CN1523999A - Dna表达载体及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的pGA构建体，它用于作为传送DNA疫苗插入片段的载体。此疫苗插入片段可包含各种病毒、细菌、寄生虫和(或)真菌的DNA转录本。本发明也描述了这样的方法，它是通过给予治疗有效剂量的包含病原体疫苗插入片段的新的pGA构建体，随后通过提高与活的包含同样疫苗插入片段的载体疫苗的免疫作用来提高多抗原决定簇CD8T－细胞应答的方法。

Description

DNA表达载体及其应用方法
本专利申请要求享有于2000年3月2日提出申请的序列号为60/186364和于2000年12月1日提出申请的序列号为60/251083的美国临时申请的优先权。
政府支持
本说明书描述的工作有部分得到了国立卫生研究院(授权号5 P01AI43045)和国立卫生研究院/国家变态反应和传染病研究院(授权号R21 AI4432501)的支持。美国政府在此发明中可有一定的权利。
本发明的 领域
总的来说，本发明涉及分子遗传学和免疫学领域。更加具体地说，本发明描述了新的DNA表达载体，它是包含有编码一种免疫蛋白质的DNA的新载体；也描述了通过给予服用包含编码一种免疫蛋白质的DNA的新载体使动物(包括人类)获得免疫的新方法。
本发明的技术背景
疫苗在全世界保健方面一直具有深刻的和持久的影响。天花已经根除，脊髓灰质炎也已接近消灭，白喉、麻疹、流行性腮腺炎、百日咳和破伤风等一些疾病也已得到控制。然而，仅仅使用当前针对一小部分人类及其家养动物传染病的疫苗，微生物仍然是主要的杀手。没有疫苗的普通传染病每年就花费美国国家1200亿美圆(Robinson等人，1997)。在第一世界国家出现了免疫缺陷病毒，象抗药类型的结核病又重新出现，这对疫苗的发展构成了新的威胁和挑战。在第三世界国家，更加明显需要新的和改善了的疫苗，在那里常常无法得到有效的疫苗或者花费是无法承受的。最近，抗原表达DNA的直接注射显示出启动了保护性免疫应答。
以DNA为基础的疫苗利用细菌质粒在被接种宿主中表达蛋白质免疫原。重组DNA技术被用于将编码目的免疫原的cDNA克隆到真核生物的表达质粒中。然后将疫苗质粒在细菌中扩增、提纯，再将其直接接种进被接种的宿主体内。典型的方法是用针注射盐水中的DNA来接种，或者用基因枪将以金包被的DNA弹丸(或称为“珠”)传送进入皮肤。DNA质粒被宿主细胞吸收，疫苗蛋白质被表达、加工以及被自身主要组织相容性复合体(MHC)类型I分子和类型II分子提呈，产生了对编码免疫原DNA的免疫应答。
历史上DNA疫苗(又名为“基因免疫接种”)是伴随基因治疗的研究和应用逆转录病毒载体的研究而出现的。将DNA传送入肌肉的基因疗法的研究揭示出，在转染骨骼肌肉细胞方面纯净的DNA同用脂质体胶囊包被的DNA一样有效(Wolff等人)。此没有胶囊包被的DNA被命名为“裸露DNA”，这是一个有想象力的术语，它在描述用于核酸疫苗的纯净DNA时已众所周知。基因枪一直被发展用于往植物细胞内传送DNA，在基因治疗研究中它也被用于往皮肤中传送DNA。在一系列测试表达人类生长激素质粒改变小鼠生长的能力的实验中，认识到没能改变小鼠生长的质粒接种激发了抗体的产生(Tang，De Vit和Johnston，1992)。这是第一次揭示出通过接种质粒DNA可以产生免疫应答。同时，应用逆转录病毒载体的实验显示，可以用很少的感染细胞(104-105)提高保护性免疫应答。对用于产生疫苗接种的逆转录病毒载体的感染类型的质粒DNA的直接测试在小鸡流行性感冒模型中进行，其结果是导致了保护性免疫作用(Robinson、Hunt和Webster，1993)。
至2000年底，明确显示HIV-1(人免疫缺陷病毒-1)感染了世界1％的人口，由于这个最近的急迫原因，使得发展疫苗成为世界卫生优先考虑的事情。DNA疫苗的临床前实验表明，在黑猩猩体内单独的DNA可对抗大大减毒的HIV-1的攻击(Boyer等人，1997)，但是在恒河猴体内不能对抗致病力更强的SIV的攻击(Lu等人，1997)。用DNA进行初始免疫再用衣壳糖蛋白进行加强免疫可提高与中和抗体有关的保护作用，以对抗非致病的SIV和HIV之间的嵌合体(SHIV-IIIb)的类似的攻击(homologous challenge)(Letvin等人，1997)。更为最近，有人进行了一组对比性实验测试了八个不同的方案对抗SHIV-s(猿和人免疫缺陷病毒嵌合体)一系列攻击的能力，这些实验揭示出对感染攻击有最大遏制能力的是包括以皮内接种DNA引发和用重组家禽天花病毒载体加强的免疫接种方案(Robinson等人，1999)。这个对感染攻击的遏制与对攻击的病毒的中和抗体的存在无关。证明对遏制感染攻击有较小效用的方案包括均通过皮内或基因枪DNA接种进行起始免疫和加强免疫的免疫接种、皮内或基因枪DNA接种进行起始免疫然后用蛋白质亚单位加强免疫的免疫接种、通过基因枪DNA接种进行起始免疫和用重组家禽天花病毒加强免疫的免疫接种、仅仅用蛋白质的免疫接种和仅仅用重组家禽天花病毒的免疫接种(Robinson等人，1999)。早期的在人体的DNA疫苗的临床实验证明没有不利的影响(MacGregor等人，1996)，也证明了溶解细胞的T-细胞的增加(Calarota等人，1998)。一些研究对增加免疫接种效率的共转染淋巴因子和共刺激分子的能力进行了筛选(Robinson和Pertmer)。
DNA疫苗不利的方面包括DNA编码的产物(例如，蛋白质)的免疫局限性和真核细胞对细菌和寄生物蛋白质非典型加工的可能性。DNA疫苗存在的另一个重要问题是在细菌中DNA疫苗质粒生长和扩增期间一些疫苗插入片段序列的不稳定性。不稳定性的一个可能的原因是在质粒生长期间在疫苗插入片段的次级结构的暴露或质粒骨架的暴露，它们可能被细菌内切核酸酶识别。
因此，必需有可以显示出在细菌宿主体内有改善的稳定性的DNA表达载体；其在用于动物体(包括人)时是安全的；其作为抗击各种各样的传染病(包括HIV-1)的疫苗，免疫原蛋白质在真核生物中的表达是有效的。
本发明的概述
本发明提供新的pGA构建体。新的pGA构建体被用于作为传送DNA疫苗的载体。
本发明也提供了具有疫苗插入片段的新的pGA构建体。病原疫苗插入片段可包括任何病毒、细菌、寄生虫和(或)真菌的DNA转录单位。
本发明描述了通过给予包含病原疫苗插入片段的治疗有效剂量的新pGA构建体给患者进行免疫接种的新方法。
本发明描述了免疫接种的新方法，其通过给予治疗有效剂量的新pGA构建体给患者进行，此新pGA构建体包含有病原疫苗插入片段，随后用例如包含同样疫苗插入片段的重组修饰的Ankara牛痘(MVA)载体那样的活的载体疫苗进行增强免疫作用。
本发明也描述了增强多抗原决定簇CD8 T-细胞应答的方法，其通过给予包含病原疫苗插入片段的治疗有效剂量的新型pGA构建体，随后用例如包含有同样疫苗插入片段的重组修饰Ankara牛痘(MVA)载体那样的活的载体疫苗增强免疫作用。
在下面将更详细地描述本发明。
附图简要描述
图1图解本发明新的pGA构建体。标示给出了载体上各元件的名称和位置。以斜体字标示用于克隆进载体的疫苗插入片段的限制性内切核酸酶的位点。
图2图解图1表明的新pGA1构建体的DNA序列SEQ IDNO：1。在核苷酸序列的下面表示出质粒各元件的位置。
图3图解本发明的新pGA2构建体。标示给出了载体上各元件的名称和位置。斜体字标示用于克隆进载体的疫苗插入片段的独特的限制性内切核酸酶的位点。
图4图解图3表示的新型pGA2构建体的DNA序列SEQ IDNO：2。在核苷酸序列的下面表示出质粒各元件的位置。
图5图解本发明的新pGA3构建体。标示给出了载体上各元件的名称和位置。斜体字标示用于克隆进载体的疫苗插入片段的独特的限制性内切核酸酶的位点。
图6图解图5表示的新型pGA2构建体的DNA序列SEQ IDNO：3。在核苷酸序列的下面表示出质粒各元件的位置。
图7比较通过pGA载体(pGA3/H1)和pJW4303研究载体(pJW4303/H1)表达的H1流感血凝素增强的抗HA IgG的水平。BALB/c小鼠被分别以低剂量(0.1μg)或高剂量(1μg)免疫接种和加强免疫：用基因枪接种注入所述质粒，起始接种后第4周进行加强免疫接种。
图8A提供了亲本wt BH10前病毒的图解，从这个前病毒中产生非感染的病毒类似颗粒(VLP)。点状的区域表示在VLP构建体中缺失的序列。在方形框中指出BH10前病毒各个区域的位置和名称标示。编码长末端重复序列的U3RU5区域包含转录控制元件。所有其他的区域表示编码蛋白质。为了清晰起见，由pol(Prt，RT，Int)和env(SU和TM)表达的产物也表示出来。
图8B描述JS2疫苗插入片段。这个6.7kb疫苗插入片段表达HIV-1-IIIb的BH10品系的Gag、Prt和RT序列，Tat和Vpu蛋白来自ADA，Rev和Env蛋白质为ADA和BH10序列嵌合体。Gag序列包含限制病毒RNA包装的锌指结构的突变。RT序列包括消除逆转录酶活性的三个点突变。与图8A中的名称标示是相同的。括号内的部分表示BH10区域，在此区域BH10序列被来自ADA的序列代替，以便于用Env引入CCR-5。x表示安全的突变。
图8C描述JS5插入片段。JS5是6kb疫苗插入片段，它表达Gag、Prt、RT、Vpu，Tat和Rev。除了在Env的序列缺失外，JS5是由与JS2相同的序列组成的。缺失的序列在图8B中以黑色的矩形表示。与图8A和8B中的名称标示是相同的。在Env的3′区域内Rev应答元件(RRE)仍在构建体中保留。
图9A和9B表示分别作为JS2疫苗插入片段结构中中间体的Gag和Env的表达。数据来自于在293T细胞中的瞬时的转染。与野生类型HIV-1 ADA或HIV-1 IIIb前病毒以及在先前的研究中应用的产生VLP的DNA(dPol)相比，pGA1/JS1(ADA VLP)产生较高水平的Gag(图9A)和Env(图9B)。
图10表示用疫苗载体在瞬时转染的细胞中p24衣壳的表达，此疫苗载体表达没有安全突变的插入片段(JS1和JS4)、具有在锌指结构和在RT中点突变的插入片段(JS2和JS5)和具有在锌指结构、RT和蛋白酶中的点突变的插入片段(JS3和JS6)。注意在锌指结构和RT中的安全突变支持有活性的VLP的表达，而在Prt中的安全突变不支持。JS2和JS5被选出来，以便用于在具有安全突变的高水平表达的基础上该载体的继续研发。
图11A和11B表示分别为由具有和不具有内含子A的pGA载体表达的新侯选疫苗构建体的Gag和Env表达。PGA1含有内含子A而PGA2不含有。pGA2/JS2和pGA1/JS5被选作在以良好表达水平为基础的疫苗中应用。
图12A-12D  表示从293T细胞得来的细胞溶胞产物和组织培养上清液的蛋白质印迹，293T细胞分别用(1)模拟物、(2)pGA2/JS2和(3)pGA1/JS5转染，其中一级抗体是：分别从被感染患者的抗-HIVIg(图A)，抗-p24(图12B)、抗-gp120(图12C)和抗-RT(图12D)收集的。
图13图示pGA。
图14比较在pGA2/89.6、pGA1/Gag-Pol和pGA2/JS2之间的Gag的表达水平。对表达的比较研究是在瞬时转染的293T细胞上进行的。
图15A-15C表示Gag-专一性T细胞的瞬间频率。图15A：由DNA起始和rMVA增强免疫的Gag-专一性CD8 T细胞的应答。图解提供在高剂量的DNA-被免疫接种动物中产生的Gag-CM9-四聚体数据。图15B：在Mamu-A*01免疫接种的和对照的恒河猴中的攻击前和攻击后两周的不同时间的Gag-CM9-Mamu-A*01四聚体-专一性T细胞。每个图表右上角的数字表示作为CD8 T细胞总数的百分数的四聚体-专一性CD8 T细胞的频率。在图表的每个柱形之上的数字表示动物的个体编号。图15C：于攻击前和攻击后两周的不同时间在A*01和非A*01(有阴影线的柱图)免疫接种和未免疫接种的恒河猴中的Gag-专一性IFN-γELISPOT。大约10-13 Gag肽(有12个重叠的22聚体)的三个数据库被用于分析。数据棒上面的数字代表在每个组内ELISPOTs的算术平均值±标准差。图表顶端的数字表示动物个体编号。*，没有数据；#，＜20 ELISPOTs/1×106PBMC。
图16A-16B表示在DNA/MVA记忆应答中对抗Gag和Env的产生IFN-γ的ELISPOT的高度和宽度。图16A：对个体的Gag和Env肽库的应答。在一个组内的动物数据以同样的符号标示。图16B：对不同组应答的ELISPOT的平均高度和宽度。高为每组动物Gag和EnvELISPOT总和的平均值±标准差。宽为被每组动物识别的Gag和Env库的数目的平均值±标准差。ELISPOT应答是在记忆状态期间应用代表Gag序列的大约70个氨基酸的Gag肽的7个库(有12重叠的大约七个22聚体)和代表Env序列的大约40个氨基酸的Env肽(有11重叠的大约十个15聚体)的21个库在rMVA加强免疫之后第25周(攻击前四周)在PBMC中被测定的。
图17表示包含有免疫插入片段的pGA2构建体的DNA序列SEQID NO：4。病原疫苗插入片段JS2表达分化体的B HIV-1 VLP。表明了SEQ ID NO：4核苷酸序列和编码的蛋白质。
图18表示包含有的病原疫苗插入片段的pGA1构建体的DNA序列。病原疫苗插入片段JS5表达分化体的B HIV-1 Gag-pol插入片段。表明了序列和编码蛋白质。
图19A-19E表示时间病毒负载、CD4计数和在被接种的和对照的动物受到攻击后的存活率。图19A：病毒负载的几何平均值以及图19B：对在攻击后不同周的疫苗和对照组CD4计数的几何平均值。图B中标示出了各组所用的图例。图19C：被接种的动物和对照动物的存活曲线。点状线代表所有24只被接种动物。图19D：病毒负载。图19E：对在被接种动物和对照动物组中动物个体的CD4计数。动物数目的图例在图19E中表示。在攻击后第一个12周的测定每毫升血浆具有1000个RNA拷贝作为底数。负载在1000以下的动物以负载500计数。在第16和20周内测定的底数是每毫升具有300个RNA拷贝，负载在300以下的动物以负载300计。
图20A-20C表示于接种和对照组中在攻击后T细胞的应答。图20A：四聚体+细胞和病毒随时间的负载。图20B：在攻击后两周产生对用Gag-CM9肽刺激的应答，细胞内IFN-γ细胞因子的测定。这个活体外测定可得以评定在图15A所表示的高峰期激发后四聚体+细胞的功能状态。图20C：攻击后12周的增殖测定。由瞬间转染产生的Gag-Pol-Env(空白的棒)和Gag-Pol(有影线的棒)被用于刺激。转染培养物的上清液作为对照抗原。大约每毫升1μg的p27Gag的蛋白质用于刺激。刺激的指数是有病毒抗原存在时培养物的生长除以在模拟抗原存在时培养物的生长所得的值。
图21A-21E表示在攻击后12周的淋巴结组织形态学和病毒负载。图21A：被接种的恒河猴的典型的淋巴结，其显示出泡状增生的特征，它的特征为存在带有膨胀的生发中心以及分散的暗和亮的带状的大量次生小泡。图21B：转染对照动物的典型淋巴结，其显示小泡排空和副皮质淋巴细胞的萎缩。图21C：来自于年龄相当的未被感染的恒河猴的典型的淋巴结，显示无反应的生发中心。图21D：测量被生发中心所占据的所有淋巴结的区域的百分比，给出了小泡增生的非专一性的指示。未感染的对照组的数据来自4个年龄相适的恒河猴。图21E：通过原位杂交用与SHIV-89.6 gag和pol互补的反义核糖核酸探针混合剂测定了淋巴结病毒负载。所有被检验的淋巴结都是腹股沟淋巴结。
图22A-22D：表示在攻击之后的抗体随时间的应答。应用酶的免疫吸附试验(ELISA)，所有Gag(图22A)或Env(图22B)抗体的微克数被测定。用MT-2细胞杀灭和中性红染色，89.6(图22C)和89.6P(图22D)中和抗体的滴度被测定。滴度是血浆稀释度的倒数，此稀释度时使在人类PBMC中生长的被指明病毒有50％被中和。所使用的动物符号与图19相同。
图23A-23E表示疫苗实验的相互关系和剂量应答曲线(图23A和B)。在由INF-γ ELISPOT产生的峰疫苗和攻击之后两周(图23A)和三周(图23B)的病毒负载为负相关。因为失去了动物3(见图15C)的峰DNA/MVA ELISPOT样本，24个被接种的动物中仅仅有23个包括在相关性分析中。图23C：在峰DNA-MVA应答的Gag ELISPOT的平均高度的剂量应答曲线(图15C的数据)。图23D：DNA/MVA记忆ELISPOT应答的宽度剂量应答曲线(图16B数据)。图23E：在MVA加强免疫后，峰抗Gag抗体应答的剂量应答曲线(图22A数据)。DNA的不同剂量产生了ELISPOT和抗体应答的不同水平(P＜0.05)。DNA接种的途径对抗体有显著的影响(P＝0.02)，但对ELISPOT应答没有影响。
图24表示抗HA IgG，它是由基因枪接种表达HA蛋白质的DNA产生的。
图25表示抗HA IgG的抗体的亲合性，所述抗HA IgG抗体由三种不同的HA DNA疫苗刺激产生的。
图26表示在病毒攻击后的保护作用，免于体重损失。
图27图示在疫苗中包含Env的重要性。
图28A-28D图示在给予用SHIV-89.6P攻击的动物接种的疫苗中包含Env的重要性。
图29是表示DNA疫苗构建体载体的示意图。
图30表示蛋白质印记结果，显示活体外疫苗构建体的表达。
图31是麻疹病毒中和抗体的时间曲线。
本发明的详细叙述
本发明与新载体、包含病原疫苗插入片段的新载体和给病人进行抗病原免疫接种的新方法有关。新的免疫方法激发了细胞免疫应答和体液免疫应答，它们限制了病原的感染、扩散或生长以及导致了保护免受随后的病原的攻击。
DNA疫苗的经典的参考资料包括第一次对提高免疫应答的论证(Tang，De Vit和JohnsT0n，1992)；第一次对细胞毒性T细胞(Tc)免疫的论证(Ulmer等人，1993)；第一次对皮内的(i.d.)、肌肉内的(i.m.)、静脉内的(i.v.)、鼻内的(i.n.)和基因枪(g.g.)的免疫接种的论证(Fynan等人，1993；Robinson，Hunt和Webster，1993)；第一次应用遗传佐剂(Xiang和Ertl，1995)；第一次应用文库免疫(Barry，Lai和JohnsT0n，1995)和第一次对用传递DNA的方法调节T辅助细胞免疫应答类型的能力的论证(Feltquate等人，1997)。收集DNA疫苗信息的非常有用的网站是http：//www.genweb.com/Dnavax.html.
