MXPA05003225A - Construcciones de acido nucleico para la expresion genica. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan construcciones de acido nucleico que comprenden acido nucleico genomico viral que comprende al menos dos unidades endogenas reguladoras de expresion genica que comprenden cada una un promotor endogeno donde los promotores endogenos de las unidades estan activos en la misma fase en el ciclo de vida viral del virus del cual se deriva el acido nucleico genomico viral. Las unidades endogenas reguladoras de expresion genica se usan para expresar secuencias heterologas de codificacion, elegidas, particulares y en particular para expresar antigenos heterologos. Las construcciones se pueden usar en una vacuna para generar una respuesta inmune contra los antigenos heterologos y en particular se pueden usar en una vacuna de ADN. Tambien se proporcionan metodos para generar las construcciones y medios para su administracion.

Description

CONSTRUCCIONES DE ACIDO NUCLEICO PARA LA EXPRESION GENICA Campo de la Invención La presente invención está relacionada a los campos de biología molecular e inmunología y en general a métodos para la expresión génica. De manera más particular, la invención se refiere a construcciones de ácido nucleico para la expresión de polipéptidos y su uso en la producción de una respuesta inmune en un sujeto por inmunización y en particular por inmunización por ácidos nucleicos.

Antecedentes de la Invención Las estrategias convencionales de vacunación comprenden en general la administración de vacunas ya sea "vivas" ó "muertas" (Ertl et al., (1996) J. Immunol. 156:3579-3582). Las llamadas vacunas vivas incluyen microbios atenuados y moléculas recombinantes basadas en un vector vivo. Las vacunas muertas incluyen aquellas basadas en patógenos enteros aniquilados y vacunas de sub-unidades , por ejemplo, sub-unidades solubles de patógenos o sub-unidades de proteínas. En general, las vacunas vivas son exitosas al proporcionar una respuesta inmune efectiva en sujetos inmunizados; sin embargo, estas vacunas pueden ser peligrosas en sujetos inmunocomprometidos o preñados, puede REF: 162921 revertirse a organismos patógenos, o estar contaminados con otros patógenos (Hassett et al., (1996) Trends in Microbiol . 8:307-312). Las vacunas muertas, tal como vacunas de sub-unidades, evitan los problemas de seguridad asociados con vacunas vivas . Puesto que las vacunas de sub-unidades no comprenden el patógeno completo, también evitan en forma típica el problema de las proteínas virales inmunomoduladoras que se pueden expresar de vacunas virales atenuadas y que puedan reducir la efectividad de la vacunación. Sin embargo, las vacunas muertas, y en particular las vacunas de sub-unidades, fallan frecuentemente en proporcionar una respuesta inmune apropiada y/o efectiva que en los sujetos inmunizados. Una posible manera de incrementar la eficiencia de las vacunas de sub-unidades es que la vacuna incluya sub-unidades múltiples. La inmunización con antígenos múltiples es deseable, debido a que induce típicamente una respuesta inmune más amplia que puede dar mejor protección que la inmunización con un antígeno único. Las vacunas de sub-unidades múltiples también pueden ayudar a reducir la necesidad de identificar un antígeno individual particular capaz de dar una respuesta protectora. Esto puede ser particularmente importante para la inducción de respuestas inmunes celulares en poblaciones cruzadas donde los individuos pueden variar enormemente en su respuesta a un producto génico individual y por lo tanto no hay un antígeno que sea capaz de dar una respuesta inmune protectora en la población como una totalidad. Se pueden introducir vacunas en el sujeto que se va a inmunizar mediante varias rutas. De forma más reciente, se ha descrito la inyección directa de ADN es plásmido por inyección intramuscular (Wolff et al. (1990) Science 247:1465:1468) o intradérmica con una aguja o jeringa (Raz et al. (1994) PNAS USA 91:9519-9523). De esta manera, una construcción que codifique para el antígeno, en lugar del antígeno mismo, se introdujo en el sujeto. Estas vacunas que comprenden una construcción de ácido nucleico que codifica para el antígeno se refieren como vacunas de ADN. Otro planteamiento para la distribución de vacunas de ADN se refiere a la distribución de ADN, balística o mediada por partículas y emplea un dispositivo de distribución de partículas sin aguja para administrar cuentas de oro, microscópicas, · revestidas con ADN directamente en las células de la epidermis (Yang et al. (1990) PNAS USA 87:9568-9572). De esta manera, se pueden usar varias técnicas de distribución para distribuir ácidos nucleicos para inmunización, incluyendo técnicas mediadas por partículas que distribuyen micropartículas revestidas con ácidos nucleicos en el tejido objetivo (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos co-poseída Nos. 5,865,796, 5,865,796., emitida el 2 de Febrero de 1999) . El nivel logrado de protección efectiva con las vacunas de ADN es similar a aquel producido por las vacunas tradicionales de sub-unidades de proteína y vacunas virales aniquiladas o atenuadas; aunque tradicíonalmente es menor que la observada en animales convalecientes después de la recuperación de una infección natural (Manickan et al . (1997) Critical Review Immunol . 17:139-154). Las técnicas de inmunización por ácido nucleico, mediadas por partículas, se ha mostrado que producen respuestas inmunes de linfocitos T, tanto humorales como citotóxicas después de la distribución epidérmica de cantidades en nanogramos de ADN (Pertmer el al., (1995) Vaccine 13:1427-1430). Estas técnicas de distribución mediada por partícula se han comparado a otros tipos de inoculación de ácidos nucleicos, y se encontraron notablemente superiores. Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmacology 17:79-83, Fynan et al. (1993) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90:11478-11482, y Raz et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:9519-9523.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se basa en el hecho que grupos de genes en genomas virales han co-evolucionado de una manera tal que se reduce al mínimo la interferencia entre la expresión dé los genes, en tanto que se aumenta al máximo la estabilidad de la región que contiene los genes. Esta evolución coordinada de los genes virales se puede usar en la generación de construcciones de expresión para la co-expresión de secuencias heterólogas de codificación. De esta manera, se toma una región de ácido nucleico genómico que comprende dos o más genes virales y las secuencias naturales de codificación de los genes virales se reemplazan con las secuencias heterólogas de codificación que se van a expresar. Por lo tanto, las construcciones se beneficiarán de la compatibilidad de los promotores virales y otros elementos reguladores usados y por lo tanto exhibirán estabilidad incrementada y mínima interferencia. La modificación adicional al ácido nucleico genómico entonces se puede introducir para optimizar la construcción. La presente invención proporciona por lo tanto construcciones de las cuales se pueden expresar múltiples secuencias heterólogas de codificación. El uso de una construcción única para expresar varios polipéptidos heterólogos, en lugar de expresar cada uno de una construcción separada, disminuye la complejidad de elaboración y control de calidad. También es probable disminuir la dificultad de obtener una aprobación reguladora. El incremento en la estabilidad de la construcción y la disminución en la interferencia debido al uso de unidades endógenas de regulación de expresión génica del ácido nucleico genomico viral contrasta con construcciones ensambladas al insertar múltiples genes en sus propios promotores u otros promotores comúnmente usados para lograr una expresión de alto nivel en un vector tal que estas construcciones exhiben frecuentemente inestabilidad e interferencia entre los promotores. Por consiguiente, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende ácido nucleico genomico viral, el ácido nucleico genomico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden cada una un promotor endógeno donde los promotores endógenos de las unidades son activos en la misma fase en el ciclo de vida viral del virus dcnde se deriva el ácido nucleico genomico viral ; donde : (a) al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores activos en la misma fase se enlazan cada una de forma operable a una secuencia heteróloga separada de codificación insertada en el ácido nucleico genomico viral; y (b) el ácido nucleico genomico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo. La invención también proporciona un método para generar una construcción de ácido nucleico para la administración directa a un sujeto para producir una respuesta inmune en el sujeto, el método que comprende: (a) insertar el ácido nucleico genómico viral en una estructura de vector, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden cada una un promotor endógeno donde los promotores endógenos de las unidades son activos en la misma fase en el ciclo viral de virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral; y (b) ya sea antes, o al mismo tiempo, o subsiguiente a la inserción del ácido nucleico genómico viral en la estructura de vector, enlazar operablemente los promotores endógenos de al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica en el ácido nucleico genómico viral a las secuencias heterólogas de codificación; en donde el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo. La invención proporciona además partículas revestidas, adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, partículas que comprenden partículas portadoras revestidas con una construcción de ácido nucleico en donde la construcción comprende ácido nucleico genómico viral, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden cada una un promotor endógeno donde los promotores endógenos de las unidades son activos en la misma fase en el ciclo viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral; donde: (a) al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores se enlazan cada una operablemente a una secuencia heteróloga de codificación insertada en el ácido nucleico, genómico viral; y (b) el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo. La invención proporciona además: un receptáculo de dosis para un dispositivo de distribución mediada por partículas que comprende partículas revestidas de la invención; y un dispositivo de distribución mediada por partículas cargado con partículas revestidas de la invención . La invención también proporciona en otra modalidad un método para obtener expresión en una célula de mamífero de un polipéptido de interés, método que comprende transferir a las células una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico genómico viral, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden cada una un promotor endógeno donde los promotores endógenos de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral, donde: al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores se enlazan cada uno operablemente a una secuencia heterologa de codificación insertada en el ácido nucleico genómico viral; y el ácido nucleico, genómico viral, es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo. En otra modalidad, la invención proporciona un método de inmunización por ácido nucleico que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de partículas revestidas, partículas que son adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, las partículas que comprenden partículas portadoras revestidas con una construcción de ácido nucleico, en donde la construcción comprende ácido nucleico genómico viral, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden cada una un promotor endógeno donde los promotores endógenos de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral, donde: al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores se enlazan cada uno operablemente a una secuencia heteróloga de codificación insertada en el ácido nucleico genómico viral; y el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud, excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo. La invención también proporciona un método para generar una construcción de ácido nucleico para la administración directa a un sujeto para producir una respuesta inmune en el sujeto, el método que comprende: (a) insertar un ácido nucleico genómico viral en una estructura de vector, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden cada una un promotor endógeno donde los promotores endógenos de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral; y (b) ya sea antes, al mismo tiempo o después de insertar el ácido nucleico genómico viral en la estructura de vector, suprimir del ácido nucleico genómico viral algunas o todas las secuencias virales, aparte de al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, que están presentes en la región del genoma viral que corresponde a aquel entre los extremos 5' y 3' del ácido nucleico genómico viral de la construcción; donde la longitud del ácido nucleico genómico viral insertado en la estructura de vector que es de 1 a 50 kb. La presente invención también proporciona un método para obtener la expresión en una célula de mamífero de un polipéptido de interés, método que comprende transferir a las células una construcción de ácido nucleico generada por un método de la invención. La presente invención también proporciona un método de inmunización por ácido nucleico que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de partículas revestidas, partículas que son adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, las partículas que comprenden partículas portadoras revestidas con una construcción de ácido nucleico generada por un método de la invención. Estos y otros objetos, aspectos, modalidades y ventajas de la presente invención se presentarán fácilmente por aquellos expertos en la técnica en vista de la descripción en la presente.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1(a) -1(h) proporcionan mapas de plásmido del cósmido 23 y la construcción OP23-6 y las varias construcciones intermedias entre los dos. Las Figuras 2 (a) -2(f) proporcionan mapas de plásmidos para las construcciones OPhsvl-1 y OPhsvl-6 y las varias construcciones intermedias entre los dos.

Descripción Detallada de la Invención Antes de describir la presente invención en detalle, se va a entender que esta invención no se limita a moléculas o parámetros de proceso, particularmente ejemplificados, como tales puesto que estos pueden variar por consiguiente. De esta manera, por ejemplo, la invención no se limita a antígenos particulares o a secuencias de nucleótidos que codifiquen para el antígeno. También se va a entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención únicamente y no se propone que sea limitante. Además, la práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular, técnicas dé ADN recombinante e inmunología, todas las cuales están dentro de la habilidad ordinaria de la técnica. Estas técnicas se ejemplifican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989) ; DMA Cloning: A Practical Aproach, vol . I & II (D. Glover, ed.) ; Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); and Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds . ) . También se va a entender que se pueden adaptar diferentes aplicaciones de los métodos descritos a las necesidades específicas en la técnica. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente, ya sea supra o infra, se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Se debe señal que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un" y "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Definiciones A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde la invención.

