。 本發明所用之名詞「有機體」係指由至少—細胞所电 成：任何具有生命之實體。具有生命之有機體可以是像真 核單細胞般簡單；或是像哺乳動物（包括 何入頰）般複雜。 本發明所用之名詞「生物樣本」係雜敕彳 」你^整個有機體或其 、、且織、細胞或組成部分（如體液，包括血、游 ，汉、黏液、淋巴 液、關節液、腦脊髓液、唾液、羊水、臍帶 … ^ 、尿液、陰 道液及精液’但不限於此）等。「生物樣太 ’ 4」更係指從整 個有機體或其組織、細胞或組成部分及复Η机 一月奴或部分所製 2l25~6960-PF 7 200533376 備之句質產物、溶解產物、萃取物、細胞培養或組織培養。 最後’ 「生物樣本」係指包含細胞成分，如蛋白質或核酸 之培養基’例如已繁殖有機體之##液體培養基或營養膠 體培養基。 本發明特載抑制細胞生長的方法。藉由將細胞與 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 siRNA 之組
合物接觸，細胞生長可被抑制。另外，使細胞進一步接觸 轉染促進劑。細胞可在試管（//? F/卜〇)、體内（以以.叩） 或體外（ez fo)獲得。個體為哺乳類動物，如人類、非人 類之靈長類動物、小鼠、A鼠、狗、猫、馬或牛。該細胞 是肺細胞。細胞為肺細胞。或者，細胞為腫瘤細胞（即癌 細胞），如非小細胞癌細胞。例如，該細胞是非小細胞肺 癌細胞。名詞「抑制細胞生長」意指經處理之細胞較未經 處理之細胞之增生速率較低或是活力降低。細胞生長可藉 由該項技術領域所習知之增生試驗測得。 名㈣「小型干擾RNA ( S i RNA )」意指可阻止標的訊息 RNA ( mRNA)轉譯之雙股RNA分子。將siRNA導入細胞所用 之標準技術，包括以轉錄RNA的DNA作為模版。siRNA包 括編譯股的 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 核酸序列’或反義股的 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLcii 或NPTX1核酸序列或兩者。siRNA可包含兩互補分子或為 單一轉錄本所建構，該單一轉錄本具有來自標的序列的編 專序列及互補之反義序列兩者，如具有髮夾式構造，在一 些實施例中，將導致微型rNA (micr〇_RNA，miRNA)的產生。 2125-6960-PF 8 200533376
該方法係用以改變細胞内基因表現，使PKP3、CDCAl、 CDCA8 、DLX5 、URLC11 或 NPTX1 表現向上調控 (up-regulate )，造成如細胞惡性轉變（malignant transformation)。siRNA 結合至標的細胞之 PKP3、CDCAl、 CDCA8、DLX5、URLC11或NPTX轉錄本導致細胞内PKP3、 CDCAl、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 產量減少。其寡核 苷酸係至少約1 0個核苷酸且可能與與自然產生之PKP3、 CDCAl、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 轉錄本一樣長度。 較佳地，該寡核苷酸係約1 9至約25個核苷酸長度。最佳 地，該募核苷酸係少於約100、約75、約50或約25個核 普酸長度。可抑制嗤乳類動物細胞内PKP3、CDCAl、CDCA8、 DLX5、URLC11 或 NPTX1 表現之 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、 URLC11或NPTX1的siRNA募核苷酸包括含有標的序歹丨J的寡 核苷酸，如序列識別號碼：5 8、5 9、6 0、61、6 2、6 3、6 4、 65、66、67、68、69、70、71 或 72 號之核苷酸。 設計具有抑制標的細胞内基因表現之雙股RNA的方法 係為習知（請參閱案例，美國專利號6, 506, 599之全部内 容以作為參考）。舉例來說，對於設計s i RNA之電腦程式 可由波仕特股份有限公司 （Ambion ) 之網站 (http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder, h tml)所獲得。該電腦程式選擇siRNA合成之核苷酸序列係 依照下列使用說明。 s i RNA標白勺位點之選擇 1.從轉錄本的AUG起始密碼開始，尋找下游之AA雙核 2125-6960-PF 9 200533376 苷酸序列。記錄每一個AA之位置及其3，端鄰近的19個 核苷酸，作為潛在的siRNA標的位點。Tuschl等人 (Targeted raRNA degradation by double-stranded RNA in vitro· 13(24): 319卜7 ( 1 999))建議不設計 siRNA為5 和3 端的非轉譯區（UTRs )和鄰近起始密碼 (不超過75驗基）之區域，原因是這些地方有較豐富的調 控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白和/或轉譯起始複合 物可能會干擾s i RNP核酸内切酶複合物的結合。
2 ·將潛在的標的序列和相應的基因組資料庫（人，小 鼠，大鼠等）進行比較，排除那些與其他編碼序列有顯著 同源的標的序列。建議使用BLAST，該資料庫搜尋的工具 可以在美國國立生物技術資訊中心（NCBI )伺服器 (www. ncbi. nlm· nih· gOV/BLAST/)找到。 3·選出具備合格條件的標的序列進行合成。通常會沿 著基因的長度選出多個標的序列以作為評估。 本發明亦包括單離的核酸分子，該分子包括標的序列 之核酸序列，如序列識別號碼：58、59、6〇、61、62、w、 64、65、66、67、68、69、7〇、71 或 72 號之核苷酸；或 是與序列識別號碼：58、59、6〇、61、62、63、W、Μ、 ⑼、67、68、69、70、71或72號之核苷酸之核酸序列互 補之核酸分子。本發明所用之「單離之核酸分子」係指— 核酸，該核酸從其原始環境（例％，天然存在時之二 境）中被分離出來，因而從其自然狀態合成改變。在本： 明中，單離的核酸包括MA、RNA及其衍生物。當單離: 2125-6960-PF 10 200533376 酸為RNA或其衍生物時，核苷酸序列中驗基之胸腺嘧咬核 苷酸（T )會被尿。密啶核苷酸（u )所取代。本發明所用之 名詞「互補」係指核酸分子之核苷酸單位中之華生—克里克 (Watson-Crick)或H oog steen驗基配對；以及名詞「結 合」思‘兩核酸、相關核酸之化合物或該化合物之組合間 的物理或化學反應。互補之核酸序列在適當的條件下雜交 可形成穩定的雙股，該雙股中幾乎無錯誤配對 (mismatch)。就本發明之目的，兩序列具有5個或以下的 9 錯誤配對都被認為是互補。而且，本發明之單離核苷酸之 編譯股及反義股經雜交可形成雙股核苷酸或髮夾般環狀 (ha i rp i η 1 oop )結構。在較佳實施例中，這樣的雙股每 1 0個配對中不超過1個錯誤配對。在特別較佳實施例中， 雙月又之股元全互補’即雙股不含有錯誤配對。PKP3、⑶cai、 CDCA8、DLX5、URLC11或NPTX1核酸分子係分別少於2831、 20 03、2307、1419、2539或5071個核苷酸長度。舉例來 說，核酸分子係少於約500、約2〇〇、或約75個核苷酸長 •度。本發明也包括載體及細胞，其中載體包含一個或多個 本毛明所述之核酸，而該細胞包含該載體。本發明的單離 核酸係有助於抑制PKP3、CDCA1、CDCA8、DU5、URLCn或 NPTX1的siRNA或編碼該siRNAi DNA的siRM。當核酸被 用作+為siRNA或其編碼DNA，編譯股之長度較佳超過約i9 個核苷酸，最佳為超過約21個核苷酸。 在某種程度上來說，本發明係以下列之發現為基礎： 編碼 PKP3、CDCA1、CDrA8、M ntM ηι 1 bLUAS DLX5、URLC11 或 NPTX1 基因在 2125-6960-PF 11 200533376 非小細胞肺癌（nsclc )較在非癌化肺組織中有過度表現之 發現。PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之 cMA 分別為 2831、2003、2307、1419、2539 或 5071 個核苷酸 長度。PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之核 酸序列如序列識別號碼·· 1、3、5、7、9及11號所示。這 些核苷酸序列包含 75..2468 (NM_0071 83)， 299.. 1 693 (NM一1 45697) 、1 14. . 956 (NM一018101)、1 95..1 064 (BC006226) 、 134··1819 (NM—173514)及 139..1431
(ΝΜ—0 0 2 52 2 )位置上的編碼區域，其分別編碼序列識別號 碼：2、4、6、8、10及12號之胺基酸序列。此序列資料 可經由下列序號所獲得·· PKP3: NM-007183 CDCA1： AI015982, NM_145697 CDCA8 (FLJ10468):匪—018101 DLX5: AI278397, BC006226 URLC11 (FLJ90709): AB105188， NM—173514 NPTX1: NM一002522 以包括序列識別號碼：58、59、60、61、62、63、 65、66、67、68、69、70、71 戎 72 获夕 ή 丨1現之§iRNA進行轉染 可導致N S C L C細胞株的生長抑制。 抑制細胞生長之方法 本發明係有關於抑制細胞生長，即藉由抑制ρκρ3、 CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 ΝΡΤΧ1 之表現而女幻产 衣現而抑制癌細 胞生長。舉例來說，利用把PKP3、cDCA1、CDeA8、 2125-6960-PF 12 200533376 URLC11或NPTX1基因作為專一之目標的siRNA以抑制 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 表現。pKP3、 CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 標的包括如序列識 別號碼：58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71或72號之核苷酸。 在非哺乳類動物細胞中，雙股RNA (dsRNA)顯示對於 基因表現具有強烈及專一的靜止效應，此即為所謂的 干擾（RNA interference，RNAi )( Sharp P A. RNAi and
double-strand RNA. Genes Dev. 1 999 Jan 15； 13(2)· 139-41· )。dsRNA 可經由一種含有 RNase 111 結構) 之酵素處理成為20-23個核苷酸的dsRNA，稱為siRNA。 siRNA與多部分核酸水解酶複合物（muiticomponent nuclease complex)結合以互補之mRNA作為專一之目標 (Hammond SM et al. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing Drosophila cel Is.Nature. 2000 Mar 16; 404(6775): 293-6., Hannon GJ. RNA interference. Nature. 2002 Jul 11.； 41 8(6894): 244-51.)。已知在哺乳類動物細胞中，由20-21聚體之 dsRNA所組成、具有19個互補之核苷酸及3’端未互補之尿 嘧啶核苷酸（U )或胸腺嘧啶核苷酸（T )雙聚體的s i RNA， 在不引發全面性基因表現變化的情形下，顯示出對特定基 因的敲除（knock-down )效應（Elbashir SM et al·
Duplexes of 21-nuc1eot i de RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2125-6960-PF 13 200533376
20 0 1 May 24; 411(6836): 494-8·)。而且，含有小核 RNA
(snRNA) U6或聚合酶III H1-RNA啟動子之質體可有效生 產短片段之RNA，獲得第三型的RNA聚合酶I π ,因而持 續地抑制它的標的 mRNA(Miyagishi M et al. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3 ， overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotechnol. 20 02 May; 20(5): 497-500., Brumme 1 kainp TR et al. A System for Stable Expression of Short Interfering RNAs in Mammalian Cells. Science· Science. 296(5567); 550-553, April 19， 2002·)。 細胞生長可藉由使細胞接觸含有pKp3、CDCA1、CDCA8、 DLX5、URLC11或NPTX之小型干擾rnA，而抑制細胞生長。 該細胞可進一步接觸轉染劑。適當之轉染劑係為該項技術 領域所習知。名詞「細胞生長之抑制」意指與未暴露在該 組合物下之細胞相比，細胞之增生速率較低或是存活力降 低。細胞生長可以該項技術領域所習知之方法測得，如Μττ 細胞增生試驗。 ΡΚΡ3、CDCAi、CDCA8、DLX5、URLC11 或 Νρτχι 之 siRM 可針對 PKP3、CDCAi、CDCA8、DLX5、URLCU 或 Νρτχι 基因 序列之單一標的。或者，siRNA可針對pKp3、cDCA卜⑶[Μ、 DLX5、URLC11或NPTX1基因序列之複數個標的。舉例來說， 本組合物包含針對二個、三個、四個或五個，或以上的 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC1uNmi 之標的序列 2125-6960-PF 14 200533376
的 PKP3 〜CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之 siRNA ° 名詞「PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之標 的序列」意指與 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1基因之部分為相同之核苷酸序列。標的序列可包括 人類 PKP3、CDCA1_、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 基因之 5’的非轉譯（UT)區、開放譯讀架（open reading frame， 0RF)或3’端的非轉譯區。或者，siRNA為與PKP3、CDCA1、 CDCA8、DLX5、URLC11或NPTX1基因表現之上下游調控子 互補之核酸序列。上下游調控子包括如，與PKP3、CDCA1、 CDCA8、DLX5、URLC11或NPTX1啟動子結合之轉錄因子； 與 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之多肽、 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之啟動子或 增強子（enhancer )交互作用之激酶或填酸酶。 可與標的 mRNA 雜交之 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、 URLC11或NPTX1的siRNA可藉由與正常單股mRNA轉錄本 結合，以減少或抑制由 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 基因所編碼之 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或NPTX1之多肽產物產生，藉此干擾轉譯及蛋白質表現。 因此，本發明之siRNA分子可根據其與PKP3、CDCA1、 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 基因之 mRNA 或 cDNA 專一 性雜交的能力定義。就本發明之目的來說，名詞「雜交」 或「專一性雜交」係指在嚴格雜交條件下，兩核酸分子雜 交之能力。名詞「嚴格雜交條件（stringent hybridization cond i t i ons )」係指核酸分子與其標的序列進行雜交之條 2125-6960-PF 15 200533376 件’通常在核酸複合混合物中，但無法偵測到其它序列。 嚴格條件是取決於序列的，而且在不同環境下將有所不 同。較長之序列需在較高溫下進行專一性地雜交。對於核 酸雜交進一步的導引可於Ti jssen的文獻（力//?
Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays ( 1 993))得到。一般來說，在一定離子強度pH值 下’對特定序列而言，嚴格條件通常選擇低於熱熔點（Tffl) 約5-10 °c之溫度。為在一定離子強度、pH值及核酸溶度 下’ 50%與目標互補之探針和標的序列雜交呈平衡狀態時的 度（即標的序列在過量存在中，當達時，平衡狀態下 有50%捸針被佔據）。嚴格條件亦可藉由添加去穩定劑 (destabilizing agent)，如甲醯胺（f〇rmamide)而達 到。針對選擇性或專一性雜交，正訊號至少為雜交背景訊 號之兩倍，較佳地，為雜交背景訊號之10倍。實例中，嚴 格雜乂條件可以如下：50%甲醯胺、5x SSC及1% SDS，於 42 C進行培育；或是5x SSC，1%SDS，於65。(：進行培育， 並於50 C以〇· 2x SSC及〇· 1% SDS洗滌。 本發明之siRNA係少於約500、約200、約1〇〇、約50 或、、句25個核脊酸長度。較佳地，s丨RNA係約1 9至約25個 核甘酸長度。實例中，用以產生PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、 URLC11或NPTX1 siRNA之核酸序列包括如以序列識別號 碼· 58 、 59 、 60 、 61 、 62 、 63 、 64 、 65 、 66 、 67 、 68 、 69 、
2125-6960-PF 16 200533376 70、71 或 7 9 /z- a以說作為標的序列之核苷酸序列。而且，為增 * 之彳卩制能力，核脊酸之尿密唆核甘酸（U )被加入 至標的序列之反義股的3，端。被加入之尿嘧啶核苷酸（U ) 之數目至少約2個，一般而言，約2至約丄〇個，較佳地， 約2至約5個。被加入之尿嘧啶核苷酸u在s i RNA之反義 股的3’端形成單股。
細胞為任何可表現或過度表現PKP3、CDCA1、CDCA8、 DLX5、URLC11或NPTX1之細胞。該細胞可為肺細胞。或者， 細胞為腫瘤細胞’如癌症、腺癌（Adenocarcinoma)、細胞 瘤（blastoma)、血癌（ieukemia)、骨髓瘤（myeloma)、 或肉瘤（sarcoma )。該細胞可為非小細胞肺癌。
PKP3、 CDCA卜 CDCA8、 DLX5、 URLC11 或 NPTX1 之 siRNA 以可與mRNA轉錄本結合之形式，直接被導入細胞。或者，
編碼 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之 siRNA 的DNA係在載體中。 舉例來說，載體之產生可經由將PKP3、CDCA卜CDCA8、 DLX5、URLC11或NPTX1標的序列選殖到表現載體，該表現 載體經 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 序列 操作性連接至調控序列，藉由DNA分子之轉錄使兩股表現 (Lee, N_ S·，Dohjima，Τ·，Bauer, G.，Li, H.，Li，M.-J·， Ehsani， A·，Salvaterra， P·， and Rossi， J. (2002)
Expression of snia 11 interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature
Biotechnology 20 : 500-505·)。反義於 ρκρ3、CDCA1、
2125-6960-PF 17 200533376 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之 mRNA 的 RNA 分子可經由 第一個啟動子（如，被選殖之DNA的3，端啟動子序列） 轉錄產生；而 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 mRNA的編譯股之RNA分子則可經由第二個啟動子（如，被 廷殖之DNA的5’端啟動子序列）轉錄產生。編譯股與反 義股可在體内雜交而產生可使PKP3、CDCM、CDCA8、DLX5、
URLC11或NPTX1基因沉靜的siRNA構築體（siRNA construct)。或者’兩個構築體可被利用產生構築 • 體之編譯股與反義股。選殖的PKP3、CDCA卜CDCA8、DLX5、 URLC11或NPTX1可編碼具有二級結構之構築體，如髮夾 狀；其中單一轉錄本具有來自標的基因之編碼股與互補反 義股。由任意核苷酸序列所組成之環狀序列可位於編碼股 與反義股之間以便形成髮夾般環狀結構。因此，本發明也 提供具有5 -[A]-[B]-[A’ ]-3’通式之siRNA，其中[A] 係對應可舆自 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 基因之mRNA或cDNA專一性雜交之序列之核糖核苷酸序 %列。在較佳實施例中，[A]係對應自由序列識別號碼：58、 59 、 60 、 61 、 62 、 63 、 64 、 65 、 66 、 67 、 68 、 69 、 70 、 71 或72號之核苷酸所組成之群中任一序列之核糖核苷酸序 列。[B]係由約3至23個核苷酸所組成之核糖核苷酸序列； 以及[A，]係與[A]互補之序列所組成之核糖核苷酸序列。 [A]區與[A，]雜交，而形成由[B]區所構成之環狀。該環狀 序列’較佳為約3到約23個核脊酸長度。舉例來說，該環 狀結構可以選自由下列序列所組成之群 2125-6960-PF 18 200533376 (http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.htral ) o 此外，由23個核苷酸所組成之環狀序列還提供活性siRNA (Jacque, J.-Μ.，Triques，Κ·，and Stevenson, Μ. (2002) Modulation of HIV-1 rep 1ication by RNA interference. Nature 418 : 435-438. ) o CCC、CCACC 或 CCACACC (Jacque，J. M，Triques，K., and Stevenson, M (2002) Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature, Vol. 418:
435-438.) UUCG (Lee，N.S·，Dohjima，T·，Bauer, G·，Li，H·， Li, M.-J.，Ehsani，A.，Sal vaterra, P.，and Rossi, J. (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20 : 500-505. Fruscoloni, P. , Zamboni, M.， and Tocchini-Valentini， G. P_ (2003) Exonucleolytic degradation of double-stranded RNA by an activity in Xenopus laevis germinal vesicles. Proc. Natl. Acad· Sci. USA 100(4): 1639-1644·) UUCAAGAGA (Dykxhoorn, D. M. , Novina, C. D. , and Sharp, P. A. (2002) Killing the messenger: Short RNAs that silence gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-467.) 舉例來說，具有本發明之髮夾般環狀結構的較佳s i RNA 如下所示。在下列結構，該環狀序列可以選自由CCC、UUCG、 2125-6960-PF 19 200533376 CCACC、CCACACC及UUCAAGAGA所組成之群。較佳之環狀 序列為 UUCAAGAGA (在 DNA 中為 “ttcaagaga”）· ccuguggcaguacaacaag-[b]-cuuguuguacugccacagg(序 列識別號碼：58之標的序列） ugccagacaagaaguggug-[b]-caccacuuciiugucuggca(序 列識別號碼：59之標的序列） gaugcugcugaaagggaga-[b]-ucucccuuucagcagcauc(序 列識別號碼：60之標的序列）
cagcagaagcuauucagac-[b]-gucugaauagcuucugcug(序 列識別號碼：61之標的序列） gguguccuccauccaagaa-[b] -inicuuggauggaggacacc(序 列識別號碼：62之標的序列） gccgugcuaacacuguuac-[b]-guaacaguguuagcacggc(序 列識別號碼：63之標的序列） gaagcucuccaaccgucuc-[b]-gagacgguuggagagcuuc(序 列識別號碼：64之標的序列） gacucaguaccucgccuug-[b ] -caaggcgagguacugaguc( 列識別號碼：65之標的序列） gguuucagaagacucagua-[b]-uacugagucuucugaaacc(序 列識別號碼：66之標的序列） gugcagccagcucaaucaa-[b]-uugauugagcuggcugcac(>^ 列識別號碼：67之標的序列） gagaauucauuacuacagc-[b]-gcuguaguaaugaauucuc(序 列識別號碼：68之標的序列） 2125-6960-PF 20 200533376 ggauauuccugcuguucca-[b]-uggaacagcaggaauaucc(序 列識別號碼：69之標的序列） gauauucaggagcagcaug-[b]-caugcugcuccugaauauc(序 列識別號碼：70之標的序列） ggagaccauccugagccag-[b]-cuggcucaggauggucucc(序 列識別號碼：71之標的序列） guggaccuucgaggccugu-[b]-acaggccucgaagguccac(序 列識別號碼：72之標的序列）
鄰接 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 序 列之調控序列可以是相同或不同的，以便基因表現可被獨 自或以短暫或空間方式進行調控。siRNA可藉由將PKP3、 CDCA卜CDCA8、DLX5、URLC11或NPTX1基因模版選殖至含 有如來自snRNA U6之RNA聚合酶III轉錄單位或人類H1 RNA啟動子之載體，進行細胞内轉錄。為將載體導入細胞 内，轉染促進劑可被使用。FuGENE (羅氏醫學儀器股份有 限公司，Roche Diagnostices)、Lipofectamine 2000 (莱 富生命科技股份有限公司，Invitrogen)、Oligofect amine (萊富生命科技股份有限公司）及 Nucleofector (日本和 光純藥工業株式會社，Wako pure Chemical)皆可用作為 轉染促進劑。 依標準方法，募核苷酸及與PKP3、CDCA卜CDCA8、DLX5、 URLC11或NPTX1 mRNA部分片段互補之寡核苷酸在試管内 檢測降低腫瘤細胞（如A549、LC319或LC176之NSCLC) 内 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 之生成能 2125-6960-PF 21 200533376 力。比較接觸候選s i R N A組合物之細胞與未處理該候選組 合物之細胞，在 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1基因產物之減少係可藉由使用專一性的PKP3、 CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 抗體或其他策略進 行檢測。然後於試管内以細胞基質試驗（cel 1-based assay) 或無細胞體分析（cell-free assay)發現可降低PKP3、 CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 生成之序列，以作 為抑制細胞生長之效果。在試管内以細胞基質試驗中可抑 ^ 制細胞生長之序列，再於大鼠或小鼠進行體内試驗以確認 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 生成之降低 及具有惡性腫瘤之動物的腫瘤細胞生長降低。 治療惡性腫瘤之方法 腫瘤病患具有 PKP3、CDCA卜 CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1過度表現之特點，藉由投與PKP3、CDCA1、CDCA8、 DLX5、URLC11或NPTX1之siRNA進行治療。siRNA治療被 用以抑制罹患或有風險發展成，如非小細胞肺癌細胞，之 % 病患的 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 表現。 該病患可由特定腫瘤類型之標準方法被確認。非小細胞肺 癌細胞可藉由下列方式被診斷，如電腦斷層（computer tomography )、胸腔鏡（thoracoscopy )、肺部 X 光（chest X-ray )、痰細胞檢查（sputum cytology )、支氣管切片 (trans-bronchial biopsy，TBB)、磁力共振影象處理 (magnetic resonance imaging，MR I)、或氟-18 去氧葡萄 糖-正子射出斷層造影（18F-fluorodeoxyglucose-positron
2125-6960-PF 22 200533376 emission tomography ， FDG-ΡΕΤ)。 假如治療導致有臨床效益，如PKP3、cdcai、CDCA8、 DLX5、URLC11或NPTX1表現之減少或在個體中腫瘤之大 小、擴散私度、轉移性潛力降低，則治療係為有效的。當 治療被應用於預防治療，「有效」意指該治療可阻礙或預 防腫瘤形成’或預防或減輕癌症之臨床症狀。有效性可用 任何習知之診斷或治療特定腫瘤類型之方法決定。
siRNA治療可藉由投與病患siRNA即可達成，而投與 siRNA可藉由編碼本發明siRNA之標準載體及/或如基因傳 遞系統，如傳遞合成的siRM分子，進行。合成的siRNA 分子通常具有化學穩定以避免在體内被核酶降解。製備化 學穩定之RNA分子的方法在該項技術領域中為習知的。該 分子通常包括經修飾之骨架及核苷酸以避免核酶作用。亦 可進行修飾，舉例來說，膽固醇共軛之siRNA (cholesterol-conjugated siRNA)已顯示具改善藥理學 的特性（Song ei a/· h i "re H 9:347-351 (2003))。 適當之基因傳遞系統可包括微脂粒（1 ip0S0mes )、受體導 引傳遞系統（receptor-mediated delivery systems)或 病毒載體’如疱療病毒（herpes viruses)、反轉錄病毒 (retroviruses)、腺病毒（adenoviruses)及腺相關病 毒（adeno-associated viruses)等等。治療的核酸組合 物被配製於醫藥可接受之載劑。醫藥組合物也可包括前述 之基因傳遞系統。醫藥可接受之載劑為適合用於動物投藥 之生物相容性載具，如生理食鹽。化合物醫藥有效量係具 2125-6960-PF 23 200533376 有產生醫藥令人滿意之結果的數量，如減少PKP3、CDCA1、 CDCA8、DLX5、URLC11或ΝΡΠ1基因產物之生成、細胞生 長（如增生）之減緩或治療處理之動物的腫瘤生長之減緩。 非腸胃道投藥’如靜脈内、皮下、肌肉内及腹腔内輸 送途徑，可用以傳遞 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或NPTX1之siRNA組合物。治療肺癌時，在電腦斷層定位 (CT guidance)或胸廓造口術（th〇rac〇sc〇py)下氣管投 藥是有用的。
任何-個病患之劑量取決於报多因素，包括病患體 積、身體表面積、年齡、施用之特定核酸、性別、投藥時 間及途徑、-般健康狀況及其他最近正施用之藥物。核酸 之靜脈内投藥的劑量係約1〇6至1〇22份之核酸份子。 該聚核普酸之投藥可蕪由‘、、士 &广 』猎由如注射至纽織（如肌肉或皮 膚）空隙、導二至循環或身體腔室、或藉由呼吸等標準方 法達成。承核甘酸添加醫藥7抹 、 西柰可接文之液體載劑，如水溶性 芝P刀U之液體载劑，以注射或其他傳遞至動物體。 該聚核脊酸可藉由^旨轉遞（如陽離 粒）。該聚核符酸包括可於標的細胞表現…其π 如啟動子。 I表現必要之基因資訊， 除非另有定義，此處所用之所 學 _項技藝者所-般所了解之意思。雖二 如同 似或等同之方法及材料可用以本發明之二處所用相 方法及材料仍敘述如 Μ X或測4，適當 申請、專利及其他參：資所有公開資料、專利 考貝枓之全部内容結合於此為參考。 2125-6960-ρρ 24 200533376 在有爭議時，本說明書，包括定義，將有所管理。此外， 該材料、方法及實施例僅舉例而非用以限制。 【實施方式】 最佳模式 本發明將進一步說明下列之實施例，但非用以侷限本 發明如後附之申請專利範圍。 實施例1 一般方法 • 細胞株及組織標本 21個人類NSCLC細胞株以單層培養方式，生長在添加 5或10%胎牛血清之適當培養基中（參見表1)。 表1
細胞株名稱 培養基 腺癌（adenocarcinoma，ADC) A549 RPMI-1640(10%FBS) NCI-H23 RPMI-1640(10%FBS) NCI-H522 RPMI-1640(10%FBS) LC174 RPMI-1640(10%FBS) LC176 RPMI-1640(10%FBS) LC319 RPMI-1640(10%FBS) PC-3 DMEM(10%FBS) PC-9 DMEM(10%FBS) PCM RPMI-1640(10%FBS) PC14-PE6 RPMI-1640(10%FBS) NCI-H1373 RPMI-1640(10%FBS) NCI-H1435 F12+DMEM(5%FBS)+EGF(+) NCI-H1793 F12+DMEM(5%FBS)+Glu SK-LU-1 DMEM(10%FBS) BAC NCI-H358 RPMI-1640(10%FBS) BAC NCI-H1650 RPMI-1640(10%FBS) BAC SW1573 Leibovitzfs L-15(10%FBS) 鱗狀上皮細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC) RERF-LC-AI DMEM(10%FBS) 2125-6960-PF 25 200533376 SW-900 Leibovitz’s L-lSQOo/oFBS) SK-MES-1 DMEM(10%FBS) 腺鱗狀上皮癌 NCI-H596 ^MI-1640(10%FB S) 丛cDNA微陳列晶片，分離NSCLC細臉中過唐砉琨夕其田 cMA微陣列晶χ載片之製造如On〇 K，Tanaka τ， Tsunoda Τ, Kitahara 0, Kihara C, Okamoto A, Ochiai K, Takagi T，and Nakamura Y. Cancer Res. , 60: 5007-5011， 2000所述。製備兩組包含約23, 040個DNA點之cDNA微陣 列晶片載片進行表現概況分析以減少實驗變動。簡單來 6兒’總D N A從N S C L C細胞被純化出來。進行τ 7為基礎的 RNA放大以獲得足夠的RNA，作為微陣列晶片試驗之用。對 照組探針，以正常人類肺部聚合腺嘌呤[A]核苷酸rna
(poly[A] RNA) ( CL0NTEC)用相同方式放大。來自NSCLC 細胞及正常肺部細胞放大之RNA的系列稀釋，分別以Cy5-去氧核糖核苷三碟酸（Cy5-dCTP)及Cy3-去氧核糖核眘三 鱗酸（Cy3- dCTP)(Amersham Biosciences)進行反轉錄 以標記。雜交、清洗及偵測之做法，如前人所述（On〇 κ，
备 Tanaka T， Tsunoda T， Kitahara 0， Kihara C， Okamoto A
Ochiai K， Takagi T， and Nakamura Y. Cancer Res. , 60· 5007-5011，2000 )。然後，在上調基因中，著重於PKP3、 CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 等六個基因。 RNA製備及反韓錄酶一聚合酶鏈反應（RT-PCR) 依製造商之使用說明書，使用Trizol試劑（Life Technologies，Inc.，Gaithersburg, MD，USA)，從培養 之細胞或臨床組織萃取總RNA。萃取之RNA經DNAase I (羅
2125-6960-PF 26 200533376 氏醫學儀器股份有限公司（Roche Diagnost ices )，瑞士巴 賽爾）處理，並用Superscript II反轉錄酶（Life Technologies, Inc·)和 12-18 個核脊酸長度之寡（dT)12-18 引子，進行反轉錄成單股 cDNA。以石-肌動蛋白 (beta-actin ， ACTB ) 或 /5 〜2〜微球蛋白 (beta-2-microglobul in，万之基因作為定量對照組監 控，每一單股cDNA進行適當稀釋以作為後續pcR放大之 用。所有反應包含於9 4 °C加熱2分鐘之初期變性，之後於 • 型號9700之GeneAmp聚合酶連鎖反應器（GeneAmp pcr system 9700)(美商應用生命系統，Appl iecj Bi〇SyStems) 中進行18循環（/ 4凡?i〇或2 5 - 3 0循環（本發明之每 一個基因）的P C R反應：每一循環的條件為9 4 °C 3 0秒、 58-6 2°C30秒及72°C 45秒。引子序列如下所列·· PKP3
前置引子：5’-ATGCAGGACGGTAACTTCCTGC-3，（序列識別號碼：73) 反置引子：5’-TGGGCCCAGGAAGTCCTCCTT-3’（序列識別號碼：74) CDCA1 前置引子：5’-GAGAAACTGAAGTCCCAGGAAAT-3’（序列識別號碼：75) 反置引子：5’-CTGATACTTCCATTCGCTTCAAC-3’（序列識別號碼：76) CDCA8 前置引子：5’ - CATCTGGCATTTCTGCTCTCTAT -3’（序列識別號碼：77) 反置引子：5’ -CTCAGGGAAAGGAGAATAAAAGAAC-3’（序列識別號碼：78) DLX5 前置引子：5’-GGGACTACTGTGTTTTGCTGTTC-3’（序列識別號碼：79) 2125-6960-PF 27 200533376 反置引子·· 5’-TGAGGTCATAGATTTCAAGGCAC-3’（序列識別號碼：80) URLC11 前置引子：5’ - CTAGGAAGAAATCATGCTGGGTT -3’（序列識別號碼：81) 反置引子：5’ - GTATTTGGCTTACTGTCCCAAAC -3’（序列識別號碼·· 82) NPTX1 前置引子：5’-TAACCTTGATAGAAGAACCTTGG-3’（序列識別號碼：83) 反置引子：5’-GCAAATGAGACAAAATTGGGAC-3’（序列識別號碼：84) 北方墨點分析(Northern blot analysis、
以放射性磷32為標記之PCR產物與人多組織墨點 (human multiple-tissue blots ) ( BD Biosciences Cl ontech)進行雜交。雜交預備、雜交及清洗係依照供應 商建議操作。該墨點於-80°C 進行9 6-1 68小時密集篩選並 進行放射性自體顯影。 為決定組織分布及基因每一個之大小，人多組織北方 墨點分析係以人類cDNA作為探針進行分析。 即/#/凡質體之構築 為製備可表現siRNA之質體載體，包含啟動子區域之 H1RNA基因組片段以下列一組引子及人類胎盤之DNA作 為模版進行 PCR 放大。該引子為 5 ’ -TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’ （序列識別號碼：85); 以及 5’ - CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’ （序列識別號 碼：8 6) 產物經純化後，依照供應商之使用說明書使用TA選殖 2125-6960-PF 28 200533376 套組（Invi trogen)，將該產物選殖至pCR2. 0質體載體。含 有之如ΜΙ及/加1片段被選殖至pcDNA3. 1( + )核 苷酸1 257至56，且該片段以下列引子進行PCR放大： 5’ -TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’ （序列識 別號碼：8 7); 以及 5’ - CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’ （序列識 別號碼：88)
接合之DNA作為PCR放大之模版並下列序列為引子： 5’ - 1TTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’ (序列識別號碼·· 8 9);以及 5， -TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3， （序 列識別號碼：Θ0) 〇 產物以11進行消化作用，接著自我接合成為具 有序列識別號碼：91所示核苷酸序列之psiHlBX3.0質體 載體。 編碼s i RNA之DNA片段被插入如下列質體序列（序列識 別號碼：91)中核苷酸489-492 (以（-)標示）之空隙 (GAP)。
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGGATCC
ACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTGGTAGCCAAGTGCAGGTTATAGGGA
GCTGAAGGGAAGGGGGTCACAGTAGGTGGCATCGTTCCTTTCTGACTGCCCGCCCCCCGC
ATGCCGTCCCGCGATATTGAGCTCCGAACCTCTCGCCCTGCCGCCGCCGGTGCTCCGTCGC
CGCCGCGCCGCCATGGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATGGCGGG
CCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTG
AGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACC
ATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTCTTTCC
C----TTTTTGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGAAACCGGGCCGGGCGCGGTGG
TTCACGCCTATAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACAAGGTCAGGAG 29
2125-6960-PF 200533376
GTCGAGACCATCCAGGCTAACACGGTGAAACCCCCCCCCATCTCTACTAAAAAAAAAAAA
TACAAAAAATTAGCCATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTATAATCCCAGCTACTTGGG
AGGCTGAAGCAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGACGTTGCAGTGAGCCGAGATCGCG
CCGACTGCATTCCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGTCTCAAAAAAAAAACCGAGTGGAATG
TGAAAAGCTCCGTGAAACTGCAGAAACCCAAGCCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTG
GCGGCCGCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCG
CCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACA
CTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGC
CGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTAC
GGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTG
ATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCC
AAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCG
ATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTG
TGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATG
CAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCA
GGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTC
CGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATT
TTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAG
GAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTC
GGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACG
CAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAA
TCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGT
CAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTG
GCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAG
GGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCT
GCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTA
CCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAG
CCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAAC
TGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCG
ATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGC
CGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAG
AGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTC
GCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCG
AAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTT
CTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGC
GGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA
CAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTT
GTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGA 30
2125-6960-PF 200533376
GCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCA
CACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAA
CTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGC
TGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGC
TTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCAC
TCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGA
GCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCAT
AGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAAC
CCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTG
TTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCT
TTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCT
GTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGA
GTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAG
CAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTA
CACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGA
GTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGC
AGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTC
TGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAG
GATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGA
GTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTC
TATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGC
TTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATT
TATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTAT
CCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAAT
AGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTAT
GGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGC
AAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTG
TTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGC
TTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGA
GTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGT
GCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGA
TCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAG
CGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGA
CACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTT
ATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCG
CGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC siRNA表現載體可藉由將雙股寡核苷酸選殖至psiHIBX載 31
2125-6960-PF 200533376 體之Bbsl位置而製得。 s i R1A 築質體 siRNA之核苷酸序列可使用siRNA設計電腦程式進行 設計。該設計siRNA之電腦程式可由波仕特股份有限公司 (Ambl0n)之網站 /siRM一finder.html)所獲得。簡單來說，siRNA合成之 核苷酸序列係依照下列使用說明書進行選擇。 siRNA標的仿點之潠擇：
1·從轉錄本的AUG起始密碼開始，尋找下游之aa雙核 苷=序列。記錄每一個AA之位置及其3,端鄰近的1=個 核苷酸，作為潛在的siRNA標的位點。Tuschi等人建議在 。又汁siRNA日守不要使用5’和3’端的非轉譯區和 鄰近：始密碼（不超過75鹼基）之區域，原因是這些地方 有五田的凋控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白和/或翻 譯起始複合物可能會干擾slRNp核酸内切酶複合物結合 mRNA 〇 ^將潛在的序列和相應的基因組資料庫（A，小鼠， 大鼠等等）進行比較’排除那些與其他編碼序列有顯著同 源的標的序列。 + &選出具備合格條件的標的序列進行合成。通常會沿 著基因的長度選出多個標的序列以作為評估。 用以作為 PKP3、CD㈤、CDCA8、dlx5 urlcii 或㈣ 的顧之寡核驻酸如下所示。每一寡繼係為標的序 列之編譯核脊酸序列及反義核脊酸序列之組合。s函的
2125-6960-PF 32 200533376 髮夾環狀結構及標的序列之核苷酸序列分別如序列識別號 碼：43至序列識別號碼：57及序列識別號碼：58至序 列識別號碼：72所示（内切核酸酶識別位點係從每一個髮 夾環狀結構之序列被移除）。另外，對照組之siRNA (psiHIBX-EGFP， psiHIBX-LUC 或 psiHIBX-SCR (擾亂， Scramble))的髮夾環狀結構及標的序列之核苷酸序列分別 如序列識別號碼：98至序列識別號碼：1 00及序列識別 號碼：1 01至序列識別號碼：1 0 3所示。 0 PKP3 siRNA表現載體之插入序列： siRNA2 ： 5, -TCCCCCTGTGGCAGTACAACAAGTTCAAGAGACTTGTTGTACTGCCA CAGG-3’（序列識別號碼：13);以及
5,-AAAACCTGTGGCAGTACAACAAGTCTCTTGAACTTGTTGTACTGCCA CAGG-3’（序列識別號碼：14) CDCA1 siRNA表現載體之插入序列： siRNAl ：
5,-TCCCTGCCAGACAAGAAGTGGTGTTCAAGAGACACCACTTCTTGTCT GGCA-3’（序歹識另U號碼：15);以及
5,-AAAATGCCAGACAAGAAGTGGTGTCTCTTGAACACCACTTCTTGTCT G G C A - 3 ’（序列識別號碼：1 6) siRNA2 ： 5, -TCCCGATGCTGCTGAAAGGGAGATTCAAGAGATCTCCCTTTCAGCAG CATC-3’（序列識別號碼：17);以及
5, -AAAAGATGCTGCTGAAAGGGAGATCTCTTGAATCTCCCTTTCAGCAG
2125-6960-PF 33 200533376 CATC-3’（序列識別號碼：18) CDCA8 siRNA表現載體之插入序列： siRNAl ： 5,-TCCCCAGCAGAAGCTATTCAGACTTCAAGAGAGTCTGAATAGCTTCT GCTG-3’（序列識別號碼：19);以及 5’ -AAAACAGCAGAAGCTATTCAGACTCTCTTGAAGTCTGAATAGCTTCT GCTG_3 (序列識別號碼· 20) siRNA2 ：
• 5,-TCCCGGTGTCCTCCATCCAAGAATTCAAGAGATTCTTGGATGGAGGA CACC-3’（序列識別號碼：21);以及 5’-AAAAGGTGTCCTCCATCCAAGAATCTCTTGAATTCTTGGATGGAGGA CACC-3’（序列識別號碼：22) siRNA3 ：
5,-TCCCGCCGTGCTAACACTGTTACTTCAAGAGAGTAACAGTGTTAGCA CGGC-3’（序列識別號碼：23);以及
5,-AAAAGCCGTGCTAACACTGTTACTCTCTTGAAGTAACAGTGTTAGCA CGGC_3 (序列識別號碼· 24) siRNA4 ：
5’ -TCCCGAAGCTCTCCAACCGTCTCTTCAAGAGAGAGACGGTTGGAGAG
CTTC-3’（序列識別號碼：25);以及 5’ -AAAAGAAGCTCTCCAACCGTCTCTCTCTTGAAGAGACGGTTGGAGAG CTTC-3’（序列識別號碼：26) DLX5 siRNA表現載體之插入序列： siRNA2 ： 2125-6960-PF 34 200533376 *
5, -TCCCGACTCAGTACCTCGCCTTGTTCAAGAGACAAGGCGAGGTACTG AGTC-3’（序列識別號碼·· 27);以及 5,-AAAAGACTCAGTACCTCGCCTTGTCTCTTGAACAAGGCGAGGTACTG AGTC-3’（序列識別號碼：28) siRNA6 ： 5, -TCCCGGTTTCAGAAGACTCAGTATTCAAGAGATACTGAGTCTTCTGA A A C C _ 3 ’（序列識別號碼：2 9);以及 5,-AAAAGGTTTCAGAAGACTCAGTATCTCTTGAATACTGAGTCTTCTGA | AACC -3’（序列識別號碼：30) siRNA7 ： 5,-TCCCGTGCAGCCAGCTCAATCAATTCAAGAGATTGATTGAGCTGGCT GCAC -3’（序列識別號碼：31);以及 5,-AAAAGTGCAGCCAGCTCAATCAATCTCTTGAATTGATTGAGCTGGCT GCAC -3’（序列識別號碼：32) URLC11 siRNA表現載體之插入序列： siRNAl :
5, -TCCCGAGAATTCATTACTACAGCTTCAAGAGAGCTGTAGTAATGAAT TCTC-3’（序列識別號碼：33);以及
5, -AAAAGAGAATTCATTACTACAGCTCTCTTGAAGCTGTAGTAATGAAT TCTC-3’（序列識別號碼：34) siRNA3 ：
5,-TCCCGGATATTCCTGCTGTTCCATTCAAGAGATGGAACAGCAGGAAT ATCC-3’（序列識別號碼：35);以及
5,-AAAAGGATATTCCTGCTGTTCCATCTCTTGAATGGAACAGCAGGAAT 2125-6960-PF 35 200533376 ATCC —3’ （序歹d識別號碼：36) siRNA4 : 5, -TCCCGATATTCAGGAGCAGCATGTTCAAGAGACATGCTGCTCCTGAA TATC-3’（序列識別號碼：37);以及 5, -AAAAGATATTCAGGAGCAGCATGTCTCTTGAACATGCTGCTCCTGAA TATC-3’（序列識別號碼：38) NPTX1 siRNA表現載體之插入序列： siRNAl ：
• 5, -TCCCGGAGACCATCCTGAGCCAGTTCAAGAGACTGGCTCAGGATGGT
CTCC-3’（序列識別號碼：39);以及 5,-AAAAGGAGACCATCCTGAGCCAGTCTCTTGAACTGGCTCAGGATGGT CTCC-3’（序列識別號碼：40) siRNA2 5, -TCCCGTGGACCTTCGAGGCCTGTTTCAAGAGAACAGGCCTCGAAGGT CCAC-3’（序列識別號碼：41);以及
5, -AAAAGTGGACCTTCGAGGCCTGTTCTCTTGAAACAGGCCTCGAAGGT CCAC-3’（序列識別號碼：42) 對照組s i RNA表現載體之插入序列： psiHIBX-EGFP (EGFPsi) 5’ -CACCGAAGCAGCACGACTTCnCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCnC-3’ (序列識別號碼：92);以及 5 ’ -AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3 ’ (序列識別號碼：93) psiHIBX-LUC (LUCsi) 2125-6960-PF 36 200533376 TCCCCGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTAC G (序列識別號碼：94);以及 AAAACGTACGCGGAATACTTCGATCTCTTGAATCGAAGTATTCCGCGTAC G (序列識別號碼：95) psiHIBX-SCR (SCRsi) TCCCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCG C (序列識別號碼：9 6);以及 AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCG 馨C (序列識別號碼：97) 每一序列之序列識別號碼如表2所列： 基因 siRNA 插入序列之序 列識別號碼 插入序列之序 列識別號碼 siRNA之髮 夾的序列 標的序列 位置 PKP3 si2 13 14 43 58 2393-2411 CDCA1 sil 15 __ 16 44 59 1099-1117 si2 17 18 45 60 1526-1544 CDCA8 sil 19 __ 20 46 61 412-430 si2 21 22 47 62 544-562 si3 23 __ 24 48 63 607-625 si4 25 26 49 64 902-920 DLX5 si2 __ 27 __ 28 50 65 668-686 si6 _ 29 __ 30 51 66 658-676 si7 31 __ 32 52 67 979-997 URLC11 sil 33 34 53 68 331-349 si3 35___ 36 54 69 1464-1482 si4 37 __ 38 55 70 1653-1671 NPTX1 sil 39 __ 40 56 71 339-357 si2 41 __ 42 57 72 1398-1416 對照組 EGFPsi 92^Π 93 98 101 對照組 LUCsi 94___ 95 99 102 對照組 SCRsi ------ ----1 97 100 103
RNA干擾分析 可於哺乳動物細胞内合成siRNA之以載體為基礎的 2125-6960-PF 37 200533376 MM系統，psiH1BX3. 〇 ’可用以抑制nsclc細胞中每—内 源基因之表現。載體以Llpofectamine 2_轉染試劑 (Invltrogene，Carlsbad’ CA，USA)轉染至 nscl^*s胞株， 轉染結果超過60-90%之轉染效率。細胞於適當濃度吉那 黴素Ueneticin (G418))存在下培養5_9天。細胞數目 或細胞存活力係以吉姆薩染色（Giemsa staining)和/或 MTT分析進行三次試驗確認。 細胞化聲分析
為製備c-myc-His標記蛋白質，含編碼一段在蛋白質 端之 c-myc-His 抗原決定部位序列 (LDEESILKQE-HHHHHH)之基因的質體 pcDNA3. i ( + )/c-myc-His被構築，並轉染至c〇s —7細胞。經暫時性 轉染的COS-7細胞放置於載玻培養皿，並以含有4%對福 馬林（paraformaldehyde)之PBS溶液固定，接著以含有 〇· 1% Triton-X 100於4°C作用3分鐘使組織具通透性。細
胞再以阻隔溶液（blocking solution)(含有2% BSA之Pbs 溶液）於室溫下覆蓋3 0分鐘以阻隔非專一抗體結合位置。 然後該細胞與老鼠抗c-myc抗體（於阻隔溶液以1 : 8〇〇稀 釋）進行培育。抗體以FITC共軛羊抗老鼠二級抗體進行 染色’再於ECLIPSE E800顯微鏡（Nikon)下進行觀察。特 別是PKP3，細胞係以老鼠抗-c-myc —若丹明（rhodamine ) 抗體（於阻隔溶液以1 : 800稀釋）或FITC共輥抗PKP3抗 體進行染色’再於ECLIPSE E800顯微鏡（Nikon)下進行 觀察。 2125-6960-PF 38 200533376 漠化3_ζϋ，_1ζ^甲基噻唑—2-基）-2, 5-二笨I四唑d7T)分
iL 細胞經psiHlBX3.0-siRNA或對照組質體轉染後，培 養於具有適當濃度之吉那黴素（genet i cin)之培養基。轉 染6 -1 2天後’培養基以含有5 〇 〇微克/毫升MTT (溴化 3-(4, 5-二甲基噻唑—2 —基）—2, 5 —二苯基四唑）（Sigma)之 新鮮培養基取代，並於37。C下培育4小時。隨後，細胞 再以0· 01 N HCl/l〇%SDS 1毫升溶解，而溶解產物利用酵 9 素免疫自動分析儀（ELISA reader )測量波長570nm (參 考值63 0 nm )之吸光值。細胞存活性係以相較對照組之吸 光值表示之。 胞基底膜侵姓實驗（Matrigel invasion assay )
以表現PKP3之質體或類比質體短暫性轉染之c〇s-7 細胞培養在添加1 〇%胎牛血清之DMEM培養基。當細胞生長 接近生長平面空間（conf luence )，細胞以胰蛋白酶消化採 收’隨後以無血清或蛋白酶抑制劑之MEM洗滌，再用dmem 配成1 X 1 0 5/m 1的細胞懸浮液待用。製備細胞懸浮液前， 細胞基底膜基質（Becton Dickinson Labware，Bedford，MA， USA)之乾燥層以DMEM於室溫下復水2小時。將含有ι〇〇/0 胎牛血清之DMEM (0.75 ml)加至24孔洞細胞基底膜侵蝕 槽的每一個下室，〇· 5 ml (5 X 1〇4細胞）之細胞懸浮液加 至上室的每一個小室（insert)，並置於37。〇下培育22小 時。培育後，處理侵蝕槽並固定侵入覆蓋細胞基底膜之小 室的細胞，依照供應商（Becton Dickinson)之指導以吉姆 2125-6960-pf 39 200533376 薩（Gi emsa)染色。 實施例2 結果
以含有23, 040之cDNA微陣列晶片篩選上調基因如前 人所述（Kikuchi，T·，Daigo，Y·，Katagiri，T·，Tsunoda， Τ·，Okada，Κ· , Kakiuchi, S.，Zembutsu，H·，Furukawa, Y.， Kawamura, M·， Kobayashi, K_， Imai， K.， and Nakamura, Y. Expression profiles of non-small cell lung cancers on cDNA microarrays: identification of genes for prediction of lymph-node metastasis and sensitivity to anti-cancer drugs, Oncogene. 22: 2192-205，2003·)。藉由進行此策略，在絕大部分臨床 NSCLC及細胞株中大量表現的六個基因被確認。本發明 中’這六個基因為斑菲素蛋白3基因 （pi akoph i 1 i η 3， PKP3)、細胞分裂周期相關1基因（cell divisi〇n cycle associated 1，CDCA1 )、細胞分裂周期相關8基因（cel 1 division cycle associated 8，⑶以沒），無末端同源盒 5 基因（distal-less homeo box 5，见/5)，基因 及神經元盤崔素蛋白1基因（neur〇nal pentraxin 1， )顯示具有治療肺癌潛力之分子標的。 (1) PKP3··(基因銀行序號第NM-007183號） 北方墨點 利用人類cDNA作為探針進行北方墨點分析以偵 測在心臟、胎盤、胰腺、前列腺、小腸、胃、甲狀腺及氣 管之3-kb轉錄本。（第la圖）. 2125-6960-PF 40 200533376 RNAi
為評估PKP3是否對於肺癌細胞生長或存活為必要，我 們設計及構築可表現對抗之s i rn A (s i 的載體及三 種不同對照組載體（EGFP、Luciferase LUC或Scramble (SCR)之siRNA)，並將它們轉染至A549及LC319細胞以 抑制内源表現。經轉染s i 2之細胞内轉錄本之 數量相較於三種對照組s i RNA之任一個皆有顯著降低（第 lb，lc圖），且轉染si之亦導致細胞存活性及群落數目顯 著減少（第Id, le圖為MTT測得；群落形成分析 (colony-formation assays)未顯示數據）。 免疫細胞化學分析 為决疋該基因所編碼之蛋白質之細胞内位置 (subcellular l〇caiizati〇n)，c〇s_7 細胞以 c — myc— Hi s 標記PKP3表現質體進行轉染。以免疫細胞化學分析，我們 偵測到PKP3/c-myc-His蛋白質主要位於細胞核周圍及細 胞質膜（第1 f圖）。 細胞基底膜侵蝕實驗 細胞基底膜侵蝕實驗以COS-7-PKP3細胞進行操作。穿 透細胞基底膜之C0S-7-PKP3細胞相較於轉染類比質體之 對照組細胞之侵蝕有顯著提升（第丨g圖）。 (2) CDCA1:(基因銀行序號第NM一 145697號） 北方墨點 方墨點分析以偵 利用人類cDNA作為探針進行北 測在睪丸之2_4-kb轉錄本（第2a圖）。 2125-6960-PF 41 200533376 RNAi
為評估是否對於肺癌細胞生長或存活視為必 要我們没计及構築可表現對抗/之siRNA (sil、si2) 的載體及三種不同對照組載體（EGFP、LUC或SCR之 siRNA)，並將它們轉染至LC3i9細胞以抑制内源⑶以/表 現。經轉染s i 1及s i 2之細胞内/轉錄本之數量相較 於二種對照組s i RNA之任一個皆有顯著降低（第2b圖）， 且轉染s i 1及s i 2亦導致細胞活性（第2 c圖，以MTT測得） 及群落數目顯著減少（群落形成分析，數據未顯示）。 免疫細胞化學分析 為決定該基因所編碼之蛋白質之細胞内位置，C〇s —7 細胞以c-myC-His標記CDCA1表現質體進行轉染。以免疫 、、、田月匕化本々析，我們镇測到CDCA1/c-myc-Hi s蛋白質主要 位於細胞核及細胞質中（數據未顯示）。 (3) CDCA8··(基因銀行序號第NM—〇181〇1號） 北方墨點 利用人類MWScDNA作為探針進行北方墨點分析以 偵測在睪丸之2.4_kb轉錄本（第3a圖）。 RNAi 為評估〔廳是否對於肺癌細胞生長或存活視為必 要’我們設計及構築可表現對抗〇⑽之siRNA(sii、si2、
si4)的載體及二種不同對照組載體LUc或 之S1_，並將它們轉染至LC319 (數據未顯示）及a549 細胞以抑制内源、㈣沒表現。經轉染W及 2125-6960-PF 42 200533376 si4之細胞内⑶以沒轉錄本
π j个 < 數里相較於二種對照組s i rnA
之任一個皆有顯著降低（第3b圖），且轉染sU、si2、 sU 及si4亦導致及群落數目顯著減少（數據未顯示）。 免疫細胞化學分析 為決定該基因所編碼之蛋白質之細胞内位置，c〇s_7 細胞以c-myc- His標記CDCA8表現質體進行轉染。以免疫 細胞化學分析，我們偵測到CDCA8/c_myc_His蛋白質主要 位於細胞核及細胞質中（數據未顯示）。 、 (4) DLX5:(基因銀行序號第Bc—〇〇6226號） 北方墨點 利用人類AZi^cDNA作為探針進行北方墨點分析以偵 測於胎盤之1· 5-kb轉錄本（第4a圖）。 RNAi
為評估见/5是否對於肺癌細胞生長或存活視為必 要’我們設計及構築可表現對抗瓜J5 isiRNA(si2、si6、 siO的載體及三種不同對照組載體（EGFp、LUC或SCR之 s 1 RNA) ’並將它們轉染至LC31 9細胞以抑制内源见J5表 現。經轉染s i 2、s i 6及s i 7之細胞内见J5轉錄本之數量 相車乂於二種對照組s i RNA之任一個有顯著之降低（第处 圖）’且轉染s i 2、s i 6及s i 7亦導致細胞活性（第4c圖， X MTT測彳于）及群落數目顯著減少（群落形成分析測得， 數據未顯示）。 (5) URLC11:(基因銀行序號第ab一 105188號）