为了便利，在详细说明、实施例和所附的权利要求书中使用的术语收集于此。
定义
术语“核酸”在此是指任何天然的和合成的核苷酸和核苷的直链和连续的排列，例如：cDNA、基因组DNA、mRNA、tRNA、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。为了便于讨论，在此这样的核酸可以被共同指为“构建体”、“质粒”或“载体”。本发明核酸的代表性的例子包括包含表达、克隆、粘粒和转化载体的细菌质粒载体，例如(也不限于此)：pBR322；动物病毒载体，例如(也不限于此)：修饰的腺病毒、感冒病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、反转录病毒、从噬菌体核酸衍生的载体以及象化学合成DNA或RNA的合成寡核苷酸。术语“核酸”进而包括修饰的或衍生的核苷酸和核苷，例如(也不限于此)，卤化核苷酸(如5-嗅尿嘧啶)和衍生核苷酸(如生物素标记核苷酸)。
术语“人工分离的核酸”在此指有着这样结构的核酸：(a)不等同于任何天然存在的核酸或(b)不等同于任何天然存在的全长长于三个独立的基因的基因组核酸的片段，以及包括DNA、RNA或其衍生物和变异体。此术语包括(但不限于此)下列：(a)具有部分天然存在的基因组分子序列的DNA，但其两侧至少有一侧不是位于在天然存在物种的基因组中该分子部分的侧翼的编码序列；(b)掺入到载体或原核生物或真核生物基因组核酸中的核酸，其掺入方式是产生的分子不等同于任何载体或天然存在的基因组DNA；(c)作为cDNA、基因组片段、由聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)或化学合成产生的片段、限制性片段；(d)是杂交基因部分(即编码融合蛋白质基因)的重组核苷酸序列和(e)是非天然存在的杂交序列部分的重组核苷酸序列。
已提纯形式的核苷酸序列在有些方面是有益的。关于核酸的术语“纯净的”表示序列具有与自然环境相比而增加的纯度。
在此应用的术语“多肽”和“蛋白质”是指通过肽键连接的三个或更多氨基酸连续排列的氨基酸聚合物。术语“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段、蛋白质类似物、寡肽等等。术语“多肽”更主要指由重组技术产生的、从适当来源中分离的或合成的核酸编码的上述定义中的多肽。术语“多肽”更进一步指包括化学修饰氨基酸、共价或非共价与标记配体连接的氨基酸的上述定义中的多肽。
在此应用的术语“片段”是指一个核酸(例如cDNA)，指人工构建(例如化学合成)的或用限制性内切核酸酶(或机械剪切)将天然产物剪切成许多碎片的核酸的分离部分，或者指通过聚合酶链式反应(PCR)、DNA聚合酶或在本领域中熟知的任何的其他聚合技术合成的或通过在本领域熟知的重组核酸技术在宿主细胞表达的核酸的部分，在此应用的术语“片段”也可指多肽的分离部分，其中多肽部分是被通过用起码一个蛋白酶进行蛋白质剪切从自然产生的多肽剪切的；或者是指通过本领域熟知的化学方法合成的自然产生的多肽部分。
在此应用的术语“基因”指编码遗传信息的核酸序列(包括RNA或DNA)，其用于整个RNA、整个蛋白质或此整个RNA或整个蛋白质的任何部分的合成。特定的有机体基因组的非自然发生的基因是指外来基因、异种基因或外源基因，特定有机体基因组天然部分的基因被指称为“内源基因”。
在此应用的术语“被表达”或“表达”是指从基因到RNA核酸分子的转录，此RNA核酸分子至少部分与基因的双链中的一条链的某区域互补。在此应用的术语“被表达的”或“表达”也指从RNA核酸分子到蛋白质或多肽或其部分的翻译。
在此应用的术语“座位”是指基因在染色体上的位点。控制遗传性状的成对基因，每一个都在成对染色体上的相同位置。这些基因对或等位基因在表达性状上可以是显性的或隐性的。在两种情况的任何一种，对于这个基因对所控制的性状，个体都被称为纯合子。如果基因对(等位基因)由一个显性的和一个隐性的组成，对于这个基因对所控制性状，个体是杂合子。基因或核酸分子的自然变异(例如由重组引起的或由突变导致的)引起带有相似的但不等同的核苷酸序列的等位基因的变异。由于自然选择典型上都是逆着改变功能的变异而选择的，这样的等位基因变异典型上编码蛋白质与同它们相对照的基因编码蛋白质的活动类似。等位基因的变异也包含在基因的非翻译区域的变化(例如3′或5′非翻译区域)或可能涉及新生的转录本的替换剪接，其导致位置邻近替换的外显子。
在此应用的术语“转录调节序列”是指与基因核酸序列有联系的和调节基因转录表达的核苷酸序列。“转录调节序列”可以被分离和合并入一个载体核酸，使之能够调节在载体DNA部分的适当细胞中的转录。“转录调节序列”可以在一核酸序列区域之先(但不限于此)，此核酸序列区域在可以被转录为mRNA蛋白质编码序列的末端的5′区域。转录调节区域也可在蛋白质编码区域内，在与内含子区域等同的基因区域中或可以在核酸区域的核酸序列区域。
在此应用的术语“编码区”是指可翻译成蛋白质的连续的线状排列的核苷酸。全长的编码区可以被翻译成全长的蛋白质；也就是说，在自然状态下，没有任何翻译后的修饰，一完整的蛋白质将被翻译出。全长的编码区也可包括前导蛋白质序列或可能从被翻译蛋白质自然切除的蛋白质的任何其他区域。
在此应用的术语“探针”在涉及到核酸时是指某一核苷酸序列，其可用于杂交，用来鉴定互补序列的存在或互补序列与探针序列区别，但不能鉴定在在杂交的严格条件下防止杂交的程度。探针也可被标记修饰，例如(但不仅仅如此)用放射性基团、生物素或任何在本领域中熟知的其他标记。
在此应用的术语“核酸载体”是指自然的或合成的单链或双链的质粒或者病毒核酸分子，其可被转染或转化进入到细胞并在宿主细胞基因组外或内独立复制。根据质粒载体的核苷酸序列，环状的双链质粒通过用适当的限制酶处理可成为直链。通过用限制酶剪切载体和再将片段连接在一起，核酸可被插入进载体。核酸分子可以是RNA或DNA。
在此应用的术语“表达载体”是指这样的核酸载体，其可进一步包括至少一个可被操纵连接于用于Mago蛋白质编码核苷酸序列的调节序列。调节序列在本领域是熟知的，无需进行任何不适当的实验，本领域的技术人员可将其选择出来以用于保证连接的核苷酸序列的很好的表达。在此应用的术语“调节序列”包括启动子、增强子和可控制表达的其他元件。在标准的分子生物学教科书[例如，Sambrook等人著《分子克隆：实验手册》第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)]可查阅到设计适合的表达载体、启动子和其他表达控制元件的内容。但是现已公认，选择适合的表达载体依赖于多种因素，包括被转化的宿主细胞和(或)被表达的蛋白质类型的选择。
在此应用的术语“转化”和“转染”是指向宿主内插入核酸的过程。许多技术在本领域已被熟知，它们使将核酸转化或转染到原核生物或真核生物有机体内变得容易。这些方法涉及各种各样的技术，例如，用高浓度盐(例如，但不仅是，钙盐或镁盐)、电场、去污剂或脂质体为媒介的转染来处理细胞，这样使宿主细胞有能力吸收核酸分子。
术语“重组细胞”是指具有核酸片段新组合的细胞，在自然界这些片段不是共价互相连接的。应用本领域技术人员可掌握的各种核酸排列操纵技术，可将核酸片段的新组合导入到有机体内。重组细胞可以是单个的真核生物细胞、单个的原核生物细胞或哺乳动物细胞。重组细胞可以将基因组外的载体包含其内。基因组外的核酸载体不插入到细胞基因组内。重组细胞可进而将载体或其基因组内的部分包含其内。术语“基因组内”定义为并入重组细胞基因组的核酸构建体。
在此应用的术语“重组核酸”是指在真核生物或原核生物细胞中没有自然发现的至少两个核酸序列。核酸序列可以包括(但不限于此)核酸载体、基因表达调节元件、复制起点、在表达时赋予抗体抗性的序列以及蛋白质编码序列。术语“重组体多肽”包括通过重组DNA技术产生的多肽，它们与自然发生的多肽在位置、纯度或结构上都是有明显不同的。一般情况，这样的重组体多肽以与在自然中正常观察到的不同的量存在于细胞内。
在此应用的术语“患者”是指动物，尤其指哺乳动物，更尤其指人。
在此应用的术语“免疫”或“免疫作用”是指在患者体内产生免疫应答，它保护患者(部分地或全部地)使其不显露由病原引起的感染(即疾病)。用本发明进行免疫接种的患者将不被病原感染或与未被免疫接种的相比有较少程度的感染。免疫接种在性质上可是预防性的或治疗性的。这就是说从前未感染的和感染的患者都可以用本发明进行免疫接种。
在此应用的术语“DNA转录单位”是指聚核苷酸序列，其至少包括两个成分：编码抗原的DNA和转录启动子元件。一个DNA转录单位可包括(任选的)另外的序列，例如，增强子元件、剪接信号、终止和多腺苷酸化信号、病毒复制子和(或)细菌质粒序列。可通过若干已知的方法产生DNA转录单位。例如，编码想要得到的抗原的DNA可被插入到表达载体内构建DNA转录单位，在《Maniatis等人，分子克隆：实验手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)》已对此有所描述，其公开内容通过引证被全面并入本文。
在此应用的术语“疫苗插入片段”是指病原体的DNA转录单位。尤其指，疫苗插入片段是可在患者体内产生免疫应答的DNA转录单位。例如，疫苗插入片段是这样的病原疫苗插入片段，其编码由病毒、细菌、寄生虫和(或)真菌衍生的抗原。典型的病毒包括疱疹病毒、正粘病毒、鼻病毒、小核糖核酸病毒、腺病毒、副粘病毒、冠状病毒、弹状病毒、披膜病毒、黄病毒、本雅病毒、风疹病毒、呼吸道肠道孤儿病毒、麻疹病毒、肝DNA病毒、埃博拉病毒、逆转录病毒(包括人免疫缺陷病毒)等等。典型的细菌包括结核菌、分支杆菌、螺旋体、立克次体、衣原体、支原体等等。典型的寄生虫包括疟原虫等等。典型的真菌包括酵母菌、霉菌等等。本领域的技术人员将会意识到这个列表没有包括所有可用在此描述的方法产生的保护性免疫应答与之对抗的潜在病原体。
在此应用的术语“抗原”是指任何蛋白质、糖类或由病原所表达的其他部分，其能够激发针对病原体的保护性应答。抗原可能是也可能不是病原体的结构成分。可以是翻译产物或各种长度的多肽的编码抗原也在术语“抗原”之列。抗原经过一般的宿主细胞修饰，例如，糖基化、肉豆蔻酰基化或磷酸化。除此之外，它们可被设计进行细胞内、细胞外或细胞表面的表达。进一步，它们可被设计进行装配和从细胞中释放。
在此应用的术语“佐剂”是指加入到疫苗中以增加免疫效率的物质。佐剂如何运作的机理还未完全搞清。一些佐剂被认为通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而另一些佐剂本身就是强免疫原性的，据认为具有协同功能。已知的疫苗佐剂包括(但不限于此)油和水的乳剂(例如，完全的分支杆菌佐剂和不完全的分支杆菌佐剂)、棒状杆菌parvum、芽孢杆菌Calmette Guerin、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、藻酸钠、Bacto佐剂、某种合成聚合物(例如，聚合氨基酸和氨基酸的共聚物)、皂角苷、“REGRESSIN”(Vetrepharm，Athens，Ga)、“AVRIDINE”[N，N-二(十八烷基)-N，N-双(2-羟乙基)丙烷二胺]、石蜡油和胞壁酰二肽。佐剂也包含遗传佐剂(例如，在共接种的DNA中被编码的免疫调变剂分子)。共接种的DNA可以在作为疫苗免疫原的相同的疫苗构建体中或在另外的DNA载体中。
在此应用的术语“药学上可接受的载体”是指容纳可被注射入牛宿主并且无副作用疫苗的载体。在本领域熟知的适合的药学上可接受的的载体包括(但不限于此)无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲液。载体也可包括辅剂，其包括(但不限于此)稀释剂、稳定剂(即糖和氨基酸)、防腐剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、增强黏度添加剂、染料等等。
在此应用的术语“选择性标记基因”是指一种表达基因，它能用作从没有表达可选择的标记基因的细胞群中选择出包含可选择标记基因的细胞群。例如，“选择性标记基因”可以是“抗生素抗性基因”，它可能使对于微生物专门的抗生素有耐受力，这是先前药物的不利影响。这样的抗性可是由突变导致的或者由于包含有转染微生物的抗性基因的质粒而获得的抗性。
在此应用的术语“终止子序列”或“终止子”是指功能为停止转录的核苷酸序列。在此应用的术语“转录”是指这样的过程，在此过程中以DNA为模板通过碱基互补配对形成RNA分子。此过程是由RNA聚合酶调节的。
在此应用的术语“VLP”是指病毒类似颗粒，也指病毒蛋白的聚集体。
以DNA为基础的免疫接种的主要免疫学优点是由MHC类型I和MHC类型II分子提呈的免疫原的能力。内源合成蛋白质容易进入加工途径，用以在MHC类型I和MHC II类型分子表面负载肽抗原决定簇。MHC I提呈的抗原决定簇提高细胞毒性T-细胞(Tc)的应答，而MHC II提呈的抗原决定簇增强辅助T-细胞(Th)的应答。相反，非细胞内合成的免疫原很大程度上局限于负载MHC II抗原决定簇并因而提高Th而非Tc的应答。当将活的减毒疫苗或能在细胞中产生免疫原并对Th和Tc都有增强的重组体病毒载体作比较时，DNA疫苗有不是感染性的优点和将免疫应答仅集中于免疫所要求的抗原上的优点。由于DNA疫苗对增强类型1或类型2T-细胞的辅助比较容易操作，因此它们也是很有优点的。这使得疫苗对于将动员与感染战斗的免疫应答来说是特制的。由于用重组DNA技术容易构建DNA质粒、疫苗生产(质粒DNA的生长和提纯)中应用遗传方法的能力和在广泛的温度范围内DNA的稳定性，DNA疫苗的花费也较小。
用高度活性的表达载体制作模型以生产重组蛋白质，可得到最好的免疫应答(Robinson和Pertmer，1998)。最频繁使用的转录控制元件包括强启动子。虽然在DNA疫苗中可能应用的其他启动子也未离开本发明的范围，一个适合应用的这样的启动子是巨细胞病毒(CMV)，它是立即早期启动子。在本发明中用到的其他转录控制元件包括强多腺苷酸化信号，例如，从牛生长激素编码基因衍生的或兔β球蛋白多腺苷酸化信号(Bohm等人，1996；Chapman等人，1991；Hartikka等人，1996；Manthorpe等人，1993；Montgomery等人，1993)。CMV立即早期启动子可以在有内含子或无内含子A的情况下应用(Chapman等人，1991)。内含子A的存在增强了RNA病毒、细菌和寄生虫中的许多抗原的表达，可能通过以支持加工和起真核生物mRNA功能的序列提供给被表达RNA来进行的。也将会意识到，用本领域已知的其他方法也可增强表达，其包括(但不限于此)尽可能完善地使原核生物mRNA密码子使用于真核生物细胞(Andre等人，1998；Uchijima等人，1998)。多顺反子载体可被用于表达超过一个的免疫原或一个免疫原与一个免疫刺激蛋白(Iwasaki等人，1997a；Wild等人，1998)。
通过将表达抗原靶向特定的细胞区室，可使免疫原对刺激产生抗体或Tc细胞应答更加有效或有较低的效果。例如，用位于细胞的质膜或从其分泌的抗原比用位于细胞内部的抗原对增强抗体应答更有效(Boyle，Koniaras，和Lew，1997；Inchauspe等人，1997)。用N-端遍在蛋白化信号，将DNA编码蛋白质靶向可引起细胞质快速降解和更有效地负载肽于MHC I途径的蛋白酶体，可以增强Tc应答(Rodriguez，Zhang，和Whitton，1997；Tobery和Siliciano，1997；Wu和Kipps，1997)。为了回顾DNA提高免疫应答的机理基础，可参考Robinson和Pertmer，《病毒研究进展》，vol 53，Academic Press(2000)，其中的发现在此通过全部引证被并入本文。
蛋白质的不同构造类型对抗体应答的效用、一系列MHC I抗原决定簇(微小基因)增强Tc应答的能力和抗原与免疫靶蛋白融合的效果都可用规定的插入片段来定值。有序的结构(例如，病毒类似颗粒)看起来比无序结构在增强抗体上更有效。(Fomsgaard等人，1998)。这似乎反映出免疫原的规律排列比抗原单体在交叉连接球蛋白受体和向B-细胞发出增殖和产生抗体信号方面更有效。编码不同病原的一系列MHC抗原决定簇的重组DNA分子可以激发对许多病原的Tc应答(Hanke等人，1998b)。如果它们也包含Th决定簇，这些系列的Tc决定簇是最有效的(Maecker等人，1998；Thomson等人，1998)。
操纵免疫应答的另外的方法是将免疫原与免疫靶分子或免疫刺激分子融合。根据资料，这个融合的最成功的是将分泌的免疫原靶向抗原提呈细胞(APC)或淋巴结(Boyle，Brady，和Lew，1998)。人IgG的分泌形态与CTLA-4的融合增加了对IgG的抗体应答，它的增加大大多于1000倍，并且改变了从完全(C′-)依赖到C′-独立抗体的倾向。