Los siguientes términos se proponen que se definan como se indican a continuación. Aunque se pueden usar varios métodos y materiales similares, o equivalentes a aquellos descritos en la presente, en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos son aquellos descritos en la presente . El término "composición de vacuna" propone cualquier composición farmacéutica que contenga un antígeno (por ejemplo, polinucleótido que codifica para un antígeno), composición que se puede usar para prevenir o tratar una enfermedad o condición en un sujeto. El término abarca de esta manera, tanto vacunas de sub-unidades , es decir, composiciones de vacuna que contienen antígenos que se separan y son discretas de un organismo completo con los cuales se asocia el antígeno en la naturaleza, así como composiciones que contienen bacterias completas, aniquiladas, atenuadas o inactivadas, virus, parásitos u otros microbios. El término "inmunización por ácido nucleico" se usa en la presente para referirse a la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica para uno o más antígenos seleccionados en una célula hospedera para la expresión in vivo del antígeno o antígenos. La molécula de ácido nucleico se puede introducir directamente en el sujeto receptor, tal como por inyección intramuscular o intradérmica normal; distribución transdérmica de partículas; inhalación; de forma tópica, por administración oral, intranasal o modos mucosos de administración. La molécula, de forma alternativa, se puede introducir ex vivo en células que se han removido de un sujeto. En este último caso, las células que contienen la molécula de ácido nucleico de interés se vuelven a introducir en el sujeto tal que se puede montar una respuesta inmune contra el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico usadas en estas inmunizaciones se refieren en general en la presente como "construcciones de ácido nucleico" . El término distribución "transdérmica" propone administración intradérmica (por ejemplo, en la dermis o epidermis), transdérmica (por ejemplo, "percutánea" ) o transmucosa, es decir, distribución por el paso de un agente en o a través de la piel o tejido mucoso (ver, por ejemplo, Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Karcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentáis and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); and Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987)). De esta manera, el término abarca distribución desde un dispositivo de distribución de partículas (por ejemplo, jeringas sin aguja) como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,630,796, así como distribución mediada por partículas como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5, 865, 796. Por "portador de núcleo" se quiere decir una partícula portadora en la cual se reviste un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) a fin de impartir un tamaño definido de partícula así como una densidad suficientemente alta para lograr el momento requerido para la penetración de la membrana celular, tal que el ácido nucleico se pueda distribuir usando técnicas de distribución mediadas por partículas, por ejemplo, aquellas descritas en la patente de los Estados Unidos No. 5,100,792. Los portadores de núcleo incluyen típicamente materiales tal como tungsteno, oro, platino, ferrita, polietileno y látex. Ver, por ejemplo, Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. ed. , Oxford University Press, New York, NY páginas 10-11. Por "jeringa sin aguja", se quiere decir un instrumento que distribuye una composición en partículas de forma transdérmica, sin una aguja convencional que perfore la piel. La jeringa sin aguja para el uso con la presente invención se analiza en la presente. Un "antígeno" se refiere a cualquier agente, en general una macromolécula , que pueda producir una respuesta inmune en un individuo. El término se puede usar para referirse a una macromolécula individual o a una población homogénea o heterogénea de macromoléculas antigénicas. Como se usa en la presente, "antígeno" se usa en general para referirse a una molécula de proteína o una porción de la misma que contiene uno o más epítopes. Para los propósitos de la presente invención, se pueden obtener antígenos o derivar de cualquier fuente apropiada. Además, para los propósitos de la presente invención, un "antígeno" incluye una proteína que tiene modificaciones, tal como supresiones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservadora) a la secuencia nativa, mientras que la proteína mantenga suficiente inmunogenicidad . Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo a través de la mutagénesis, dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de hospederas que producen los antígenos. La respuesta inmunológica producida por el antígeno puede ser una respuesta inmune específica al antígeno, celular, o una respuesta humoral de anticuerpos o ambas. El antígeno se puede derivar por ejemplo de cualquier virus conocido, bacteria, parásito, planta, protozoario u hongo. El término "antígeno" también incluye antígenos de tumor. El término también incluye auto-antígenos y también antígenos de alérgenos. De manera similar, un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antígeno, tal como en aplicaciones de inmunización por ADN, también se incluye en la definición de antígeno. También se incluyen antígenos sintéticos, por ejemplo, poli -epítopes , epítopes de flanqueo y otros antígenos recombinantes y sintéticamente derivados (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol 23:2772-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol . 157 :3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol . 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Génoeva , suiza, Junio 28-Julio 3, 1998) . Una "respuesta inmune" contra un antígeno de interés es el desarrollo en un individuo de una respuesta inmune humoral y/o celular a ese antígeno. Para propósitos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, en tanto que una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T y/o otras células sanguíneas blancas . El término "polipéptido" se usa en el sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más aminoácidos de sub-unidades , análogos de aminoácidos u otros peptidomiméticos . Las sub-unidades se pueden enlazar por enlaces peptídicos o por otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" se refiere a ya sea aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y tanto los isómeros ópticos D ó L y los análogos y peptidomiméticos de aminoácidos. Un péptido de tres o más aminoácidos se llama comúnmente un oligopéptido si la cadena peptídica es corta. Si es larga la cadena peptídica, el péptido se llama típicamente un polipéptido o una proteína. El término "patógeno" se usa en un sentido amplio para referirse a la fuente de cualquier molécula que produce una respuesta inmune. De esta manera, el patógeno se incluye de manera enunciativa y sin limitación, virus atenuados o virulentos, bacterias, hongos, protozoarios , parásitos, célula de cáncer y similares. Típicamente, la respuesta inmune se produce por uno o más péptidos producidos por estos patógenos. Como se describe en detalle posteriormente, el ácido nucleico que codifica para los péptidos antigénicos de estos y otros patógenos de usa para generar una respuesta inmune que imita la respuesta a la infección natural. También será evidente en vista de las enseñanzas en la presente, que los métodos incluyen en uso de ácidos nucleicos que codifican para antígenos obtenidos de más de un patógeno. Los términos "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan de forma indistinta para referirse a una forma polimérica de nucleotidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos , o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, exones, intrones, un cuadro de lectura abierto, ARN mensajero (ARNm) ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes , polinucleótidos ramificados, plásmidos, cósmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido está compuesto típicamente de una secuencia específica de cuatro bases de nucleótido: adenina (A) ; citosina (C) ; guanina (G) ; y tiamina (T) (uracilo (U) para timina (T) cuando el polinucleótido es ARN) . De esta manera, el término secuencia de polinucleótido es la representación alfabética de una molécula de polinucleótido. Esta representación alfabética se puede introducir en base de datos en una computadora que tiene una unidad central de procesamiento y se usa para aplicaciones de bioinformática tal como genómica funcional y búsqueda de homología . Una "construcción" es cualquier porción capaz de transferir secuencias de ácidos nucleicos a células objetivo (por ejemplo, vectores no virales, portadores en forma de partículas, liposomas y vectores virales) . Una construcción de "plásmido" es un elemento genético extra-cromosómico que es capaz de la auto- repl icación en una célula hospedera. Un "cósmido" es un tipo especial de construcción de plásmido que usa las secuencias eos de el bacteriófago lambda (?) . El término "extremos eos" o "sitios eos" se refiere a las extensiones complementarias de 12 pares de base, de hebra individual de ?-ADN. Los cósmidos pueden tener inserciones largas, por ejemplo de hasta aproximadamente 50 kb de tamaño, en tanto que los plásmidos típicos pueden tener inserciones por abajo de aproximadamente 10 kb de tamaño. Debido a su capacidad para tener fragmentos grandes, los cósmidos se usan para la construcción de bibliotecas genómicas y también para situaciones donde se necesitan inserciones grandes. Típicamente, "vector", "construcción", "vector de expresión" y "vector de transferencia génica" , significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir las secuencias génicas a las células objetivo. De esta manera, el término incluye vehículo de clonación y expresión, así como vectores virales. Una "biblioteca genómica" es una colección de moléculas recombinantes de ácido nucleico que conjuntamente representan el genoma completo, o casi completo de un organismo. En los casos donde la biblioteca tiene casi, pero no realmente, todo el genoma, puede comprender por ejemplo más de 95 %, 98 %, 99 % o aun 99.9 % de las secuencias en el genoma . Una "secuencia de codificación" o una secuencia que "codifique" para un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas (o "elementos de control") . Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio en el término 5' (amino) y un codón de paro de traducción en el término 3' (carboxi) . Una secuencia de codificación puede incluir, de manera enunciativa y sin limitación, ADNc de ARNm viral, procariótico o eucariótico, secuencias genómicas de ADN de ADN viral o procariótico, o aun secuencias sintéticas de ADN. Una secuencia de terminación de trascripción se puede localizar 3' a la secuencia de codificación. La trascripción y traducción de la secuencia de codificación se regulan típicamente por "elementos de control", que incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, promotores de trascripción, elementos intensificadores de trascripción, secuencia de Shine y Delagarno, señales de terminación de trascripción, secuencias de poliadenilacion (localizadas 3' al codón de paro de traducción) , secuencias para la optimización de la iniciación de traducción (localizada 5' a la secuencia de codificación) y secuencia de terminación de traducción. Una "unidad reguladora de expresión génica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende, como mínimo, un promotor. La unidad puede comprender adicionalmente otras secuencias que se necesitan o tienen influencia para la expresión de las secuencias de codificación enlazadas operablemente al promotor. Los elementos de la unidad no tienen que estar contiguos y pueden estar separados por secuencias de intervención. Los elementos a la unidad pueden influenciar la expresión de la secuencia de codificación al nivel de la trascripción, estabilidad de A N, procesamiento y/o traducción de ARN. Típicamente, la unidad no incluye las secuencias de codificación a las cuales está enlazada de forma operable. En algunos casos, una unidad reguladora de expresión génica puede comprender, consistir esencialmente de, un gen que se presenta de forma natural a parte de las secuencias de codificación del gen. Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la trascripción de un polinucleótido que codifica para el polipéptido. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos enlazada operablemente al promotor se induce por un analito, co-factor, proteína reguladora, etc.), promotores reprimibles (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido enlazada operablemente al promotor se reprime por un analito, co-factor, proteína reguladora, etc.), y promotores constitutivos. Se propone que el término "promotor" o "elemento de control" incluya todas las regiones promotoras de longitud completa y los segmentos funcionales (por ejemplo, que controle la trascripción o traducción) de estas regiones. Una "unidad endógena reguladora de expresión génica" se refiere a una unidad reguladora de expresión génica que se deriva del mismo organismo como algunas, o todas, de las secuencias de ácido nucleico que están presentes. De esta manera, una unidad endógena reguladora de expresión génica tendrá típicamente secuencias ya sea en la dirección 5' ó en la dirección 3' de la misma, o en ambas, que se deriven del mismo organismo como la unidad reguladora de expresión génica misma y que correspondan de manera preferente algunas o todas las secuencias que flanquean la unidad reguladora de expresión génica en el genoma de ese organismo. Típicamente, algunas o todas las secuencias de flanqueo derivadas del mismo organismo como la unidad reguladora de expresión génica pueden tener la misma posición con relación a la unidad reguladora de expresión génica que lo que lo tienen en el genoma del organismo y pueden estar inmediatamente en la dirección 5' y/o en la dirección 3' de la unidad reguladora de expresión génica. De esta manera, en el caso de las construcciones de ácido nucleico de la invención, la unidad endógena reguladora de expresión génica se originará típicamente de, y será parce de, las secuencias de ácido nucleico genómico viral presentes en la construcción. Una "secuencia heteróloga de codificación" es una secuencia de codificación enlazada operablemente a una unidad reguladora de expresión génica y en particular un promotor, con el cual no está asociado de forma natural. Típicamente, los dos se habrán de enlazar operablemente vía técnicas de ADN recombinante . La secuencia heteróloga de codificación puede originarse del mismo organismo como la unidad endógena reguladora de expresión génica a la cual está enlazada operablemente, o alternativamente, o puede ser de un organismo diferente al cual está enlazada la unidad reguladora de la expresión. La secuencia heteróloga de codificación puede por ejemplo ser cualquiera de las secuencias de codificación mencionadas en la presente y en particular puede codificar para un antígeno heterólogo . Una molécula de "polipéptido aislado" es una molécula de ácido nucleico separada y discreta del organismo completo con el cual se encuentra en la naturaleza la molécula; o una molécula de ácido nucleico desprovista, en totalidad o en parte, de las secuencias asociadas normalmente con la misma en la naturaleza; a una secuencia, como se usa en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas (como se" define posteriormente) en asociación con la misma. Una secuencia se "deriva u obtiene de" una molécula si tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de pares de base como una región de la molécula fuente, su ADNc, complementos de la misma, o si exhibe identidad de secuencia como se describe posteriormente. "Enlazado operablemente" se refiere a un arreglo de elementos en donde los componentes descritos de este modo se configuran para analizar su función usual. De esta manera, una unidad dada reguladora de expresión génica, y en particular un promotor, que se enlaza operablemente a una secuencia de codificación (por ejemplo, que codifica para un antígeno de interés) es capaz de efectuar la expresión de la secuencia de codificación cuando están presentes las enzimas apropiadas . El promotor u otros elementos de control no necesitan estar contiguos con la secuencia de codificación, en tanto que funcionen para dirigir la expresión de la misma. Por ejemplo, pueden estar presentes secuencias no traducidas de intervención, aun transcritas, entre la secuencia promotora y la secuencia de codificación y la secuencia promotora aun se puede considerar "operablemente enlazada" a la secuencia de codificación. "Recombinante" como se usa en la presente para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, semi-sintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una porción del polinucleótido con el cual está asociado en la naturaleza; y/o (2) se enlaza a un polinucleótido diferente del cual se enlaza en la naturaleza. Recombinante incluye tanto moléculas de ADN como de ARN que caen dentro de esta definición. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por la expresión de un polipéptido recombinante. Los homólogos de polinucleotidos se refieren en la presente. Típicamente, un polinucleótido que es homólogo a otro polinucleótido es al menos 70 % homólogo al polinucleótido, de manera preferente al menos 80 ó 90 % y de manera más preferente al menos 95 %, 97 %, o 99 % homólogo a este. Son bien conocidos en la técnica los métodos para medir la homología y se entenderá por aquellos expertos en la técnica que en el presente contexto, la homología se calcula en base a la identidad del ácido nucleico. Esta homología puede existir sobre una región de al menos 15, de manera preferente al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100 ó más nucleótidos contiguos. Los métodos para medir la homología o identidad de los polinucleotidos así como la homología o identidad de los polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIF que se puede usar para calcular la homología (por ejemplo, usado en sus ajustes por omisión) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395) . Los algoritmos PILEUP y BLAST también se pueden usar para calcular la homología o las secuencias de alineación (típicamente en sus ajustes por omisión) , por ejemplo como se describe en Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10. El programa para realizar el análisis BLAST está públicamente disponible a través del centro nacional de información biotecnológica (htt : //www. ncbi . nlm. nih . gov/ ) . Este algoritmo comprende identificar primero el par de secuencia de alta puntuación (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que ya sea corresponden o satisfacen alguna puntuación T de umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere como el umbral de puntuación de la palabra de cercanía (Altschul et al, supra) . Estos aciertos iniciales de la palabra de cercanía actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que se puede incrementar la puntuación acumulativa de alineación. Las extensiones de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación acumulativa de alineación va a cero o por abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo de BLAST determina la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como omisiones una longitud (W de palabra de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:10915-10919), alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=4 , y una comparación de ambas hebras . El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias, ver por ejemplo Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati, Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentará por oportunidad una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera una secuencia similar a otra secuencia si la probabilidad de suma es más pequeña en comparación de la primera secuencia a la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, de manera preferente menos de aproximadamente 0.1, de manera más preferente menos de aproximadamente 0.01," y de manera más preferente menos de aproximadamente 0.001. Los homólogos se hibridan típicamente, con el polinucleótido pertinente a un nivel significativamente por arriba del fondo. El nivel de señal generado por la interacción entre el homólogo y el polinucleótido es típicamente al menos 10 veces, de manera preferente al menos 100 veces, tan intenso como la "hibridación de fondo". Se puede medir la intensidad de interacción, por ejemplo, al radiomarcar la sonda, por ejemplo con 32P. Se logra típicamente la hibridación selectiva usando condiciones de severidad media a alta, (por ejemplo, cloruro de sodio 0.03M y citrato de sodio 0.003M de aproximadamente 50°C a aproximadamente 60 °C. Las condiciones de hibridación severa pueden incluir 50 % de formamida, Solución de Denhardt 5x SSC, SDS al 0.1 % y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y las condiciones de lavado pueden incluir SSC 2x, SDS al 0.1 % a 37°C seguido por SSC lx, SDS al 0.1 % a 68°C. La definición de las condiciones apropiadas de hibridación está dentro de la habilidad de la técnica. Ver, por ejemplo Sambrook et al., supra. El homólogo puede diferir de una secuencia en el polinucleótido pertinente por menos de 3, 5, 10, 15, 20 ó más mutaciones (cada uno de los cuales puede ser una sustitución, supresión o inserción) . Estas mutaciones se pueden medir sobre una región de al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100 ó más nucleótidos contiguos del homólogo. Donde un polinucleotido codifique para una polipéptido, las sustituciones crean de manera preferente cambios "conservadores" en el aminoácido codificado. Estos se definen de acuerdo a la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y de manera preferente en el mismo renglón en la tercera columna se pueden sustituir entre sí en cambios conservadores.