RNAi 2125-6960-PF 43 200533376 為#估仍PZC7/是否對於肺癌細胞生長或存活視為必 要’我們設計及構築可表現對抗從之siRNA (si 1、 si3、Sl4)的載體及三種不同對照組載體（EGFp、Luc或SCR 之siRNA)，並將它們轉染至a549細胞以抑制内源仰Z67/ 表現。經轉染sil、si3及si4之細胞内轉錄本之 數i相較於一種對知、組s丨⑽A之任一個有顯著之降低（第 囷）且轉染s丨1、s i 3及s i 4亦導致細胞活性（第5b 圖’以MTT測得）及群落數目顯著減少（群落形成分析測 得，數據未顯示）。 (6) NPTX1:(基因銀行序號第關-〇〇2522號） RNAi 為#估紗Π7是否對於肺癌細胞生長或存活視為必 要，我們設計及構築可表現表現以,為對照之難 (311、312)的載體及三種不同對照組載體（£(^卜[此或8邙 之siRNA) ’亚將它們轉染至託49及lci76細胞以抑制内
源卿//表現。經轉染s i i及s i 2之細胞内射^轉錄本 之數量相較於三種對照組_之任一個有顯著之降低 (第讣圖）’且轉染s 11及s 1 2亦導致細胞活性（第6d圖， 以MTT測得）及群落數目顯著減少（群落形成分析測得， 數據未顯示）。 產業利用 本發明顯示細胞生長可藉由抑制pkp3、cdcai、cdca8、 URLC11或ΝΡΤχι基因表現而抑制。特別的是，對這 t基因有專-性標的之小型干擾rna (“腿）能有效抑制
2125-6960-PF 44 200533376 ，此新穎siRNA是抗癌醫藥發展中有用的 阻斷 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 阻止它的活性之藥劑可發現其可作為抗癌 且知'別用以治療肺癌，如N S C L C，之抗
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限疋本毛明，任何熟習此項技藝者，在不脫離本發明之精 神和耗®内，仍可作些許的更動與潤飾，目此本發明之保 護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 【圖式簡單說明】 第1圖係PKP3之特性描述。第1 a圖顯示在正常組織 樣本ΛΓΑ?表現之北方墨點之圖片。第lb及lc圖顯示户 之siRNA抑制之圖片。第1(1及le圖係分 析之柱狀圖。該鏍|示之siRNA對細胞生長之抑制。
細胞生長。因此 標的。舉例來說， 或NPTX1表現或 藥物之醫藥用途 癌藥物。 對照組siRNA中（EGFP)表示NSCLC細胞以EGFP之 siRNA進行轉染；（LUC)表示NSCLC細胞以螢光酵素—GL2 之siRNA進行轉染；以及（SCR)表示NSCLC細胞以 Scramble之siRNA進行轉染。第If圖係為C0S-7細胞以 c-myc- His標記PKP3表現質體進行轉染後，以免疫細胞 化學分析所獲得之PKP3細胞内位置之圖片。（左攔）以老鼠 抗-c-myc-若丹明（rhodamine)抗體偵測PKP3 ;(中間欄） 以FITC共軛抗PKP3抗體偵測PKP3 ;(右攔）包括DAPI 染色之MERGE影像。PKP3/c-myc-His蛋白質被偵測到主 要位於細胞核周圍及細胞質膜。第1 g圖顯示細胞基底膜 2125-6960-PF 45 200533376 (Matrigel )侵蝕實驗，當人類PKP3表現載體轉染至COS-7 細胞，該細胞侵蝕細胞基底膜基質能力提升。
第2圖係CDCA1之特性描述。第2a圖顯示在正常組織 樣本CDCA1表現之北方墨點之圖片。第2b圖顯示CDCA1之 siRNA抑制CDCA1 mRNA之圖片。第2c圖係MTT分析之 柱狀圖。該圖顯示CDCA1之s i RNA對細胞生長之抑制。對 照組siRNA中（EGFP)表示NSCLC細胞以EGFP之siRNA 進行轉染；（LUC)表示NSCLC細胞以螢光酵素-GL2之 siRNA進行轉染；以及（SCR)表示NSCLC細胞以Scramble 之s i RNA進行轉染。 第3圖係CDCA8之特性描述。第3a圖顯示在正常組織 樣本CDCA8表現之北方墨點之圖片。第3b圖顯示CDCA8之 siRNA抑制CDCA8 mRNA之圖片。對照組siRNA中（EGFP) 表示NSCLC細胞以EGFP之siRNA進行轉染；（LUC)表示 NSCLC細胞以Luciferase-GL2之siRNA進行轉染；以及 (SCR)表示NSCLC細胞以Scramble之siRNA進行轉染。 第4圖係DLX5之特性描述。第4a圖顯示在正常組織 樣本DLX5表現之北方墨點之圖片。第4b圖顯示DLX5之 siRNA抑制DLX5 mRNA之圖片。第4c圖係MTT分析之柱 狀圖。該圖顯示DLX5之s i RNA對細胞生長之抑制。對照組 siRNA中（EGFP)表示NSCLC細胞以EGFP之siRNA進行 轉染；（LUC)表示 NSCLC 細胞以 Luciferase-GL2 之 siRNA 進行轉染；以及（SCR)表示NSCLC細胞以Scramble之 s i RNA進行轉染。 2125-6960-PF 46 200533376 第5圖係URLC11之特性描述。第5a圖顯示DLX5之 siRNA抑制DLX5 mRNA之圖片。第5b圖係MTT分析之柱 狀圖。該圖顯示DLX5之siRNA對細胞生長之抑制。對照組 siRNA中（EGFP)表示NSCLC細胞以EGFP之siRNA進行 轉染；（LUC)表示 NSCLC 細胞以 Luciferase-GL2 之 siRNA 進行轉染；以及（SCR)表示NSCLC細胞以Scramble之 s i RNA進行轉染。 第6圖係NPTX1之特性描述。第6a及6b圖顯示DLX5 ^ 之siRNA抑制DLX5 mRNA之圖片。第6c及6d圖係MTT分 析之柱狀圖。該圖顯示DLX5之s i RNA對細胞生長之抑制。 對照組siRNA 中 （EGFP) 表示NSCLC細胞以EGFP之 siRNA 進行轉染；（LUC) 表示 NSCLC 細胞以 Luciferase-GL2 之 siRNA 進行轉染；以及（SCR)表示 NSCLC 細胞以Scramble之siRNA進行轉染。 【主要元件符號說明】 益 2125-6960-PF 47 200533376
0NC-A0405—TW 1/5 2 序列表 <110> Oncotherapy Science, Inc.
The University of Tokyo
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER
<130> 0NC-A0405P <150〉US 60/555, 757 <151〉 2004-03-24 〈160〉 103
<170> Patentln version 3.1 <210〉 1 <211〉 2831 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400〉 1 gaattccgga caggacgtga agatagttgg gtttggaggc ggccgccagg cccaggcccg 60 gtggacctgc cgccatgcag gacggtaact tcctgctgtc ggccctgcag cctgaggccg 120 gcgtgtgctc cctggcgctg ccctctgacc tgcagctgga ccgccggggc gccgaggggc 180 cggaggccga gcggctgcgg gcagcccgcg tccaggagca ggtccgcgcc cgcctcttgc 240 agctgggaca gcagccgcgg cacaacgggg ccgctgagcc cgagcctgag gccgagactg 300
ccagaggcac atccaggggg cagtaccaca ccctgcaggc tggcttcagc tctcgctctc 360 agggcctgag tggggacaag acctcgggct tccggcccat cgccaagccg gcctacagcc 420 cagcctcctg gtcctcccgc tccgccgtgg atctgagctg cagtcggagg ctgagttcag 480 cccacaatgg gggcagcgcc tttggggccg ctgggtacgg gggtgcccag cccacccctc 540 ccatgcccac caggcccgtg tccttccatg agcgcggtgg ggttgggagc cgggccgact 600 atgacacact ctccctgcgc tcgctgcggc tggggcccgg gggcctggac gaccgctaca 660 gcctggtgtc tgagcagctg gagcccgcgg ccacctccac ctacagggcc tttgcgtacg 720 agcgccaggc cagctccagc tccagccggg caggggggct ggactggccc gaggccactg 780 aggtttcccc gagccggacc atccgtgccc ctgccgtgcg gaccctgcag cgattccaga 840 gcagccaccg gagccgcggg gtaggcgggg cagtgccggg ggccgtcctg gagccagtgg 900
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 2/5 2
ctcgagcgcc atctgtgcgc agcctcagcc tcagcctggc tgactcgggc cacctgccgg 960 acgtgcatgg gttcaacagc tacggtagcc accgaaccct gcagagactc agcagcggtt 1020 ttgatgacat tgacctgccc tcagcagtca agtacctcat ggcttcagac cccaacctgc 1080 aggtgctggg agcggcctac atccagcaca agtgctacag cgatgcagcc gccaagaagc 1140 aggcccgcag ccttcaggcc gtgcctaggc tggtgaagct cttcaaccac gccaaccagg 1200 aagtgcagcg ccatgccaca ggtgccatgc gcaacctcat ctacgacaac gctgacaaca 1260 agctggccct ggtggaggag aacgggatct tcgagctgct gcggacactg cgggagcagg 1320 atgatgagct tcgcaaaaat gtcacaggga tcctgtggaa cctttcatcc agcgaccacc 1380 tgaaggaccg cctggccaga gacacgctgg agcagctcac ggacctggtg ttgagccccc 1440 tgtcgggggc tgggggtccc cccctcatcc agcagaacgc ctcggaggcg gagatcttct 1500 acaacgccac cggcttcctc aggaacctca gctcagcctc tcaggccact cgccagaaga 1560 tgcgggagtg ccacgggctg gtggacgccc tggtcacctc tatcaaccac gccctggacg 1620 cgggcaaatg cgaggacaag agcgtggaga acgcggtgtg cgtcctgcgg aacctgtcct 1680 accgcctcta cgacgagatg ccgccgtccg cgctgcagcg gctggagggt cgcggccgca 1740 gggacctggc gggggcgccg ccgggagagg tcgtgggctg cttcacgccg cagagccggc 1800 ggctgcgcga gctgcccctc gccgccgatg cgctcacctt cgcggaggtg tccaaggacc 1860 ccaagggcct cgagtggctg tggagccccc agatcgtggg gctgtacaac cggctgctgc 1920 agcgctgcga gctcaaccgg cacacgacgg aggcggccgc cggggcgctg cagaacatca 1980 cggcaggcga ccgcaggtgg gcgggggtgc tgagccgcct ggccctggag caggagcgta 2040 ttctgaaccc cctgctagac cgtgtcagga ccgccgacca ccaccagctg cgctcactga 2100 ctggcctcat ccgaaacctg tctcggaacg ctaggaacaa ggacgagatg tccacgaagg 2160 tggtgagcca cctgatcgag aagctgccag gcagcgtggg tgagaagtcg cccccagccg 2220 aggtgctggt caacatcata gctgtgctca acaacctggt ggtggccagc cceatcgctg 2280 cccgagacct gctgtatttt gacggactcc gaaagctcat cttcatcaag aagaagcggg 2340 acagccccga cagtgagaag tcctcccggg cagcatccag cctcctggcc aacctgtggc 2400
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0NC-A0405-TW 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2831 agtacaacaa gcccataggt tcagctccag tcgctggggc atagctgggg tgtatggggt atcttgggat aaaaggaatt gctccaccgt gaagccttct gctgcttggc ccctgtgtgc acttggcttc ggtgacccag agccagcact gactttcggg ggaggagaag agcccagcct atctttgagg cgcagggcag tcacattggc gggaataaag 3/5 2 cgaagggcta gtgacgtggc ggaggagaag gtcctgggcc ggggtggggc agaggtgggg atggccatga tcggaaggag ccagcgtcca gctaatgacg accaggaggg agggctcaag gttggctgtg acagtcacaa gacttcctgg agggacagac gaggggcccc gcagggtctt gctgctctgg gcctggcagt aaaaaaaaaa 0 12 3 IX IX 1X 2 2 2 2 < < < < 797
PRT
Homo sapiens 〈400〉 2
Met Gin Asp Gly Asn Phe Leu Leu Ser Ala Leu Gin Pro Glu Ala Gly 15 10 15
Val Cys Ser Leu Ala Leu Pro Ser Asp Leu Gin Leu Asp Arg Arg Gly 20 25 30
Ala Glu Gly Pro Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Ala Arg Val Gin Glu 35 40 45
Gin Val Arg Ala Arg Leu Leu Gin Leu Gly Gin Gin Pro Arg His Asn 50 55 60
Gly Ala Ala Glu Pro Glu Pro Glu Ala Glu Thr Ala Arg Gly Thr Ser 65 70 75 80
Arg Gly Gin Tyr His Thr Leu Gin Ala Gly Phe Ser Ser Arg Ser Gin 85 90 95
Gly Leu Ser Gly Asp Lys Thr Ser Gly Phe Arg Pro lie Ala Lys Pro 100 105 110
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0NC-A0405-TW 4/5 2
Ala Tyr Ser Pro Ala Ser Trp Ser Ser Arg Ser Ala Val Asp Leu Ser 115 120 125
Cys Ser Arg Arg Leu Ser Ser Ala His Asn Gly Gly Ser Ala Phe Gly 130 135 140
Ala Ala Gly Tyr Gly Gly Ala Gin Pro Thr Pro Pro Met Pro Thr Arg 145 150 155 160
Pro Val Ser Phe His Glu Arg Gly Gly Val Gly Ser Arg Ala Asp Tyr 165 170 175
Asp Thr Leu Ser Leu Arg Ser Leu Arg Leu Gly Pro Gly Gly Leu Asp 180 185 190
Asp Arg Tyr Ser Leu Val Ser Glu Gin Leu Glu Pro Ala Ala Thr Ser 195 200 205
Thr Tyr Arg Ala Phe Ala Tyr Glu Arg Gin Ala Ser Ser Ser Ser Ser 210 215 220
Arg Ala Gly Gly Leu Asp Trp Pro Glu Ala Thr Glu Val Ser Pro Ser 225 230 235 240
Arg Thr lie Arg Ala Pro Ala Val Arg Thr Leu Gin Arg Phe Gin Ser 245 250 255
Ser His Arg Ser Arg Gly Val Gly Gly Ala Val Pro Gly Ala Val Leu 260 265 270
Glu Pro Val Ala Arg Ala Pro Ser Val Arg Ser Leu Ser Leu Ser Leu 275 280 285
Ala Asp Ser Gly His Leu Pro Asp Val His Gly Phe Asn Ser Tyr Gly 290 295 300
Ser His Arg Thr Leu Gin Arg Leu Ser Ser Gly Phe Asp Asp lie Asp 305 310 315 320
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0NC-A0405-TW 5/5 2
Leu Pro Ser Ala Val Lys Tyr Leu Met Ala Ser Asp Pro Asn Leu Gin 325 330 335
Val Leu Gly Ala Ala Tyr lie Gin His Lys Cys Tyr Ser Asp Ala Ala 340 345 350
Ala Lys Lys Gin Ala Arg Ser Leu Gin Ala Val Pro Arg Leu Val Lys 355 360 365
Leu Phe Asn His Ala Asn Gin Glu Val Gin Arg His Ala Thr Gly Ala 370 375 380
Met Arg Asn Leu lie Tyr Asp Asn Ala Asp Asn Lys Leu Ala Leu Val 385 390 395 400
Glu Glu Asn Gly He Phe Glu Leu Leu Arg Thr Leu Arg Glu Gin Asp 405 410 415
Asp Glu Leu Arg Lys Asn Val Thr Gly He Leu Trp Asn Leu Ser Ser 420 425 430
Ser Asp His Leu Lys Asp Arg Leu Ala Arg Asp Thr Leu Glu Gin Leu 435 440 445
Thr Asp Leu Val Leu Ser Pro Leu Ser Gly Ala Gly Gly Pro Pro Leu 450 455 460 lie Gin Gin Asn Ala Ser Glu Ala Glu lie Phe Tyr Asn Ala Thr Gly 465 470 475 480
Phe Leu Arg Asn Leu Ser Ser Ala Ser Gin Ala Thr Arg Gin Lys Met 485 490 495
Arg Glu Cys His Gly Leu Val Asp Ala Leu Val Thr Ser lie Asn His 500 505 510
Ala Leu Asp Ala Gly Lys Cys Glu Asp Lys Ser Val Glu Asn Ala Val
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0NC-A0405-TW 6/5 2 515 520 525
Cys Val Leu Arg Asn Leu Ser Tyr Arg Leu Tyr Asp Glu Met Pro Pro 530 535 540
Ser Ala Leu Gin Arg Leu Glu Gly Arg Gly Arg Arg Asp Leu Ala Gly 545 550 555 560
Ala Pro Pro Gly Glu Val Val Gly Cys Phe Thr Pro Gin Ser Arg Arg 565 570 575
Leu Arg Glu Leu Pro Leu Ala Ala Asp Ala Leu Thr Phe Ala Glu Val 580 585 590
Ser Lys Asp Pro Lys Gly Leu Glu Trp Leu Trp Ser Pro Gin lie Val 595 600 605
Gly Leu Tyr Asn Arg Leu Leu Gin Arg Cys Glu Leu Asn Arg His Thr 610 615 620
Thr Glu Ala Ala Ala Gly Ala Leu Gin Asn lie Thr Ala Gly Asp Arg 625 630 635 640
Arg Trp Ala Gly Val Leu Ser Arg Leu Ala Leu Glu Gin Glu Arg lie 645 650 655
Leu Asn Pro Leu Leu Asp Arg Val Arg Thr Ala Asp His His Gin Leu 660 665 670
Arg Ser Leu Thr Gly Leu lie Arg Asn Leu Ser Arg Asn Ala Arg Asn 675 680 685
Lys Asp Glu Met Ser Thr Lys Val Val Ser His Leu lie Glu Lys Leu 690 695 700
Pro Gly Ser Val Gly Glu Lys Ser Pro Pro Ala Glu Val Leu Val Asn 705 710 715 720
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0NC-A0405-TW 7/5 2 lie lie Ala Val Leu Asn Asn Leu Val Val Ala Ser Pro lie Ala Ala 725 730 735
Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Asp Gly Leu Arg Lys Leu lie Phe lie Lys 740 745 750
Lys Lys Arg Asp Ser Pro Asp Ser Glu Lys Ser Ser Arg Ala Ala Ser 755 760 765
Ser Leu Leu Ala Asn Leu Trp Gin Tyr Asn Lys Leu His Arg Asp Phe 770 775 780
Arg Ala Lys Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Phe Leu Gly Pro 785 790 795 〈210〉 3 <211〉 2003 <212> DNA <213> Homo sapiens 〈400〉 3 ggaatggggc gggacttcca gtaggaggcg gcaagtttga aaagtgatga cggttgacgt 60 ttgctgattt ttgactttgc ttgtagctgc tccccgaact cgccgtcttc ctgtcggcgg 120 ccggcactgt aggtgagcgc gagaggacgg aggaaggaag cctgcagaca gacgccttct 180
ccatcccaag gcgcgggcag gtgccgggac gctgggcctg gcggtgtttt cgtcgtgctc 240 agcggtggga ggaggcggaa gaaaccagag cctgggagat taacaggaaa cttccaagat 300 ggaaactttg tctttcccca gatataatgt agctgagatt gtgattcata ttcgcaataa 360 gatcttaaca ggagctgatg gtaaaaacct caccaagaat gatctttatc caaatccaaa 420 gcctgaagtc ttgcacatga tctacatgag agccttacaa atagtctatg gaattcgact 480 ggaacatttt tacatgatgc cagtgaactc tgaagtcatg tatccacatt taatggaagg 540 cttcttacca ttcagcaatt tagttactca tctggactca tttttgccta tctgccgggt 600 gaatgacttt gagactgctg atattctatg tccaaaagca aaacggacaa gtcggttttt 660 aagtggcatt atcaacttta ttcacttcag agaagcatgc cgtgaaacgt atatggaatt 720 tctttggcaa tataaatcct ctgcggacaa aatgcaacag ttaaacgccg cacaccagga 780
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW
tgtaaatagt ttgagtaaaa tS3,S3,3,3,33S 3,3,3,3.3,3,3,3.3,3 3,3,Q ggcattaatg gcagctttca aacgatagtg gcgtttgaat 3303,3,33,3^^ ggtccagaag ctcagttgac ggacctttca ggaccaaatt caaaagactg gaagcatgaa agaaaaaaga taaacttgga aatatttcta agaggactcc aatgtcaacc tttctattta gcttcatcag ttattaattt aaactggaga gatggaattc ctgcaagagg gaactaaaat gtggattctc cttaaaaatg tgcctgcctt gataataggg gagagtgatg atgattgtga gatgttaagc ggtgctgtct attcaacaac aacttgaaaa tatgctaaga tgattaacaa gaaagaaaag tttttataca gacttgattc aggagctaca gaaattccca tgttggtggt cagagaagtt ccagacaaga catgtcagtt aaaaattagc agtcagaact agaaggaaaa aatacaaacg atgaacgagt taaaagatgc ctgctttgga tagatgagaa aattacatgt ttgaagcgaa ctctcataag taacttgtgc caaaactagt 8/5 2 tgttccagtt acaatcacta aaagaagtca ttctttgaaa aaagaattat agtggtggag ggaagtgcag cagtatctta gaagaaattg acttgccaca cacagtaatt aaccacaatt tgctgaaagg gaaataccac gacagctgaa ctttttgtaa tggaagtatc tagttaataa agctattcat tacctttgaa gaagagcaag aatcaggatt aatatttcag gaaatacaag aaagaaaaaa aaatatgaaa ttatatcaaa aaggagagcc aagactgaag gcacaattca gaggattgca aatcaagaaa gagaaactga gacggtattg ctgaagagga atggcttgcc agaagtacca gatgaattta gtctctactc atatatatat aagagttcaa ttcatcaaaa agaaaaccaa agagtttgaa tgaaagatac tctatggaga agaaaataca tgaacttgga aaaattcgtt aaataaataa ataaagttca tccaaaaaat agtcccagga aaaaggcagc agatgttcaa atcttttaat aataatgttg atgtaggctt tgccccttgt ttttttctgt 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2003 > > > > 0 12 3 r—I r-H r-H lx 2 2 2 2 < < < < 4 464