人IgG与L-selectin的融合也增加了抗体应答，但不改变被增强抗体的C′-结合特征。与L-selectin融合的免疫原可能通过作为门户的内皮小静脉被传递到淋巴结。抗原与细胞素cDNAs的融合引起抗体、Th、和Tc应答的适度增强(Hakim，Levy，和Levy，1996；Maecker等人，1997)。IL-4-融合增强了抗体应答，而IL-12和IL-1β增强了T-细胞应答。
DNA传递的两种方法是用皮下组织针注射溶于盐水中的DNA或基因枪传递包被金衣的DNA弹丸。盐水注射将DNA传递入细胞外的空间，而基因枪将DNA直接轰击到细胞中。盐水注射比基因枪需要更大量的DNA(多100-1000倍)(Fynan等人，1993)。这两种类型的传递的不同还在于，盐水注射倾向于对类型1T-细胞辅助的应答，而基因枪传递倾向于对类型2T-细胞辅助的应答(Feltquatate等人，1997；Pertmer，Roberts，和Haynes，1996)。DNA盐水注射能快速在整个体内散布。用基因枪传递DNA更局限于靶部位。使用任何一种接种方法，细胞外质粒DNA只有短暂的半衰期，大约10分钟(Kawabata，Takaura，和Hashida，1995；Lew等人，1995)。盐水注射疫苗也可肌肉内(i.m.)注射或皮内(i.d.)注射(Fynan等人，1993)。
虽然静脉内和皮下的注射对不同的质粒都有不同程度的成功(Bohm等人，1998；Fynan等人，1993)，但腹膜内注射还没有得到过成功(Bohm等人，1998；Fynan等人，1993)。基因枪传递可通过给予皮肤或外科手术后露出的肌肉来进行。在小鼠体内对增强免疫应答有效的DNA传递方法和路线在其他种类也是有效的。
通过粘膜传递DNA的免疫接种比用非肠道的接种途径进行的免疫更少成功。通过鼻内给服盐水DNA有两个好的(Asakura等人，1997；Sasaki等人，1998b)和有限的(Fynan等人，1993)成功。通过把DNA传递到阴道粘膜，基因枪成功地增强了IgG(LivingsT0n等人，1995)。用类脂体(McCluskie等人，1998)、微球(Chen等人，1998a；Jones等人，1997)和重组Shigella载体(Sizemore，Branstrom，和Sadoff，1995；Sizemore，Branstrom，和Sadoff，1997)将DNA传递到粘膜表面也获得了一些成功。
对增强免疫应答的DNA剂量依赖于传递方法、宿主、载体和被编码抗原。对剂量影响最大的是传递方法。盐水注射DNA一般用10μg到1mg DNA，而用基因枪传递DNA一般用0.2μg到20μg DNA。一般情况，对小鼠用低剂量的DNA(10-100μg盐水注射和0.2-20μg基因枪传递)，而对灵长类动物用高剂量的DNA(100μg-1mg盐水注射和2μg-20μg基因枪传递)。基因枪传递需要较低剂量的DNA反映出金弹丸是直接将DNA传递到细胞内的。
抗原在增强应答上的明显效果的实例可以在这样的研究中找到，它比较了在兔子体中对表达流感血凝集素的DNA或表达免疫缺陷病毒的包膜糖蛋白(Env)的DNA的抗体应答的增强(Richmond等人，1998)。在类似情况下，表达血凝集素的DNA增强了长而持久的高抗体亲抗原性的和高效价的抗体(～100μg/ml专一性抗体)，而表达Env的DNA只增强了瞬间的低抗体亲抗原性的和低效价的抗体应答(小于10μg/ml的专一性抗体)。在增强抗体上的区别可被假设为反映出了作为T-依赖性抗原的血凝集素和作为T-非依赖性抗原的高糖基化免疫缺陷病毒Env。
蛋白质和重组体病毒都被用于加强经DNA引发的免疫应答。蛋白质加强免疫被应用于增强对HIV-1 Env的中和抗体应答。重组天花病毒增强也被应用于增强体液的和细胞的免疫应答。
对于弱免疫原，例如，免疫缺陷病毒Env，用DNA增强抗体应答仅仅是在自然感染动物体内抗体应答的一部分，已用蛋白质促进提供了增强低效价抗体应答的手段(Letvin等人，1997；Richmond等人，1998)。在对兔的研究中，用蛋白质加强免疫提高了抗体效价、抗体亲抗原性和抗体应答的持久性(Richmond等人，1998)。同对用蛋白质加强免疫的次级免疫应答一致，与只接受蛋白质的动物相比，在用蛋白质加强免疫之后，经DNA引发的动物显示出抗体的更快速的增加和更高的抗体效价。但是，第二次蛋白质免疫接种时，在曾接受和未曾接受DNA引发的免疫的动物中抗体应答的动力和效价是相似的。
用重组天花病毒加强免疫被证明是促进经DNA引发的CD8+细胞应答的高度成功的方法(Hanke等人，1998a；Kent等人，1998；Schneider等人，1998)。在用天花病毒加强免疫后，抗原专一性CD8+细胞在经DNA引发的小鼠或恒河猴中增加了10倍之多。研究测定的免疫接种的顺序揭示，DNA必须被首先递入(Schneider等人，1998)。这被假定为，它反映出集中于对所要求免疫原的免疫应答的DNA。在用天花病毒加强免疫后，CD8+细胞应答的较大的增加被假设为反映出较大量的由天花病毒载体表达的抗原，也反映出天花病毒诱导的细胞因子增强了免疫应答(Kent等人，1998；Schneider等人，1998)。
许多不同的天花病毒可被用于天花的加强免疫上。一种被定名为修饰疫苗Ankara(MVA)的疫苗病毒在小鼠模型中特别有效(Schneider等人，1998)。这也可反映出在哺乳动物模型中不完全复制的MVA规避宿主免疫应答的能力被减弱了。
通过经DNA引发后由天花病毒加强免疫而提高的应答对提高保护性细胞介导的免疫反应是高度有效的。给小鼠肌内注射DNA，然后用重组天花病毒加强免疫可保护小鼠免受疟疾的攻击(Schneider等人，1998)。在恒河猴体内，用皮内注射(但非基因枪传递)DNA引发，然后用重组天花病毒加强免疫，以此抑制了猿和人免疫缺陷病毒嵌合体的攻击(Robinson等人，1999)。
免疫缺陷病毒(例如，HIV-1)的DNA疫苗遇到足够有限的进入的感染的攻击，这样使导致艾滋病(AIDS)的无法制止的长期的感染得到了预防。使此变得复杂的是中和抗体难于产生并难于对特别的病毒品系有专一性。(Burton和Montefiori，1997；Moore和Ho，1995)。对于增强中和抗体的问题，许多努力都集中于增强对几个特定感染的足够强度的细胞介导的应答。根据资料，增强Tc高效价的最成功的实例是来自于用经DNA引发的然后用重组天花病毒加强免疫的方案。通过用测定溶解细胞的活性来测定专一性Tc的水平(Kent等人，1998)、通过用MHC-专一性四聚体对专一性SIV Gag抗原决定簇染色和通过用SIV或SHIV激发(Hanke，1999)，评价了这个方案的效果。
用DNA引发和用重组天花病毒加强免疫，许多显著的发现从临床前期的试验中出现。首先，攻击感染可被抑制在用对质粒病毒RNA进行定量的RT-PCR分析可检出的水平以下(Robinson等人，1999)。第二，这个保护是长期持久的并不需要有中和抗体存在(Robinson等人，1999)。第三，用DNA盐水注射的皮内的DNA引发对于增强保护性免疫优于用基因枪的引发(P＝0.01，Fisher′s exact test)(Robinson等人，1999)。
本发明的新pGA载体有原核生物复制起点、对质粒选择的选择性标记基因和对真核生物细胞的转录盒。本发明的pGA载体的独到之处是包括与转录同向的λ终止子和选择标记基因。在质粒于细菌内产生时，终止子序列防止从卡那霉素盒(kanamycin cassette)到疫苗的序列的通读。通过限制暴露可被细菌内切核酸酶识别的次级结构，防止转录的通读稳定了疫苗插入片段序列。
已并入到本发明pGA载体的转录盒应用了来自巨细胞病毒立即早期启动子序列(CMVIE)和来自牛生长素多腺苷酸化的序列(BGHpA)的序列以控制转录。组织溶酶原激活剂基因前导序列(tPA)的合成同系物作为前导序列在转录盒中是可有可无的。本发明的载体在对接受疫苗插入片段可应用的位点上有所不同，在转录盒是否包括CMVIE启动子中的内含子A序列上也有所不同。内含子A和tPA前导序列在某些例子中显示出对疫苗插入片段的强表达的优点(Chapman等人，1991)。
pGA1是一个3894bp大小的质粒。pGA1包含启动子(bp1-690)、CMV-内含子A(bp691-1638)、tPA前导序列合成模仿物(bp1659-1721)、牛生长激素多腺苷酸化序列(bp1761-1983)、λT0终止子(bp1984-2018)、卡那霉素抗性基因(bp2037-2830)和ColE1复制子(bp2831-3890)。在图2中表示pGA1构建体的DNA序列(SEQ IDNO：1)。在图1中，所指示的限制性位点是用于疫苗插入片段克隆的单个切点。在疫苗插入片段5′端被克隆在tPA前导序列上游区时，应用ClaI或BspD1位点。NheI位点用于克隆在tPA前导序列框架中的序列。在于SmaI和BlnI之间的位点用于克隆疫苗插入片段的3′端。
pGA2是一个2947bp大小的质粒，其缺少在pGA1中存在的947bp内含子A序列。除了内含子A序列缺失，pGA2与pGA1相同。对于克隆不需要有效表达所需的上游区内含子的序列或克隆上游区内含子可能与需要良好表达的剪接类型产生干扰的序列，pGA2是有价值的。图3提供了具有有用的克隆疫苗插入片段限制性位点的图，图4表示SEQ ID NO：2的DNA序列。将疫苗插入片段克隆进入pGA2的限制性位点的应用与克隆片段进入pGA1的应用相同。
pGA3是包含内含子A的3893bp的质粒。除了可被用于导入疫苗插入片段的克隆位点外，pGA3与pGA1相同。在pGA3，将插入片段克隆到tPA前导序列上游区用HindIII位点。将序列克隆到tPA前导序列下游区用SmaI和BlnI位点之间的位点。在pGA3，这些位点包括BamHI位点。图5表示pGA3的图谱，图6表示SEQ ID NO：3的DNA序列。
从此处的技术看来，本领域的技术人员将认识到，任何本领域已知的疫苗插入片段都可被应用于在此描述的新pGA构建体，其包括(但不限于)象HIV、流感、麻疹、疱疹、埃博拉等等病毒病原体。
例如，本发明包括来自于下列的一些插入片段：免疫缺陷病毒特别是HIV(包括HIV-1和HIV-2的分化体及其修饰体)、流感病毒基因(包括所有亚型和修饰体)和从麻疹基因衍生的疫苗插入片段。本领域的技术人员将意识到，关于从免疫缺陷病毒、流感病毒、麻疹病毒及其修饰体衍生的插入片段的讨论是自然的举例，仅仅为了说明缘故而提供的。
本发明的免疫缺陷病毒疫苗插入片段被设计为表达来自于单一DNA的非感染病毒类似颗粒(VLP)。这是用亚基因组剪接元件得到的，此元件一般应用于免疫缺陷病毒从单个病毒RNA表达多基因产物。对于亚基因组剪接模式而言重要的是：(i)剪接位点和全长病毒RNA中存在的受体(ii)Rev应答元件(RRE)和(iii)Rev蛋白质。逆转录病毒RNA的剪接位点用真核生物RNA剪接位点的规范序列。RRE是一个大约200bp RNA的结构，其与Rev蛋白质相互作用使病毒RNA从细胞核到细胞质运送。在没有Rev的情况下，免疫缺陷病毒的～10kb RNA对调节基因Tat、Rev和Nef的mRNA进行剪接。这些基因被在RT与Env之间和在基因组3′端存在的外显子编码。除了Tat、Rev和Nef的被多重剪接的mRNA之外，在Rev存在的情况下单个被剪接的Env的mRNA和未被剪接的Gag与Pol的mRNA得到了表达。
由单个DNA对非感染性的VLP的表达使免疫缺陷病毒疫苗具有了许多优势特征。单个DNA对许多蛋白质的表达给被接种的宿主提供了对这些蛋白质包含的广泛T-细胞和B-细胞抗原决定簇作出应答的机会。包含多样抗原决定簇的蛋白质的表达给由多样组织相容性类型对抗原决定簇的提呈提供了机会。通过使用所有蛋白质，给不同组织相容性类型的宿主提供了产生有广泛基础的T-细胞应答的机会。这可能对有效抑制免疫缺陷病毒感染(它的高度突变率使之容易逃脱免疫应答)是必需的(Evans等人，1999)(Poignard等人，1999；Evans等人，1995)。正如在药物治疗时，需要多个逃避突变的多抗原决定簇T-细胞应答将比仅需要单一逃避突变的单个抗原决定簇T-细胞应答提供更好的保护。
抗体应答常常被多价疫苗最好的引发，多价疫苗给应答B-细胞提呈了抗原决定簇的有序排列(Bachmanm，Zinkernagel，1997)。通过病毒颗粒膜上Env的多价性的效用，病毒类似颗粒将有利于增强抗Env抗体应答。这些颗粒也给免疫系统提呈非变性的和正常的Env形态。
在有佐剂或其他物质(这些物质要有促进DNA吸收或使免疫系统细胞恢复到接种位点的能力)的情况下，可给患者施用本发明的新载体。实施方案包括DNA疫苗与常规佐剂或基因佐剂的结合。常规佐剂包括有利于DNA稳定和吸收的佐剂、可使免疫系统细胞恢复到接种位点的佐剂或有利于应答淋巴细胞免疫激活的佐剂。常规佐剂包括(但不限于此)油剂和水剂(例如，完全的分支杆菌佐剂和不完全的分支杆菌佐剂)、棒状杆菌parvum、芽孢杆菌Calmette Guerin、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、藻酸钠、BacT0佐剂、某种合成聚合物(例如，聚合氨基酸和氨基酸的共聚物)、皂角苷、“REGRESSIN”(Vetrepharm，Athens，Ga)、“AVRIDINE”[N，N-二(十八烷基)-N，N-双(2-羟乙基)丙烷二胺]、石蜡油和胞壁酰二肽。本发明也考虑应用遗传佐剂(例如，在共接种的DNA中被编码的免疫调变剂分子)。共接种的DNA可以在作为疫苗免疫原的相同的疫苗构建体中或在分离的DNA载体中。
本发明的疫苗可以以各种方式服用，包括非肠道的或典型的途径。例如，可以通过静脉内的、腹膜内的、皮内的、皮下的或肌内的方法进行接种。例如可以用皮下注射针、用象推动液流进入靶位点那样的无针传递装置或用将于金弹丸上的DNA轰击入靶位点的基因枪。可通过各种方法将包含病原疫苗插入片段的载体给予粘膜表面，包括鼻内服用即鼻滴剂或吸入剂，或者通过直肠内或阴道内给予溶液、凝胶、泡沫或栓剂服用。也可选择口服包含疫苗插入片段的载体，形式可为片剂、胶囊、嚼片、糖浆、乳剂等等。在另一替代方案，可通过被动的皮肤贴片、电离子渗入疗法等方法经过皮肤给予载体。任何生理学合格的适当媒介对导入包含病原疫苗插入片段的载体都是适宜的。例如，在本领域已知的适宜的药学上合格的载体包括(但不限于此)无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲液。载体也可包括辅剂，其包括(但不限于此)稀释剂、稳定剂(即糖和氨基酸)、防腐剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、增强黏度添加剂、染料等等。
通过下列实施例对本发明进行解释，这些实施例是通过例证方式提供的并将不被局限地解释。参考资料的内容、出版专利和全部本申请书引用的专利在此通过引证被全部并入本文。
实施例1：pGA1的结构和序列
在图1和图2中表示的pGA1包含ColE1复制起点、用于抗生素选择的卡那霉素抗性基因、λT0终止子和包括上游区内含子的真核生物表达盒。ColE1复制起点是600核苷酸的DNA片段，其包含复制起端(ori)，编码RNA引物和编码两个复制起始的负调节基因。用于质粒复制的所有的酶促功能都是由细菌宿主提供的。包含ColE1复制基因的起始构建体质粒是pBR322(Bolivar等人，1977；Sutcliffe等人，1978)。
卡那霉素抗性基因是用于在细菌中质粒选择的抗生素抗性基因。λT0终止子防止在原核生物质粒生长期间从卡那霉素抗性基因到疫苗转录盒的通读(Scholtisse和kGrosse，1987)。通过防止在疫苗表达盒中的通读，终止子帮助稳定在细菌中生长期间的质粒插入片段。
真核生物表达盒是由包括内含子A(CMVIE-IA)的CMV立即早期启动子和来自于牛生长素多腺苷酸化序列(BGHpA)的终止序列组成。组织溶酶原激活剂(tPA)的前导序列的合成模仿物转录盒内的选择性组份可被包括在内。有这些元件的转录盒被证明对于表达在真核生物细胞中的外来基因是高度有效的(Chapman等人，1991)。在转录盒中的克隆位点包括位于tPA前导基因上游区的ClaI位点、用于与tPA前导基因以符合读码框克隆的的NheI克隆位点以及用于在BGHpA之前克隆的XmnI、SmaI、RsrII、AvrII和BlnI克隆位点。
用来自于商用载体pZErO-2(Invitrogen、Carlsbad、CA)和真核生物表达载体pJW4303的聚合酶链式反应(PCR)片段，将ColE1复制基因、卡那霉素抗性基因和用于真核生物细胞的转录控制元件结合为一个质粒。(Lu等人，1997)。