Como se usa en la presente, el término "adyuvante" se refiere a cualquier material que mejora la acción de un fármaco, antígeno, polinucleotido, vector o similar. Se propone, aunque no siempre se señala de forma explícita, que las moléculas que tienen actividad biológica similar como los adyuvantes pep ídicos tipo silvestre o purificados (por ejemplo, producidos de forma recombinante o muteínas de los mismos) y el ácido nucleico que codifica para estas moléculas se proponen que se usen dentro del espíritu y alcance de la invención. Como se usa en la presente, el término "tratamiento" incluye cualquiera de los siguientes: la prevención de la infección o re-infección; la reducción o eliminación de los síntomas; la reducción o eliminación completa de un patógeno; y la reducción, prevención, mejora o eliminación de una enfermedad o trastorno. Se puede efectuar el tratamiento de forma profiláctica (por ejemplo, antes de la infección) o de forma terapéutica (por ejemplo, después de la infección) . Los términos "individuo" y "sujeto" se usan de manera indistinta en la presente para referirse a cualquier miembro del subphylum chordata, que incluyen, sin limitación humanos, y otros primates, incluyendo primates no humanos tal como chimpancés y otras especies de monos y micos; animales de granja tal como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tal como perros y gatos; animales de veterinario incluyendo roedores tal como ratones, ratas y cobayos, aves, incluyendo domésticas, aves silvestres y de cacería tal como pollos, pavos y otros pájaros gallináceos, patos, gansos y similares. Los términos no denotan una edad particular. De esta manera, se propone que se cubran individuos tanto adultos como recién nacidos. Los métodos descritos en la presente se proponen para el uso en cualquiera de las especies vertebradas anteriores, puesto que los sistemas inmunitarios de todos estos vertebrados operan de forma similar.

Vista General de la Invención Antes de describir la invención en detalle, se va a entender que esta invención no se limita a formulaciones o parámetros de proceso, particulares, puesto que estos pueden variar por consiguiente. También se va a entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención únicamente y no se propone que sea limitante. La presente invención está relacionada con construcciones de ácido nucleico que permiten la expresión de múltiples antígenos desde la misma construcción y el uso de estas construcciones para la inmunización por ácidos nucleicos. La invención también proporciona métodos para la construcción de estas construcciones. Las construcciones comprenden ácido nucleico genómico viral y utilizan dos o más de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica presentes en el ácido nucleico genómico viral para expresar los polipéptidos heterólogos deseados. Las secuencias heterólogas de codificación que se van a expresar se insertan en las construcciones de modo que están enlazadas operablemente a las unidades endógenas reguladoras de expresión génica y en particular a los promotores endógenos de estas unidades. Las construcciones permiten la expresión eficiente de las secuencias heterólogas de codificación, y en particular genes que codifican para antígenos, en células hospederas. Las construcciones de cido nucleico de la presente invención comprende de forma típica, o en algunas modalidades consisten especialmente de, ácido nucleico genómico viral, éste ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden cada una un promotor endógeno donde los promotores endógenos de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo de vida viral del virus del cual se deriva el ácido nucleico genómico viral, donde : (a) al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores activos en la misma fase se enlazan cada una de manera operable a una secuencia heteróloga, separada de codificación insertada en el ácido nucleico genómico viral; y (b) el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo. Las ventajas de la presente invención incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, (i) alta estabilidad de construcción y poca interferencia entre los genes; (ii) proporcionar un arreglo de antígenos (por ejemplo, epítopes) en lugar de un antígeno único de modo que la construcción imite más cercanamente aquella de una infección natural, (iii) lograr la co-distribución de los antígenos en la misma célula para lograr la expresión coordinada de múltiples antígenos; (iv) producir una respuesta inmune similar a aquella producida por infección natural debido a la expresión de múltiples antígenos; (v) producir una respuesta inmune que es más protectora que aquella producida por infección natural, como por ejemplo, debido a que los antígenos elegidos no incluyen antígenos inmunodominantes o polipéptidos que inhiben las respuestas inmunes que pueden estar presentes en las vacunas virales completas; y (vi) activar el procesamiento de antígenos u las rutas de presentación que normalmente están comprendidas en la depuración de las infecciones intracelulares .

Unidades endógenas reguladoras de expresión génica El ácido nucleico genómico viral en una construcción de la invención comprende dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica. Cada unidad endógena reguladora de expresión génica comprenderá un promotor endógeno. Típicamente, sin embargo, la unidad comprenderá otras secuencias de nucleótidos. En particular, la unidad comprenderá secuencias de nucleótidos necesarias para, o que tienen influencia en, trascripción y/o traducción de las secuencias de codificación con las cuales se enlaza operablemente la unidad endógena reguladora de expresión génica. En muchas modalidades, una o más de las unidades comprenderán, o consistirán esencialmente de, un gen endógeno en el cual las secuencias de codificación asociadas naturalmente con el gen se han reemplazado con una secuencia heterologa de codificación. Cada unidad endógena reguladora de expresión génica puede comprender elementos esenciales para, o que tienen influencia en, la trascripción de las secuencias de codificación enlazadas operablemente a la unidad. Estas pueden incluir una secuencia intensificadora u otra secuencia que modula la expresión de las secuencias de codificación operablemente enlazadas. Las secuencias que modulan la conformación y/o accesibilidad de las secuencias de codificación y/o otras secuencias pueden estar presentes en la unidad. En una modalidad preferida, también puede estar presente la secuencia endógena de terminación trascripcional . Como mínimo, la unidad endógena reguladora de expresión génica " 'comprenderá un promotor endógeno. Típicamente, esto será el promotor endógeno completo, es decir, las secuencias endógenas necesarias para lograr la expresión normal de las secuencias de codificación que el promotor endógeno está enlazado operablemente de forma natural y/o la misma especificidad y nivel de expresión de las secuencias heterólogas de codificación a la cual se enlazará de forma operable la unidad en la construcción de la invención. En algunas modalidades, el promotor puede tener algunas modificaciones de secuencia hechas al mismo. Por ejemplo, se pueden haber introducido sustituciones, inserciones o supresiones de bases tal como por ejemplo, ninguna, dos, cinco, diez o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de base. En otra modalidad, se pueden haber introducido modificaciones más grandes. Por ejemplo, se pueden haber introducido supresiones de dos a cinco, de cinco a diez, de diez a veinte o más bases. En algunos casos, el promotor se puede haber truncado a las secuencias mínimas necesarias para lograr la expresión de las secuencias de codificación al cual esta enlazado operablemente aunque típicamente esto no será el caso. En algunas modalidades, se retendrán las secuencias endógenas entre el promotor y el sitio de inicio trascripcional . Las unidades endógenas reguladoras de expresión génica también pueden comprender secuencias que están comprendidas en, o tienen influencia en, la traducción. Las secuencias transcritas, no traducidas asociadas con el gen endógeno del cual se deriva la unidad pueden estar presentes en la unidad. Para algunas, o todas, de las regiones 5' y/o 3' traducidas de la unidad se pueden retener. En regiones particulares que tienen influencia en la trascripción, se puede retener el procesamiento y/o estabilidad. También se puede retener el codón de inicio de Shine y Dalgarno y/o el codón de paro. Las secuencias que tienen influencia en la conformación de trascripción se puedan retener en la unidad y en particular donde estas tienen influencia en el nivel de expresión de las secuencias de codificación enlazadas de manera operable a la unidad. La unidad endógena reguladora de expresión génica no tiene que comprender todas las secuencias de no codificación del gen endógeno del cual se deriva, aunque lo pueda hacer. Puede comprender el promotor endógeno y opcionalmente cualquier otra región del gen endógeno a parte de las secuencias de codificación. Puede comprender el promotor endógeno en combinación con uno o más de los elementos génicos endógenos mencionados en la presente. La unidad endógena reguladora de expresión génica puede comprender secuencias que están espacialmente separadas en el gen endógeno.

Algunas de las secuencias en las regiones de no codificación del gen endógeno pueden estar ausentes de la unidad, tal como secuencias que no juegan un papel en, o no tienen influencia en, la trascripción y/o traducción. En algunos casos, se pueden usar elementos reguladores asociados de forma natural con la secuencia heteróloga de codificación en lugar de sus contrapartes del gen endógeno del cual se deriva la unidad reguladora de expresión génica. Por ejemplo, las regiones ' 5' ó 3' no traducidas del trascripto pueden ser aquellas naturalmente asociadas con las secuencias heterólogas de codificación. Los intrones pueden originarse de la misma fuente como las secuencias heterólogas de codificación. En algunos casos, se pueden emplear regiones reguladoras de las fuentes heterólogas diferentes al origen de las secuencias heterólogas de codificación, Las unidades endógenas reguladoras de expresión génica pueden originarse de cualquier gen viral adecuado y en particular de cualquier gen viral mencionado en la presente. El ácido nucleico genómico viral en una construcción de la invención comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica y puede comprender por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco o más unidades endógenas reguladoras de expresión génica. Al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica comprenden un promotor endógeno expresado en la misma fase en el ciclo de vida viral del virus del cual se origina el ácido nucleico genómico viral y de manera preferente tres, cuatro, cinco ó más de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica comprenden estos promotores expresados en la misma fase en el ciclo de vida viral. En algunas modalidades, todos los promotores endógenos de las unidades se pueden expresar en la misma fase. Al menos dos de los promotores endógenos expresados en la misma fase en el ciclo de vida viral se enlazarán individualmente de forma operable a una secuencia eteróloga de codificación y de manera preferente se pueden enlazar de este modo operablemente tres, cuatro, cinco o más de los promotores a las secuencias heterologas de codificación. En algunas modalidades, todos los promotores endógenos de las unidades se pueden enlazar de manera separada a secuencias heterologas de codificación. Las unidades endógenas reguladoras de expresión génica tendrán típicamente los mismos orígenes y serán parte del ácido nucleico genómico viral en el cual están presentes. De esta manera, de manera preferente, el ácido nucleico genómico viral se obtendrá del genoma viral como un fragmento único y entonces se modificará de forma subsiguiente para introducir las secuencias heterologas de codificación y hacer otras modificaciones si así se desea.