PRT
Homo sapiens 〈400〉 4
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 9/5 2
Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr Asn Val Ala Glu lie Val lie 1 5 10 15
His lie Arg Asn Lys lie Leu Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr 20 25 30
Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met lie 35 40 45
Tyr Met Arg Ala Leu Gin lie Val Tyr Gly lie Arg Leu Glu His Phe 50 55 60
Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu 65 70 75 80
Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu 85 90 95
Pro lie Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu Thr Ala Asp lie Leu Cys Pro 100 105 110
Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu Ser Gly lie lie Asn Phe lie 115 120 125
His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gin 130 135 140
Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gin Gin Leu Asn Ala Ala His Gin 145 150 155 160
Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu 165 170 175
Gin Glu Glu Phe Lys Gin Leu Ser Asp Gly He Gin Glu Leu Gin Gin 180 185 190
Ser Leu Asn Gin Asp Phe His Gin Lys Thr lie Val Leu Gin Glu Gly 195 200 205
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 10/5 2
Asn Ser Gin Lys Lys Ser Asn lie Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn 210 215 220
Glu Leu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu Lys Glu lie Gin Glu Ser Leu 225 230 235 240
Lys Thr Lys lie Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu 245 250 255
Lys Met Lys Asp Thr Val Gin Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gin Glu Val 260 265 270
Val Glu Lys Tyr Glu lie Tyr Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser 275 280 285
Cys Gin Leu Glu Val Gin Leu Tyr Gin Lys Lys lie Gin Asp Leu Ser 290 295 300
Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser lie Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu 305 310 315 320
Glu Asp Gin He Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr 325 330 335
Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu Met lie Val Lys Lys Glu Lys Leu 340 345 350
Ala Thr Ala Gin Phe Lys lie Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gin 355 360 365
Tyr Lys Arg Thr Val lie Glu Asp Cys Asn Lys Val Gin Glu Lys Arg 370 375 380
Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr lie Asn Gin Glu lie Gin Lys 385 390 395 400 lie Lys Leu Gly lie Gin Gin Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys 405 410 415
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ONC-A0405-TW 11/5 2
Leu Lys Ser Gin Glu lie Phe Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys 420 425 430
Tyr His Asp Gly lie Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys lie 435 440 445
Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr 450 455 460
<210〉 5 〈211〉 2307 <212〉 DNA <213〉 Homo sapiens 〈400〉 5 gtgactgtgg agtttgaatt gggtggcggt tgactgtaga gccgctctct ctcactggca 60 cagcgaggtt ttgctcagcc cttgtctcgg gaccgcagcc tccgccgagc gccatggctc 120 ctaggaaggg cagtagtcgg gtggccaaga ccaactcctt acggaggcgg aagctcgcct 180 cctttctgaa agacttcgac cgtgaagtgg aaatacgaat caagcaaatt gagtcagaca 240 ggcagaacct cctcaaggag gtggataacc tctacaacat cgagatcctg cggctcccca 300 aggctctgcg cgagatgaac tggcttgact acttcgccct tggaggaaac aaacaggccc 360
tggaagaggc ggcaacagct gacctggata tcaccgaaat aaacaaacta acagcagaag 420 ctattcagac acccctgaaa tctgccaaaa cacgaaaggt aatacaggta gatgaaatga 480 tagtggaaga ggaagaagaa gaagaaaatg aacgtaagaa tcttcaaact gcaagagtca 540 aaaggtgtcc tccatccaag aagagaactc agtccataca aggaaaagga aaagggaaaa 600 ggtcaagccg tgctaacact gttaccccag ccgtgggccg attggaggtg tccatggtca 660 aaccaactcc aggcctgaca cccaggtttg actcaagggt cttcaagacc cctggcctgc 720 gtactccagc agcaggagag cggatttaca acatctcagg gaatggcagc cctcttgctg 780 acagcaaaga gatcttcctc actgtgccag tgggcggcgg agagagcctg cgattattgg 840 ccagtgactt gcagaggcac agtattgccc agctggatcc agaggccttg ggaaacatta 900 agaagctctc caaccgtctc gcccaaatct gcagcagcat acggacccac aaatgagaca 960
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405—TW ccaaagttga cttcaggctt attcaggaat ccatcccagc tctcccagct atcctcttca gaagactgcc tgcttgagac ccagaaggtg agtagggaac tcttcctcct gctgtgccca actgaagacc ttagtggaaa gccacagaat cttcagagag ggtggcctca agtgaggtcc agaatttgag ggctctctgt tcaagttgta ttctgagtaa aaattctggt caggatggac attgtttgag tcagacgtgc tgatcccagt gaatcctccc ccctgccctg tccaccaccg cgggaggttt gggggaactg atgtccgtct cctcctcctc gtagttctga aaatactggt tttggataag aactgtctct cacttctctc ttccatgtgt tcattctcca aactagagtc ggtatttgtt ttcttttaag tggtatcttt tttgtgtttt ttttaatggg tgtgaagttc tagtcccaca cactgcttgc tgctctctga cctgcagttg ctacccagag aggctcagat tacagatcag accctctcgc ctgtgggagg agtctgcttg ttggagacaa ggaactgtag aagctatcca ttatggggtt gcctgtgcct gccagcctct ctcatcccca attattttgc ttcttttatt gagctgattg cttctgt 12/5 2 cacttctggg cagagcaagg ccagttaggt tggggccatg gctgctgcct agggggcgaa aacctctgca aagtgagctc cagagcagga actcatgaca tggtcagtgg tggagcagtg cttccatgtc ggcccagatt tggtccagtg catgggaaca ggggcatgga ctgccctgga ggcttgaagg aacaagacca ctcctttccc ttctaatcag accctgaaga agccatgttc agagctgtct ccatggaagc tttgcctcct gaagaaccct tctggcattt tgggccatga cagttggcag cctcccccta gacttaggga ttttatgttt ttgctcttct ctggaggttt gtccctgcca ggggcgggtg ctttgttaag gaatcatgtg cacatggctt ttttagtaaa tgagattttt agctggtacc gacttcttcc ctctaaggga gttcaccctc ttcccatcag gcaactcaac gtgttctcag ctgctctcta gagggtaggt cagtgacctc ccagccctcc tctttcacct atccctgttt acctccctag tatgtcattg agtctgtaga tgacttgctt cagagtcagc ctatgttcta tctcatgtag acagtcctgt gtatatattg tactttcaat 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2307 0 12 1± IX IX 2 2 2 < < < o T 8 R 2 p
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 13/5 2 <213> Homo sapiens <400〉 6
Met Ala Pro Arg Lys Gly Ser Ser Arg Val Ala Lys Thr Asn Ser Leu 1 5 10 15
Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ser Phe Leu Lys Asp Phe Asp Arg Glu Val 20 25 30
Glu He Arg He Lys Gin He Glu Ser Asp Arg Gin Asn Leu Leu Lys 35 40 45
Glu Val Asp Asn Leu Tyr Asn lie Glu lie Leu Arg Leu Pro Lys Ala 50 55 60
Leu Arg Glu Met Asn Trp Leu Asp Tyr Phe Ala Leu Gly Gly Asn Lys 65 70 75 80
Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Thr Ala Asp Leu Asp lie Thr Glu lie 85 90 95
Asn Lys Leu Thr Ala Glu Ala lie Gin Thr Pro Leu Lys Ser Ala Lys 100 105 110
Thr Arg Lys Val He Gin Val Asp Glu Met lie Val Glu Glu Glu Glu 115 120 125
Glu Glu Glu Asn Glu Arg Lys Asn Leu Gin Thr Ala Arg Val Lys Arg 130 135 140
Cys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Thr Gin Ser lie Gin Gly Lys Gly Lys 145 150 155 160
Gly Lys Arg Ser Ser Arg Ala Asn Thr Val Thr Pro Ala Val Gly Arg 165 170 175
Leu Glu Val Ser Met Val Lys Pro Thr Pro Gly Leu Thr Pro Arg Phe 180 185 190
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 14/5 2
Asp Ser Arg Val Phe Lys Thr Pro Gly Leu Arg Thr Pro Ala Ala Gly 195 200 205
Glu Arg lie Tyr Asn He Ser Gly Asn Gly Ser Pro Leu Ala Asp Ser 210 215 220
Lys Glu lie Phe Leu Thr Val Pro Val Gly Gly Gly Glu Ser Leu Arg 225 230 235 240
Leu Leu Ala Ser Asp Leu Gin Arg His Ser He Ala Gin Leu Asp Pro 245 250 255
Glu Ala Leu Gly Asn lie Lys Lys Leu Ser Asn Arg Leu Ala Gin lie 260 265 270
Cys Ser Ser He Arg Thr His Lys 275 280 <210> 7 <211〉 1419 <212> DNA <213> Homo sapiens <400〉 7
cggagacaga gacttcacga ctcccagtct cctcctcgcc gcggccgccg cctcctcctt 60 ctctcctcct cctcttcctc ctcctccctc gctcccacag ccatgtctgc ttagaccaga 120 gcagccccac agccaactag ggcagctgcc gccgccacaa cagcaaggac agccgctgcc 180 gccgcccgtg agcgatgaca ggagtgtttg acagaagggt ccccagcatc cgatccggcg 240 acttccaagc tccgttccag acgtccgcag ctatgcacca tccgtctcag gaatcgccaa 300 ctttgcccga gtcttcagct accgattctg actactacag ccctacgggg ggagccccgc 360 acggctactg ctctcctacc tcggcttcct atggcaaagc tctcaacccc taccagtatc 420 agtatcacgg cgtgaacggc tccgocggga gctacccagc caaagcttat gccgactata 480 gctacgctag ctcctaccac cagtacggcg gcgcctacaa ccgcgtccca agcgccacca 540 accagccaga gaaagaagtg accgagcccg aggtgagaat ggtgaatggc aaaccaaaga 600
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW
cagagaaggt tcgctgggat aagaagatca atggcgtgta ctcagccacc ctggagaact ccgccgggct tgctctctct gaaaggaatt tttgcatgta gcgcaactgt cttttttcaa ttctggataa 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1419 > > > > 0 12 3 IX IX ix 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 15/5 2 aagttcgtaa acccaggact atttattcca gctttcagct ggccgcatta ttcagaagac tcagtacctc gccttgccgg aacgcgccga gctggccgcc tgacacaaac acaggtgaaa atctggtttc agaacaaaag atccaagatc tgaaaaacgg ggagatgccc ccggagcaca gtcccagctc cagcgaccca actcgccgca gtctccagcg gtgtgggagc cccagggctc gtcccgctcg accctcatgc ccaccctccg acctccaacc agtccccagc gtccagctac ctgcatcctg gtacacaagt gcagccagct caatcaattc ccacctgccg ccttacagca cccgctggcg ctggcctccg ggacactcta ttagatgggc tactctcttt tttgggacta ctgtgttttg ctgttctaga aaatcataaa catatgggga agttcggaaa actgaaaaag attcatgtgt aaagcttttt agttattgca tttcaaaaga cccccccttt ttttacagag gacttttttt ggacactttc aatggtgcct tgaaatctat gacctcaact tttcaaaaga tgttatttta gccatgtaaa taagtgtaga tagaggaatt aaactgtata ataaaattat ttcgaccatg aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 289
PRT
Homo sapiens 〈400〉 8
Met Thr Gly Val Phe Asp Arg Arg Val Pro Ser lie Arg Ser Gly Asp 15 10 15
Phe Gin Ala Pro Phe Gin Thr Ser Ala Ala Met His His Pro Ser Gin 20 25 30
Glu Ser Pro Thr Leu Pro Glu Ser Ser Ala Thr Asp Ser Asp Tyr Tyr 35 40 45
Ser Pro Thr Gly Gly Ala Pro His Gly Tyr Cys Ser Pro Thr Ser Ala 50 55 60
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 16/5 2
Ser Tyr Gly Lys Ala Leu Asn Pro Tyr Gin Tyr Gin Tyr His Gly Val 65 70 75 80
Asn Gly Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Ala Lys Ala Tyr Ala Asp Tyr Ser 85 90 95
Tyr Ala Ser Ser Tyr His Gin Tyr Gly Gly Ala Tyr Asn Arg Val Pro 100 105 110
Ser Ala Thr Asn Gin Pro Glu Lys Glu Val Thr Glu Pro Glu Val Arg 115 120 125
Met Val Asn Gly Lys Pro Lys Lys Val Arg Lys Pro Arg Thr lie Tyr 130 135 140
Ser Ser Phe Gin Leu Ala Ala Leu Gin Arg Arg Phe Gin Lys Thr Gin 145 150 155 160
Tyr Leu Ala Leu Pro Glu Arg Ala Glu Leu Ala Ala Ser Leu Gly Leu 165 170 175
Thr Gin Thr Gin Val Lys lie Trp Phe Gin Asn Lys Arg Ser Lys lie 180 185 190
Lys Lys lie Met Lys Asn Gly Glu Met Pro Pro Glu His Ser Pro Ser 195 200 205
Ser Ser Asp Pro Met Ala Cys Asn Ser Pro Gin Ser Pro Ala Val Trp 210 215 220
Glu Pro Gin Gly Ser Ser Arg Ser Leu Ser His His Pro His Ala His 225 230 235 240
Pro Pro Thr Ser Asn Gin Ser Pro Ala Ser Ser Tyr Leu Glu Asn Ser 245 250 255
Ala Ser Trp Tyr Thr Ser Ala Ala Ser Ser lie Asn Ser His Leu Pro 260 265 270
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 17/5 2
Pro Pro Gly Ser Leu Gin His Pro Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Leu 275 280 285
Tyr 〈210〉 9 <211〉 2539 <212〉 DNA <213〉 Homo sapiens
<400〉 9 atccttatct tctcgtctag ttctccgagg ttgaaggctc ggcctgctca gagaaggaaa 60 ctgaggtcca ccgagttgga gaaacctact caacaccagg actaacttct tcagtgctta 120 gagtgtgaga aaaatggcaa atatgaatag tgattctagg catcttggca cctctgaggt 180 agatcatgaa agagatcctg gacctatgaa tatccagttt gagccatcgg atctaagatc 240 caaaaggcct ttctgtatag agcccacaaa catcgtgaat gtgaatcatg tcattcagag 300 ggttagtgac catgcctctg ccatgaacaa gagaattcat tactacagcc ggctcaccac 360 tcctgcagac aaggcactga ttgccccaga ccatgtagtt ccagctccag aagagtgcta 420 tgtgtatagt ccattgggct ctgcttataa acttcaaagt tacactgaag gatacggtaa 480 aaacaccagt ttagtaacca tttttatgat ttggaatacc atgatgggaa catctatact 540 aagcattcct tggggcataa aacaggctgg atttactact ggaatgtgtg tcatcatact 600 gatgggcctt ttaacacttt attgctgcta cagagtagtg aaatcacgga ctatgatgtt 660 ttcattggat accactacct gggaatatcc agatgtctgc agacattatt tcggctcctt 720 tgggcagtgg tcgagtctcc tcttctcctt ggtgtctctc attggagcaa tgatagttta 780 ttgggtgctt atgtcaaatt ttctttttaa tactggaaag tttattttta attttattca 840 tcacattaat gacacagaca ctatactgag taccaataat agcaaccctg tgatttgtcc 900 aagtgccggg agtggaggcc atcctgacaa cagctctatg attttctatg ccaatgacac 960 aggagcccaa cagtttgaaa agtggtggga taagtccagg acagtcccct tttatcttgt 1020 agggctcctc ctcccactgc tcaatttcaa gtctccttca tttttttcaa aatttaatat 1080
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376 曹
0NC-A0405-TW 18/5 2