来自于从核苷酸1319到核苷酸3178的pZErO2的一个1853bp片段包含ColE1复制起点和卡那霉素抗性基因。来自于从核苷酸376到核苷酸2416的pJW4303的一个2040bp片段包含带有内含子A的CMVIE启动子、组织溶酶原激活剂前导基因(tPA)的合成同系物和牛生长素多腺苷酸化位点(BGHpA)。通过用包含有SalI位点的寡核苷酸引物的聚合酶链式反应(PCR)，片段被扩增。与来于pZeRO2的卡那霉素抗性转录盒和来于pJW4303的真核生物转录盒以相反的转录方向的连接产物被鉴定以用于进一步的发展。对这pGA载体亲本的核苷酸计数从CMV启动子5′端的第一个碱基对开始。
通过对带有5′端BamH1限制性内切核酸酶位点和3′端XbaI限制性内切核酸酶位点的391bp片段的PCR扩增，T0终止子被导入到这个pGA载体的亲本。片段起始的355bp是在从pJW4303转录盒衍生的BGHpA序列中的序列，紧接其后的合成的寡核苷酸上的36个碱基导入了T0序列和XbaI位点。被导入的T0终止子序列包含下列核苷酸序列：
5′-ATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAA-3′(SEQ ID NO：)
包含BamH1-XbaI片段的T0终止子替代在来自于pXeRO2和pJW4303质粒的没有T0终止子的同系物片段。产物经过测序被证实为T0方向的序列。
于1755-1845核苷酸之间的真核生物转录盒的区域包含SIV nef的读码框的最后30bp。此区域通过在pGA的核苷酸1858产生突变并产生AvrII限制性内切核酸酶位点而将之从pGA中去除。自然发生的AvrII位点位于核苷酸1755。用AvrII酶水解然后用T4 DNA连接酶重新连接使得在1755-1845核苷酸之间的DNA的SIV片段被去除。为了便于克隆HIV-1序列，用位点定点诱变在bp1645和在bp1743的RsrII位点上，ClaI位点被导入pGA载体内。此构建体被序列分析验证。
实施例2：pGA2的结构和序列
如图3和图4所示，除了缺失了来自CMVIE启动子的内含子A序列外，pGA2与pGA1是相同的。通过在CMVIE启动子中的mRNA帽子位点下游8bp的位置引入ClaI位点，从pGA1产生了pGA2。用互补引物：
5′-CCGTCAGATCGCATCGATACGCCATCCACG-3′(SEQ IDNO：)和
5′-CGTGGATGGCGTATCGATGCGATCTGACGG-3′(SEQ IDNO：)
用寡核苷酸定点诱变法使ClaI位点被导入。
在新ClaI位点插入之后，pGA1被ClaI水解并从pGA1切除946bpClaI片段，然后重新连接产生pGA2。
实施例3：pGA3的结构和序列
如图5和图6所示pGA3除了导入HindIII位点代替在核苷酸1645的ClaI位点和导入BamHI位点代替在核苷酸1743的RsrII位点外，pGA3与pGA1相同。
实施例4：pGA3和pJW4303的比较表达和免疫原性
要测定pGA质粒作为疫苗载体的功效，可将pGA质粒与先前描述的疫苗载体pJW4303做比较。pJW4303质粒被用作在小鼠、兔子和恒河猴体中的DNA疫苗接种(Robinson等人，1999；Robinson等人，1997；Pertmer等人，1995；Feltquate等人，1997；T0rres等人，1999)。比较是这样做的：用带有编码普通的A/PR/8/34(H1N1)流感病毒血凝集素的质膜形式的疫苗插入片段的pGA3(pGA3/H1)与编码同样片段的pJW4303(pJW4303/H1)做比较。pGA3和pJW4303在流感病毒H1序列的上游包含内含子A。
pGA3/H1和pJW4303/H1疫苗质粒在真核生物细胞中对H1表达的水平类似，总结如下：
表5：HA质粒的体外表达水平
              相对的HA单位
    质粒     上清液     细胞溶解产物
    pGA3/H1     0.1±0.1     5.7±0.6
    pGA载体     0.0±0.0     0.2±0.1
    pJW4303/H1     0.3±0.05     4.8±0.5
    pJW4303     0.0±0.0     0.1±0.1
用2μg的质粒对人胚胎肾脏293T细胞进行瞬时转染，应用捕获抗原的酶联免疫吸附测定法(ELISA)对上清液和细胞溶解产物的H1进行测定。捕获的抗体是抗H1多克隆兔血清、可检测抗体和多克隆抗H1小鼠血清。pGA3/H1表达的H1稍稍多于pJW4303/H1的表达[5.8HA单位对5.1H1单位(表6)]。正如所预期的，90％的H1抗原在细胞溶解产物中。用pGA3/H1和pJW4303/H1进行的比较免疫的研究揭示出，pGA3/H1比pJW4303/H1有相当的或更好的免疫原性(图7)。在BALB/c小鼠中测定免疫原性。在此例中使用基因枪给小鼠接种包被有金衣的DNA颗粒。小鼠被引发免疫，用低剂量(0.1μg)或高剂量(1μg)的质粒DNA加强免疫。在引发免疫后四周给予免疫增强。用pGA3/H1免疫接种与用pJW4303/H1相比，在免疫应答中提高的抗H1 IgG的量相同或较高(图7)。已证实，在增强免疫应答上，pGA载体与pJW4303载体一样有效或更有效。
实施例5：在pGA载体中的免疫缺陷病毒疫苗插入片段
表达颗粒病毒的免疫缺陷病毒疫苗插入片段在pGA1和pGA2得到发展。VLP插入片段是用分化体B HIV-1序列设计的，这样它与在美国流行的HIV-1序列相配。在分化体B内不同的分离物显示出簇的多样性，每个分离物与分化体共有序列有总的类似的多样性(Subbarao，Schochetman，1996)。任何分化体B分离物都可用做其他分化体B分离物的代表序列。HIV-1分离物用不同的趋化因子受体作为共受体。绝大多数经过传播的病毒用CCR-5作共受体(Berger，E.A.，1997)。因此使用EnV将疫苗插入片段设计为具有CCR-5。通过HIV-1 DNA疫苗表达带有R5-Env的VLP也具有支持病毒颗粒的Env介导的进入到专门的抗原提呈细胞(APC)如树突细胞和巨噬细胞中去的优点。树突细胞和巨噬细胞表达由CCR-5-向性(R5)HIV-1Envs应用的CD4受体和CCR-5共受体。通过在疫苗中使用R5 Env，在被转染的非专门的APC(例如，角化细胞或肌肉细胞)中被表达的VLP可通过Env-介导的进入而得以进入到APC的细胞质中。在进入到APC细胞质之后，VLP可进行类型I组织相容性抗原的加工和提呈。以DNA为基础的免疫依赖于用于抗原提呈的专门的APC(Corr等人，1996；Fu等人，1997；Iwasaki A等人，1997)。许多以DNA为基础的免疫是通过直接转染专门的APC来完成的(Condon等人，1996；Porgador等人，1998)。被转染的肌肉细胞或角化细胞可作为抗原制造厂，但其不能直接增强免疫应答(Torres等人，1997)。通过用从被转染的角化细胞或肌肉细胞释放和装配的然后又有活性地进入专门的APC中的被表达的抗原，免疫的效率可被增强。
构建pGA2/JS2的目标是(i)获得高度表达的使用CCR-5的分化体B VLP，(ii)产生非感染性的VLP(iii)将疫苗质粒的大小减到最小。在构建使用CCR-5-的VLP(pGA2/JS2)之后，JS2的衍生物被制备出来，它表达Env-不完全的VLP。质粒插入片段被标示为JS5。虽然预期此序列与包含Env的JS2 VLP相比效用较小，但不含Env的VLP提供了某些优势。其包括能监控被接种的群体，通过监测血清表型转化为Env来实现。Env序列的缺失也减小了疫苗质粒的大小。pGA2/JS2的DNA序列在图17中表示，pGA1/JS5的DNA序列在图18中表示。
正如在下表中表示的，为了获得高度表达的VLP质粒，侯选疫苗可从7种不同的HIV-1序列中构建。
表I：侯选疫苗插入片段的比较
质粒名称   被测序列   质粒生长能力   Gag的表达   Env的表达   注释
BH10-VLP   BH10   好   好   好   X4 Env
6A-VLP   BH10-VLP中的6A env   差   没测定   没测定
BAL-VLP   BH10-VLP中的BAL env   好   差   差
ADA-VLP   BH10-VLP中的ADA env   好   好   好   被选出用作疫苗，重新命名为pGA1/JS1
CDC-A-VLP   BH10-VLP中的CDC-Aenv   好   好   差
CDC-B-VLP   BH10-VLP中的CDC-B-env   好   好   好   不如ADA那样表达良好
CDC-C-VLP   BH10-VLP中的CDC-Cenv   好   好   好   不如ADA那样表达良好
最初的构建体-pBH10-VLP是从在细菌体内稳定的和在真核生物细胞中高度表达的IIIb序列制备的。BH10序列是从NIH-赞助的AIDS体藏库(catalog #90)中获得的。亲本的pBH10被用作PCR反应的模板构建pBH10-VLP。
所用引物被设计为能产生一个Gag-Rt PCR产物(5′PCR产物)，此产物包含从5′到3′的105bp的5′不翻译的前导序列以及从Gag起始密码子到RT编码序列末端的gag和pol序列。寡核苷酸引物将ClaI位点导入到PCR产物的5′端以及将EcoRI和NheI位点导入到PCR产物的3′端。正义的引物1(5′-GAGCTCTATCGATGCAGGACTCGGCTTGC-3′(SEQ ID NO：)和反义引物2(5′-GGCAGGTTTTAATCGCTAGCCTATGCTCTCC-3′(SEQ IDNO：)被用于扩增5′PCR产物。
HIV-1的env区域的PCR产物(3′PCR产物)包含vpu、tat、rev以及env序列和对于它们各自的mRNA的适当加工和表达所必需的剪接受体位点。一个EcoRI位点被导入到此产物的5′端以及NheI和RsrII位点被导入到3′端。正义引物3(5′-GGGCAGGAGTGCTAGCC-3′(SEQID NO：)和反义引物4(5′-CCACACTACTTTCGGACCGCTAGCCACCC-3′(SEQ ID NO：)被用于扩增3′PCR产物。
5′PCR产物在ClaI和NheI位点被克隆进入pGA1，通过序列分析进一步证实了构建体的身份。3′PCR产物然后被插入到5′克隆体中的EcoRI和NheI位点产生了pBH10-VLP。此VLP的构建结果产生缺少LTR、整合酶、vif和vpr序列的前病毒序列(见图8A)。
由于BH10-VLP有X4而不是R5 Env，编码六个不同的R5 Env的序列代替了在BH10-VLP中的env序列。这是通过将包含有来自不同的病毒基因组的tat、rev、vpu和env编码序列的EcoRI至BamHI片段克隆进入pBH10-VLP的而完成的。得到的env和rev序列是上述被代替序列和BH10序列的嵌合体(例见图8B)。在ADA被膜的情况下，BamHI位点被导入到ADA序列以便用EcoRI到BamHI的片段代替BH10-VLP中的EcoRI到BamHI的区域(图8)。在表1中总结了这些构建的结果。六个被测定序列中的一个即6A-VLP被发现与在转化细菌中质粒生长不良有关。此质粒不能在进一步的疫苗发展中使用(表1)。
在于细菌中显示生长良好的质粒中，对VLP表达最好的是在ADA-VLP被发现的(表1)。在293T细胞中的瞬时转染中，与野生型前病毒对ADA或IIIb的表达相比，ADA-VLP的表达较高。表达也比以前的VLP-疫苗(dpol)的表达高，此VLP-疫苗曾成功地在恒河猴体内引发了细胞毒性T-细胞应答(Kent等人，1998)。
实施例6：安全突变
ADA-VLP一旦被鉴定为进一步发展疫苗的良好侯选者，这个质粒就要被突变以增加它在人体应用的安全性。进一步的突变使在NC的锌指结构无效，此锌指结构在被病毒衣壳包裹的病毒RNA中是有活性的；增加点突变还使病毒逆转录酶和蛋白酶失去活性(图8)。下表概括总结了安全点突变的位置。
表2：在pGA/JS2和pGA/JS5上的安全点突变的位置，点突变抑制病毒RNA的包装和使逆转录酶在疫苗构建体中失去活性
  基因     区域   功能    氨基酸的改变1     位置
  Gag     锌指结构   病毒RNA包装    C392S     1285/128
  Gag     锌指结构   病毒RNA包装    C392S     1294/129
  Gag     锌指结构   病毒RNA包装    C413S     1348/135
  Gag     锌指结构   病毒RNA包装    C416S     1357/135
  Pol     RT   聚合酶的活动    D185N     2460/246
  Pol     RT   链传送    W266T     2703/2704/2
  Pol     RNAseH   RNAse的活性    E478Q     3339
1 氨基酸编号与在HIV-1 BH10序列中的个体基因相一致；
2 在野生型HIV-1 BH10序列中核苷酸编号
依照生产厂商的操作规程使用定点诱变试剂盒(Stratagene)进行突变。所有突变已被序列分析所证实。诱变使用的引物对是：
(A)C15S ZN1
5′-GGTTAAGAGCTTCAATAGCGGCAAAGAAGGGC-3′(SEQ IDNO：)
C15S ZN2 5′-GCCCTTCTTTGCCGCTATTGAAGCTCTTAACC-3′(SEQ ID NO：)
(B)C36S ZN3 5′-GGGCAGCTGGAAAAGCGGAAAGGAAGG-3′(SEQ ID NO：)
C36S ZN4 5′-CCTTCCTTTCCGCTTTTCCAGCTGCCC-3′(SEQ IDNO：)
(C)D185N RT1
5′-
CCAGACATAGTTATCTATCAATACATGAACGATTTGTATGTA
GG-3′(SEQ ID NO：)
D185N RT2
5′-
CCTACATACAAATAGTTCATGTATTGATAGATAACTATGTCT
GG-3′(SEQ ID NO：)
(D)W266T RT3
5′-GGGGAAATTGAATACCGCAAGTCAGATTTACCC-3′(SEQ IDNO：)
W266T RT4 5′-GGGTAAACTGACTTGCGGTATTCAATTTCCCC-3′(SEQ ID NO：)
(E)E478Q RT5
5′-
CCCTAACTAACACAACAAATCAGAAAACTCAGTTACAAGC-3′
(SEQ ID NO：)
E478Q RT6
5′-GCTTGTAACTGAGTTTTCTGATTTGTTGTGTTAGTTAGGG-3′(SEQ ID NO：)
(F)D25A Prt1
5′-GGCAACTAAAGGAAGCTCTATTAGCCACAGGAGC-3′(SEQID NO：)
D25A                    prt2                  5′-
GCTCCTGTGGCTAATAGAGCTTCCTTTAGTTGCC-3′(SEQ ID NO：)
人们发现有锌指结构和RT突变的ADA-VLP对Gag和Env的表达比没有突变的VLP质粒更有效(图10)。使蛋白酶基因失去活性的突变明显降低了VLP的表达(图10)，其未被选入用作疫苗质粒的进一步发展。没有突变的ADA-VLP被标示为JS1，带有突变的ADA-VLP被标示为JS2。
实施例7：JS5疫苗插入片段的构建
JS5插入片段是表达Gag、RT、Tat和Rev的质粒，其是通过缺失在ADA Env中的Bg1II片段由JS2构建的(图8)。此缺失从pGA2/JS2序列中除去了核苷酸4906-5486，其结果在env基因产生了早生的终止密码子，这导致在Env的854个氨基酸当中的269个被表达同时完整留下编码RRE区域的tat、rev和vpu和剪接受体位点。在图18表示出pGA1/JS5的DNA序列。
实施例8：JS2和JS5疫苗质粒体积的最小化
JS2和JS5疫苗插入片段最初是在pGA1构建的，pGA1是一在疫苗插入片段的上游包含CMVIE启动子的～1kb内含子A的载体。为测定此内含子对于疫苗的高水平表达是否必需，构建了缺少内含子A的pGA2载体来表达JS2和JS5疫苗插入片段。在表达测试中证明了pGA2有着与pGA1一样好的对JS2的表达模式(图11)。与此结果对照，pGA1对JS5的表达比pGA2有更大效力(图11)。对于JS5插入片段，没有内含子A比有内含子A的表达水平低2-3倍。
实施例9：对在疫苗插入片段JS2和JS5中的安全突变效率的测试