Aunque esto es la ruta preferida para la generación de construcciones de la invención, también se abarcan por la invención otras rutas que logran el mismo resultado final, tal como la obtención de ácido nucleico genómico viral como varios fragmentos y al ensamblarlos paso a paso con secuencia adicional que se inserta al mismo tiempo, o posterior, en un vector apropiado. En muchas modalidades, las unidades endógenas reguladoras de expresión génica y en particular el promotor endógeno de la unidad puede tener las mismas secuencias en la dirección 5' y/o en la dirección 3' de la misma que lo que tienen en el genoma viral. En particular, las unidades endógenas reguladoras de expresión génica pueden tener algunas o todas de las mismas secuencias en la dirección 5' que lo que tienen en el genoma viral, dentro de los límites del ácido nucleico genómico viral en la construcción. En algunas modalidades algunas, o todas las secuencias en la dirección 3' de la secuencia heteróloga de codificación de la unidad, y en particular el promotor endógeno, se enlaza operablemente que puede ser equivalente a aquellas en la dirección 3' de la secuencia de codificación de la unidad, y en particular el promotor endógeno, con el cual esta naturalmente asociado. Los elementos endógenos en la dirección 3' presentes en la unidad pueden incluir elementos que se incluyen en el trascripto del promotor endógeno tal como por ejemplo aquéllos comprendidos con la determinación de la estabilidad del trascripto. Las secuencias endógenas en la dirección 3' presentes pueden comprender un elemento de terminación de trascripción y/o una señal de poliadenilación. Las secuencias en la dirección 5' y/o en la dirección 3' de las secuencias heterólogas de codificación o en secuencias intrónicas dentro de las secuencias de codificación pueden incluir elementos intensificadores endógenos. Las secuencias en la dirección 5' presentes pueden incluir la secuencia endógena de Shine y Dalgarno. En algunas modalidades, la totalidad del gen endógeno, del cual se deriva la unidad endógena reguladora de la expresión génica, se retiene la construcción a parte de las secuencias de codificación. Además, también se pueden retener cualesquiera secuencias que afecten la expresión del promotor endógeno de la unidad, tal como un intensificador . En algunas modalidades, las secuencias de más de 100 pares de base, de manera preferente de más de 500 pb, de manera más preferente de más de 1 kb y aun de manera más preferente de más de 2 kb en la dirección 5' de la unidad y en particular del promotor, y en la dirección 3' de la secuencia heteróloga de codificación pueden ser homologas o idénticas a aquellas en la dirección 5' y/o en la dirección 3' de la unidad, y en particular el promotor endógeno y su secuencia de codificación en el genoma viral. La región de identidad de secuencia en al dirección 3' y/o en la dirección 5' a aquellas en el genoma viral pueden extenderse a la siguiente unidad endógena reguladora de expresión génica enlazada operablemente a las secuencias heterólogas de codificación y/o a las siguientes secuencias heterólogas de codificación. En algunas modalidades, puede haber supresiones presentes en el ácido nucleico genómico viral en la construcción en la dirección 5' y/o en la dirección 3' de la unidad endógena reguladora de expresión génica y la secuencia heterologa de codificación lo que significa que la secuencias en la dirección 5' y en la dirección 3' que son equivalentes a algunas de aquellas encontradas en la dirección 5' y/o en la dirección 3' en el genoma viral se puede mover, en efecto más cerca a la unidad endógena reguladora de expresión génica en la construcción. Los promotores endógenos, los cuales se enlazan operablemente las secuencias heterólogas de codificación, se expresarán de manera preferente en la misma fase y típicamente a un tiempo similar o el mismo, en el ciclo viral del virus del cual se deriva el ácido nucleico genómico viral. Típicamente, los ciclos de vida viral se dividen en fases, cada una de las cuales puede comprender la expresión de un subcon unto particular de genes, los genes que se clasifican en cuanto a que fase se expresan. Por ejemplo, un ciclo de vida viral puede comprender la expresión génica inmediata temprana y tardía o la expresión génica durante un periodo de latencia. De esta manera, en muchas modalidades, los promotores endógenos de las unidades reguladoras de expresión génica estarán aquellos de genes virales de las mismas o adyacentes fases en el ciclo de vida viral y de manera preferente la misma fase. De esta manera, pueden ser promotores inmediatamente tempranos, tardíos o asociados a la latencia. Típicamente, en alguna etapa en el ciclo de vida viral, los promotores endógenos serán ambos/todos los que se expresan es decir habrá un traslape o cuando los promotores den la trascripción. De manera preferente, el tiempo en el cual inicia la trascripción y/o cesa de los promotores endógenos enlazados a las secuencias heterólogas de codificación se presentará en un punto de tiempo similar o idéntico. En algunos casos, los promotores elegidos pueden ser expresados ambos en la misma fase de la expresión génica viral tal como por ejemplo la fase inmediata temprana, pero no habrá un traslape real en los promotores que se expresan en lugar todos los promotores se expresarán secuencialmente en la misma fase. En algunas modalidades de la invención, los promotores inmediatos tempranos se pueden elegir para expresar las secuencias heterólogas de codificación. Esto puede ser en particular el caso donde se requieran proteínas virales para la expresión de promotores de etapas tardías en el ciclo de vida viral. De manera preferente, los promotores elegidos no requerirán proteínas virales para la expresión. En otras modalidades, los promotores se pueden elegir para imitar una etapa particular en el ciclo de vida viral. De esta manera, al usar promotores génicos inmediatos tempranos, puede ser posible imitar la situación donde un virus, tal como por ejemplo HSV, emerge de un periodo de latencia . Los ejemplos de conjuntos preferidos de promotores endógenos incluyen: (i) Al menos dos de los genes ICPO, 4, 22 y 27 de HSV y en particular: ICPO y 4; ICP4 y 22; ICP22 y 27; ICP 0,4 y 22; ICP 4,22 y 27; o ICP 0,4,22 y 27. (ii) Al menos dos de los promotores de tegumento de HSV y en particular dos de UL48, 49 y 50, en la cual: UL48 y UL49; UL49 y 50; o UL48,49 y 50. (iii) Al menos dos de: UL83 y UL84; UL122 y UL123; o UL36, 37 y 38 de citomegalovirus y en particular citomegalovirus humano tal como UL36 y 37; o UL37 y 38. En muchos casos, los genes virales que se expresan en una etapa similar en el ciclo de vida viral están adyacentes entre sí " sin genes de intervención entre los mismos. En muchas modalidades, las unidades endógenas reguladoras de expresión génica elegidas por lo tanto serán aquellas que se originan de genes adyacentes o cercanamente enlazados en el genoma viral del cual se derivan. De esta manera, las unidades endógenas reguladoras de expresión génica elegidas para accionar la expresión de la secuencias heterólogas de codificación pueden ser aquellas derivadas de dos, tres, cuatro o más genes consecutivos en el genoma viral, aunque en algunas modalidades, puede haber genes de intervención, tal como uno, dos o tres o más por ejemplo entre dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión, elegidas. Algunos virus contienen secuencias repetidas dentro de su genoma. Por ejemplo, el HSV tiene dos conjuntos de estas representaciones. En muchas modalidades de la invención, el ácido nucleico genómico viral presente en la construcción no comprenderá una secuencia repetida y en particular no comprenderá múltiples copias del mismo gen, unidad o promotor. De manera preferente, la construcción no comprenderá repeticiones invertidas en el ácido nucleico genómico viral y en particular no comprenderá repeticiones invertidas de genes, promotores y/o unidades o repeticiones invertidas de dos promotores, genes o unidades homologas. De manera preferente, las secuencia heterólogas de codificación enlazadas operablemente a los promotores endógenos no tendrán ninguno de los elementos promotores con los cuales están enlazados operablemente de forma natural . De esta manera, el promotor responsable de su expresión será el promotor viral endógeno de la unidad endógena reguladora de expresión génica y no se inserta, por ejemplo, con las secuencias heterólogas de codificación. Sin embargo, en algunas modalidades, algunas o todos los elementos promotores enlazados de forma natural a las secuencias heterólogas de codificación se pueden introducir en la dirección 5' del promotor endógeno o en la dirección 3' del mismo, pero en la dirección 5' del punto de inicio de trascripción. En estas modalidades, típicamente, el promotor desde luego estará en la dirección 3' de un endógeno. Típicamente, las secuencias heterólogas de codificación se insertarán en lugar de la secuencia de codificación con las cuales esta asociado de forma natural el promotor. De esta manera, la secuencia de codificación enlazado de forma natural al promotor endógeno se suprimirán típicamente y desplazarán con la secuencia heteróloga de codificación. En algunas modalidades, los primeros pocos codones de las secuencias naturales de codificación pueden permanecer y ser fusionados a las secuencias heterólogas de codificación. Cualquier arreglo que conduzca la expresión del polipéptido codificado ver las secuencias heterólogas se puede usar. En una modalidad, las secuencias de codificación asociadas de forma natural con el promotor pueden permanecer con las secuencias heterólogas de codificación en la dirección 3' de las mismas con una secuencia interna de entrada de ribosoma (IRES) para asegurar la traducción. En algunas modalidades, las construcciones pueden comprender dos o más conjuntos de unidades endógenas reguladoras de expresión génica enlazadas operablemente a las secuencias heterólogas de codificación. Cada conjunto de unidades reguladoras reexpresión génica comprenderá de forma operable al menos dos promotores expresados en la misma fase en el ciclo de vida del virus que el ácido nucleico genómico viral de la construcción de la cual se deriva. Los diferentes conjuntos de unidades darán la expresión en diferentes momentos. Esto permitirá la expresión de antígenos particulares en diferentes momentos.

Antígenos Las secuencias heterólogas de codificación presentes en la codificación de la invención codificarán típicamente para antígenos. Los métodos y construcciones descritos en la presente son útiles en la producción de una respuesta inmune contra una amplia variedad de células, tejidas y patógenos humanos y de animales. Estos patógenos comprenden uno o más antígenos. Los polipéptidos heterólogos expresados con una construcción de la invención pueden ser uno o más de cualquiera de estos antígenos. Los ejemplos no limitantes de fuentes para antígenos que se van a expresar por las construcciones de la invención incluyen virus, células bacterianas, células fúngales, parásitos y otros organismos patógenos. En muchas modalidades, los antígenos se derivarán de un agente infeccioso que provoca enfermedad. Los antígenos codificados por las secuencias heterólogas de codificación en las construcciones de la invención pueden originarse del mismo organismo como el ácido nucleico genómico viral de la construcción o de un organismo diferente. Se pueden originar todos del mismo organismo o de dos o más, o todos, ellos pueden originarse de diferentes organismos. Los antígenos pueden originarse de varios organismos cercanamente relacionados. De esta manera, por ejemplo, pueden originarse de varias cepas del mismo patógeno, la finalidad que es inmunizar a un sujeto de modo que se pueda generar una respuesta protectora contra cada una las cepas de la cual se originan los antígenos. Pueden codificar para el antígeno equivalente de cada cepa. Típicamente, las secuencias heterólogas de codificación codificarán para diferentes antígenos aunque en algunas modalidades dos o más, o aun todas las secuencias heterólogas de codificación pueden codificar para el mismo antígeno a fin de obtener un mayor nivel de expresión del antígeno. Los antígenos expresados por la construcción pueden presentarse en ubicaciones similares en el patógeno y/o tener funciones similares, por ejemplo, se pueden expresar en la superficie del patógeno o de manera alternativa pueden ser antígenos que no se exponen en la superficie del patógeno tal como antígenos intracelulares . Los antígenos pueden ser todos proteínas de cubierta viral, glicoproteínas u otras proteínas expresadas en la superficie de un virus. En algunas modalidades, una construcción puede expresar tanto un antígeno de superficie tanto un antígeno no de superficie. En algunas modalidades, el antígeno será parte de una proteína de fusión expresada del promotor endógeno. De esta manera, las secuencias antigénicas se pueden fusionar aquellas expresadas normalmente por el promotor endógeno de la unidad reguladora de expresión génica. De manera alternativa el promotor endógeno puede accionar la expresión de una proteína de fusión que comprende, o en algunas modalidades que consiste esencialmente de, varios antígenos o epítopes diferentes. La proteína de fusión puede comprender cualquier combinación de dos o más de los antígenos analizados en la presente. Además de las secuencias que codifican para el antígeno, las secuencias heterólogas de codificación insertadas también pueden incluir secuencias 'para seleccionar como objetivo los antígenos al sitio apropiado. También pueden incluir sitios de escisión para proteasas específicas para permitir la liberación de antígenos específicos o secuencias de la fusión. Algunas modalidades de la invención, los antígenos serán principalmente, o todos serán aquellos que den principalmente una respuesta celular u humoral de modo que la respuesta sea principalmente o casi completamente celular o humoral. De esta manera, los antígenos pueden no estar presentes en la superficie del patógeno, por ejemplo, pueden no ser gl icoproteínas , en un esfuerzo para generar una respuesta mediada por células principalmente en lugar de una humoral. En algunas modalidades, puede ser cierto lo contrario. En algunas modalidades, los antígenos se pueden elegir para producir específicamente tanto una respuesta celular como humoral. Los antígenos virales adecuados incluyen de manera enunciativa y sin limitación, aquellos obtenidos o derivados de familias de virus de hepatitis, incluyendo virus de hepatitis A (HAV) , virus (HAV) , virus de hepatitis B (HBV) , virus de hepatitis C (HCV) , virus de delta-hepatitis (HDV) , virus de hepatitis E (HEV) y virus de hepatitis G (HGV) . Ver por ejemplo, WO 89/04669; O 90/11089; y WO 90/14436. El genoma de HCV codifica para varias proteínas virales, incluyendo El y E2. Ver, por ejemplo, Houghton et al. (1991) Hepatology 14:381-388. De manera similar, la secuencia de codificación para el d-antígeno de HDV se conoce (ver por ejemplo (Patente de los Estados Unidos No. 5,378,814). De igual manera, se puede usar una amplia variedad de proteínas de la familia de herpes virus en la presente invención, incluyendo proteínas derivadas del virus de herpes simple (HSV) tipos 1 y 2 tal como las glicoproteínas gB, gD y gH de HSV-1 y HSV-2; aníigenos del virus de varicela- zoster (VZV) , vitus de Epstein-Barr (EBV) y citomegalovirus (CMV) incluyendo gB y gH de CMV; u antígenos de otros hipervirus humanos tal como HHV6 y HHV7. (Ver, por ejemplo Chee et al. (1990) Cytomegaloviruses (J.K. McDougall, ed. , Springer-Verlag, pp. 125-169; McGeoch et al. (1988) J. Gen. Virol. 69:1531-1574; U.S. Patent No. ,171,568; Baer et al. (1984) Nature 310:207-211; and Davison et al. (1986) J. Gen. Virol. 67:1759-1816.) Los antígenos del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , tal como las moléculas gpl20 para una multitud de productos aislados de HIV-1 y HIV-2, incluyendo miembros de varios subtipos genéticos de HIV, se conocen y se han reportado (ver, por ejemplo Myers et al., Los Alamos Datábase, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New México (1992); and Modrow et al. (1987) J. Virol. 61:570-578) y las secuencias de codificación del antígeno derivados u obtenidas de cualquiera de estos productos aislados encontrará uso en la presente invención. Además, otras proteínas inmunogénicas derivadas u obtenidas de cualquiera de los varios productos aislados de HIV pueden ser un antígeno expresado por una construcción de la invención, incluyendo una o más de las varias proteínas de envoltura o fragmentos de las mismas tal como gpl60 y gp4l, antígenos gag, tal como p24gag y p55gag, así como proteínas derivadas de las regiones poi, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu y LTR de HIV. Los antígenos derivados u obtenidos de otros virus también encontrarán uso en la presente, tal como sin limitación, antígenos de miembros de las familias Picornaviridae (por ejemplo, poliovirus, rinovirus, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, virus de rubéola, virus de dengue, etc.); Flaviviridae ; Coronaviridae ; Reoviridae (por ejemplo, rotavirus, etc.); Birnaviridae ; Rhabodoviridae (por ejemplo, virus de rabia, etc.); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de influenza tipo A, B y C, etc.); Filoviridae ; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de paperas, virus de sarampión, virus sincitial respiratorio, virus de parainfluenza, etc.); Bunyaviridae ; Arenaviridae ; Retroviradae (por ejemplo, HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (también conocido como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), incluyendo de manera enunciativa y sin limitación a antígenos de los productos aislados y HIVHI( HIVSF2, HIV^v; HIVLAI, HIVLM, HIVMN) ; HIV-1CM235 , HIV-lus4; HIV-2, entre otros; virus de inmunodeficiencia de simio (SIV) ; papilomavirus , el virus de encefalitis de garrapata; y similares. Ver, por ejemplo Virology, 3rd Edition (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds . 1991) , para una descripción de estos y otros virus . En algunos contextos, puede ser preferible que los antígenos seleccionados sean antígenos virales obtenidos o derivados de un patógeno viral que entre típicamente al cuerpo vía una superficie mucosa y se conozca y provoque que este asociado con una enfermedad humana, tal como de manera enunciativa y sin limitación, HIV (SIDA) , virus de influenza (Flu) , virus de herpes simple (infección genital, úlceras frías, STDs) , rotavirus (diarrea), virus de parainfluenza (infecciones respiratorias), poliovirus (poliomelitis) , virus sincitial respiratorio (infecciones respiratorias) , virus de paperas y sarampión (sarampión, paperas) , virus de rubéola (rubéola) , y rinovirus (resfriado común) . Los antígenos bacterianos y parásitos que se pueden codificar por las secuencias heterólogas de codificación de las construcciones de la invención incluyen aquellos obtenidos o derivados de agentes causantes conocidos responsables de enfermedades que incluyen de manera enunciativa y" sin limitación, Difteria, Tos ferina, Tétanos, Tuberculosis, Pneumonía Bacteriana o Fungal , Otitis Media, Gonnorea, Colera, Tifoidea, Meningitis, Mononucleosis , Peste, Shigelosis o Salmonelosis , Enfermedad de Legionario, Enfermedad de Lyroe, Lepra, Malaria, Anquilostoma, Oncocerciasis , Esquistosomiasis , Tripamasomialsis , Lesmaniasis, Giardia, Amibiasis, Filariasis, Borelia, y Triquinosis. Se pueden obtener aun antígenos adicionales o derivar de virus no convencionales tal como priones que incluyen los agentes causantes de la enfermedad de kuru, Creutzfeldt-Jakob (CJD) , rasguños, encefalopatía de visón, transmitible y enfermedades crónicas de debilitamiento, o de, los priones que están asociados con enfermedad de las vacas locas. También pueden ser, o están derivados de los priones responsables de insomnio fatal familiar. En las enfermedades de priones, donde pueda ver una forma conformacional particular de la proteína prión asociada con la enfermedad así como una forma conformacional normal, de manera preferente el antígeno deseado por la construcción será tal que se formule solo una respuesta contra la forma conformacional asociada con la enfermedad de la proteína prión y no la forma normal de la proteína. Los patógenos específicos de las cuales se puedan derivar los antígenos pueden incluir M tuberculosis, Chla ydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio Cholera, Treponema pallidua, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Franciscella tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospria interrogaus, Legionella pneu ophila , Yersinia pestis, Streptococos (tipos A y B) , Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (tipo b) , Toxoplasma gondic, Complylobacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis, y Actinomycosis; patógenos fúngales que incluyen Candidiasis y Aspergillosis; patógenos parásitos que incluyen Tenias, Gusanos, Asceribes, amibiasis, Giardiasis, Criptosporidio, Esquistosoma , Pneumocistis carinii, Tricomoniasis y Triquinosis. De esta manera, la presente invención también se puede usar para proporcionar una respuesta inmune adecuada contrael numeras enfermedades veterinarias tal como enfermedades de patas y vaca, Coronavirus, Pasteurella multocida, Helicobacter, Strongylus vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia, virus de diarrea viral (BVDV) , Klebsiella pneumoniae, E. coli, Bordetella Bovine pertussis, Bordetella parapertussis y brochiséptica . En algunas modalidades, una o más, o de manera preferente todos los antígenos expresados por la construcción de la invención serán antígenos de tumor. De manera preferente, estos antígenos serán específicos a tumores y no se asociarán por otros tipos de células o al menos otros tipos de células del sujeto. Estos antígenos se pueden derivar de tumores malignos y en particular de tumores metastáticos . En algunos casos, se habrán aislado específicamente del sujeto que se va a tratar o hecho corresponder a los antígenos específicos de tumor expresados por el tumor del sujeto. En otras modalidades, el antígeno puede ser un autoantígeno y en particular un autoantígeno implicado en o responsable de una enfermedad o trastorno autoinmunitario . De manera alternativa, el antígeno puede ser, o ser derivado de, un alérgeno.