cctaggcaca gtgtctgtcc tttatttgat tttccttgtc acctttaagg ctgttcgctt 1140 gggatttcat ttggaatttc attggtttat accaacagaa ttttttgtac cagagataag 1200 atttcagttt ccacagctga ctggagtgct tacccttgct ttttttattc ataattgtat 1260 catcacactc ttgaagaaca acaagaaaca agaaaacaat gtgagggact tgtgcattgc 1320 ttatatgctg gtgacattaa cttatctcta tattggagtc ctggtttttg cttcatttcc 1380 ttcaccacca ttatccaaag attgtattga gcagaatttt ttagacaact tccctagcag 1440 tgacaccctg tccttcattg caaggatatt cctgctgttc cagatgatga ctgtataccc 1500 actcttaggc tacctggctc gtgtccagct tttgggccat atcttcggtg acatttatcc 1560 tagcattttc catgtgctga ttcttaatct aattattgtg ggagctggag tgatcatggc 1620 ctgtttctac ccaaacatag gagggatcat aagatattca ggagcagcat gtggactggc 1680 ctttgtattc atatacccat ctctcatcta tataatttcc ctccaccaag aagagcgtct 1740 gacatggcct aaattaatct tccacgtttt catcatcatt ttgggcgtgg ctaacctgat 1800 tgttcagttt tttatgtgaa atacctcaac tgtttttttc aagagctctc atgatatttt 1860 gagccttgac aacagttcta tataaattca cttgtaaatg ctgctgttgt gtaattctaa 1920 atattttcta agataatttg aaagcaaggg aaatagtggc cccttaatga gtattttttt 1980 attggggtgg ggaaaggggc aaaaagaatg atcttagtgt ctttaccttt ctcatattaa 2040 ctcacctctt tattctgtgg tcttttctga atagaaatgt atgccctagg aagaaatcat 2100 gctgggtttt gcttttagag ataaaaggtg gtggatttat tttgcctgca gtaaagattc 2160 tcagggtgtc agagcagcat attgtcaaat cctgcttctg ttttatgttt cagtgtattc 2220 actttcattt tcttacttac tagaccattt ctgcagtttg cccaaacctc tactgtttgg 2280 gacagtaagc caaatacctc atttttaaaa agaagttttc atggcatcag tgttaataaa 2340 gtacattttt aactgagtct taatctctat ttgaagaaaa agtagagaca aaagtaatgt 2400 caatgtaatc cccaggatca tgaaatgtat acaaaataaa taaagtagga gagtttgttg 2460 ctgtctaact cctcttttat ttctaatcca gtaccagtga cttagatcga aattacagtt 2520 ccccaagcca gactttgca 2539
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ONC-A0405-TW 19/5 2 lTmc 0 6 R o 1 5 p H > > > > 0 12 3 1X 1x 2 2 2 2 sapiens <400〉 10 Met Ala Asn 1 Asp His Glu
Met Asn Ser Asp Ser Arg His Leu Gly Thr Ser Glu Val 5 10 15
Arg Asp Pro Gly Pro Met Asn lie Gin Phe Glu Pro Ser 20 25 30
Asp Leu Arg 35
Ser Lys Arg Pro Phe Cys lie Glu Pro Thr Asn lie Val 40 45
Asn Val Asn 50
His Val lie Gin Arg Val Ser Asp His Ala Ser Ala Met 55 60
Asn Lys Arg 65 lie His Tyr Tyr Ser Arg Leu Thr Thr Pro Ala Asp Lys 70 75 80
Ala Leu lie
Ala Pro Asp His Val Val Pro Ala Pro Glu Glu Cys Tyr 85 90 95
Val Tyr Ser
Pro Leu Gly Ser Ala Tyr Lys Leu Gin Ser Tyr Thr Glu 100 105 110
Gly Tyr Gly 115
Lys Asn Thr Ser Leu Val Thr lie Phe Met lie Trp Asn 120 125
Thr Met Met 130
Gly Thr Ser He Leu Ser He Pro Trp Gly lie Lys Gin 135 140
Ala Gly Phe 145
Thr Thr Gly Met Cys Val lie He Leu Met Gly Leu Leu 150 155 160
Thr Leu Tyr
Cys Cys Tyr Arg Val Val Lys Ser Arg Thr Met Met Phe 165 170 175
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 2 0/5 2
Ser Leu Asp Thr Thr Thr Trp Glu Tyr Pro Asp Val Cys Arg His Tyr 180 185 190
Phe Gly Ser Phe Gly Gin Trp Ser Ser Leu Leu Phe Ser Leu Val Ser 195 200 205
Leu He Gly Ala Met lie Val Tyr Trp Val Leu Met Ser Asn Phe Leu 210 215 220
Phe Asn Thr Gly Lys Phe lie Phe Asn Phe lie His His lie Asn Asp 225 230 235 240
Thr Asp Thr lie Leu Ser Thr Asn Asn Ser Asn Pro Val He Cys Pro 245 250 255
Ser Ala Gly Ser Gly Gly His Pro Asp Asn Ser Ser Met He Phe Tyr 260 265 270
Ala Asn Asp Thr Gly Ala Gin Gin Phe Glu Lys Trp Trp Asp Lys Ser 275 280 285
Arg Thr Val Pro Phe Tyr Leu Val Gly Leu Leu Leu Pro Leu Leu Asn 290 295 300
Phe Lys Ser Pro Ser Phe Phe Ser Lys Phe Asn lie Leu Gly Thr Val 305 310 315 320
Ser Val Leu Tyr Leu lie Phe Leu Val Thr Phe Lys Ala Val Arg Leu 325 330 335
Gly Phe His Leu Glu Phe His Trp Phe lie Pro Thr Glu Phe Phe Val 340 345 350
Pro Glu lie Arg Phe Gin Phe Pro Gin Leu Thr Gly Val Leu Thr Leu 355 360 365
Ala Phe Phe lie His Asn Cys lie lie Thr Leu Leu Lys Asn Asn Lys 370 375 380
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 2 1/5 2
Lys Gin Glu Asn Asn Val Arg Asp Leu Cys lie Ala Tyr Met Leu Val 385 390 395 400
Thr Leu Thr Tyr Leu Tyr He Gly Val Leu Val Phe Ala Ser Phe Pro 405 410 415
Ser Pro Pro Leu Ser Lys Asp Cys He Glu Gin Asn Phe Leu Asp Asn 420 425 430
Phe Pro Ser Ser Asp Thr Leu Ser Phe lie Ala Arg lie Phe Leu Leu 435 440 445
Phe Gin Met Met Thr Val Tyr Pro Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Arg Val 450 455 460
Gin Leu Leu Gly His lie Phe Gly Asp lie Tyr Pro Ser lie Phe His 465 470 475 480
Val Leu lie Leu Asn Leu lie lie Val Gly Ala Gly Val lie Met Ala 485 490 495
Cys Phe Tyr Pro Asn lie Gly Gly lie lie Arg Tyr Ser Gly Ala Ala 500 505 510
Cys Gly Leu Ala Phe Val Phe lie Tyr Pro Ser Leu lie Tyr lie lie 515 520 525
Ser Leu His Gin Glu Glu Arg Leu Thr Trp Pro Lys Leu lie Phe His 530 535 540
Val Phe lie lie lie Leu Gly Val Ala Asn Leu lie Val Gin Phe Phe 545 550 555 560
Met * <210〉 11
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW
2 2/5 2 <211〉 5071 <212〉 DNA <213> Homo sapiens 〈400〉 11 ggcctgatag cgcggcgtgt ggaccggccg gccacagccc gagccggtcc cagccgagcc gctccggtgc ccgcagccat gccggccggc tgcctcctgg ggccccagga tttcgggccg gacgccgaca tgtgtgccgc gtccgtggcc aatgtgctgc agctccggga gaccgtgctg gagaccatcc gcgagctgac cgccaagctg cccggagccg gcgaggcccg ggcgggcggc accatgggcg acctgtcccg gacaccggcc ttgcaatcgc tcaaaacccg cctggagaac agccagacca acagcctcaa ggatctgctg gtgctgtccc gggtgaacac cctggaggag gagagggtca agatcgagac cgccctgacc aaaggtcaga aagacaaccg ccctggagac aactatatgt atgccaaggt gaagaagagc atgtggctca agtccagcgc cacgccaggt ggccaggcca acgagctggt cctcattgag aatgacaagg tggccaagct gccttttgtc gtcacctgga ccacccggga cggggtctgg agtggcgaga acttggcgcc ctatcacccc caggagcagg acactctggg tggtgggttt gcccacttca acatctggga ccgcaagctg tgcagcacca aggctctgtc cggcaatgtc aagagcgcgc ccagagcggc gccgtcgcga gagccccagc cgagccgagc cggcccgagc cgcgcgcgca cctgtgcgct gctcgccctc acgcgcttca tctgcacttc ggtgccggtg gcgggcggcg cggaggagct ccggagcagc cagcagaagg agaccatcct gagccagaag ggccgctgcg agagccagag cacgctggac ggccgcaagc agccgggctc gggcaagaac gccgagacgc tcagccaact cgggcaaact ctcgagcagt acagccgcct caattcctcc cagagcaaga tcgatgagct ggagaggcag ggcaaggggg ggcccaagaa cgacaccgag tccctgcacc agcggatcag cgagctcgag aagttccagc tcacattccc actgcggacc ctgccagaga tgtacgcctt cactgtctgc gtgggcacgc ccttctccta cgctgtgccc tggggcaaca accccatgga gatcctcatc atcaatgatg gcaagtggca ccacatctgt gaggcctacc aggatggcac gcagggtggc atcaagcccc agggcgtgct ggtgctgggc gatgccaccc aggcatttgt gggtgagctg acccccgggg aggtgtacaa cctggccacc atcgcctggg ctgaatccca catcgagatc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 1380 200533376
0NC-A0405-TW 2 3/5 2
tacggcgggg ccaccaagtg gaccttcgag gcctgtcgcc agatcaactg agcacggcag 1440 gccaggctga gccgcccgcc ctcgccccct gcttgtgcgg cgatgatctg tttgtgcgtc 1500 tcttctctcc cttttcccca ggaatgaacc gaggccgtcg ccctgcacac gcacacgcac 1560 acagcctggt tttgtcctca tgcacacgaa gcagcccctg ctcccatctg tccctgagga 1620 agccccactt ctctgtagga gcccggactc tctcagcatg ccccattcac agctgaagtg 1680 ggtgctgcaa cgtcttgaac aaggcagaag ttggtgagag gatctgtgtg tgcgtgtcta 1740 catgtgtgtg tctacgtgtg tgcgtgcgtg gctgggggag gccttttctt tgaggacgta 1800 cctcatttcc ttctttcttc tggctttgga aaaatctcat gatgaaaatt catatttgcc 1860 aactttgtta gctgcgtgcg tgctttgggg ttggtgcaac ctcagtacac gcatttgtct 1920 ttgtttgcaa acctttctca gagcgacata tctttatatt gatgtaataa atgtctttta 1980 gtggtttgtc aaaggccggg ggcgggggct ctctacagag aatttttatt ttgtaataga 2040 agtgaactgt ctctgaaggt gaaggcaggc cgtcctggga tggtaccctg tgctctcccg 2100 tggaggagag gggatggctg aggacactgg cccttaccca gggcgaacag catccatccc 2160 tgctgtttgc atcttgagag cagcatgggg cctgggaggt cggcctgtgt gcccagctca 2220 gctagctctg ccccaggacg gccctgccct cgaccttccc acctcctcag atcctgcaag 2280 gctgggtctg cccctccctt ctcacctctg gagctgtgct gcactgcttc ccagagaggg 2340 ccctgagaga ggagcgtgcc acccaccagg gaagccgggc cccagcaccc ctctcctttg 2400 gcctcccgga gtgcagacca gaggggacct tttaaggaaa gaagccgtgt ttcgatgaag 2460 acctggccac atggggcact gggacttcaa cccagcccat cggtgggaag gtcctttttg 2520 ggggactttg acagccatat ccctcccagc acaccaggcg ccaggtgagc tggttcagac 2580 ccctccaggg tactccagag acctcacgtg tggagccagg cctggccagg caggggcctg 2640 aaacccactc ctccatctca tgggctcacg gcctacacga gcccacaagc tgccactggc 2700 cggcgacact gacacctgag cagtgtccag aacctttttg cctttttttg ttccccgtga 2760 aaagcaacat ggacatttcc ttctagtcct tccaaggagg ggagagaagt gtatgtgcat 2820 ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt tgtgtgtgtg tgtgcgctaa gtgagaaaga gagcaggctc 2880 gggaggccct gcccagggta ggaggagctt cctgctttgc accatctggt ggtcgcaccc 2940
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
ONC—A0405-TW 2 4/5 2
tggagggcac cccgactctg tctccaggag tctcatcagc aaaccgctga caagtctttc 3000 tagaaattct actgcactgc ctggctcagc tgcacgctgc agacatttct gcaggaggag 3060 caggtgtttc tgtcttctgt tccttctagg gccacctgtc cccttaaaca caggtccacg 3120 ttgtgtcaag aacctagtgc atctgtgtgt gtctgtcagt gtctctgtgt cagtgttctc 3180 gtgggtgtct gcacggtacc ggcccgcctt ctgcaatcat cactcccgca gagggggtgc 3240 agatcaggcg ccgtgctgcg gttgttgttc aacagtgctt tttcttagat agcgtcttcc 3300 tcagcgcccg tcggttgtgg catccttgat ctcagggatc ttctccgttt gcatgtcctc 3360 ggagtggcgt gttccttctc cctgggtccg acatgtgttc ccgcacctgc atggactgcc 3420 ccggttctgt gttgtgtgcc gagtgccgcc cagtgttctg tgaccacccg tgtagctact 3480 gaaaatggct gggtaagcaa gtcaagggtg ttggaggagg tcaagagaga gctcagtttc 3540 cctctccccc tccccaaaca caccaagaag catttttaac gtgtaggttg agaacaagcc 3600 taaaggattc ccacagctgg gagccagcaa gagagcttgg agtcgcctct ctagaccaga 3660 tctagcccca ccctcactcc agccatctcg gagcccttgt gtaggcaacg ccggtgcgcg 3720 gctgtgtggg gtgctccctg ccagcacctc cggccagccc cgcccctgcc gatctactgg 3780 accgcagacc accttctgcc cccgtggcca ggtgggagct gtccgttcag gaccatgagc 3840 catcctctgc cctgactagc gaggggcaga gcacacccca gtgcttacgc ctccacccct 3900 gcagcctcct ggcccgctca ccttcctcac ccctcctctg acccacccat ggtgccaggg 3960 ccgaagctga cctttagctc cctcctgccc ttgctagggt ctgagccaag cccctcgact 4020 cctcactgtg ttgacacttg gcactttgct ggccccgaga aggtcgatga cacagccgca 4080 aatctaatcc acgtagttcc catttactcc ttaatctgat tgatgttccc tcttgcactg 4140 aataatacat gcctctctca ggtaagccat tttataaaac aagaagataa aaagcactgt 4200 tgaggcagtg tttgcttttg ccgagctggt gtccgacagc tccctgggtg tccggggtgg 4260 gagagctgtt gacagaagct ctccgggcct cagggcttag atcccacttg agtcgtaagc 4320 cttcttgctt ttgataacac agtattattt ctcttactgt agaagaaaaa gtttattacc 4380 aaacaagagt atttttatga aagaaaagga caaacctata aattaactca acctatatct 4440
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
ONC—A0405-TW 2 5/5 2 cccttgaaaa tactttcagg ctccaccaaa acgtagaact gaaagcatgt attttggaag 4500 aaagagatac attttgtatg ctttcttttc cttttgtaga ttcccagttt attttctaag 4560 actgcaaaga tcactttgtc accagccctg ggacctgaga ccaagggggt gtcttgtggg 4620 cagtgagggg gtgaggagag gctggcatga ggttcagtca ttccagtgag ctccaaagag 4680 gggccacctg ttctcaaaag catgttgggg accaggaggt aaaactggcc atttatggtg 4740 aacctgtgtc ttggagctga cttactaagt ggaatgagcc gaggatttga atatcagttc 4800 taaccttgat agaagaacct tgggttacat gtggttcaca ttaagaggat agaatccttt 4860 ggaatcttat ggcaaccaaa tgtggcttga cgaagtcgtg gtttcatctc ttaaacacag 4920 tgtgtaaatt tattcaacta acgatgggaa atgtattact tctgtacaca gtggactgaa 4980 gtgcaatttg ttgaaaggga acaagtcatt gaagagaaaa aaaaaaagcc caatacttag 5040 agtcccaatt ttgtctcatt tgccaaaaaa a 5071 0 12 3 IX IX r—H 2 2 2 2 \/ < \Z < 12 430
PRT
Homo sapiens <400〉 12
Met Pro Ala Gly Arg Ala Arg Thr Cys Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu 15 10 15
Leu Gly Pro Gin Asp Phe Gly Pro Thr Arg Phe lie Cys Thr Ser Val 20 25 30
Pro Val Asp Ala Asp Met Cys Ala Ala Ser Val Ala Ala Gly Gly Ala 35 40 45
Glu Glu Leu Arg Ser Ser Asn Val Leu Gin Leu Arg Glu Thr Val Leu 50 55 60
Gin Gin Lys Glu Thr He Leu Ser Gin Lys Glu Thr lie Arg Glu Leu 65 70 75 80
Thr Ala Lys Leu Gly Arg Cys Glu Ser Gin Ser Thr Leu Asp Pro Gly
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 2 6/5 2 85 90 95
Ala Gly Glu Ala Arg Ala Gly Gly Gly Arg Lys Gin Pro Gly Ser Gly 100 105 110
Lys Asn Thr Met Gly Asp Leu Ser Arg Thr Pro Ala Ala Glu Thr Leu 115 120 125
Ser Gin Leu Gly Gin Thr Leu Gin Ser Leu Lys Thr Arg Leu Glu Asn 130 135 140
Leu Glu Gin Tyr Ser Arg Leu Asn Ser Ser Ser Gin Thr Asn Ser Leu 145 150 155 160
Lys Asp Leu Leu Gin Ser Lys lie Asp Glu Leu Glu Arg Gin Val Leu 165 170 175
Ser Arg Val Asn Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly Gly Pro Lys Asn Asp 180 185 190
Thr Glu Glu Arg Val Lys lie Glu Thr Ala Leu Thr Ser Leu His Gin 195 200 205
Arg lie Ser Glu Leu Glu Lys Gly Gin Lys Asp Asn Arg Pro Gly Asp 210 215 220
Lys Phe Gin Leu Thr Phe Pro Leu Arg Thr Asn Tyr Met Tyr Ala Lys 225 230 235 240
Val Lys Lys Ser Leu Pro Glu Met Tyr Ala Phe Thr Val Cys Met Trp 245 250 255
Leu Lys Ser Ser Ala Thr Pro Gly Val Gly Thr Pro Phe Ser Tyr Ala 260 265 270
Val Pro Gly Gin Ala Asn Glu Leu Val Leu lie Glu Trp Gly Asn Asn 275 280 285
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 2 7/5 2
Pro Met Glu lie Leu lie Asn Asp Lys Val Ala Lys Leu Pro Phe Val 290 295 300 lie Asn Asp Gly Lys Trp His His lie Cys Val Thr Trp Thr Thr Arg 305 310 315 320
