CN110846404A - Pkp3基因甲基化在精子活力检测剂中的应用及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人PKP3基因启动子区的甲基化水平在制备检测精子活力的检测剂中的应用，所述人PKP3基因启动子区为人第11号染色体第392017至394717位对应的区域。本发明通过基于全基因组甲基化测序结果进行分析和研究并通过验证，发现人PKP3基因启动子区的甲基化水平可作为分子标志来检测精子活力的强弱，当该区域所有甲基化位点没有全部被甲基化时，可认为相应的精子的活力较弱。该分子标志可为弱精症的诊断以及人工授精前对精子的选择提供辅助评价信息。
Description
技术领域
本发明涉及人类生殖健康领域，更特别地，涉及人PKP3基因启动子区的甲基化水平在制备检测精子活力的检测剂中的应用，以及一种用于检测精子活力的检测试剂盒。
背景技术
40％以上的不育男性均检测出患有弱精症。弱精症的病因是多因子的，例如，可能与内分泌紊乱、环境因素、生活经历甚至年纪渐长等都密切相关。对鼠类进行基因敲除和突变的研究显示，一些基因的突变与精子活性改变相关，但是这些基因在人类研究中均显示与精子活性无关。尽管近50％的不育案例被认为由遗传缺陷所致，但是，在一些男性不育的案例中，遗传因素貌似并非主要因素。越来越多的证据显示，在男性不育中，异常的表观遗传改变也有贡献。
精子是具有高度多样性的细胞群，其在DNA和精子质量参数上均体现出高度的多样性。有研究者已经开始研究精子DNA甲基化的样品内多样性，包括不同精细胞之间的精子DNA甲基化多样性和同一次射精物中不同质量的精子区之间的精子DNA甲基化多样性。本申请的发明人在研究过程中发现并报道(杜野等，Human Reproduction,Vol.31,No.1pp.24–33,2016，Promoter targeted bisulfite sequencingreveals DNA methylationprofiles associated with low sperm motility in asthenozoospermia)，一些特定区域上的甲基化在弱精症患者的低活力精细胞与正常对照的高活力精细胞之间存在显著的差异，推测其中某些区域的甲基化可能与精子活力有关。
然而，目前已报道的跟精子活力有关的甲基化区域十分少，难以用来准确评价精子活力，因此需要鉴定更多与精子活力相关的甲基化区域，从而为后续诊断和治疗的应用提供更多依据。
发明内容
我们在以前研究的基础上，继续深入研究，寻找和分析与精子活力或弱精有关联的差异甲基化区域。基于此，本发明提供了人PKP3基因启动子区在制备检测精子活力的检测剂中的应用。
在一个具体实施方案中，所述人PKP3基因启动子区为人第11号染色体第392017至394717位对应的区域。
在一个具体实施方案中，所述人PKP3基因启动子区为如SEQ ID NO:1所示序列对应的区域。
本发明还提供了一种用于检测精子活力的检测试剂盒，包括检测人PKP3基因启动子区的甲基化水平的引物。
在一个优选实施方案中，所述检测试剂盒包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对由序列分别为SEQ ID NO:2和3的两条引物组成，所述第二引物对由序列分别为SEQ ID NO:4和5的两条引物组成。
在一个优选实施方案中，所述检测试剂盒还包括亚硫酸氢盐溶液。
在一个优选实施方案中，所述亚硫酸氢盐溶液为亚硫酸氢钠溶液。
本发明通过基于全基因组甲基化测序结果进行分析和研究并通过验证，发现人PKP3基因启动子区的甲基化水平可作为分子标志来检测精子活力的强弱，当该区域所有甲基化位点没有全部被甲基化时，可认为相应的精子的活力较弱。该分子标志可为弱精症的诊断以及人工授精前对精子的选择提供辅助评价信息。
附图说明
图1为全基因组测序研究中8名健康志愿者的高活力精子(Na)与低活力精子(Nc)的人PKP3基因启动子区甲基化水平统计图；
图2为验证研究中50名健康志愿者高活力精子(a)和低活力精子(c)的人PKP3基因启动子区甲基化水平统计图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、精子分离
招募7个弱精症志愿者(A组)和8个健康志愿者(N组)，从志愿者获取精子样品，进行全基因组甲基化水平测序研究。使用Sperm Class Analyzer进行计算机辅助的精子分析(CASA)，进行Diff-Quik快速染色法评价精子形态。通过以下方法将具有不同活力的精细胞分离：在300×g下离心20min，制备非连续密度梯度级分(分为47.5、57、76和95％浓度层)，从95％浓度层(级分a)收集高活力精子细胞，从57％与76％浓度层之间(级分c)收集低活力精子细胞。收集到的精子经PBS洗两次后，提取基因组DNA
2、文库构建与甲基化测序
使用试剂盒从精子细胞中提取基因组DNA，用于文库构建。将1μg基因组DNA打断成约200-300bp的片段。纯化后将DNA片段用T4 DNA聚合酶、Klenow片段和T4多聚核苷酸激酶处理，形成平端的DNA片段，将平端DNA片段进行3’腺苷化，然后与接头连接，得到文库。对文库定量后，将其用于液相杂交捕获和亚硫酸氢盐测序。
经数据处理分析，我们发现，A组和N组的无论级分a还是级分c的全局DNA甲基化水平几乎相等，没有显著差异。但是，在一些区域上，存在A组与N组之间，或者同一组的不同级分之间，存在着甲基化的差异性。
3、差异甲基化区域的鉴定
对上述差异甲基化区域进行分析，我们发现，11号染色体第392017-394717位(参考基因组：GRCh37/hg19，UCSC Genome Browser)之间的区域存在甲基化水平差异，该区域为PKP3基因的启动子区，覆盖该基因的第-2089至+611位(SEQ ID NO:1)。我们的研究显示，该区域内的甲基化水平方差在A组的8个健康人的高低活力精子中具有显著差异。如表1和图1所示，在A组的所有高活力精子(级分a)中，该区域为全甲基化状态，区域内所有甲基化位点全部都被甲基化，而在多份低活力精子(级分c)则并未全部被甲基化，极显著性P值为0(<0.01)。因此，我们推测，该位点的甲基化水平的波动可作为检测精子活力的分子标志物。
表1 A组的8个健康人的PKP3基因启动子区的甲基化水平
4、临床验证
我们另外招募了50个健康志愿者，收集这50名志愿者的精液样品，用于临床验证。
通过以下方法将具有不同活力的精细胞分离：在300×g下离心20min，制备非连续密度梯度级分(分为47.5、57、76和95％浓度层)，从95％浓度层(级分a)收集高活力精子细胞，从57％与76％浓度层之间(级分c)收集低活力精子细胞。收集到的精子经PBS洗两次后，提取基因组DNA。
设计引物，采用位点特异性亚硫酸氢盐测序(locus specific bisulfitesequencing，LBS)检测11号染色体第392017-394717位之间的区域内的甲基化率。方法如下：
采用EZ DNA Methylation-Direct Kit(Zymo Research)进行亚硫酸氢盐处理。基因组DNA经过99℃变性8min，随后立即加入亚硫酸氢盐溶液于64℃孵育3.5h进行转换；转换后的基因组DNA通过回收柱回收后作为模板用于PCR。
采用HotStarTaq Master Mix(Qiagen)进行位点特异性PCR。根据待测区域，分别设计了两对引物(表2)进行扩增和测序，每对引物扩增片段长度在2kb左右，扩增产物经回收后用ABI3730测序仪完成，甲基化状态通过比较C-T转换来检测。