在RT(表2)的三个点突变完全消除了对JS2和JS5的逆转录酶活性的可测查水平。在逆转录产物被PCR扩增的情况下，应用高度敏感的逆转录酶测定(Yamamoto，Folks，Heneine，1996)。此测定可测查象10个那样少的病毒颗粒中的逆转录酶。逆转录酶的测定可在瞬时转染细胞的培养物上清液进行。在JS1疫苗中对于10个那样少的颗粒(p24的4×10-3pg)也容易测查出逆转录酶的活性，但是对于JS2或JS5插入片段就不能测查出来。
在JS2和JS5疫苗插入片段中的缺失和锌指结构突变(表2)减少颗粒中病毒RNA水平至少1000倍。从瞬时转染细胞上清液形成的颗粒被用来测定其病毒RNA的包装效率。用DNase处理VLP，提取RNA并在RT PCR之前以p24水平标准检验RNA的量。在RT PCR反应之后用对病毒序列的专门引物进行嵌套式PCR。VLP RNA的终点稀释度与从在野生型HIV-1 Bal病毒中包装的RNA获得的信号进行比较。
对JS2和JS5的包装被在质粒中的缺失限制达500-1000倍，概括如下：
表3：在pGA2/JS2和pGA1/JS5 VLP中，病毒RNA的包装被减少
  疫苗构建体 缺失/突变    与野生型HIV-1b相关的vRNA拷贝
  HIV-1bal Wt    1
  pGA1/JS1VLP 缺失LTR、int、vif、vpr、nef    .002
  pGA1/JS2VLP 缺失LTR、iht、vif、vpr、nef；在锌指结构和RT的突变    .0001
  pGA1/JS4VLP 缺失LTR、int、vif、vpr、nef    .001
  pGA1/JS5VLP 缺失LTR、int、vif、vpr、nef、env在锌指结构和RT的突变    .001
锌指结构的突变将对JS2颗粒的包装效率降低20倍，但是不进一步影响对JS5颗粒的包装效率。对独立转染产生的颗粒可再现性地以这种模式包装。
实施例10：蛋白质表达的蛋白质印迹分析
在图12A-D中表示的蛋白质印迹分析揭示了预期的pGA2/JS2和pGA1/JS5的表达模式。在细胞溶解产物中都可观察到未成熟的和已成熟的蛋白质，而仅仅Gag和Env的成熟形态可以在包含VLP的溶解产物中发现(图12B和12C)。在细胞溶解产物中很容易探测出逆转录酶(图12D)。
实施例11：pGA2/89.6SHIV载体构建
最初的免疫原性实验是用表达SHIV的VLP来进行的，而不是用表达HIV-1的疫苗质粒。SHIV是猿和人免疫原性病毒序列的杂合体，它在恒河猴体内生长很好(Li等人，1992)。通过用SHIV，可测定至少部分来源于HIV-1的疫苗在恒河猴模型中的效能。
pGA2/89.6(也标示为pGA2/M2)表达来于SHIV-89.6的序列(Reimann、Li、Veazey等人，1996)。89.6Env代表一个患者的分离物(Collman等人，1992)。作为SHIV-89.6的高度病原性毒株，被定名为SHIV-89.6P病毒(Reimann、Li、Voss等人，1996；Reimann、Li、Veazey等人，1996)，SHIV-89.6P能使疫苗效能快速测定。可通过直肠和静脉内途径给予SHIV-89.6P的攻击。SHIV-89.6和SHIV-89.6P不能产生交叉中和抗体。
pGA2/89.6(图13)有许多pGA2/JS2的设计特征。二者都能表达免疫缺陷病毒VLP：由pGA2/89.6表达的VLP是SHIV VLP，而pGA2/JS2则为HIV-1VLP。在pGA2/89.6中的gag-pol序列来自于SIV239，而tat、rev和env序列来自于HIV-1-89.6。pGA2/89.6与pGA2/JS2的不同也在于，整合酶、vif和vpr序列没有缺失以及逆转录酶基因没有通过点突变失去活性。最后，在NC的锌指结构由于缺失而不是由于点突变才失去活性。
pGA1/Gag-Pol的构建也使得Gag-Pol表达载体和Gag-Pol-Env表达性pGA2/89.6的保护效能可被评估。此载体是由pGA1/JS5和pGA2/89.6构建的(图13)。
实施例12：pGA2/89.6SHIV质粒的表达与pGA2/JS2表达的比较
pGA2/89.6和pGA1/Gag-Pol表达Gag的水平与pGA2/JS2类似。对表达的比较研究在瞬时转染的293T细胞上进行。对瞬时转染细胞的溶胞产物和上清液的分析揭示，两种质粒对壳体抗原的表达水平类似(图14)。用针对HIV-1p24和SIVp27的商用抗原捕获ELISA试剂盒对壳体蛋白质定量。
实施例13：pGA2/89.6SHIV疫苗的实验方案
恒河猴被用于调查系统DNA引发免疫然后用重组体MVA(rMVA)加强免疫对抗用SHIV-89.6P攻击珠对粘膜攻击的保护能力(Amara等人，2001)。
疫苗(pGA2/89.6)的DNA成分是如实施例11所描述的那样制成的，其应用免疫缺陷病毒的亚基因组剪接机制从单个转录本表达了八个免疫缺陷病毒蛋白(SIV、Gag、Pol、Vif、Vpx、Vpr与HIV Env、Tat和Rev)。rMVA加强免疫剂(89.6-MVA)是由Dr.Bernard Moss(NIH)提供的，在疫苗病毒早/迟启动子的控制下其表达HIV89.6Env和SIV239Gag-Pol，并分别插入到MVA的缺失II和缺失III内(Wyatt和Moss，未发表的结果)。89.6Env蛋白质被截断为gp41的C-末端115氨基酸。经修饰的H5启动子控制两个外来基因的表达。
接种试验比较了DNA疫苗的皮内和肌肉内的施用，也比较了基因佐剂的效力；表达恒河猴GM-CSF的质粒增强了疫苗插入片段引发的免疫应答。在0和8周用DNA引发以及在第24周用rMVA加强免疫而完成了接种。为了进行表达GM-CSF质粒的共传递，用包含2.5mg的pGA2/89.6和2.5mg/ml的pGM-CSF的溶液进行1-100μl的皮内接种。
以两种剂量(2.5mg和250μg的DNA)比较通过皮内的和肌肉内的对DNA的传递。通过皮内或肌肉内途径用无针喷射注射器(Bioject，Portland OR)，六只恒河猴为一组的四个疫苗组由2.5mg(高剂量)或250μg(低剂量)的DNA引发。通过用针在皮内和肌肉内注射进行89.6-MVA加强免疫接种(2×108pfu)。对照组包括两个模拟免疫接种的动物和两个首次用来做实验的动物。接种的方案概括如下：
表4：接种试验
组别(#恒河猴)   在0-8周引发     免疫原     在第24周加强免疫接种   免疫原
 1(6) i.d.无针喷射注射     2.5mg VLP DNA     i.d.+i.m.   MVA gag-pol-env
 2(6) i.m.无针喷射注射     2.5mg VLP DNA     i.d.+i.m.   MVA gag-pol-env
 3(6) i.d.无针喷射注射     250μg VLP DNA     i.d.+i.m.   MVA gag-pol-env
 4(6) i.m.无针喷射注射     250μg VLP DNA     i.d.+i.m.   MVA gag-pol-env
 5(6) i.d.无针喷射注射     2.5mg gag-pol DNA     i.d.+i.m.   MVA gag-pol
 6(6) i.d.无针喷射注射     250μg gag-pol DNA     i.d.+i.m.   MVA gag-pol
 7(6) i.d.无针喷射注射     250μg VLPDNA+250μgGM-CSF DNA     i.d.+i.m.   MVA gag-pol-env
 8(5) i.d.无针喷射注射i.d.+i.m.对照MVA     2.5mg对照DNA对照MVA     i.d.+i.m.   对照MVA
 9(4) i.d.无针喷射注射     250μg对照DNA+250μgGM-CSF DNA     i.d.+i.m.   MVA gag-pol-env
 10(6) i.d.+i.m.     MVA gag-pol-env     i.d.+i.m.   MVA gag-pol-env
除了Nef被截断的LTR、2nd ZN++锌指结构和被突变表达细胞表面Env，VLP DNA表达所有SHIV-89.6蛋白质；gag-pol DNA表达SIVmac 239 gag-pol；MVA gag-pol-env表达89.6被截断的enV和SIV mac239 gag-pol；MVA gag-pol表达SIV mac 239 gag-pol；MVA剂量是1×108pfu。
在用rMVA加强免疫后七个月，动物被攻击以测试是否疫苗产生了长期的免疫性。因为大部分HIV-1感染是通过粘膜表面传导的，直肠内攻击用以测试是否疫苗能控制粘膜免疫缺陷病毒的攻击。简言之，攻击(病毒RNA的5.7×109拷贝/ml)是通过一次i.v.，随后对经过初次SHIv-89.6P攻击的恒河猴直肠内攻击进行的。淋巴细胞是从高峰时期的病毒血症感染动物直肠中取得的，排除CD8的和用分裂素刺激生产的。在进行直肠内攻击之前，将禁食动物麻醉(盐酸氯胺酮，10mg/kg)，然后将其胃朝下骨盆区域稍稍抬高放置。将喂食管[8Fr(2.7mm)×16英寸(41cm)，Sherwood Medical，St.Louis，MO]插入到直肠15-20cm的距离。插入喂食管后，将注射器[其中装有在2mlRPMI-1640加10％胎牛血清(FBS)中的20倍直肠感染剂量]系在喂食管上，接种物缓缓注入到直肠内。在传递了接种物之后，用没有胎牛血清的3.0ml RPMI冲洗喂食管，然后慢慢将其拔出。在接种后10分钟内将骨盆区域缓缓抬起，再将动物挪开。
实施例14：疫苗增强的T-细胞应答
在DNA引发后再用rMVA加强免疫产生了高频率的对病毒的专一性T细胞，如图15所示，其在使用rMVA加强免疫后一周达到高峰。用Mamu-A*01-四聚体测定识别Gag-CM9抗原决定簇的T细胞频率；用重叠Gag和Env肽和酶联免疫点(ELISPOT)测定识别全部Gag和Env抗原决定簇的T细胞频率。
对于四聚体的分析，大约1×106PBMC是抗体进行了表面染色，这些抗体是分别与FITC、PerCP和APC结合的抗CD3(FN-18，BiosourceInternational，Camarillo，CA)、抗CD8(SK1，Becton Dickinson、SanJose，CA)和抗Gag-CM9(CTPYDINQM)-Mamu-A*01四聚体的抗体(染色容积100μl，温度8-10℃，30分钟)。用冷的包含2％FBS的PBS冲洗细胞两次，用在PBS中的1％多聚甲醛对其固定，在24小时内以FACScaliber(Becton Dickinson，San Jose，CA)获得分析结果。用前扩散器和侧扩散器使细胞最初分离出淋巴细胞群，然后再分离出CD3细胞。然后分析CD3细胞以找出CD8和四聚体结合细胞。每个样本大约获得150000淋巴细胞。用FloJo软件对数据进行分析(Tree Star，Inc.San Carlos，CA)。
对于IFN-γ ELISPOT，于8-10℃下，以碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)中浓度为2μg/ml的抗人IFN-γ抗体(Clone B27，Pharmingen，SanDiego，CA)对MULTISCREEN 96孔过滤板(Millipore Inc.Bedford，MA)包被过夜。用RPMI培养液冲洗过滤板两次，然后用完全培养基(包含10％FBS的RPMI)在37℃下封闭一小时。用纯RPMI培养液冲洗过滤板五次以上，细胞被接种于100μl完全培养基上，其数目从每孔2×104到每孔5×105个细胞，每板设一重复。将肽库加入到每个孔使最终浓度为在100μl容积的完全培养基中每肽2μg/ml。在37℃与5％CO2条件下细胞被培养36小时。用冲洗缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)冲洗过滤板六次，然后将其与用包含2％FBS冲洗缓冲液稀释的每毫升1μg的生物素化的抗人IFN-γ抗体(clone 7-86-1，Diapharma Group Inc.，West Chester，OH)一起保温。在37℃下板被保温2小时，后用冲洗缓冲液冲洗六次。在每个孔中加入亲合素-HRP(Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA)并在37℃下保温30-60分钟。将板用冲洗缓冲液冲洗六次，用稳定的DAB作为底物使样点扩展(Research Genetics Inc，Huntsville，AL)。用立体解剖显微镜对样点计数。在每个分析中包括作为对照的卵清白蛋白肽(SIINFEKL)。卵清白蛋白肽的本底样点一般每5×105PBMC小于5。当用1×106 PBMC标准化时本底小于10。只有两次本底的ELISPOT计数(≥20)才被认为是有效的。因为在没有饲养细胞的情况下(34)细胞的不同稀释有不同的样点形成效率，ELISPOT的频率是大约数。细胞的相同稀释被用于给定时间点的所有动物，但是不同的稀释被用于探测记忆和高峰期的效应应答。
简单的线形回归被用于估计加强免疫后和攻击后ELISPOT应答之间，记忆和攻击后ELISPOT应答之间和对数病毒负载和接种组内ELISPOT频率之间的相关性。用对数病毒负载和对数ELISPOT应答，通过2-样本t-检验进行疫苗组和对照组之间的比较。用2-样本t-检验，进行了A*01和无A*01恒河猴之间的ELISPOT或对数病毒负载的比较。根据高峰期DNA/MVA ELISPOT，记忆DNA/MVA ELISPOT，和对数转化的Gag抗体数据，用双因素方差分析的方法检测所给予剂量和途径的效力。
Gag-CM9四聚体分析仅限于恒河猴，它表达Mamu-A*01组织相容性类型，而ELISPOT应答不依赖专一性的组织相容性类型。T细胞随时间的变化的测定用作记录T细胞应答的急性状态(效应细胞高峰)和长期(记忆)状态(图15A)。正如所预期的，DNA免疫接种产生了了低水平的记忆细胞，其在用rMVA加强免疫后一周内增加为高频率(图15)。在Mamu-A*01恒河猴中，对Gag-CM9抗原决定簇的专一性细胞增加到高达CD8 T细胞总数的19％的比率(见图15B动物2)。专一性细胞的峰值经过一次＞10倍的收缩变成DNA/MVA记忆库(图15A和B)。在收缩成DNA/MVA记忆应答之前，三个Gag肽库的ELISPOT也经过大量的膨胀(频率达到每1×106PBMC为4000点)(图15C)。在有和没有A*01的组织相容性类型的恒河猴体中ELISPOT的频率是相同的(p＞0.2)。在疫苗应答的高峰和记忆状态在不同疫苗组的ELISPOT高度的排列顺序是2.5mg i.d.＞2.5mgi.m.＞250μg i.d.＞250μg i.m.(图15C)。IFN-γELISPOT包括CD4和CD8细胞(工作在进行中)。在用肽再刺激之后，Gag-CM9-专一性CD8细胞具有良好的溶胞活性(没有显示数据)。
给人印象深刻的是，在动物远系交配的种群中所有Gag和Env肽均刺激IFN-γELISPOT反应(图16A)。在用rMVA加强免疫后25周，疫苗免疫产生的T细胞处于记忆中时，对细胞应答的宽度进行测试。七个Gag肽库中的7个和21个Env肽库中的16个可被被接种动物体中的T细胞识别。5个Env库不被识别，其中2个于美国疾病控制中心在恒河猴DNA/MVA疫苗试验中被识别(未显示数据)。其余的三个(19-21库)在我们的免疫原中被截断(Amara等人，2001，已提供)，其作为阴性对照。Gag和Env ELISPOT在DNA/MVA记忆应答中全都具有类似的频率(图16B)。应答的最大的宽度是在高剂量i.d.DNA引发免疫的动物中，在那里平均10个肽库(4.5Gag和5.3Env)被识别。疫苗组的应答宽度排列顺序与DNA/MVA应答高度排列顺序相同：2.5mg i.d.＞2.5mg i.m.＞250μg i.d.＞250μg i.m.(图16B)。
实施例15：AIDS的攻击和对抗保护
在用rMVA加强免疫后当疫苗免疫产生的T细胞已记忆时，通过直肠给予高病原性SHIV-89.6P攻击(图15)。
SHIV拷贝数目的测定：用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen)直接提取150μl ACD抗凝血血浆中的病毒RNA，将其在60μl AVE缓冲液中洗脱，在-80℃下冰冻直到对SHIV RNA进行定量。在包含有50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，4mM MgCl2，1mM各dNTP，2.5μM随机六聚物，20单位MultiScribe RT和8单位RNA酶抑制剂的20μl的体积中，将5μl提纯的血浆RNA逆转录。反应在25℃保温10分钟，在然后在42℃保温20分钟99℃下将逆转录酶去活性5分钟。将反应混合物最后调节到50μl容积，其中包含50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，4mM MgCl2，0.4mM各dNTP，0.2μM正向引物，0.2μM反向引物，0.1μM探针和5单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(所有试剂来源于Perkin Elmer Applied Biosystems，Foster City，CA)。在SIV gag基因的保守区内的引物序列与以前描述的相同(Staprans，S，等人，1996)。