Asp Gly Val Trp Glu Ala Tyr Gin Asp Gly Thr Gin Gly Gly Ser Gly 325 330 335
Glu Asn Leu Ala Pro Tyr His Pro lie Lys Pro Gin Gly Val Leu Val 340 345 350
Leu Gly Gin Glu Gin Asp Thr Leu Gly Gly Gly Phe Asp Ala Thr Gin 355 360 365
Ala Phe Val Gly Glu Leu Ala His Phe Asn lie Trp Asp Arg Lys Leu 370 375 380
Thr Pro Gly Glu Val Tyr Asn Leu Ala Thr Cys Ser Thr Lys Ala Leu 385 390 395 400
Ser Gly Asn Val lie Ala Trp Ala Glu Ser His lie Glu lie Tyr Gly 405 410 415
Gly Ala Thr Lys Trp Thr Phe Glu Ala Cys Arg Gin He Asn 420 425 430 <210> 13 <211> 51 <212> DNA 〈213〉 Artificial 〈220〉
<223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 13 tccccctgtg gcagtacaac aagttcaaga gacttgttgt actgccacag g > > > nv IX 1i IX 1X 2 2 2
1451DN
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 51 200533376
0NC-A0405-TW 2 8/5 2 <213> Artificial
<220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 14 aaaacctgtg gcagtacaac aagtctcttg aacttgttgt actgccacag g 51 0 12 3 IX 1± r—H 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 15 51 DNA Artificial
<220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 15 tccctgccag acaagaagtg gtgttcaaga gacaccactt cttgtctggc a 51
<210〉 16 〈211〉 51 <212〉 DNA 〈213〉 Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 16 aaaatgccag acaagaagtg gtgtctcttg aacaccactt cttgtctggc a 51
> > > > 0 12 3 11—It—II 2 2 2 2 17 51 DNA Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 17 tcccgatgct gctgaaaggg agattcaaga gatctccctt tcagcagcat c 51 〈210〉 18 <211〉 51 <212〉 DNA <213> Artificial 〈220〉
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 2 9/5 2 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 18 51 aaaagatgct gctgaaaggg agatctcttg aatctccctt tcagcagcat <210〉 19 <211〉 51 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 19 51 tccccagcag aagctattca gacttcaaga gagtctgaat agcttctgct g 1X IX IX 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\
20 51 DNA Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 20 aaaacagcag aagctattca gactctcttg aagtctgaat agcttctgct g 51
<210〉 21 <211〉 51 <212〉 DNA <213〉 Artificial<220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 21 tcccggtgtc ctccatccaa gaattcaaga gattcttgga tggaggacac c 51 > > > > 0 12 3 t—H t-H r-H 1± 2 2 2 2 22 51 DNA Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 22
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405—TW 3 0/5 2 aaaaggtgtc ctccatccaa gaatctcttg aattcttgga tggaggacac c 51 0 12 3 t-H r-H r-H i-H 2 2 2 2 < /\ /\ /\ 23 51 DNA Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 23 tcccgccgtg ctaacactgt tacttcaaga gagtaacagt gttagcacgg c 51 t 0 12 3 ΙΑ IX IX IX 2 2 2 2 \/ < < < 24 51 DNA Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 24 aaaagccgtg ctaacactgt tactctcttg aagtaacagt gttagcacgg c 51 > > > > 0 12 3 t—H r—Η 1—Η IX 2 2 2 2 25 51 DNA Artificial
〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 25 tcccgaagct ctccaaccgt ctcttcaaga gagagacggt tggagagctt 51 > > > > 0 12 3 T—I T-H r—I t—H 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 26 51 DNA Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 26 aaaagaagct ctccaaccgt ctctctcttg aagagacggt tggagagctt c 51
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
ONC-A0405-TW 3 1/5 2 <210〉 27 <211> 51 <212〉 DNA <213〉 Artificial <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 27 51 51 51 tcccgactca gtacctcgcc ttgttcaaga gacaaggcga ggtactgagt 〈210〉 28 <211〉 51 <212> DNA 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 28 aaaagactca gtacctcgcc ttgtctcttg aacaaggcga ggtactgagt c <210〉 29 <211〉 51 〈212〉 DNA <213〉 Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 29 tcccggtttc agaagactca gtattcaaga gatactgagt cttctgaaac c 0 12 3 IX IX 1X 2 2 2 2 < < < 30 51
DNA
Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 30 aaaaggtttc agaagactca gtatctcttg aatactgagt cttctgaaac c 51 > > > 0 12 1i IX 1X 2 2 2
3151DNA
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
ONC-A0405-TW 3 2/5 2 <213〉 Artificial 〈220〉
<223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 31 51 tcccgtgcag ccagctcaat caattcaaga gattgattga gctggctgca c 〈210〉 32 <211〉 51 <212> DNA <213> Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 32 51 aaaagtgcag ccagctcaat caatctcttg aattgattga gctggctgca c IX 2 2 2 2 \Z \Z < <
33 51 DNA Artificial 〈220〉
<223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 33 51 tcccgagaat tcattactac agcttcaaga gagctgtagt aatgaattct c 〈210〉 34 〈211〉 51 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 34 aaaagagaat tcattactac agctctcttg aagctgtagt aatgaattct <210〉 35 〈211〉 51 <212〉 DNA <213〉 Artificial <220〉
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 51 200533376
ONC-A0405-TW <223〉
3 3/5 2 An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 35 tcccggatat tcctgctgtt ccattcaaga gatggaacag caggaatatc 51 0 12 3 IX ία IX r-H 2 2 2 2 < < < < 36 51 DNA Artificial <220〉 〈223〉
An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 36 aaaaggatat tcctgctgtt ccatctcttg aatggaacag caggaatatc 51 <210〉 <211〉 〈212〉 〈213〉 37 51 DNA Artificial 〈220〉 <223〉
An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 37 tcccgatatt caggagcagc atgttcaaga gacatgctgc tcctgaatat c 51
> > > > 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < 38 51 DNA Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 38 aaaagatatt caggagcagc atgtctcttg aacatgctgc tcctgaatat c 51 0 12 3 IX IX IX 2 2 2 2 < < < < 39 51 DNA Artificial <220〉 <223〉 An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 39
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER '200533376
0NC-A0405-TW 3 4/5 2 tcccggagac catcctgagc cagttcaaga gactggctca ggatggtctc c 51 0 12 3 t—I r—I IX IX 2 2 2 2 < < < < 40 51 DNA Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 40 aaaaggagac catcctgagc cagtctcttg aactggctca ggatggtctc c 51
> > > > 0 12 3 IX 1x IX T—H 2 2 2 2 41 51 DNA Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 41 tcccgtggac cttcgaggcc tgtttcaaga gaacaggcct cgaaggtcca c 51 0 12 3 IX 1± 1A 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 42 51 DNA Artificial
<220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 42 aaaagtggac cttcgaggcc tgttctcttg aaacaggcct cgaaggtcca 51 > > > > 0 12 3 43 47 DNA Artificial <220〉 <223> siRNA hairpin design <400〉 43 cctgtggcag tacaacaagt tcaagagact tgttgtactg ccacagg 47
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER '200533376
3 5/5 2
0NC-A0405-TW > > > > 0 12 3 IX IX IX r-H 2 2 2 2 < < < < 44 47 DNA Artificial <220〉 <223> siRNA hairpin design 〈400〉 44 tgccagacaa gaagtggtgt tcaagagaca ccacttcttg tctggca 0 12 3 1X IX 1X 2 2 2 2 /\ /\ < /\ 45 47 DNA Artificial <220〉 <223> siRNA hairpin design <400> 45 gatgctgctg aaagggagat tcaagagatc tccctttcag cagcatc > > > > 0 12 3 1—-111 2 2 2 2 46 47 DNA Artificial 〈220〉 <223> siRNA hairpin design <400> 46 cagcagaagc tattcagact tcaagagagt ctgaatagct tctgctg 0 12 3 1± 2 2 2 2 /\ κ\ κ\ /\ 47 47 DNA Artificial <220〉 <223> siRNA hairpin design <400〉 47 ggtgtcctcc atccaagaat tcaagagatt cttggatgga ggacacc o 1 2 IX IX IX 2 2 2 /\ /\ /\
4847DNA
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 47 47 47 200533376
0NC-A0405-TW 3 6/5 2 〈213〉 Artificial 〈220〉 〈223〉 siRNA hairpin design 〈400〉 48 gccgtgctaa cactgttact tcaagagagt aacagtgtta gcacggc 47 〈210〉 49 〈211〉 47 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223〉 siRNA hairpin design <400〉 49 gaagctctcc aaccgtctct tcaagagaga gacggttgga gagcttc 47 > > > > 0 12 3 IX 1—A IX 2 2 2 2 < \z \z < 50 47 DNA Artificial 〈220〉 <223> siRNA hairpin design <400〉 50 gactcagtac ctcgccttgt tcaagagaca aggcgaggta ctgagtc 47
> > > > 0 12 3 IX IX IX i—H 2 2 2 2 51 47 DNA Artificial 〈220〉 <223> siRNA hairpin design 〈400〉 51 ggtttcagaa gactcagtat tcaagagata ctgagtcttc tgaaacc > > > > 0 12 3 r-H t-H t—I r—I 2 2 2 2 52 47 DNA Artificial 〈220〉
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 3 7/5 2 <223> siRNA hairpin design <400〉 52 gtgcagccag ctcaatcaat tcaagagatt gattgagctg gctgcac 47 0 12 3 IX IX 1X IX 2 2 2 2 < < < < 53 47 DNA Artificial 〈220〉 〈223〉 siRNA hairpin design 〈400〉 53 gagaattcat tactacagct tcaagagagc tgtagtaatg aattctc 47 〈210〉 54 <211> 47 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial 〈220〉 〈223〉 siRNA hairpin design <400〉 54 ggatattcct gctgttccat tcaagagatg gaacagcagg aatatcc 47
> > > > 0 12 3 T-H r-H t—I IX 2 2 2 2 55 47 DNA Artificial 〈220〉 <223> siRNA hairpin design 〈400〉 55 gatattcagg agcagcatgt tcaagagaca tgctgctcct gaatatc 47 > > > > 0 12 3 T-H t—H t-H 1± 2 2 2 2 56 47 DNA Artificial <220〉 <223> siRNA hairpin design <400〉 56
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 3 8/5 2 ggagaccatc ctgagccagt tcaagagact ggctcaggat ggtctcc 47 > > > > 0 12 3 i—x IX IX 1X 2 2 2 2 57 47 DNA Artificial 〈220〉 〈223〉 siRNA hairpin design 〈400〉 57 gtggaccttc gaggcctgtt tcaagagaac aggcctcgaa ggtccac 47 〈210〉 〈211〉 〈212〉 <213〉 58 19 DNA Artificial 〈220〉 <223〉
An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 58 cctgtggcag tacaacaag 19 0 12 3 1X ix IX 1± 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 59 19 DNA Artificial 〈220〉 <223〉
An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 59 tgccagacaa gaagtggtg 19 > > > > 0 12 3 IT—It—It—_ 2 2 2 2 60 19 DNA Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA 〈400〉 60 gatgctgctg aaagggaga 19
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376 0NC-A0405-TW 3 9/5 2 <210> 61 <211> 19 <212> DNA 〈213〉 Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA 〈400〉 61 cagcagaagc tattcagac 19 t 0 12 3 IX iM 2 2 2 2 /\ x\ /\ /\ 62 19 DNA Artificial <220〉 <223〉 An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 62 ggtgtcctcc atccaagaa 19 0 12 3 IX IX IX 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 63 19 DNA Artificial <220〉 <223〉
An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 63 gccgtgctaa cactgttac 19 > > > > 0 12 3 r-H t—I r-H r—I 2 2 2 2 < < < < 64 19 DNA Artificial 〈220〉 <223〉
An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 64 gaagctctcc aaccgtctc <210〉 〈211〉 〈212〉
65 19 DNA
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 19 200533376
0NC-A0405-TW 4 0/5 2 <213〉 Artificial
<220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 65 gactcagtac ctcgccttg 19 0 12 3 1X 1—x IX IX 2 2 2 2 < 66 19 DNA Artificial
<220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 66 ggtttcagaa gactcagta 19 > > > > 0 12 3 IX 1± 1A IX 2 2 2 2 67 19 DNA Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA 〈400〉 67 gtgcagccag ctcaatcaa 19 0 12 3 r—H t—H t—H 1± 2 2 2 2 < < < < 68 19 DNA Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA 〈400〉 68 gagaattcat tactacagc 19 〈210〉 69 〈211〉 19 <212〉 DNA <213〉 Artificial <220>
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 4 1/5 2 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 69 ggatattcct gctgttcca 19 > > > > 0 12 3 1± 1i IX 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 70 19 DNA Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 70 gatattcagg agcagcatg 19 <210〉 71 <211〉 19 <212> DNA <213> Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400> 71 ggagaccatc ctgagccag 19
〈210〉 72 <211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial 〈220〉 〈223〉 An artificially synthesized target sequence for siRNA 〈400〉 72 gtggaccttc gaggcctgt 19 > > > > 0 12 3 t-H T-H r-H 2 2 2 2 < < < V/ 7322 DNA Artificial
〈220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence for RTHPCR <400> 73COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 4 2/5 2 atgcaggacg gtaacttcct gc 22 0 12 3 r-H r-H r-H 1± 2 2 2 2 < < < < 7421 DNA Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 74 tgggcccagg aagtcctcct t 21 〈210〉 75 〈211〉 23 <212> DNA <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 75 gagaaactga agtcccagga aat 23 〈210〉 76 〈211〉 23 <212> DNA 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR 〈400〉 76 ctgatacttc cattcgcttc aac 23 〈210〉 77 <211〉 23 <212> DNA <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 77 catctggcat ttctgctctc tat
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 23 200533376
0NC-A0405—TW 4 3/5 2 <210〉 <211> <212〉 <213〉 78 25 DNA Artificial <220〉 <223>
an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 78 ctcagggaaa ggagaataaa agaac <210〉 <211〉 〈212〉 〈213〉 79 23 DNA Artificial 〈220〉 〈223〉
an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400〉 79 gggactactg tgttttgctg ttc 23 0 12 3 IX IX 1± 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 80 23 DNA Artificial <220〉 <223〉
an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400〉 80 tgaggtcata gatttcaagg cac 23 <210〉 <211〉 〈212〉 <213〉 81 23 DNA Artificial 〈220〉 <223〉
an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR 〈400〉 81 ctaggaagaa atcatgctgg gtt