表2 PCR引物
结果如图2所示，50个健康人的样品中，级分a的精子该区域的甲基化位点全部都被甲基化，而大部分级分c的精子该区域没有被完全甲基化。进一步分析数据显示，由32份级分c的精子该区域没有发生完全甲基化，占所有级分c样品的64％。由此可见，PKP3基因的启动子区(-2089至+611位)是否被完全甲基化可用于作为评估精子活力高低的标准。
需要说明的是，本文中以GRCh37/hg19作为参考基因组定位相关区域，本领域还有其他参考基因组，对于相关区域的标示可能与本文中不同，但是，只要通过blast等比对工具最终比对到与本研究中所标示区域对应，均应落在本发明的保护范围之内。同样的，本文中虽然仅列出了SEQ ID NO:1作为一个实例，但是，本领域技术人员应当清楚，基因组中的序列不是完全保守的，有可能有变异存在，不需要所检测的序列与SEQ ID NO:1完全相同，仅需要通过blast等比对工具最终比对到与SEQ ID NO:1对应，即可认为落在本发明的保护范围内。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市龙华区人民医院
<120> PKP3基因甲基化在精子活力检测剂中的应用及试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2701
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
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caccaggaag gctgggctac catggaggct ggctgattct tggagctacc tagggcccta 1800
gacccccagg gactggggca ccctcccctt catgctgggg gtggcaggac ataggccccc 1860
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cagggcctgt tcttccgccc aaattccacc ttaagcaggc ggcggcccct ccctcccacc 2100
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gaagatagtt gggtttggag gcggccgcca ggcccaggcc cggtggacct gccgccatgc 2280
aggacggtaa cttcctgctg tcggccctgc agcctgaggc cggcgtgtgc tccctggcgc 2340
tgccctctga cctgcagctg gaccgccggg gcgccgaggg gccggaggcc gagcggctgc 2400
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<212> DNA
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<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agggtttttt tattaggggt ttttt 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accatatacc aaccttccct atcat 25
Claims (7)
1.人PKP3基因启动子区的甲基化水平在制备检测精子活力的检测剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人PKP3基因启动子区为人第11号染色体第392017至394717位对应的区域。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人PKP3基因启动子区为如SEQ ID NO:1所示序列对应的区域。
4.一种用于检测精子活力的检测试剂盒，其特征在于，包括检测人PKP3基因启动子区的甲基化水平的引物。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对由序列分别为SEQ ID NO:2和3的两条引物组成，所述第二引物对由序列分别为SEQ ID NO:4和5的两条引物组成。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括亚硫酸氢盐溶液。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述亚硫酸氢盐溶液为亚硫酸氢钠溶液。
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| CN110846404A true CN110846404A (zh) | 2020-02-28 |
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN1977168A (zh) * | 2004-03-24 | 2007-06-06 | 肿瘤疗法科学股份有限公司 | 治疗肺癌的组合物和方法 |
| CN101775372A (zh) * | 2009-12-02 | 2010-07-14 | 桂耀庭 | 一种抗睾丸hT279蛋白的抗体或抗体片段及其应用 |
| US20130022974A1 (en) * | 2011-06-17 | 2013-01-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Dna methylation profiles in cancer |
| AU2016202399A1 (en) * | 2011-09-30 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Diagnostic methylation markers of epithelial or mesenchymal phenotype and response to EGFR kinase inhibitor in tumours or tumour cells |
| CN110144407A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-08-20 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种基于fbxw11甲基化评价公牛精子活力的方法及应用 |
-
2019
- 2019-11-21 CN CN201911151807.4A patent/CN110846404A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HANNA JACOBSSON 等: "Functional characterization of candidate risk CNVs in lung cancer" * |
| 蒋丹丹 等: "弱精子症发生的分子机制研究进展" * |
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