将Perkin Elmer Applied Biosystems 7700型序列探测器与PCR程序一起应用：95℃下10分钟，然后在93℃下30秒，59.5℃下1分钟，40个循环。用7700序列探测器和针对内部保守的gag基因序列的探针检测PCR产物，在此处FAM和Tamra表示报告和猝灭染料。SHIVRNA拷贝数目是通过对由病毒体衍生的用SIV bDNA方法定量的SIVmac239 RNA组成的外部标准曲线的比较来测定的(BayerDiagnostics，Emeryville，CA)。所有样品的提取和扩增都设有重复实验，用平均结果报告的。血浆输入量为0.15ml，测定的敏感性为每毫升血浆103拷贝RNA，线形动力学范围是103到108RNA拷贝(R2＝0.995)。对每毫升包含大于104SHIV RNA拷贝的样本，内测定变异系数小于20％；对每毫升包含103-104SHIV RNA拷贝的样本则小于25％。为了更准确地对在被接种16和20周的动物中低SHIV RNA拷贝数目定量，可以进行下列调整以增加SHIV RNA测定敏感性：1)用离心方法(23000g，10℃，150分钟)将来源于小于或等于1毫升的血浆的病毒颗粒浓缩，提取病毒RNA；2)应用一步RT-PCR方法。通过与相同的SIVmac239标准比较，SHIV RNA拷贝的绝对数被测定。这些改变提供了每毫升300SHIV RNA拷贝的可靠定量限度并给出了SHIV RNA值，其与通过应用第一种方法获得的值高度相关(r＝0.91，p＜0.0001)。
攻击结果：攻击感染了所有被接种的和对照组动物。但是，在攻击后两周疫苗组(几何平均数1×107到5×107)比对照组动物(几何平均数4×108)的血浆病毒RNA的效价至少低10倍(图19A)。在攻击后8周高剂量DNA引发组和低剂量i.d.DNA引发组几何平均数负载减少到大约每毫升1000病毒RNA拷贝。在这时低剂量i.m.DNA引发组的几何平均数为6×103病毒RNA拷贝，没接种的对照组几何平均数为2×106。在攻击后20周即使低剂量的i.m.组的平均数也减少到了1000病毒RNA拷贝。在这时，未接种的对照组死于艾滋病。在24个被接种动物中仅有一个动物(低剂量i.m.组)出现间歇性的病毒负载达每毫升1×104拷贝以上(图19D)。
病毒负载的迅速减少保护被接种的恒河猴避免CD4细胞的损失和艾滋病的的迅速发作(图19B、19C、19E)。攻击后5周所有未接种的对照组经受了CD4细胞的大量损耗，这是SHIV-89.6P感染的特征(图19B)。除了动物22(见上面)经受CD4的缓慢下降外，所有被接种动物都保持了它们的CD4细胞(图19E)。在攻击后23周，四个对照动物中的三个死于艾滋病(图19C)。这些动物不同程度上患有伴有腹泻的小肠结肠炎、隐孢子虫病、大肠杆菌性膀胱炎、小肠弯曲菌感染、淋巴结病和与SIV相关的巨细胞肺炎。与此对照的是，所有24个被接种动物都保持健康。
细胞内细胞因子的测定：大约1×106 PBMC在37℃下被刺激一小时，其置于5ml聚丙烯试管中，其中有在体积为100μl的RPMI中的每毫升100μg的Gag-CM9肽(CTPYDINQM)，并包含0.1％BSA和抗人CD28和抗人CD49d(Pharmingen，Inc.San Diego，CA)共刺激抗体(1μg/ml)。加入包含10％FBS和莫能菌素(10μg/ml)的900μlRPMI，细胞于37℃，5％CO2下，于5°角被再培养5小时。在8-10℃下用偶联于PerCP(clone SK1，Becton Dickinson)的抗CD8的抗体对细胞表面染色30分钟，用包含2％FBS的冷PBS冲洗两次，用Cytofix/Cytoperm(Pharmingen，Inc.)溶液固定和透化。然后将细胞与分别连接于FITC和PE的抗人CD3(clone FN-18，BiosourceInternational，Camarillo，CA)和抗IFN-γ(Clone B27，Pharmingen)的抗体一起置于Perm冲洗液(Pharmingen)于4℃保温30分钟。将细胞用Perm冲洗两次，用纯PBS冲洗一次，并重悬浮于PBS中的1％多聚甲醛中。用FACS caliber获得大约150000个淋巴细胞，用FloJo软件分析。
增殖测定：用适当抗原刺激大约20万PBMC，一式三份，于37℃，在5％CO2下，于200μl的包含10％FCS的RPMI中5天。来自于由表达SHIV-89.6Gag和Pol或表达SHIV-89.6Gag、Pol和Env的DNA转染的293T细胞的悬浮液被直接用作抗原。来自于模拟DNA(仅为载体)转染细胞的悬浮液被用作阴性对照。在第6天，每孔用1μCi的氚标记胸苷脉冲细胞16-20小时。用自动细胞采集器(TOMTEC，Harvester 96，Model 1010，Hamden，CT)采集细胞，再用Wallac 1450MICROBETA闪烁计数器(Gaithersburg，MD)计数。刺激指数是掺入到受89.6抗原刺激的PBMC的氚标记胸苷的计数除以掺入到受模拟抗原刺激的同样PBNC的氚标记胸苷的计数。
攻击后T细胞结果：病毒攻击的抑制与抗病毒的T细胞发生有关(图15；图20A)。攻击后一周外周血的四聚体+细胞的频率降低，有可能反映出对感染位点的专一性T细胞得到补充(图20A)。但是，在攻击后两周外周血的细胞迅速扩增，其频率同用MVA加强免疫后一样高甚至更高(图15，20A)。大多数四聚体+细胞产生了IFN-γ以应答用肽Gag-CM9的6小时的刺激(图20B)，它们没有有时在慢性病毒感染中观察到的“被震晕”的IFN-γ负表型。攻击后T细胞的发生伴随着病毒负载的下降。攻击后12周呈现的病毒专一性T细胞约为它们高峰时的十分之一(图15A、20A以及未表示的数据)。DNA/MVA诱导的ELISPOT峰值的高度预示了如用ELISPOT(r＝+0.79，P＜0.0001)测量的一样的攻击后T细胞应答的高度。与在被接种动物中强有力的次级应答相对照，在首次用来作实验的动物中，只是初级应答有了少量增长(图15B、15C和20A)。四聚体+细胞的峰值比所有CD8细胞的1％还少(图20A)，产生IFN-γ的T细胞呈现出大约300的平均频率，而在被接种组中呈现出1000到6000的高得多的频率(图15C)(P＜0.05)。在用Gag-CM9肽刺激后，对照组的大部份细胞产生IFN-γ，这与被接种组的相同(图20B)。在攻击后12周，4个对照动物中的三个已测查不出产生IFN-γ的T细胞(数据未表示)。在存在高病毒负载的情况下，抗病毒的CD8细胞的迅速丢失可反映出缺少CD4的帮助。
T细胞增殖性应答显示，病毒专一性CD4细胞在攻击后存活下来，并能够支持抗病毒免疫应答(图20C)。在攻击后12周，Gag-Pol-Env或Gag-Pol蛋白的平均刺激指数在被接种组为从35到14，但在对照组是探测不出的。与增殖测定一致，细胞内细胞因子测定也显示，在被接种动物有病毒专一性CD4细胞但在对照组没有(未显示数据)。增殖性应答量在所有被接种疫苗组的排列顺序是：2.5mg i.d.＞2.5mgi.m.＞250μg i.d.＞250μg i.m.
淋巴结的保持：在攻击后12周，被接种动物的淋巴结在形态上是完整的，其对感染是有应答的；而被感染的对照动物的淋巴结功能已被破坏(图5)。被接种动物的淋巴结包含大量反应性次级囊泡，膨大的生发中心和分散的暗带与亮带(图5A)。与此对照，未被接种的对照动物的淋巴结显示囊泡和副皮质的缺失(图5B)，而未被接种也未被攻击的动物的淋巴结显示了最低限度反应性生发中心的正常数目(图5C)。在感染的对照动物中，生发中心占据的淋巴结区域小于0.05％，在未感染的动物中占据2％，在被接种动物组中可高达18％(图5D)。被生发中心占据的淋巴结区域在接受低剂量DNA引发的动物中比接受高剂量引发的动物高两倍，这一点提示在低剂量动物中有更强有力的免疫反应性(图5D)。在攻击后12周，在24个被接种的恒河猴中有3个其淋巴结中，病毒RNA原位杂交发现少量的病毒表达细胞，而在每一个被感染对照动物的淋巴结中都很容易检测出病毒表达细胞(图5E)。在CD4 T细胞大量损耗的对照组中，被感染淋巴结细胞的细胞形态学与巨噬细胞的表型是一致的(未表示数据)。
抗体随时间的应答：总的抗Gag抗体的ELISA采用细菌产生的SIV gag p27来包被孔(于碳酸氢盐缓冲液中，2μg/ml)。抗Env抗体的ELISA采用瞬时转染的293T细胞产生的89.6Env，其可用抗Env绵羊抗体捕获(产品目录号：6205；International Enzymes，FairbrookCA)。采用SHIV-89.6感染的恒河猴的血清和已知量的抗Gag和抗Env免疫球蛋白，产生了Gag和Env的ELISA标准曲线。用山羊抗恒河猴IgG-PO(产品编号# YNGMOIGGFCP，Accurate Chemical，Westbury，NY)和TMB底物(产品编号# T3405，Sigma，St.Louis，MO)可测查结合的抗体。在一式两份的孔中血清被3倍稀释，测定。在乳清缓冲液(4％乳清和0.1％Tween20于1X PBS中)中将测试的血清进行稀释。封闭缓冲液由乳清缓冲液加0.5％无脂肪干奶组成。用2MH2SO4使反应停止，光密度读数在450nm。用SOFTmax 2.3软件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)绘出标准曲线，以每毫升血清的抗体量(μg)作为样本浓度插入图中。
结果显示，引发/加强免疫的方法产生了低水平的抗Gag抗体和几乎检则不到的抗Env抗体的水平(图22)。但是在攻击后对Env和Gag的抗体经过了回忆应答，Gag抗体总量达到接近每毫升1mg，Env抗体总量高达每毫升100μg(图22A和B)。
攻击后两周，在高剂量DNA引发免疫组，对89.6免疫原的中和抗体显示为(几何平均效价在i.d.组为352，在i.m.组为303)(图22C)出现，而SHIV-89.6P攻击组没有出现。攻击后5周对89.6P的中和抗体产生了(在高剂量i.d.组几何平均效价为200，在高剂量i.m.组为126)(图22D)，对89.6的中和抗体开始下降。这样，抗89.6的抗体应答的引发没有阻碍导致抗SHIV-89.6P的中和抗体的B细胞应答。在攻击后16到20周，抗Gag和Env的抗体在大多数动物中下降了(图22A和B)。这和对病毒感染的对照是一致的。
与保护相关的T细胞。在攻击后两周和三周血浆病毒RNA水平与攻击前DNA/MVA-产生的IFN-γ ELISPOT的峰频率负相关(分别为r＝-0.53，P＝0.008和r＝-0.70，P＝0.0002)(图23A)。
重要的是，这些相关性是在免疫应答正有效减少病毒血症水平的时候观察到的。在攻击后的较后时间，在检测水平或之下的病毒负载组排除了相关性。也寻找了在病毒负载与攻击后的ELISPOT、增殖性应答和中和性抗体应答之间的相关性。在攻击后两周，IFN-γ ELISPOT水平与攻击后三周的病毒负载相关(r＝-0.51，P＝0.009)(数据未表示)。攻击后的增殖性和中和性抗体应答与病毒负载无关。
剂量和途径：对于细胞和体液应答DNA的剂量有显著影响(P＜0.05)，而DNA的施用途径仅对体液应答有显著影响(图23C-E)。在产生抗Gag抗体方面，DNA的皮内传递途径比肌肉内传递途径的效果大约强10倍(P＝0.02)(图23E)。在我们所给的数据中，i.d.DNA注射在引发病毒专一性T细胞的高度和宽度上大约有效3倍多(图23C和D)。但这些不同并不显著(高度，P＝0.2；宽度，P＝0.08)。有趣的是，DNA的途径和剂量对保护水平无重要影响。在攻击后20周，高剂量DNA引发的动物(7×102和5×102)比低剂量DNA引发的动物的病毒RNA(9×102和1×103)的几何平均水平稍低。有最高间歇性病毒负载的动物(恒河猴22)是在低剂量i.m.引发组(图19D)。这样，缓慢控制病毒血症的低剂量i.m.引发组(图19A)可能有较差的长期保护。应答的宽度对抑制病毒负载没有立即的影响，但随着时间，也可能影响到病毒逃避的频率。
这些结果清楚地显示，多蛋白DNA/MVA疫苗可以增强记忆免疫应答，其能控制高毒性粘膜免疫缺陷病毒攻击。其对病毒控制的优良水平比迄今为止仅用DNA或rMVA疫苗(Egan等人，2000；I.Ourmanov等人，2000)达到的水平要更高，这也与用白细胞介素-2辅助的DNA免疫(Barouch等人，2000)所获得的水平不相上下。所有这些以前的研究都用到三次以上疫苗的接种，没有应用粘膜攻击并且大部分是在高峰期效应物应答时进行攻击，而没考虑到如我们的研究中所做的那样延长接种后的测试时期以测定长期效用。我们的结果也第一次证明，如用IFN-γ ELISPOT所度量的，疫苗免疫产生的T细胞与控制病毒血症相关。现在这个比较简单的测定可应用于HIV-1的DNA和MVA免疫原临床前期的评估，也能用于作为人类临床试验功效的标记。
DNA/MVA疫苗不能预防感染。然而疫苗迅速地减少病毒负载到接近每毫升血液有1000个病毒RNA拷贝或在其以下，因而控制了感染。抑制而非预防感染使病毒有机会建立慢性感染(Chun等人，1998)。然而通过迅速减少病毒负载，多蛋白DNA/MVA疫苗可长期抑制病毒感染的进展并限制HIV传染。
实施例16：Gag-Pol疫苗试验
用表达Gag-Pol而非Gag-Pol-Env的免疫原对在疫苗中包含Env的重要性进行测定(见图27的构建体)。不包括Env的疫苗在某方面(例如，筛选作为感染标记的抗Env抗体的能力)有一定的优势。此试验应用pGA1/Gag-Pol和表达SIV239的Gag-Pol序列的rMVA(MVA/Gag-Pol)(由Dr.Bernard Moss提供)(NIH-NIAID)。
按上面实施例13中描述的针对“Gag-Pol-Env”(pGA2/89.6MVA89.6)免疫原的方案施用“Gag-Pol”免疫原(见表4中的5和6组)。以同样的DNA剂量(2.5mg和250μg)用于引发高剂量和低剂量组，通过皮内途径施用。如前面实施例13-15中描述的疫苗试验，在每个试验组中包括2-3只mamu A*01恒河猴。如上文实施例所描述的，用pllc-m四聚体和被重叠肽库刺激的ELISPOT，对那些对plle-m抗原决定簇有专一性的T细胞产生了T细胞应答。
免疫接种后，疫苗受体显示了类似于在Gag-Pol-Env疫苗试验中观察到的抗Gag T细胞应答。在用rMVA加强免疫之后7.5月，将动物用SHIV-89.6P直肠内攻击(图28)。与保护动物免受CD4细胞快速丢失的Gag-Pol-Env疫苗的方案不同，Gag-Pol动物全都丢失CD4细胞(图28B和28D)。在接受低剂量i.d.DNA引发的组中，丢失是最明显的。与CD4细胞的丢失一致，与Gag-Pol-Env组相比，Gag-PolDNA接种组在减少它们病毒负载上也效力不高(图28A和28C)。这些组的几何平均病毒负载在攻击后3周高10-100倍，在攻击后5周高10倍。这些结果证明，在被攻击动物体中，Env基因在保护CD4细胞和减少病毒RNA水平方面起着重要作用。结果也显示，在保护受体对抗病毒攻击上Gag-Pol-Env DNA/MVA疫苗比Gag-PolDNA/MVA疫苗更有效。
实施例17：麻疹插入片段
表达麻疹H和C3d补体成分融合蛋白的DNA疫苗被用于测定接种是否能够获得更早的和更有效的抗H抗体应答。在以前Dempsey等人所做的小鼠研究中，两个或三个拷贝的C3d与模型抗原鸡卵溶菌酶的融合体增强了免疫效率1000多倍(Dempsey等人，1996)。这导致了更快出现血凝反应的抑制(HI)活性和保护性免疫(Ross等人，2000和Ross等人，2001)。
在人免疫系统中，补体活化的一个结果是第三补体蛋白C3d片段与对活化蛋白质的共价结合。C3d转而结合B淋巴细胞上的CD21，它是具有能扩大B淋巴细胞活性的B细胞刺激功能的分子。在麻疹H-C3d融合蛋白中，融合体的H部分将结合于B细胞上的抗H Ig受体和通过B细胞受体传递信号，而融合体的C3d部分将结合于CD21并通过CD19传递信号。在这个假说中，对H-C3d融合蛋白的B细胞应答将比仅仅对单独H的B细胞应答更有效。用表达结合三个C3d拷贝的分泌型H融合蛋白(sH-3C3d)的DNA疫苗接种的小鼠比仅表达sH的DNA疫苗接种的小鼠产生了更快的和更高水平的中和抗体活性。