<210〉 82 <211〉 23 〈212〉 DNA
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 23 200533376
0NC-A0405-TW 4 4/5 2 <213> Artificial <220〉 〈223〉
an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400〉 82 gtatttggct tactgtccca aac 23 〈210〉 〈211〉 〈212〉 〈213〉 83 23 DNA Artificial 〈220〉 〈223〉
an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR 〈400〉 83 taaccttgat agaagaacct tgg 23 <210〉 〈211〉<212〉 〈213〉 8422 DNA Artificial 〈220〉 <223〉
an artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400〉 84 gcaaatgaga caaaattggg ac 22 > > > > 0 12 3 8522 DNA Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence <400〉 85 tggtagccaa gtgcaggtta ta 22 > > > 0 12 3 r—H r—I r-H 2 2 2 2 8622 DNA Artificial
〈220〉COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 4 5/5 2 <223> an artificially synthesized primer sequence 〈400〉 86 ccaaagggtt tctgcagttt ca 22 <210〉 〈211〉 〈212〉 〈213〉 〈220〉 <223〉 87 30 DNA Artificial an artificially synthesized primer sequence <400〉 87 tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30 0 12 3 1X 1x 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 88 29 DNA Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence <400〉 88 ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca 29
> > > > 0 12 3 ili 1x 1X 2 2 2 2 < < < < 89 47 DNA Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence 〈400〉 89 tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac 0 12 3 1X 1x 1X 2 2 2 2 < < < < 90 34 DNA Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 90
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 4 6/5 2 34 tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca > > > > 0 12 3 1X 1± IX 2 2 2 2 < 91 5089
DNA
Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized plasmid sequence <220〉 <221> misc—feature 〈222〉 (489h . (492) <223〉 〃n" indicates GAP. aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacgaaaccg ggccgggcgc ggcgggcgga tcacaaggtc ccccatctct actaaaaaaa 〈400〉 91 gacggatcgg ccactagtaa ggagctgaag cgcatgccgt tcgccgccgc cgggcccagt tgtgagggac tcaccataaa tctttcccnn ggtggttcac aggaggtcga aaaaatacaa cttgggaggc tcgcgccgac aatgtgaaaa actggcggcc gcgccctgta gagatctccc cggccgccag ggaagggggt cccgcgatat gccgccatgg gtcactaggc aggggagtgg cgtgaaatgt nntttttggg gcctataatc gaccatccag aaaattagcc tgaagcagaa tgcattccag gctccgtgaa gctcgagtga gcggcgcatt gatcccctat tgtgctggaa cacagtaggt tgagctccga aattcgaacg gggaacaccc cgccctgcaa ctttggattt ccagcacttt gctaacacgg attagccggg tggcgtgaac cctgggcgac actgcagaaa ggcggaaaga aagcgcggcg ggtgcactct ttcggcttgg ggcatcgttc acctctcgcc ctgacgtcat agcgcgcgtg tatttgcatg gggaatctta gggaggccga tgaaaccccc cgtggtggcg ccgggaggcg agagcgagtc cccaagccga accagctggg ggtgtggtgg cagtacaatc tagccaagtg ctttctgact ctgccgccgc caacccgctc cgccctggca tcgctatgtg taagttctgt ggcgcctata gacgttgcag "t 03.3.3,3,3.3,3,3, attctgcaga gctctagggg ttacgcgcag tgctctggat caggttatag gcccgccccc cggtgctccg caaggaatcg ggaagatggc ttctgggaaa atgagaccac atcccagcta tgagccgaga aaccgagtgg tatccatcac gtatccccac cgtgaccgct 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 4 7/5 2 acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 1080 ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 1140 gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca 1200 tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 1260 ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 1320 gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 1380 gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1440 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc 1500 caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 1560 tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 1620 cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc 1680 tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg 1740 gagcttgtat atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 1800 ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 1860 atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 1920 aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg 1980 acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 2040 acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 2100 tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 2160 ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 2220 agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 2280 atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg 2340 aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 2400 gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 2460 cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 2520
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 4 8/5 2
tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 2580 agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc 2640 atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt 2700 ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca 2760 ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 2820 cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 2880 atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata 2940 gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 3000 cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 3060 ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 3120 acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 3180 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 3240 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 3300 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 3360 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 3420 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 3480 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 3540 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 3600 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 3660 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 3720 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 3780 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 3840 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggttttttt gtttgcaagc agcagattac 3900 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 3960 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 11 St CB3.3.33 ggatcttcac 4020 ctagatcctt ΐ 13.3,0, 3,3,3 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4080
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW ttggtctgac tcgttcatcc accatctggc atcagcaata cgcctccatc tagtttgcgc tatggcttca gtgcaaaaaa agtgttatca aagatgcttt gcgaccgagt tttaaaagtg gctgttgaga tactttcacc aataagggcg catttatcag acaaataggg agttaccaat atagttgcct cccagtgctg aaccagccag cagtctatta aacgttgttg ttcagctccg gcggttagct ctcatggtta tctgtgactg tgctcttgcc ctcatcattg tccagttcga agcgtttctg acacggaaat ggttattgtc gttccgcgca gcttaatcag gactccccgt caatgatacc ccggaagggc attgttgccg ccattgctac gttcccaacg ccttcggtcc tggcagcact gtgagtactc cggcgtcaat gaaaacgttc tgtaacccac ggtgagcaaa gttgaatact tcatgagcgg catttccccg 4 9/5 2 tgaggcacct cgtgtagata gcgagaccca cgagcgcaga ggaagctaga aggcatcgtg atcaaggcga tccgatcgtt gcataattct aaccaagtca acgggataat ttcggggcga tcgtgcaccc aacaggaagg catactcttc atacatattt aaaagtgcca atctcagcga actacgatac cgctcaccgg agtggtcctg gtaagtagtt gtgtcacgct gttacatgat gtcagaagta cttactgtca ttctgagaat accgcgccac aaactctcaa aactgatctt caaaatgccg ctttttcaat gaatgtattt cctgacgtc tctgtctatt gggagggctt ctccagattt caactttatc cgccagttaa cgtcgtttgg cccccatgtt agttggccgc tgccatccgt agtgtatgcg atagcagaac ggatcttacc cagcatcttt caaaaaaggg attattgaag agaaaaataa 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5089 0 12 3 1—111—II 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 92 51 DNA Artificial
<220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 92 caccgaagcagcacgacttcttcttcaagagagaagaagtcgtgctgcttc
<210〉 93 〈211〉 51 <212〉 DNA
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 51 200533376
0NC-A0405-TW 5 0/5 2 <213> Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 93 aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt 51
<210〉 94 <211> 51 <212> DNA <213〉 Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 94 tccccgtacg cggaatactt cgattcaaga gatcgaagta ttccgcgtac g 51 <210〉 95 <211〉 51 <212〉 DNA <213〉 Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 95 aaaacgtacg cggaatactt cgatctcttg aatcgaagta ttccgcgtac g 51
> > > > 0 12 3 T-H r—H r-H 2 2 2 2 < < < < 96 51
DNA
Artificial 〈220〉 <223> An artificially synthesized sequence for siRNA 〈400〉 96 tcccgcgcgc tttgtaggat tcgttcaaga gacgaatcct acaaagcgcg c 51 > > > > 0 12 3 t-H r-H r-H IX 2 2 2 2 \Z \/ < < 97 51
DNA
Artificial <220〉
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
0NC-A0405-TW 5 1/5 2 <223〉 An artificially synthesized sequence for siRNA <400〉 97 aaaagcgcgc tttgtaggat tcgtctcttg aacgaatcct acaaagcgcg 〈210〉 98 <211> 47 <212〉 DNA <213> Artificial 〈220〉 〈223〉 siRNA hairpin design 〈400〉 98 gaagcagcac gacttcttct tcaagagaga agaagtcgtg ctgcttc 51 47 > > > > 0 12 3 1± r-H 2 2 2 2 /\ /\ /\ /\ 99 47 DNA Artificial <220〉 〈223〉 siRNA hairpin design <400〉 99 cgtacgcgga atacttcgat tcaagagatc gaagtattcc gcgtacg 47 〈210〉 100 <211〉 47 <212〉 DNA <213〉 Artificial <220〉 〈223〉 siRNA hairpin design 〈400〉 100 gcgcgctttg taggattcgt tcaagagacg aatcctacaa agcgcgc 47 0 12 3 1± 1J- IX 1± 2 2 2 2 < < < < 101 19 DNA Artificial
<220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400> 101COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER 200533376
ONC-A0405-TW 5 2/5 2 19 gaagcagcac gacttcttc <210〉 102 <211〉 19 <212〉 DNA <213〉 Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400> 102 19 cgtacgcgga atacttcga
<210〉 103 <211〉 19 〈212〉 DNA <213> Artificial <220〉 <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400〉 103 19 gcgcgctttg taggattcg
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG CANCER

Claims (1)

  1. 200533376 十、申請專利範圍： 1 · 一種治療或預防個體之肺癌之方法，包括對該個體 投與一組合物，該組合物包括可抑制pKP3、CDCAh CDCA8、 DLX5、URLC11 或 NPTX1 表現之小型干擾 RNA(siRNA)。 2·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該5丨rnA 包括編譯核苷酸序列及反義核苷酸序列，該核苷酸序列可 專一地與 PKP3、CDCA1、CDCA8、DLX5、URLC11 或 NPTX1 中 任一序列雜交。
    3.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該肺癌為 非小細胞肺癌（NSCLC)。 4·如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該siRNA 包括一核糖核苷酸序列，該核糖核苷酸序列對應選自由序 列識別號碼：5 8、5 9、6 0、61、6 2、6 3、6 4、6 5、⑽、β 了、 68、69、70、71或72號所組成之群中任一序列作為標的 序列。 5·如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該s丨RNA %具有5’ -[A]-[B]-[A’ ]-3’之通式，其中[A]係對應選自 由序列識別號碼·· 5 8、5 9、6 0、61、6 2、6 3、6 4、β 5、6 e、 67、68、69、70、71或72號之核苷酸所組成之群中任一 序列之核糖核苷酸序列；[B]係由約3至約23個核脊酸所 組成之核糖核苷酸序列；以及[A，]係與[A]互補之序列所 組成之核糖核苷酸序列。 6 ·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該組合物 包括轉染增強劑。 2125-6960-PF 48 200533376 7 · —種雙股分； 刀于’包括編譯股和反義股，其中該編譯 股包括對膺纟登自4·> ^ …、自由序列識別號碼：58、59、60、61、62、 63 、 64 、 65 、 RR 、 μ ο 6 67、Μ、69、70、71或72號所組成之 >、丄 不、序列之核糖核苷酸序列，及該反譯股包括與 / •睪月又互補之核糖核苷酸序列，其中該編譯股與反義股 相互雜父形成該譬股八2 · 、.， 又刀子，以及將該雙股分子導入可表現 PKP3、CDCA1、γγ^λ 〇 CDCA8、DLX5、URLC11 或 ΝΡΤΧ1 基因之細胞 時，可抑制該基因表現。 ^ _明專利範圍第7項所述之雙股分子，其中該標 的序列包括至少約1 0個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷 酸序列係選自序列# 斤夕j識別號碼：：1、3、5、7、9或11號之群。 9·如申明專利範圍帛8項所述之雙股分子，其中該標 #】l括、力1 9至2 5個連續核：g：酸之核普酸序列，該核 甘酉文序列係選自序列識別號碼：：1、3、5、7、9或1 i號之 群。 1 &八1〇·如申請專利範圍第9項所述之雙股分子，其中該雙 刀子係為單核糖核苷酸轉錄本，該轉錄本包括藉由單 股核糖核苷酸序列連接之編碼股及反義股。 ^ U·如申請專利範圍第8項所述之雙股分子，其中該雙 月又刀子為少於約1 00個核苷酸長度之寡核苷酸。 12·如申請專利範圍第u項所述之雙股分子，其中該 又版刀子為少於約75個核苷酸長度之寡核苷酸。 13·如申請專利範圍第12項所述之雙股分子，其中該 又月又刀子為少於約50個核苷酸長度之募核苷酸。 2125-6960-PF 49 200533376 14·如申睛專利範圍第1 3項所述之雙股分子，其中該 雙股分子為少於約25個核苷酸長度之募核苷酸。 15·如申晴專利範圍第14項所述之雙股分子，其中該 雙股分子為約1 9至25個核苷酸長度之寡核苷酸。 16· —種載體，該載體編碼如申請專利範圍第7項所述 之雙股分子。 、 17·如申請專利範圍第16項所述之載體，其中該載體 編碼具一級結構之轉錄本及包括編碼股及反義股。 I8·如申請專利範圍第17項所述之載體，其中該轉錄 本更包括連接讓編碼股及該反義股之單股核糖核苷酸序 列0 ^ I9· 一種载體，包括一聚核苷酸，該聚核苷酸包括編碼 股核酸及反義股核酸之組合，其中該編喝股核酸包括序列 識別號碼：58、59、60、61、62、63、W、65、66、67 ν 68、69 70、71或72號之核苷酸序列，以及該反義股核 酸為與該編碼股互補之序列所組成之核苷酸序列。
    2〇·如申請專利範圍第19項所述之栽體，其中該聚核 苷酸具有5, -[Α]_[Β] —[Α’ ]_3’之通式，其中[Α]係= 列識別號碼.58、59、60、61、62、63、64、65、ββ、0 ⑽、69、70、71或72之核苷酸序列；[Β]係由約3至Q 個核苷酸所組成之核苷酸序列；以及[Α，]係與[α]互補 核苷酸序列。 ^ 21 · —種治療或預防肺癌之醫 切，包祜醫樂有欵 量之小型干擾RNA (siRNA)為活性成分及其醫藥可接受之 2125-6960-PF 50 200533376 載劑，4 小型干擾 RNA( siRNA)可抑制 pKp3、CDCiU、CDCA8、 DLX5、URLC11 或 NPTX1 之表現。 .22.如中請專利範圍第21項所述之醫藥組合物，其中 該SlRM包括選自由序列識別號碼：58、59、60、6卜62、 63、64、65、66、67、 b8 ' 69、70、71或72號所組成之 群中任—㈣酸序列作為標的序列。 2 3 ·如申請專利範圍 L国弟22項所述之醫藥組合物，中 該 siRNA 具有 5’ 〜「ΑΊ 「n 、 」〜[Β]-[Α’ ] - 3’之通式，其中[A]係 對應序列識別號碼：以 x 59 、 60 、 61 、 62 、 63 、 64 、 65 、 66 、 67 、 68 、 69 、 7〇 、 _ ^ — ·「 71或72號之核苷酸序列之核糖核 甘酉文序列；[B ]係由約q 、J d至2 3個核苷酸所組成之核糖核苷 酸序列；以及[A,]係伽「n _ 、Η [ A ]互補之核糖核奋酸序列。
    2125-6960-PF 200533376 j 七、指定代表圖·· (一） 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二） 本代表圖之元件符號簡單說明：無 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：
    2125-6960-PF 4
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