Adyuvantes En algunas modalidades, la presente invención se puede usar en forma efectiva con cualquier adyuvante adecuado o combinación de adyuvantes. Por ejemplo, los adyuvantes adecuados incluyen sin limitación adyuvantes formados cristales de aluminio (alum)-, tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de aluminio, etc; formulaciones de emulsión de aceite en agua y de agua en aceite tal como sus Adyuvantes Completos de Freunds (CFA) y el Adyuvante Completo de Freunds (IFA) ; adyuvantes formados de los componentes de la pared celular bacteriana tal como adyuvantes que incluyen lipopolisacáridos (por ejemplo, lípido A ó monofosforil-lípido A (MPL) , Imoto et al. (1985) Tet. Lett. 26:1545-1548), dimicolato de trehalosa (TDM) , y esqueleto de pared celular (CWS) ; proteínas de choque térmico derivados de las mismas, adyuvantes derivados de toxinas bacterianas de ADP-ribosilación, incluyendo la toxina de difteria (DT) , la toxina de tos ferina (DT) , toxina de cólera (CT) toxinas lábiles al calor de E. coli (LT1 y LT2), endotoxina A de Pseudomonas, exotoxina S, B de Pseudomonas, exoenzima de B. cerreus, toxina de B. esfaericus toxina C2 and C3 de C. ¿otulinum, exoenzima de C. limosu , así como toxinas de C. perfringens, C. spiriforma y C. difficile, EDIN de Stafilococcus aureus, y mutantes de toxina bacteriana de ADP-ribosilación tal como CRM197 un mutante de toxina de difteria no tóxico (ver, por ejemplo, Bixler et al. (1989) Adv. Exp. Med. Biol . 251:175; y Constantino et al. (1992) Vaccine) ; adyuvantes de saponina tal como Quil A (Patente de los Estados Unidos No. 5,057,540), o partículas generadas de saponinas tal como ISCOM (complejos de inmunoestimulación) ; quimiocinas y citocinas tal como las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, interferon-gama) , factor de estimulación de colonia de macrófagos (MCSF) , factor de necrosis de tumor (TNF) , defensinas 1 ó 2, RANTES, Tl-a y MT-2, etc; péptidos de muramilo tal como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil -normuramil -L-alanil -D-isoglutamina (nor-MDP) , N-acetilmuramil -L-alanil -D-isoglutaminil-L-alanina-2 - (1 ' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3 huidroxifosforiloxi) -etilamina ( TP-PE) etc.; adyuvantes derivados de la familia CpG de moléculas, dinucleótidos de CpG y oligonucleotidos sintéticos que comprenden porcionesa de CpG (ver por ejemplo, Krieg et al. Nature (1995) 374:546, edzhitov et al. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:4-9, y Davis et al. J. Immunol. (1998) 160:870-876) tal como TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID NO: 1) y ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC (SEQ ID NO: 2); y adyuvantes sintéticos tal como PCPP (Poli [di (carboxilatofenoxi) fosfazeno) (Payne et al. Vaccines (1998) 16:92-98) . Estos adyuvantes están comercialmente disponibles de varios distribuidores tal como Accurate Chemicals c; Ribi Immunechemicals , Hamilton, MT; GIBCO; Sigma, St . Louis, O . Un adyuvante preferido para el uso en la presente invención es imiquimod. El imiquimod es 1- (2-metil-propil) -lH-imidazo [4 , 5-c] quinolin-4 -amina . Tiene la fórmula molecular de Ci4H16N4 y un peso molecular de 240.3. El imiquimod tiene la siguiente estructura: ro adyuvante preferido es resiquimod El resiquimod es 4-amino-2-etoximetil-alfa, alfa-dimetil-lH-imidazo [4 , 5-c] quinolina- 1 -etanol . (R-848; S-28463) . Se pueden usar derivados adecuados de imiquimod y resiquimod . El adyuvante puede distribuirse de forma individual o ser distribuido en una combinación de dos o más adyuvantes. A este respecto, los adyuvantes combinados pueden tener un aditivo o un efecto sinérgico en la promoción de una respuesta inmmunitaria . Un efecto sinérgico es uno donde el resultado logrado al combinar dos o más adyuvantes es mayor que el esperado que al adicionar solo el resultado logrado con cada adyuvante cuando se administran de forma individual. El adyuvante se puede expresar de una construcción de ácido nucleico administrada al sujeto. El adyuvante se puede codificar por la construcción de la invención o por una construcción separada. Las construcciones de la invención por lo tanto pueden incluir una región que codifique para un 'adyuvante, enlazada operablemente a elementos reguladores que permitan la expresión del adyuvante en el sujeto. En modalidades donde el adyuvante se codifica por un ácido nucleico, se puede emplear cualquier unidad reguladora de expresión génica adecuada para expresar el adyuvante. Los promotores que dan una expresión constitutiva de alto nivel del adyuvante se pueden emplear. De manera alternativa, se pueden emplear unidades reguladoras de expresión génica, idénticas o similares a aquellas usadas para expresar el antígeno. En modalidades donde el adyuvante se codifica en una construcción separada de la construcción de ácido nucleico de la invención, la construcción que codifica para el adyuvante se administrará de manera preferente con, al mismo tiempo, como o en secuencia con la construcción de la invención. Típicamente, los dos se administrarán como una composición individual. Por ejemplo, las dos construcciones se pueden revestir en las mismas partículas o de manera alternativa en partículas separadas y luego mezclar. Las composiciones que comprenden estas partículas o mezclas de partículas se proporcionan per la invención. En modalidades donde el adyuvante se codifica por un ácido nucleico que se va a administrar al sujeto, los ejemplos de adyuvantes preferidos incluyen cualquier adyuvante de polipéptido mencionado en la presente y en particular PT, CT, LT y DT.

Preparación de ácido nucleico genómico viral Típicamente, el ácido nucleico genómico viral para el uso en la invención se obtendrá de una biblioteca genómica del virus particular elegido. También se pueden emplear otros métodos tal como amplificación por PCR de la región elegida del genoma viral ya sea como varios fragmentos o como un fragmento único o al combinar la región de los clones existentes de una sub-región del genoma viral. Las bibliotecas genómicas virales se pueden producir por cualquier método conocido en la técnica. En muchas modalidades de la invención, el ácido nucleico genómico viral en la construcción de la invención puede ser un fragmento de una biblioteca genómica o se puede derivar de este fragmento. Se pueden usar una variedad de fuentes para el ADN genómico. El ADN genómico puede estar comercialmente disponible, por ejemplo de fuentes tal como Advanced Biotechnologies Inc (ABI) y Clonetech, Inc. Otra fuente normal es ADN genómico directamente aislado del virus elegido . El ácido nucleico genómico viral usado en una construcción de la invención, y también la construcción misma, puede ser ácido nucleico de doble hebra o de hebra individual y puede ser ARN o ADN. En modalidades de la invención, donde se usa un virus de ARN, el ARN se puede convertir primero a ADN y luego manipular en esa forma antes de que la construcción de ARN se genere entonces del ADN. El ADN genómico de la fuente seleccionada se puede aislar por procedimientos normales, que incluyen típicamente extracciones sucesivas con fenol y fenol/cloroformo seguido por purificación con etanol . Después de la precipitación, el ADN de un virus de interés se puede tratar con una endonucleasa de restricción. La digestión con la endonucleasa de restricción puede ser deliberadamente parcial a fin de lograr fragmentos más largos. De manera alternativa, el ADN genómico se puede digerir hasta el término. La enzima de restricción empleada de puede regir en base a la frecuencia promedio con la cual corta el ADN de modo que una porción grande de los fragmentos en la digestión resultante esté dentro de un cierto intervalo deseado de tamaños. Los fragmentos' de ADN de un tamaño seleccionado se pueden separar por varias técnicas que incluyen electrofóresis en gel de agarosa o poliacrilamida, electrofóresis en gel con campo de impulsos (Carie et al. (1984) Nuc. Acid Res. 12:5647-5664; Chu et al. (1986) Science 234:1582; Smith et al. (1987) Methods in Enzymology 151:461), para proporcionar un material de inicio de tamaño apropiado para la clonación.