质粒DNA：pTR600，一个真核生物表达载体，被构建成包含加上内含子A(IA)的两个拷贝的巨细胞病毒立即早期启动予(CMV-IE)用以起始真核生物插入片段的转录，还包含牛生长素多腺苷酸信号序列(BGH poly A)用以终止转录。载体包含用以容易插入基因片段的多克隆位点，也包含用以原核复制的Col E1复制起点和用以在抗生素介质中筛选的卡那霉素抗性基因(Kanr)(图29A)。
来于Edmonton品系的血凝集素(H)cDNA序列和C3d序列如前所描述地被克隆和用单一的限制性内切核酸酶位点被转移到pTR600疫苗载体内(图29B)。通过去除H的跨膜和胞质结构域产生了分泌型版本。应用PCR将H基因片段与组织纤溶酶原激活物(tpA)前导序列(Torres等人，2000)的N端合成模仿物以符合读框的方式克隆而完成这些。
正如以前描述的，通过在sH基因3′端以符合读框的方式克隆三个串联重复的小鼠同源性C3d基因而产生了表达sH-C3d融合蛋白的载体(Dempsey，1996；Ross等人，2000和Ross等人，2001)。构建体的设计依据Dempsey等人的资料，用了来自于pSLG-C3d的序列。由4个甘氨酸和1个丝氨酸的两次重复{(G4S)2}组成的连接物在H和C3d结合点和在每个C3d重复之间融合。通过用导致精氨酸密码子突变为甘氨酸密码子的BamHI和BglII融合，在C3d接点和sH与C3d接点之间潜在的蛋白水解酶剪切位点发生了突变。
在大肠杆菌菌株，DH5a中扩增质粒，用阴离子交换树脂柱(Qiagen，Valencia，CA)提纯，在-20℃于dH2O下保存。通过适当的限制性酶消化和胶体电泳检验质粒。在260nm和280nm通过光密度读数测定DNA制备物的纯度。
小鼠和DNA免疫：6-8周年龄的BALB/c小鼠(Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)被用于接种。简言之，用0.03-0.04ml混合液[5ml盐酸氯胺酮(100mg/ml)和1ml盐酸塞拉嗪(20mg/ml)混合]麻醉小鼠。在400psi氦压力下用每0.5mg含有0.5μg DNA的大约1-μm金弹丸(DeGussa-Huls Corp，Ridgefield Park，NJ)的两个基因枪剂量给小鼠进行免疫接种。
转染和表达分析：依据操作规程(Life Technologies，Grand Island，NY)，用12％脂转染剂以2μg的DNA转染人胚胎肾脏细胞系293T(5×105细胞/转染)。收集上清液并保存在-20℃。如以前描述的，用捕获抗原H的ELISA进行计量(Cardoso等人，1998)。
为了进行蛋白质杂交分析，将15μl上清液或细胞溶解产物以1∶2比例稀释于SDS样本缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA)中，并将其置于10％聚丙烯酰胺/SDS凝胶上。解离的蛋白质被转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)并与以1∶1000的多克隆兔抗HA抗血清稀释液保温于包含0.1％Tween 20和1％无脂干牛奶的PBS中。在彻底冲洗后，用以1∶2000稀释的与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔抗血清和增强的化学发光剂(Amersham，Bucknghamshire，UK)探测出结合的兔抗体。
抗体测定：进行计量ELISA，以测定抗H专一性IgG水平。简言之，将组成型表达MV(24)的H蛋白质的Ltk-细胞置于96孔板中生长。抗血清稀释液与表达H抗原的完整细胞一起保温保存。使抗H抗体结合于细胞上30分钟，在此后将细胞固定于丙酮(80％)中。用生物素酰基化的抗小鼠IgG抗体和链霉抗生物素磷酸酯酶碱性系统(Sigma)探测专一性抗体应答。结合于不表达H抗原的Ltk-细胞的抗体被应用于使系统标准化。结果以终点稀释滴定度表达出。
中和性测定：中和性测定在于六孔板(25)中生长的Vero细胞上进行。简言之，将100-200p.f.u.的麻疹病毒Edmonton株与一系列血清稀释液混合，在37℃保温1小时，然后在板上保温。将板置于37℃保温48小时并对斑块计数。中和效价定义为减少斑块形成50％或90％需要的血清相应的稀释度。免疫前血清作为阴性对照。
结果：两种表达血凝素的疫苗质粒被构建于PTR600载体以表达来于Edmonston株的分泌类型H(sH)或分泌类型H的C3d融合蛋白(sH-3C3d)(图29)。sH代表H的全部胞外域，但不包括跨膜和胞质区。该克隆使H序列与组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)前导序列的N-端合成模拟物符合读框。tPA前导基因和H序列融合于H跨膜区3′端。通过将小鼠同源的三个串联重复的C3D序列与分泌型H基因以符合读框的方式克隆，产生了sH-3C3d融合蛋白(图29B)。在每个C3d分子之间结合处和H蛋白和第一个C3d编码区域之间结合处发现的蛋白水解剪切位点被诱变破坏。
蛋白印迹分析揭示了预期大小的sH和sH-3C3d蛋白质。应用抗MV H抗血清的兔多克隆抗体的蛋白印记分析显示出与在被转染细胞的上清液中H的分泌类型相符的～70kD的宽阔带。～190kD的高分子量带是与sH-3C3d融合蛋白反映的大小是一致的(图30)。通过蛋白分析没有发现sH-C3d融合蛋白的蛋白水解剪切证据。
与抗原的跨膜相关类型相比，麻疹病毒H通过包含sH或sH-3C3d的质粒以稍稍较低的水平被表达。用2μg质粒对人293T细胞进行瞬时转染，用抗原捕获ELISA测定上清液和细胞溶解产物中的H。大约75％的H蛋白被分泌进入sH-DNA和sH-3C3d-DNA转染细胞的上清液。正如所预期的，在用表达H跨膜类型的质粒转染细胞的细胞溶解产物中可探测出～99％的H抗原。
对麻疹H DNA免疫的抗体应答：表达sH-3C3d DNA质粒比sHDNA产生了更高的ELISA抗体效价。用DNA包被的金粒通过基因枪以0.1μg或1ug接种物给BALB/c小鼠接种。接种后4周和26周，用在第一次免疫接种时所给的同样DNA剂量对小鼠进行加强免疫。抗H抗体呈现的时间图形显示，与用sH DNA接种的小鼠比较，免疫应答在用表达C3d融合蛋白的DNA接种的小鼠体内能更快启动。通过第一次免疫接种产生了抗体的良好效价。通过第二次和第三次免疫接种得到进一步增强。在第三次免疫接种之后，用sH-3C3D接种的小鼠比用sH DNA接种的小鼠其体内效价高5-6倍。
中和作用测定：对MV中和的血清检测显示，在第二次接种0.1μg表达sH-3C3d的DNA后效价高达1700。对Vero细胞的中和抗体研究探测出，与用sH DNA接种的小鼠血清相比，在用sH-3C3d构建体激发的小鼠血清中，抗MV Edmonton模型的中和活性的效价更高。用sH-3C3d质粒接种的小鼠在中和抗体水平上有急剧上升，在14周其达到一高平顶。与此对照的是，用sH DNA进行第三次接种后只激发出中和抗体的可探测水平。接种28周后，用sH-3C3d-DNA接种的小鼠血清具有的中和效价(＞250)可减少MV感染形成的斑块90％。
与用仅仅表达sH的DNA接种的小鼠相比，在用表达C3d蛋白构建体接种的小鼠体内对H的抗体应答的高度增加7-15倍。表达sH-3C3d的DNA增加的抗体应答更引起人们兴趣，因为这个质粒仅表达～60％表达sH的质粒所表达的蛋白质。
除了整个抗体水平的增加外，在体外感染测定中，专门中和MV的抗体能更快产生。在第二次免疫接种后，在用sH-3C3d的DNA免疫接种的小鼠体内能观测到可探察水平的中和抗体。在14周中和抗体的效价达到高峰(1700，对于50％斑块减少)，它实际上在与保护相关的最低量(＞120，对于50％斑块减少)之上。与此对照，用表达sH的DNA接种的小鼠甚至在第三次接种后，其中和抗体的水平仍然低(180，对于50％斑块减少)(图31)。
实施例18：具有和没有-C3d的流感插入片段
质粒载体构建和提纯的过程在以前针对JW4303已有所描述(Torres等人，1999；Pertmer等人，1995；Feltquate等人，1997)。简言之，用单一的限制位点将来自于A/PR/8/34(H1N1)的流感血凝素(HA)序列克隆于pJW4303或pGA真核表达载体内。
HA的两种形式，一个分泌(s)型和一个跨膜(tm)型，在以前已有所描述(Torres等人，1999；Feltquate等人，1997)。在pJW4303中表达sHA或tmHA的载体分别被标示为pJW/sHA和pJW/tmHA，在pGA中表达sHA、tmHA或sHA-3C3d的载体分别被标示为pGA/sHA、pGA/tmHA和pGA/sHA-3C3d。
通过克隆小鼠同源的三个串联重复的C3d以及使三个串联重复的C3d与分泌型HA基因符合读框，产生了表达HA-C3d融合蛋白的载体。构建体的设计依据Dempsey等人的资料(1996)。由4个甘氨酸和一个丝氨酸的两个重复体[(G4S)2]组成的连接物于每个C3d重复连接处融合。pGA/sHA-3C3d质粒表达大约50％由pGA/sHA载体表达的蛋白质。但是在上清液与细胞溶解物中发现的sHA-3C3d的比率与由pGA/sHA表达的抗原的比率相似。80％多的蛋白质被分泌入上清液。在蛋白质分析中，较高的分子量带120kDa被探测到，其代表了sHA-3C3d融合蛋白。因此，sHA-3C3d融合蛋白象sHA抗原一样有效地被分泌进入上清液。
小鼠和DNA免疫接种：6-8周龄的BALB/c小鼠(Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)被用于接种。小鼠被关在一个小隔离室，自由进食和饮水，并按照实验动物的USDA准则照料小鼠。用5ml盐酸氯胺酮(100mg/ml)和1ml盐酸塞拉嗪(20mg/ml)的混合物0.03-0.04ml对小鼠进行麻醉。用手握Accell基因运送系统在刮净的腹部皮肤上进行基因枪免疫接种，用每0.5mg约1μm金弹丸(DeGussa-HulsCorp.，Ridgefield Park，NJ)含0.5μg DNA的两基因枪剂量在400psi氦压力下进行免疫接种。
流感病毒的攻击：通过鼻内滴注法以活的适于小鼠的流感病毒进行攻击，鼻内滴注法是将稀释于PBS中包含3份致死剂量病毒的50μl尿囊液注入到盐酸氯胺酮麻醉的小鼠的鼻孔中。这种方法导致肺部的迅速感染，其对于未经免疫接种的小鼠是100％的致死。在免疫接种后8或14周对小鼠个体进行攻击以及对其体重损失和存活情况进行监测。标绘的数据是指每一个实验组中个体平均攻击后体重与攻击前重量的百分比与攻击后天数的对应关系。
对HA DNA免疫接种的抗体应答：与sHA DNA比较，tmHA和sHA-3C3d DNA质粒产生了较高的ELISA抗体的效价。用基因枪以0.1μg或1μg剂量的DNA包被的金粒对BALB/c小鼠进行接种。在接种后4周，将每个组一半的小鼠用与第一次免疫接种中所给剂量相同的剂量的DNA进行加强免疫。用sHA-3C3d-和tmHA-表达质粒诱导的所有抗HA IgG在不同小鼠试验组中是类似的并且比用sHA表达质粒产生的量高3-5倍(图24)。除此之外，被激发的抗HA抗体的量以剂量依赖方式随接种的DNA量而增加(图24E-24F)。总而言之，剂量应答曲线和抗HA抗体呈现的时间图形在用tmHA-DNA或sHA-3C3d-DNA接种的小鼠中是类似的，但是在用sHA-DNA接种的小鼠中它是较低和较缓慢的。如所预期的，加强免疫促进和增加了HA抗体的效价。
小鼠HA抗血清的亲和力：硫氰酸钠(NaSCN)置换ELISA证明，用表达sHA-3C3d的DNA产生的HA专一性抗体的亲和力比来自于sHA-DNA或tmHA-DNA接种的小鼠的抗体的更高(图25)。用梯度浓度的硫氰酸钠即一种破坏抗原抗体相互作用的离液剂对HA专一性抗体的亲和力进行比较。同对抗原有较大亲和力的抗体比较，对抗原有较小亲和力的抗体的结合在较低的硫氰酸钠浓度下就被破坏。释放50％抗血清的硫氰酸钠的有效浓度(ED50)是～1.20M，其中抗血清是在接种后8周从sHA-DNA或tm-DNA加强免疫的小鼠(0.1μg剂量或1μg剂量)中采集的(图25A)。与此对照，来于用sHA-3C3d-DNA接种和加强免疫的小鼠的抗血清具有～1.75M的ED50(图25B)。在攻击时(接种后14周)，来于用sHA-DNA和tmHA-DNA接种小鼠抗体的ED50增加到～1.8M(图25C)。来于用sHA-3C3d-DNA接种小鼠的抗体的ED50增加到～2.0M(图25D)。此结果提示，与来于用sHA-DNA和tmHA-DNA接种小鼠的抗体相比，来于用sHA-3C3d-DNA接种小鼠的抗体的亲和力成熟更迅速。在sHA-3C3d和tmHA的抗体亲和力随时间成熟之间的区别是对产生的抗体水平的非依赖性。这两种质粒有类似的抗体出现随时间变化的图形和产生抗体的能力的剂量应答曲线(图25)。
血凝素抑制(HI)效价：进行血凝素抑制测定(HI)用来评定所产生抗体阻止A/PR/8/34(H1N1)结合硅铝酸的能力。用从接种后8周和14周小鼠采集的血清样本测定HI效价。不考虑剂量或所给予的疫苗，所有被加强免疫的小鼠在第14周都有可被测定的HI效价。sHA-3C3d-DNA接种小鼠有最高效价(高达1∶1200)的记录。未被加强免疫的小鼠显示出HI效价的更多变化。用0.1μg剂量的sHA-DNA或tmHA-DNA表达质粒接种的未被加强免疫的小鼠具有1∶10的低HI效价。与此对照，用sHA-3C3d-DNA接种小鼠具有高于1∶640的效价。在8周有可测定HI效价(1∶160)的被接种小鼠仅仅是用1μg剂量sHA-3C3d-DNA接种并加强免疫的小鼠。这些结果指出，当融合于sHA时C3d能刺激专一性B细胞增强抗体的亲和活性的成熟从而产生对HA的中和抗体。
对流感攻击的保护功效：与激发HI抗体最高效价相一致，sHA-3C3d DNA比sHA或tmHA DNA能提供更有效的保护。用致死剂量的A/PR/8/34流感病毒(H1N1)攻击小鼠，然后对其发病率(通过体重减少来度量)和死亡率进行每日的监测，以此来测定各种HA-DNA疫苗的保护效率。以相对于攻击前平均重量的百分比与攻击后天数的关系标绘每个动物重量减少图(图26)。第一次被病毒攻击的小鼠和仅用pGA载体接种的小鼠显示出重量的急剧下降，在攻击后8天所有小鼠体重都下降＞20％(图26)。与此对照，PBS模拟攻击的小鼠在观察14天后体重仍未下降。不考虑所给予的DNA质粒的剂量，在接种后14周所有被加强免疫的小鼠都在攻击后存活下来。但是，用0.1μg剂量的sHA-DNA接种的被加强免疫的小鼠在复原前在接种后第8天其体重下降到它们起始的体重的92％(图26)。与此对照，使用1μg剂量，在接种后8周攻击被加强免疫的小鼠，在攻击下存活的小鼠只有sHA-3C3d-和tmHA-DNA接种的小鼠，尽管在接种后14周观察到它们的体重有很大的下降。用0.1μg剂量加强免疫接种的小鼠在接种后8周在攻击后存活的只有sHA-3C3d接种小鼠(图26)。
在未加强免疫的0.1μg剂量免疫接种组中，只有sHA-3C3d-DNA接种小鼠于接种后14周在攻击下存活(图26)。所有只给予单独DNA接种的小鼠的体重下降。但是，在这些中sHA-3C3d-DNA接种小鼠体重下降最少，也只有它们是唯一在致死的攻击下存活下来的小鼠(图26)。这些结果证明，3C3d蛋白在与HA融合时加强了DNA疫苗的效率，以此可考虑减少DNA剂量和接种次数来提供抵抗致死流感病毒攻击的保护。
实施例19：HIV gp120-C3d融合构建体
在这项研究中，与实施例18所述相似之处是也应用三个鼠C3d拷贝并将其融合于HIV Env gp120亚单位的羧基端。用DNA接种法给BALB/c小鼠接种并测定增强的免疫应答。与野生类型gp120序列相比，融合构建体诱导较高的对Env的抗体应答和亲和活性成熟较快发生。此结果提示，增强抗体的DNA疫苗功效可通过与C3d的融合蛋白被极大改善。