Los fragmentos genómicos de pueden hacer de extremos romos y clonar en un vector similarmente de extremos romos o pueden tener salientes particulares de hebra individual de la escisión con enzimas de restricción y por lo tanto se pueden clonar en un vector que se ha preparado para dar salientes compatibles. Los fragmentos escindidos por restricción pueden ser de extremos romos, si se desea, al tratar con el fragmento grande de polimerasa I de ADN de E. coli (Klenow) en la presencia de los cuatro desoxinucleótido-trifosfatos (d TP) usando técnicas normales. El fragmento Klenow llena en los salientes 5' de hebra individual, pero digiere las hebras individuales 3' salientes, aunque estén presentes los cuatro dNTP. Si se desea, se puede realizar la reparación selectiva al suministrar sólo uno, o varios, dNTP seleccionados dentro de las limitaciones dictadas por la naturaleza de la saliente. Después del tratamiento con Klenow, la mezcla se puede extraer con por ejemplo fenol/cloroformo, y precipitar con etanol . El tratamiento bajo condiciones apropiadas con Sl-nucleasa o BAL-31 da por resultado la hidrólisis de cualquier porción de hebra individual en los fragmentos de restricción que produce también fragmentos de extremos romos . Una vez que se han preparado fragmentos genómicos adecuados se pueden clonar en cualquier construcción de vector adecuada, o " replicón adecuado. Los ejemplos de vectores adecuados son bien conocidos en la técnica. El vector puede ser por ejemplo un plásmido, o en algunas modalidades de la invención, puede ser un cósmido. Cuando se usan vectores de clonación de cósmido, los fragmentos de ácido nucleico genómico clonados en ellos mismos son típicamente grandes, de manera preferente de aproximadamente 20,000 pb (20 kb) y 50,000 pares de base (50 kb) de tamaño (o cualquier número entero entre estos) , de manera preferente entre aproximadamente 25 kb y 50 kb, de manera más preferente entre aproximadamente 30-35 kb y 50 kb, y de manera aún más preferente entre aproximadamente 35 kb y aproximadamente 50 kb. Los vectores adecuados de cósmido están comercialmente disponibles por ejemplo el Equipo de Vector de Cósmido SuperCos 1 (Stratagene, La Jolla, California) . La ligación del ADN en el cósmido se realiza como se instruye por el fabricante o se puede determinar de forma empírica usando métodos conocidos en la técnica en vista de las enseñanzas de esta especificación. En otra modalidad preferida, los fragmentos genómicos virales se clonan en plásmidos para generar bibliotecas de plásmidos. Cuando se usan vectores de clonación de plásmidos, los fragmentos son típicamente de entre aproximadamente 5,000 pb (5 kb) y 25,000 pares de base (25 kb) de tamaño (o cualquier número entero entre estos) , de manera preferente entre aproximadamente 10 kb y 25 kb, de manera más preferente entre aproximadamente 10-15 kb y 25 kb, y de manera aún más preferente entre aproximadamente 15 kb y 20 kb. Los vectores adecuados de plásmido están comercialmente disponibles. Se realiza la ligación del ADN en el plásmido usando métodos bien conocidos en la técnica en vista de las enseñanzas de esta especificación. En modalidades de la invención donde se desea eliminar algunas de las secuencias de un ácido nucleico genómico viral de la construcción, la cantidad de- ácido nucleico genómico viral presente en la construcción, excluyendo las secuencias heterólogas insertadas, puede ser más pequeña. Por ejemplo, el tamaño total del ácido nucleico genómico viral en el vector puede ser de 1 a 20 kb, de manera preferente de 1 a 15 kb, de manera más preferente de 3 a 12 kb, de manera aún más preferente de 5 a 10 kb de longitud, excluyendo la longitud de las secuencias heterólogas de clonación, introducidas. En muchas modalidades de la invención, las secuencias endógenas de codificación asociadas de forma natural con la unidad endógena elegida, reguladora de expresión génica se suprimirán. Esto se puede hacer por cualquier medio adecuado, pero en muchas modalidades se hará por PCR. Se puede usar una estrategia de PCR de dos pasos para suprimir las secuencias de codificación. Se elegirán sitios únicos de enzimas de restricción para un gen particular; uno dentro de las secuencias endógenas de codificación, uno fuera del gen en la región 5', en la dirección 5' y un tercero en la región 3', en la dirección 3' del gen. Entonces se lleva a cabo una reacción de PCR con cebadores que amplifican del sitio de restricción único en 5' a justo en la dirección 5' de las secuencias de codificación. El cebador en la dirección 3' incluye la secuencia del sitio único de restricción en las secuencias de codificación. Esto da un producto de PCR que comprende la región 5' del gen, incluyendo el promotor endógeno y cualquier otro elemento regulador deseado, pero que carece de las secuencias de codificación, que incluye el sitio de restricción 5' y el sitio interno a las secuencias de codificación. El vector que contiene el ácido nucleico genómico viral tipo silvestre entonces se digiere con las enzimas de restricción específicas para los sitios 5' e internos únicos y la región 5' del gen se escinde, esto entonces se remplaza con el producto de PCR. Repitiendo el mismo conjunto de pasos para el extremo 3' del gen da una construcción resultante que tiene los extremos 5' y 3' originales del gen, pero en el cual se han removido las regiones de codificación. Todo lo que permanece de las secuencias de codificación es el sitio único de restricción, en el cual se pueden insertar las secuencias heterólogas de codificación . Al generar construcciones que tienen sitios únicos de restricción donde las secuencias endógenas de codificación estuvieron previamente, esto significa que se puede insertar entonces cualquier secuencia elegida heteróloga de codificación en el vector. En una modalidad, las secuencias heterólogas elegidas de codificación se amplificarán por PCR usando cebadores que incluyen el sitio único de restricción para permitir la fácil clonación en el sitio deseado. En algunas modalidades, se pueden manejar múltiples sitios únicos en la dirección 3' de un promotor elegido para permitir máxima flexibilidad en la estrategia de clonación. Aunque, de manera preferente, las construcciones de la invención se generarán al iniciar desde un fragmento único del ácido nucleico genómico viral y luego al modificarlo, se puede lograr el mismo resultado final usando otras estrategias. Por ejemplo, se pueden montar regiones del ácido nucleico genómico por porción. Esto puede hacerse más fácil para introducir las secuencias heterólogas necesarias de codificación. En algunas modalidades, esto puede permitir que se introduzcan de forma efectiva supresiones en el ácido nucleico genómico, tal como la remoción de secuencias innecesarias del ácido nucleico genómico viral . Se puede usar, en algunas modalidades, PCR para obtener el fragmento de ácido nucleico genómico individual para la modificación subsiguiente o para la aplicación de sub-regiones particulares del ácido nucleico genómico de la construcción. También se puede usar PCR para introducir modificaciones deseadas de la secuencia tal como mutaciones y/o la introducción de un sitio particular de restricción. Las construcciones de la invención no comprenderán de forma típica un genoma viral completo, en cambio comprenderán una o más sub-regiones de un genoma viral . Típicamente, por lo tanto, las construcciones, en si mismas carecerán de la capacidad para dar una partícula viral infecciosa. La construcción puede carecer de un origen viral de replicación y/o uno o más genes esenciales para la replicación del virus del cual se deriva el ácido nucleico genómico de la construcción. Las secuencias de ácido nucleico genómico viral de la construcción pueden carecer de señales de empaque. Las secuencias pueden carecer de un gen particular que codifica para una proteína incluida en la partícula viral del virus tipo silvestre o una proteína comprendida en la replicación viral, la construcción puede no contener estos genes. En algunas modalidades, las únicas secuencias expresadas de las secuencias de ácido nucleico viral en la construcción serán las secuencias heterólogas de codificación enlazadás operablemente a unidades endógenas reguladoras de expresión génica. En una modalidad de la invención, las secuencias de ácido nucleico genómico viral presentes en la construcción se pueden acortar por la remoción de algunas de las secuencias innecesarias entre las unidades endógenas reguladoras de secuencia de expresión, elegidas. De esta manera, algunas o todas las secuencias de intervención del extremo del elemento terminador de trascripción asociadas con las secuencias heterólogas de codificación y la siguiente unidad endógena reguladora de expresión génica enlazada operablemente a las secuencias heterólogas de codificación se pueden suprimir. Además, o de manera alternativa, algunas o todas las secuencias endógenas entre los términos 5' y 3' de la unidad reguladora de expresión génica que no forman parte de la unidad misma se pueden suprimir. Esto puede hacer a las construcciones más fáciles de manipular y propagar. También puede significar que se reduce la oportunidad de una recombinación entre los virus tipo silvestre y las construcciones de la invención. En términos de la cantidad de secuencias extrañas suprimidas, en total, en comparación al tamaño de la región en el genoma viral que corresponde a entre los términos 5' y 3' del ácido nucleico genómico viral en la construcción, puede haber remoción de más del 10 %, de manera preferente más del 20 %, de mañera más preferente más del 30 % y de manera aún más preferente más del 50 % de las secuencias. En algunas modalidades, hasta 75 % de manera preferente hasta 85 % y de manera aún más preferente hasta 95 % de las secuencias de ácido nucleico genómico viral se pueden suprimir. En algunos casos, la longitud de las secuencias endógenas en la dirección 5' de una o más de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica enlazadas operablemente a una secuencia heteróloga de codificación puede ser menor de 5 kb, de manera preferente menos de 2.5 kb, de manera aún más preferente menos de 1 kb y de manera aún más preferente menos de 500 pb. Estas pueden ser la cantidad de secuencias endógenas en la dirección 5' del promotor endógeno. La cantidad de secuencias endógenas inmediatamente en la dirección 3' de la unidad endógena reguladora de expresión génica y en particular en la dirección 3' de las secuencias heterólogas de codificación pueden ser de tamaño similar. Se pueden remover secuencias de entre todas las unidades endógenas reguladoras de expresión génica o sólo entre algunas de ellas. En algunos casos, todas las secuencias endógenas, aparte de aquellas comprendidas en la expresión de las secuencias heterólogas de codificación, se pueden suprimir. Por ejemplo, la supresión puede ser de al menos 250 pb, de manera preferente al menos 1 kb, de manera más preferente ai menos 2.5 kb y de manera aún más preferente al menos 5 kb de tamaño. Las supresiones introducidas pueden corresponder a supresiones individuales entre pares de unidades adyacentes endógenas reguladoras de expresión génica o también se pueden introducir múltiples supresiones. Las supresiones se pueden restringir a secuencias de no codificación. Típicamente, las supresiones se introducirán para reducir el tamaño de la construcción, en lugar de para propósitos de atenuación. En algunas modalidades de la invención, la unidad endógena reguladora de expresión génica consistirá de un promotor endógeno. En estas modalidades, algunas o todas las secuencias de intervención entre los promotores endógenos operablemente enlazados a las secuencias heterologas de codificación se suprimirán. La región suprimida puede ser típicamente de cualquiera de los tamaños especificados en la presente. Otros componentes del gen endógeno tal como secuencias transcritas de no codificación y/o elementos intensi icadores se puede escindir de cualquiera, se pueden reemplazar con secuencias heterologas. Las supresiones se pueden introducir usando cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, una construcción se puede cortar con enzimas de restricción que en la digestión se va a suprimir en cualquier lado de la región. El vector resultante se puede purificar del fragmento indeseado y volver a ligar para dar un vector que comprenda la supresión deseada. Se pueden usar otras técnicas tal como PCR para introducir las supresiones elegidas. Se puede usar secuenciación y digestiones con enzimas de restricción para confirmar que se han reducido las supresiones propuestas. A fin de seleccionar las construcciones con la supresión deseada durante la clonación, se pueden digerir las ligaciones con una enzima de restricción que corta dentro de la región que se va a suprimir antes de la transformación. La remoción de algunas o todas las secuencias extrañas para reducir el tamaño de los vectores también es igualmente aplicable a construcciones que contienen ácido nucleico genómico viral similares a aquellas analizadas en la presente, que sólo difieren con respecto a que los promotores endógenos expresados en la misma fase están enlazados operablemente a las secuencias de codificación con las cuales están asociadas de forma natural, en lugar de las secuencias heterólogas de codificación. Por ejemplo, el ácido nucleico genómico viral se puede derivar de HSV y la construcción se propone que se use para generar una respuesta inmune contra proteínas inmediatamente tempranas tal como ICPO, 4, 22 y 27 que se expresan del ácido nucleico genómico viral bajo el control de sus promotores endógenos normales. La remoción de secuencias extrañas de las secuencias que codifican para los antígenos que se van a expresar y las unidades endógenas de expresión génica con las cuales están operablemente enlazadas también es benéfico para esta clase de construcción de ácido nucleico genómico. Nuevamente, se pueden remover secuencias extrañas entre los términos de la unidad reguladora de expresión génica para disminuir adicionalmente el tamaño de la construcción. Por consiguiente, la invención también proporciona un método para generar una construcción de ácido nucleico para la administración directa a un sujeto para producir la respuesta inmune en el sujeto, el método que comprende: (a) insertar ácido nucleico genómico viral en una estructura de vector, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, cada una que comprende un promotor endógeno donde los promotores endógenos de las unidades son activos en la misma fase en el ciclo viral del virus del cual se deriva el ácido nucleico genómico viral; y (b) ya sea antes, o al mismo tiempo después de insertar el ácido nucleico genómico viral en la estructura de vector, suprimir del ácido nucleico genómico viral algunas o todas las secuencias virales, aparte de al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, están presentes en la región del genoma viral que corresponde a aquel entre los extremos 5' y 3' del ácido nucleico genómico viradle la construcción; donde la longitud del ácido nucleico genómico viral insertado en la estructura de vector es de 1 a 50 kb. La supresión introducida puede ser de una naturaleza similar a cualquiera de las analizadas en la presente y las construcciones generadas pueden tener características similares y utilidades a cualquiera de las otras construcciones de la invención, aparte del hecho que las unidades endógenas reguladoras de expresión génica están enlazadas a sus secuencias naturales de codificación, en lugar de las heterólogas. De esta manera, las partículas revestidas, los receptáculos de dosis, los dispositivos de distribución mediada por partículas, etc, se pueden generar usando estas construcciones y las construcciones se pueden usar en métodos de inmunización y/o para obtener la expresión génica como se analiza donde quiera en la presente .

Administración de construcciones Las construcciones de ácido nucleico y sustancias auxiliares descritas en la presente se pueden administrar por cualquier método adecuado. En una modalidad preferida, descrita posteriormente, las construcciones se administran al revestir una construcción adecuada (por ejemplo, cósmidos o plásmidos) sobre partículas portadoras de núcleo y luego al administrar las partículas revestidas al sujeto o células. Sin embargo, los fragmentos también se pueden distribuir usando otros sistemas no virales, por ejemplo, distribución de ácido nucleico desprotegido. Aunque las construcciones se pueden distribuir por medios virales, de manera preferente no se hace así. Por lo tanto, de forma típica, las construcciones se distribuirán directamente al sujeto por un medio no viral. De esta manera, la construcción puede carecer de secuencias de señal de empaque viral y/o un origen viral de replicacion. Típicamente, carecerán de las secuencias de empaque viral y/o el origen viral de replicacion nativo al virus del cual se deriva el ácido nucleico genómico viral. Las construcciones no requerirán de manera preferente un virus auxiliar y/o proteínas virales proporcionadas en trans, a fin de replicarse y en particular no harán uso de un virus auxiliar o proteínas auxiliares de los virus de donde se deriva para replicarse el ácido nucleico genómico. En el caso de construcciones basadas en cósmidos, sin embargo, se pueden proporcionar proteínas lambda en trans y los virus pueden tener las secuencias necesarias de cósmidos para la replicacion . En modalidades donde se usa una construcción separada de ácido nucleico para expresar un adyuvante, la expresión se puede formular con una construcción de la invención o de forma separada, si se formula de manera separada, el método de formulación puede ser el mismo empleado para formular la construcción de la invención y/o las formulaciones pueden ser las mismas entre si de la construcción presente. Las dos construcciones se pueden administrar en cualquier relación adecuada tal como por ejemplo, en cantidades equimolares o en una relación molar de 1:2, de manera preferente 1:5, o de manera más preferente 1:10, con cualquier construcción que está en exceso. La invención también proporciona vacunas que comprenden y una construcción que codifica para el adyuvante.

Preparaciones Farmacéuticas Convencionales La formulación de una preparación que comprende una construcción de la presente invención, con o sin adición de una composición de adyuvante, se puede llevar a cabo usando química normal de formulación farmacéutica, y metodologías, todas las cuales están fácilmente disponibles para el experto en la técnica. Por ejemplo, las composiciones que contienen una o más construcciones se pueden combinar con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para proporcionar una preparación líquida. Las sustancias auxiliares, tal como agentes humectantes o emulsionantes, sustancia de amortiguamiento de pH y similares, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares son en general agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmune en el individuo que recibe la composición, y que se puedan administrar sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen de manera enunciativa y sin limitación, líquidos tal como agua, solución salina, polietilenglicol , ácido hialurónico, glicerol y etanol . Las sales farmacéuticamente aceptables también se pueden incluir en la presente, por ejemplo, sales de ácidos minerales tal como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tal como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. También se prefiere, aunque no se requiere, que la preparación contendrá un excipiente farmacéuticamente aceptable que sirve como un estabilizador, particularmente para péptido, proteína u otras moléculas similares si se van a incluir en la composición de vacuna. Los ejemplos de portadores adecuados que también actúan como estabilizadores para péptidos incluyen de manera enunciativa y sin limitación, grados farmacéuticos de dextrosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, sorbitol, inositol, dextrano y similares. Otros portadores adecuados incluyen, nuevamente sin limitación almidón, celulosa, fosfatos de sodio o calcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietilenglicoles (PEG) de alto peso molecular y combinación de los mismos. Una discusión completa de los excipientes, vehículos o sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables está disponible en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub . Co . , N.J. 1991), incorporado en la presente como referencia. También se pueden incluir en las composiciones ciertos agentes de facilitación de la captación y/o expresión del ácido nucleico ("agentes que facilitan la transfección" ) como por ejemplo, agentes de facilitación, tal como bupivacaina, cardiotoxina y sacarosa, y vehículos que facilitan la transfección tal como preparaciones liposómicas o lípidas que se usan rutinariamente para distribuir moléculas de ácido nucleico. Los liposomas aniónicos y neutrales están ampliamente disponibles y son bien conocidos para distribuir moléculas de ácido nucleico (ver por ejemplo Liposomes: A Practical Approach, (1990) RPC New Ed. , IRL Press) . Las separaciones de lípidos catiónicos también son vehículos bien conocidos para el uso en la distribución de moléculas de ácido nucleico. Las preparaciones adecuadas de lípidos incluyen DOT A (cloruro de (N- [1 - (2 , 3 -dioleiloxi ) ropil] -N,N, N-trimeti1amonio) , disponible de la marca comercial Lipofectin"11 y DOTAP (1,2-bis (oleiloxi) -3- (trimetilamonio) propano) , ver, por ejemplo., Felgner et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 84:7413-7416; Malone et al 1 (1989) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86:6077-6081; Patentes de los Estados Unidos Números 5,283,185 y 5,527,928, y Publicaciones Internacionales números WO 90/11092, WO 91/15501 y WO 95/26356. Estos lípidos catiónicos se pueden usar de manera preferente en asociación con un lípido neutral, por ejemplo, DOPE (dioleil - fosfatidiletanolamina) . Aún además, las composiciones que facilitan la transfección que se pueden adicionar a las preparaciones anteriores de lípidos o liposomas incluyen derivados de espermina (ver, por ejemplo, Publicación Internacional número WO 93/18759) y compuestos de permeabilizacion de membrana tal como GALA, Gramicidina S y sales biliares catiónicas (ver por ejemplo, Publicación Internacional número WO 93/19768) . De manera alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden encapsular, absorber o asociar con, portadores en forma de partículas. Los portadores adecuados en forma de partículas incluyen aquellos de derivados de polímeros de polimetil-metacrilato, así como micropartículas de PLG derivadas de poli (lácticos) y poli (láctido-co-glicólidos) . Ver, por ejemplo Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368. También se pueden usar otros sistemas y polímeros en forma de partículas, por ejemplo, polímeros tal como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina, así como conjugados de estas moléculas. Las composiciones formuladas de vacuna incluirán una construcción de la invención. Una cantidad efectiva apropiada se puede determinar fácilmente por un experto en la técnica. Esta cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina. Por ejemplo, se han obtenido respuestas inmunes con tan poco como 1 µg de ADN, en tanto que en otras administraciones, se ha usado hasta 2 mg de ADN. En general se espera que una dosis efectiva de construcción caerá dentro de un intervalo de aproximadamente 10 µg a 100 µg de construcción, sin embargo, también se encontraron que son efectivas dosis por arriba y por abajo de este intervalo. Las composiciones de esa manera pueden contener de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 99.9% de la construcción .

Administración de Preparaciones Farmacéuticas Convencionales La administración de las preparaciones farmacéuticas descritas anteriormente se puede efectuar en una dosis, de forma continua o intermitente a todo lo largo del transcurso del tratamiento. La distribución será más típicamente vía aguja y jeringa convencional para las composiciones líquidas y para suspensiones líquidas que contienen las composiciones en forma de partículas. Además, se conocen en la técnica varios inyectores de chorro de líquido y se pueden emplear para administrar las presentes composiciones. Los métodos para determinar los medios y dosis de administración más efectivas son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y variarán con el vehículo de distribución, la composición de terapia, las células objetivo, y el sujeto que se trate. Se pueden llevar a cabo administraciones únicas y múltiples con el nivel de dosis y patrón que se seleccione por el facultativo que atiende. Además, también se propone que las construcciones retribuidas por los métodos de la presente invención se combinen con otras composiciones y terapias adecuadas. Por ejemplo, a fin de aumentar una respuesta inmune en un sujeto, las composiciones y métodos descritos en la presente pueden incluir adicionalmente sustancias auxiliares (por ejemplo, adyuvantes), tal como agentes farmacológicos, citosinas o similares. Se pueden administrar sustancias auxiliares, por ejemplo, como proteínas u otras macromoléculas al mismo tiempo, antes de o subsiguiente a, la administración de las vacunas de ADN (por ejemplo, cósmidos o plásmidos) descritas en la presente. Las composiciones también se pueden administrar directamente al sujeto, o de manera alternativa, distribuir ex vivo, a las células derivadas del sujeto, usando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Partículas Revestidas" En una modalidad, las construcciones de la invención, y otros componentes auxiliares tal como adyuvantes se distribuyen usando partículas portadoras. Los métodos de distribución mediada por partículas para administrar estas preparaciones de ácido nucleico se conocen en la técnica. De esta manera, una vez que se han preparado y purificado de forma adecuada, las construcciones descritas anteriormente se pueden revestir en partículas portadoras (por ejemplo, portadoras de núcleo) usando una variedad de técnicas conocidas. Se seleccionan partículas portadoras a partir de materiales que tengan una densidad adecuada en el intervalo de tamaños de partículas usados típicamente para distribución intracelular desde un dispositivo apropiado de distribución de partículas. El tamaño óptimo de la partícula portadora dependerá por supuesto del diámetro de las células obj etivo . Para los propósitos de la presente invención, las partículas de núcleo que se pueden usar incluyen partículas portadoras de núcleo de tungsteno, oro, platino e iridio. Se prefieren las partículas de tungsteno y oro. Las partículas de tungsteno están fácilmente disponibles en tamaños promedio de 0.5 a 2.0 µt de diámetro. Aunque estas partículas tienen densidad óptima para el uso en métodos de distribución de partículas, y permiten el revestimiento altamente eficiente con ácido nucleico, el tungsteno puede ser potencialmente tóxico a ciertos tipos de células. Por consiguiente, también encontrarán uso con los presentes métodos partículas de oro u oro microcristalino (por ejemplo, polvo de oro A1570, disponible de Engelhard Corp., East Newark, NJ) . Las partículas de oro proporcionan uniformidad en el tamaño (disponibles de Alpha Chemicals en tamaños de partículas de 1-3 µp?, o disponibles de Degussa, South Plainfield, NJ en un intervalo de tamaños de partícula que incluye 0.95 µp?) y toxicidad reducida. Se conocen y se han sugerido varios métodos para revestir o precipitar ADN o ARN en partículas de oro o tungsteno. La mayoría de estos métodos combina en general una cantidad predeterminada de oro o tungsteno con ADN de plásmido, CaCl2 y espermidina. La solución resultante se somete a vórtice de forma continua durante el procedimiento de revestimiento para asegurar la uniformidad en la mezcla de reacción. Después de la precipitación del ácido nucleico, las partículas revestidas se pueden transferir a membranas adecuadas y se dejan secar antes del uso, se revisten en superficies de un módulo o cartucho de muestra, o se cargan en un cartucho de distribución para el uso en un dispositivo adecuado de distribución de partículas. Los adyuvantes de péptidos (por ejemplo citosinas y toxinas bacterianas) también se pueden revestir en las mismas o similares partículas portadoras de núcleo. Por ejemplo, se pueden unir péptidos a una partícula portadora al mezclar simplemente los dos componentes en una relación empíricamente determinada, por precipitación con sulfato de amonio u otros métodos de precipitación con solvente, familiares para aquellos expertos en la técnica o por acoplamiento peptídico del péptido a la partícula portadora. El acoplamiento de los residuos de L-cisteína al oro se ha descrito de forma previa (Brown et al., Chemical Society Reviews 9:271-311 (1980)). Otros métodos incluirán, por ejemplo, disolver el adyuvante de péptido en etanol puro, agua o una mezcla de alcohol/agua, adicionando la solución a una cantidad de partículas portadoras, y luego secando la mezcla bajo una corriente de aire o gas nitrógeno en tanto que se somete a vórtice. De manera alternativa, el adyuvante se puede secar en partículas portadoras por centrifugación bajo vacío. Una vez que se secan, las partículas revestidas se pueden volver a suspender en un solvente adecuado (por ejemplo, acetato de etilo o acetona) y triturar (por ejemplo, por tratamiento con sonido (sonificación) ) para proporcionar una suspensión sustancialmente uniforme. Las partículas portadoras de núcleo revestidas con el adyuvante entonces se pueden combinar con las partículas portadoras de núcleo que tienen las construcciones de ácido nucleico de la invención y administrar en un paso único de inyección de partículas, o administrar de forma separada de las composiciones de las construcciones de ácido nucleico. En algunas modalidades, se pueden revestir las construcciones que codifican para un adyuvante sobre las mismas partículas como las construcciones de la invención o se pueden revestir en partículas separadas y luego mezclar con partículas revestidas con una construcción de la invención.

Administración de Partículas Revestidas Después de su formación, las partículas portadoras de núcleo revestidas con las construcciones de la presente invención, solas o en combinación con por ejemplo preparaciones adyuvantes, se distribuyen a un sujeto usando técnicas de distribución, mediadas por partículas. Se conocen en la técnica varios dispositivos de distribución de partículas adecuados para las técnicas de distribución mediadas por partículas, y son bien adecuados para el uso en la práctica de la invención. Los diseños actuales de los dispositivos emplean una descarga explosiva, eléctrica o gaseosa para impulsar las partículas portadoras del núcleo, revestidas, hacia las células objetivo. Las partículas revestidas se pueden unir por sí mismas de forma liberable a una hoja portadora móvil, o unir de forma removible a una superficie junto a lo largo de la cual pasa una corriente de gas, levantando las partículas de la superficie y acelerándolas hacia el objetivo. En la Patente de los Estados Unidos No. 5,204,253 se describe un ejemplo de un dispositivo de descarga gaseosa. En la Patente de los Estados Unidos No. 4,945,050 se describe un dispositivo del tipo explosivo. En la Patente de los Estados Unidos No. 5,120,657 se describe un ejemplo de un aparato de aceleración de partículas del tipo de descarga eléctrica. En la Patente de los Estados Unidos No. 5,149,655 se describe otro aparato de descarga eléctrica adecuado para el uso en la presente. La descripción de todas estas patentes se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Las partículas revestidas se administran al sujeto que se va a tratar de una manera compatible con la formulación de dosis, y en una cantidad que será efectiva para provocar una respuesta inmune deseada. La cantidad de la composición que se distribuye, que, en el caso de moléculas de ácido nucleico está en general en el intervalo de 0.001 a 100.0 µg, más típicamente de 0.01 a 10.0 9 y de manera preferente de 0.1 a 5 µ?t? de molécula de ácido nucleico por dosis, y en el caso de moléculas de péptido o proteína es de 1 g a 5 mg, más típicamente de 1 a 50 µg, de manera preferente de 5 a 25 µg de péptido, depende del sujeto que se trate. En modalidades donde se va administrar una construcción que codifica para un antígeno, se puede administrar una cantidad similar de esta construcción. De manera alternativa, la cantidad total de la construcción de la invención y la construcción que codifica para el adyuvante pueden caer dentro de los intervalos anteriores . La cantidad exacta de la construcción necesaria variará dependiendo de la edad y condición general del individuo que se inmunice y de la secuencia particular de nucleótidos o el péptido seleccionado, así como otros factores. Se puede determinar fácilmente una cantidad efectiva apropiada por un experto en la técnica al leer la presente especificación. De esta manera, una cantidad efectiva de las construcciones descritas en la presente será efectiva para provocar una respuesta inmune adecuada en un sujeto inmunizado, y caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina. De manera preferente, las partículas revestidas de núcleo se distribuyen a células receptoras adecuadas a fin de causar una respuesta inmune (por ejemplo, activación de células T) en el sujeto tratado.