质粒DNA：如上面实施例1所述，pGA的构建包含起始真核插入片段转录的巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)加上内含子A(IA)以及终止转录的牛生长素多腺苷酸信号(BGH poly A)。应用单一的限制性内切核酸酶位点，将来自于分离的ADA的HIV包膜序列、IIIB和编码几乎全部gp120区域的89.6与C3d序列克隆进入pGA疫苗载体。gp120片段编码从氨基酸32到465的区域，并以氨基酸序列VAPTRA结束。前32个氨基酸从每个sgp120 N端缺失而由组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tpA)的前导序列代替。通过与表达sgp120的DNA以符合读框的方式克隆小鼠同源的三个串联重复的C3d，产生表达sgp120-C3d融合蛋白的载体。构建体的设计依据Dempsey等人(1996)资料。由4个甘氨酸和1个丝氨酸的二次重复体{(G4S)2}组成的连接物在HA与C3d结合处和每个C3d重复体之间融合。通过连接Bam HI和Bgl II限制性内切核酸酶位点使Arg密码子突变为Gly密码子，潜在的在C3d结合处和3C3d结合处之间的蛋白质水解剪切位点发生了突变。
在大肠杆菌菌株，DH5a中扩增质粒，用阴离子交换树脂柱(Qiagen，Valencia，CA)提纯，在-20℃于dH2O下保存。通过适当的限制性酶消化和胶体电泳检验质粒。通过260nm和280nm光密度测定DNA制备物的纯度。
小鼠和DNA免疫：如在上面实施例17中所描述的，6-8周龄的BALB/c小鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)被用于接种。简言之，在400psi氦压力下用每0.5mg包含有0.5μgDNA的大约1-μm金弹丸(DeGussa-Huls Corp，Ridgefield Park，NJ)的两个基因枪剂量给小鼠进行免疫接种。
如实施例17所述进行转染与表达分析和蛋白质杂交实验，除了将硝化纤维素膜与1∶1000的多克隆HIV感染病人的抗血清稀释液保温于包含0.1％Tween 20和1％无脂干牛奶的PBS中。在彻底的冲洗后，用辣根过氧化物酶结合山羊抗人抗血清的1∶2000稀释液和增强的化学发光剂(Amersham，Bucknghamshire，UK)探测出结合的人抗体。
ELISA和亲和力测定：用提纯的HIV-1-IIIB gp120 CHO表达的蛋白质(Intracell)包被板，进行终点ELISA以测定在免疫血清中的抗Env IgG的效价(如Richmond等人，1998所述)。可以替代的是，板被绵羊抗Env抗体(International Enzymes Inc.，Fallbrook，CA)包被并用于捕获在以sgp120表达载体瞬时转染的293T细胞中产生的sgp120。来于被接种小鼠的血清结合并随后通过结合于辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG被探测。终点效价比底数高两倍被认为是阳性。进行亲和力ELISA，根据样本和标准的加入亲和力ELISA与血清抗体ELISA测定类似。根据O.D.值，将样本稀释到与专一性IgG同样的浓度。用0.05％PBS-Tween 20冲洗板三次。然后加入不同浓度的离液剂一于PBS中的硫氰酸钠(0M、1M、1.5M、2M、2.5M和3M NaSCN)。将板放置于室温中15分钟然后用PBS-Tween 20洗涤6次。以下几步类似血清抗体ELISA测定，相对于起始IgG的百分比被计算为相对于起始的O.D.百分比。所有测定都一式三份。
中和抗体测定：如前所述，HIV-1 IIIB和89.6的抗体介导的中和作用在MT-2细胞杀死测定中测量(Montefiori等人，1988)。简言之，将无细胞病毒(50μl包含108TCID50病毒)加入到在以多聚赖氨酸包被的96孔微滴定板的一式三份小孔中的100μl生长培养基里的血清样本多倍稀释液中，并在37℃保温1小时，然后加入MT-2细胞(每孔加入在100□1内的105细胞)。有必要时在三天后降低细胞密度并置换培养基。当对照孔中细胞病变效果大于70％但小于100％时，通过用Finters中性红给存活细胞染色测定中和作用。通过计算在测试孔(细胞+病毒)之间吸收作用(A540)的差并将该结果除以在细胞对照孔(只有细胞)和病毒对照孔的吸收作用差来测定保护的百分率。根据需要保护至少50％细胞免于病毒诱导杀灭的原生质稀释度的倒数来表示中和效价。
结果：包含任一种分泌类型抗原的质粒在类似的总水平上表达Env，但sgp120-C3d表达质粒的表达水平低2-4倍。用2μg质粒对人293T细胞进行瞬时转染，并用抗原捕获ELISA测定上清液和细胞溶解产物的gp120。sgp120构建物表达量为每毫升450到800ng，而3C3d融合物表达量为每毫升140到250ng。在sgp120和sgp120-3C3d-DNA转染细胞的上清液中存在大约90％Env蛋白质(数据未表示)。不同的sgp120表达水平的区别大约为两倍，这似乎反映出Env基因的区别以及对不同Env识别的抗体的捕获与探测效率的区别。
蛋白质印记分析揭示出预期大小的sgp120和sgp120-3C3d蛋白质。应用病人多克隆抗血清，蛋白质印记分析显示，预期的115-120kD宽带与gp120相符。在～240kD的更高的分子量带与sgp120-3C3d融合蛋白预期的大小一致。与抗原捕获测定一致，在sgp120-DNA转染细胞的上清液中存在了高强度蛋白质带，而在sgp120-3C3d-DNA转染的细胞上清液中存在的是较少强度的蛋白质带(未表示数据)。在蛋白质分析中未见sgp120-C3d融合蛋白的蛋白质水解剪切证据。
对Env gp120 DNA免疫接种的抗体应答：sgp120-3C3d表达DNA质粒所产生的ELISA抗体效价比sgp120 DNA更高。通过基因枪以1μg剂量DNA包被金的颗粒给BAIB/c小鼠接种。在第一天给小鼠接种，然后在第4、14和26周用与第一次接种所给予的同样DNA进行加强免疫。在gp120-IIIB包被板上测定血清，与sgp120表达质粒增强的抗体量相比，用表达C3d融合蛋白的DNA接种的小鼠具有高出3-7倍的抗Env抗体。在C3d构建体中，用sgp120-(IIIB)-3C3d接种的小鼠具有最高水平的抗体，而用sgp120-(ADA)-3C3d表达DNA接种的小鼠具有最低水平的抗Env抗体。抗Env抗体出现随时间变化的图形揭示出对于所有被测试的构建体每个接种中均增强了效价。
用不同Env产生的抗体水平的区别似乎是由所产生抗体的专一性来决定的。在可替换的ELISA方案里(其中，在Env同源物上捕获抗体)所有C3d融合物增强抗体的水平似乎是类似的。在这项测定中，绵羊抗Env抗体被用于捕获瞬间产生的sgp120蛋白质。此测定揭示出由每个sgp120-3C3d构建物增强的抗体水平低但类似。在这个测定中探测出的较低的抗体水平似乎反映出，用于捕获抗体的转染产生的Env水平比用商业生产的IIIB gp120包被板所做的测定值要低。正如应用ELISA方法预期的，加强免疫接种对于达到最适宜的抗体应答是必要的。
小鼠Env抗血清的亲和力：硫氰酸钠(NaSCN)置换ELISA证明，用表达sgp120-3C3d DNA产生的抗体的亲和力持续高于由sgp120-DNA接种小鼠产生的。因为所产生的抗血清的类型专一性和用于捕获抗原的IIIB蛋白质(不是其他蛋白质)可商业购得，亲和力测定是在用sgp120-(IIIB)和sgp120-(IIIB)-3C3d免疫产生的血清上进行的。用梯度浓度的硫氰酸钠，一种破坏抗原抗体相互作用的离液剂，对Env的专一性抗体的亲和力进行比较。结果指出，来自于sgp120-3C3d-DNA接种小鼠的抗体比来自于sgp120-DNA接种小鼠的抗体亲和活性成熟更快。
Env-3C3d表达质粒激发适量中和抗体：在MT-2细胞进行的中和抗体研究在由gp120-3C3d构建体产生的血清中探测出比在由sgp120构建体产生的血清中更高的中和活性效价。用血清对两种包括IIIB(X4)和89.6(X4R5)病毒的合胞体进行测定。用sgp120-3C3d表达质粒接种的小鼠具有非常适量的对HIV同源毒株的中和抗体水平，这是通过以中性红摄取度量的对MT-2细胞免受病毒诱导杀灭的保护来测试的。由表达gp120的DNA产生的中和抗体效价作为测定的底数。
此研究结果显示，HIV-1 Env和三个小鼠C3d副本的融合增强了对被接种小鼠Env的抗体应答。在第4次接种后(引发后28周)，用三种表达sgp120序列的DNA质粒的任何一种接种的小鼠具有低的或不可探测水平的抗体。与此对照，用表达sgp120和3C3d融合蛋白的DNA接种的小鼠激发抗体更快地发生(第三次接种)也具有更高的抗体水平。
与抗体效价增强和抗体对Env亲和活性成熟相对照，被接种小鼠被激发的中和抗体量是低的。用表达sgp120的质粒接种的小鼠具有低的中和抗体水平，它在用sp120-3C3d表达质粒接种的小鼠体中仅有少量增加。但是中和抗体水平在第四次接种后有明显增加。中和抗体的不良效价可能反映出，因为没有将中和抗原决定簇充分暴露于应答B细胞造成sgp120-3C3d融合蛋白对增强中和抗体的内在的低劣能力。在小鼠血清中对HIV-1中和测定的固有的高底数也可能造成低劣的中和效价。
结果证明了C3d融合物作为增加抗体产生和增进抗体成熟的分子佐剂的效用。除此之外，对Env的中和抗体应答在用C3d融合疫苗接种的小鼠中有少量增加。与在使用了来自于麻疹和流感病毒的HA分泌型版本的实施例17和18中所看到的结果类似，仅仅应用表达相当于那些表达非融合sgp120的质粒所表达的蛋白质一半量的蛋白质的质粒，就可以获得C3d-增强的抗体应答。
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Claims (32)

1.一种载体，其包含：
用于λT0终止子的编码终止序列；
原核生物复制起点；
可选择的标记基因；和
包含编码一个或多个从病原体衍生的免疫原的疫苗插入片段的真核生物转录盒。
2.权利要求1的载体，其中所述病原体是病毒病原体。
3.权利要求1的载体，其中所述病毒病原体是从由HIV、麻疹、流感、脊髓灰质炎和风疹组成的组群中挑选的。
4.权利要求1的载体，其中所述一个或多个免疫原是从由HIVGag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
5.权利要求1的载体，其中所述一个或多个免疫原是进一步从由HIV Gag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
6.权利要求1的载体，其中所述编码一个或多个免疫原的疫苗插入片段进一步包含至少一个C3d基因。
7.一种免疫接种或治疗患者的方法，包含给予治疗有效剂量的生理学上可接受的组合物的步骤，所述组合物包含权利要求1的载体。
8.权利要求7的方法，进一步包含随后给予治疗有效剂量的组合物的步骤，所述组合物包含表达一个或多个免疫原的重组天花病毒载体，其中免疫原是从由HIV Gag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
9.权利要求7的方法，其中所述一个或多个免疫原是从由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
10.权利要求7的方法，进一步包含随后给予治疗有效剂量的表达一个或多个免疫原的重组天花病毒载体，其中免疫原是从由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
11.权利要求7的方法，其中所述载体表达一个或多个从由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的免疫原。
12.包含SEQ ID NO：1的DNA序列的载体。
13.权利要求12的载体，其中该载体进一步包含编码一个或多个免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是从由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感选择血凝素、流感跨膜血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的；并且该载体可任选地包括至少一个C3d基因。
14.权利要求12的载体，其中所述一个或多个免疫原是从由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
15.包含SEQ ID NO：2的DNA序列的载体。
16.权利要求15的载体，其中该载体进一步包含编码一个或多个免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是从由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感选择血凝素、流感跨膜血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的；并且该载体可任选地包括至少一个C3d基因。
17.权利要求15的载体，其中所述一个或多个免疫原是从由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
18.包含SEQ ID NO：3的DNA序列的载体。
19.权利要求18的载体，其中该载体进一步包含编码一个或多个免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是从由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感选择血凝素、流感跨膜血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的；并且该载体可任选地包括至少一个C3d基因。
20.权利要求18的载体，其中所述一个或多个免疫原是从由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
21.包含SEQ ID NO：4的DNA序列的载体。
22.权利要求21的载体，其中该载体进一步包含编码一个或多个免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是从由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感选择血凝素、流感跨膜血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的；并且该载体可任选地包括至少一个C3d基因。
23.权利要求21的载体，其中所述一个或多个免疫原是从由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
24.包含SEQ ID NO：5的DNA序列的载体。
25.权利要求24的载体，其中该载体进一步包含编码一个或多个免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是从由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感选择血凝素、流感跨膜血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的；并且该载体可任选地包括至少一个C3d基因。
26.权利要求24的载体，其中所述一个或多个免疫原是从由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
27.一种免疫接种或治疗患者的方法，包含给予治疗有效量的生理学上可接受的组合物，其中该组合物包含一种载体，该载体是包含从SEQ ID NOS：1、2、3、4和5中挑选出的序列的核酸，以及其中所述治疗有效量的组合物是通过肌肉内或皮内途径给予的。
28.权利要求27的方法，其中所述载体表达一个或多个从由HIVGag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的免疫原；并且该载体可任选地包括至少一个C3d基因。
29.权利要求27的方法，其中所述载体表达一个或多个从由HIVGag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的免疫原。
30.权利要求27的方法，进一步包含随后给予治疗有效剂量的表达一个或多个免疫原的重组天花病毒载体，其中所述免疫原是从由HIV Gag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的。
31.权利要求27的方法，其中所述载体表达一个或多个从由HIVGag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它们的突变体及其子序列组成的组群中挑选的免疫原。
32.一种免疫接种和治疗患者的方法，包括对需要的患者给予治疗有效剂量的包含权利要求29的载体的组合物。
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