Composiciones en Partículas De manera alternativa, las construcciones de la presente invención, así como uno o más adyuvantes seleccionados, se pueden formular como una composición en forma de partículas. De manera más particular, la formulación de partículas que comprende una construcción de interés se puede llevar a cabo usando química normal de formulación farmacéutica y metodologías todas las cuales están fácilmente disponibles por la persona experta en la técnica. Por ejemplo, se pueden combinar una o más construcciones y/o adyuvantes con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para proporcionar una composición de vacuna. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica para un adyuvante, en lugar del adyuvante mismo, se incluirá en la composición. Las sustancias auxiliares, tal como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de amortiguación del pH y similares pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Esos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares son en general agentes farmacéuticos que no inducen por sí mismos una respuesta inmune en el individuo que recibe la composición y que se puede administrar sin toxicidad inhibida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen de manera enunciativa y sin limitación líquidos, tal como agua, solución salina, polietilenglicol , ácido hialurónico, glicerol y etanol . Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden incluir en la presente, por ejemplo, sales de ácidos minerales tal como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y sales de ácidos orgánicos tal como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. También se prefiere, aunque no se requiere, que la composición de ácido nucleico contenga un portador farmacéuticamente aceptable que sirva como un estabilizador, particularmente para el péptido, proteína u otros adyuvantes similares o materiales auxiliares. Los ejemplos de portadores adecuados que también actúan como estabilizadores para los péptidos incluyen, de forma enunciativa y sin limitación, grados farmacéuticos de dextrosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, sorbitol, inositol, dextrano y similares. Otros portadores adecuados incluye, nuevamente sin limitación, almidón, celulosa, fosfato de sodio o calcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietilenglicoles de alto peso molecular (PEG) , y combinaciones de los mismos. Un análisis completo de los excipientes, portadores, estabilizadores y otras sustancias auxiliares, farmacéuticamente aceptables está disponible en RE INGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub . Co . , N.J. 1991), incorporado en la presente como referencia. Las composiciones formuladas se distribuirán en una cantidad suficiente para dar una respuesta inmunológica, como se define anteriormente. Una cantidad efectiva apropiada se puede determinar fácilmente por un experto en la técnica. Esta cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio, en general dentro del intervalo de aproximadamente 0.1 µg a 25 mg o más de la construcción de ácido nucleico de interés, y se pueden determinar cantidades adecuadas específicas a través de los ensayos de rutina . Las composiciones pueden contener de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 99.9% de manera más preferente de 1 a 80%, de manera más preferente de 10 a 50% y de manera aún más preferente de 20 a 40% de la molécula de ácido nucleico. Si se incluye un adyuvante en la composición, o se usan los métodos para proporcionar una composición de adyuvante en forma de partículas, el adyuvante estará presente en una cantidad adecuada como se describe anteriormente. Las composiciones entonces se preparan como partículas usando técnicas normales, tal como por evaporación simple (secado con aire) , secado al vacío, secado por aspersión, secado por congelación (liofilización) , secado por aspersión-congelación, revestimiento por aspersión, precipitación, formulación de partículas con fluido supercrítico, y similares. Si se desea, las partículas resultantes se pueden densificar usando las técnicas descritas en la Publicación Internacional comúnmente poseída No. WO 97/48485, incorporada en la presente como referencia. Las dosis unitarias individuales o los recipientes de múltiples dosis, en los cuales se pueden empacar antes del uso las partículas, pueden comprender un recipiente herméticamente sellado que encierra una cantidad adecuada de las partículas que comprenden una construcción adecuada de ácido nucleico y/o el adyuvante seleccionado (por ejemplo para proporcionar una composición de vacuna) . Las composiciones en forma de partículas se pueden empacar como una formulación estéril, y el recipiente sellado herméticamente de esta manera se puede diseñar para conservar la esterilidad de la formulación hasta el uso en los métodos de la invención. Si se desea, los recipientes se pueden adaptar para uso directo en un dispositivo de distribución de partículas. Estos recipientes pueden tomar la forma de cápsulas, bolsitas plegables, sobrecitos, cartuchos y similares. Se describen en la presente, dispositivo, apropiados de distribución de partícula. Por ejemplo, (jeringas sin aguja) y también se pueden empacar con las partículas para la distribución. El recipiente en el cual se empacan las partículas se puede marcar adicionalmente para identificar la composición y proporcionar información pertinente de la dosis. Además, el recipiente se puede marcar con un aviso en la forma pre-establecida por una agencia gubernamental, por ejemplo, la Administración Norteamericana de Alimentos y Fármacos, en donde el aviso indica la aprobación por la agencia bajo la Ley Federal de la Fabricación, uso o venta del antígeno, adyuvante (o composición de vacuna) contenida en el mismo para administración humana. Las composiciones en forma de partículas (que comprenden una o más construcciones de interés solas, o en combinación con un adyuvante seleccionado) se pueden entonces administrar usando una técnica de distribución transdérmica . De manera preferente, las composiciones en forma de partículas se distribuirán vía un método de inyección de polvo, por ejemplo, distribuido desde un sistema de jeringa sin aguja tal como aquellos descritos en las Publicaciones Internacionales comúnmente poseídas Nos. WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 y WO 96/20022, todos los cuales se incorporan en la presente como referencia. La distribución de partículas desde los sistemas de jeringas sin aguja se practica típicamente con partículas que tienen un tamaño aproximado que varía en general de 0.1 a 250 µta, que varía de manera preferente de aproximadamente 10-70 µp. También se pueden distribuir partículas más grandes de aproximadamente 250 µ?? desde los dispositivos, con la limitación superior que es el punto en el cual el tamaño de las partículas provocará daño adverso a las células de la piel. La distancia real que las partículas distribuidas penetrarán una superficie objetivo depende del tamaño de las partículas (por ejemplo, el diámetro nominal de las partículas asumiendo una geometría de partícula aproximadamente esférica) , en principio o densidad, la velocidad inicial a la cual las partículas impactan la superficie y la densidad y viscosidad cinemática del tejido cutáneo objetivo. A este respecto, las densidades óptimas de partícula para el uso en la inyección sin aguja varían en general entre aproximadamente 0.1 y 25 g/cm3, de manera preferente entre aproximadamente 0.9 y 1.5 g/cm3, de manera más preferente aproximadamente 1.2 a 1.4 g/cm3, y velocidades de inyección que varían en general de aproximadamente 100 a 3,000 m/segundo o mayor. Con presión apropiada de gas, las partículas que tienen un diámetro promedio de 10-70 µ?t? se pueden acelerar a través de la boquilla a velocidades que alcanzan velocidades supersónicas de un flujo de gas de impulsión. Si se desea, estos sistemas de jeringas sin aguja se pueden proporcionar en una condición precargada que contiene una dosis adecuada de las partículas que comprenden la construcción y/o el adyuvante seleccionado. La jeringa cargada se puede empacar en un recipiente herméticamente sellado, que se puede etiquetar adicionalmente como se describe anteriormente. De esta manera, el método se puede usar para obtener partículas de ácido nucleico que tienen un tamaño que varia de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 µ?t?, de manera preferente de aproximadamen e 10 a aproximadamente 150 µp?, y de manera más preferente aproximadamente 20 a aproximadamente 60 µt?; y una densidad de partículas que varía de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 25 g/cm3, y una densidad aparente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 3.0 g/cm3, o mayor. De manera similar, se pueden obtener las partículas de adyuvante seleccionados que tienen un tamaño que varía de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 250 µ??, de manera preferente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 150 µ?t?, y de manera más preferente de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 µ??; una densidad de partículas que varía de aproximadamente 0.1 a 25 g/cm3, y una densidad aparente de manera preferente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 3.0 g/cm3, de manera más preferente aproximadamente 0.8 a aproximadamente 0.5 g/cm3.

Administración de Composiciones en Forma de Partículas Después de su formación, las composiciones en forma de partículas (por ejemplo, polvo) se pueden distribuir de forma transdérmica al tejido de un sujeto vertebrado usando una técnica adecuada de distribución transdermica. Varios dispositivos de distribución de partículas, adecuados para la administración de la sustancia de interés se conocen en la técnica y encontrarán uso en la práctica de la invención. Un sistema particularmente preferido de distribución transdérmica de partículas emplea una jeringa sin aguja para disparar partículas sólidas en dosis controladas en y a través de piel, y tejido intacto. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,630,796 de Bellhouse et al., que describe una jeringa sin aguja (también conocida como "el dispositivo de distribución de partículas PowderJectMR" ) . En la técnica se conocen otras configuraciones de jeringas sin aguja y se describen en la presente . Las composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de las moléculas en polvo descritas en la presente se pueden distribuir a cualquier tejido objetivo adecuado vía los dispositivos de distribución de partículas descritos anteriormente. Por ejemplo, las composiciones se pueden distribuir al músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, vaso, médula ósea, timo, corazón, nodulos linfáticos, sangre, cartílago óseo, páncreas, riñon, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojos, glándulas y tejidos conectivos. Para construcciones de ácido nucleico la distribución es de manera preferente y las moléculas expresadas en, células terminalmente diferenciadas; sin embargo, las moléculas también se pueden distribuir a células no diferenciadas, o parcialmente diferenciadas tal como células madre de sangre y fibroblastos de piel. Las composiciones en polvo se administran al sujeto que se va a tratar de una manera compatible con la formulación de dosis, y en una cantidad que será profiláctica y/o terapéuticamente efectiva. La cantidad de la composición que se va a distribuir, en general en el intervalo de 0.5 g/kg a 100 /.g/kg de construcción de ácido nucleico por dosis, depende del sujeto que se va a tratar. Las dosis para otros productos farmacéuticos, tal como péptidos y proteínas activas fisiológicas, varían en general de aproximadamente 0.1 /¿g a aproximadamente 20 mg, de manera preferente 10 g a aproximadamente 3 mg. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo de la edad y condición general del individuo que se trate, la severidad de la condición que se trate, la preparación particular distribuida, el sitio de administración, así como otros factores. Una cantidad efectiva apropiada se puede determinar fácilmente por la habilidad en la técnica. De esta manera, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de la presente composición en forma de partículas será suficiente para causar el tratamiento o prevención de la enfermedad o síntomas de la condición, y caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina. A continuación están ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos únicamente y no se propone que limiten el alcance de la invención de ninguna manera.

EJEMPLOS Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero se permitirá por supuesto algún error experimental y desviación.

Ejemplo 1: Construcción de la construcción OP23-6 Se construyó una construcción de HSV-2 que comprende los cuatro genes inmediatamente tempranos, pero que carece de las secuencias genómicas virales extrañas. El punto de inicio para la construcción del vector fue un cósmido que incluyó tres fragmentos de EcoRI de la cepa MS de HSV-2 que abarca los nucleótidos 110,931 a 147,530 del genoma de HSV-2 basado en la secuencia publicada (cepa HG52) . El orden genómico también es como se muestra en la secuencia publicada.

El cósmido se digirió parcialmente con EcoRI y se volvió a ligar y se seleccionó una construcción que tiene sólo el fragmento de 28,000 (110,931-139,697). Esta molécula se designó OP-23. De esta molécula, se hicieron seis modificaciones para remover la mayoría de las secuencias innecesarias del ácido nucleico genómico viral. Las modificaciones fueron como sigue: 1. Digestión con Bstll07I y Scal y re-ligación del cósmido (se mueve del gen de resistencia a ampicilina) para crear OP23-1. 2. Digestión con Nsil y re-ligación para remover el origen de replicacion de SV40 y crear OP23-2. 3. Digestión parcial con BstXI y re-ligación para remover las regiones entre ICP27 e ICP0 para dar OP23-3. 4. Digestión completa con BspHI , seguido por digestión parcial con BsiWI y luego re-ligación para remover las secuencias que siguen al gen de ICP22 y algunas secuencias de estructura. Esto da OP23-4. 5. Digestión con Srfl y re-ligación para crear OP23-5 (remueve secuencias entre ICP4 e ICP0) . 6. Digestión total con BstXI y re-ligación para crear OP23-6 (remueve un pequeño fragmento de entre ICP27 e ICP0) . La secuenciación de la construcción OP23-6 se llevó a cabo para confirmar la estructura del vector y su secuencia . La estructura de las construcciones OP23 y OP23-1 a OP23-6 se muestra en la Figura 1.

Ejemplo 2: Generación de vacunas de HSV1 de muíti -antígeno que carecen de secuencias extrañas Se puede desarrollar un tipo similar de vacuna para HSV-1 a aquella descritas en el Ejemplo 1 para HSV-2. Se realizaría una digestión parcial con EcoRI en el HSV-1 para generar fragmentos genómicos, cósmidos que comprenden los fragmentos entonces se generarían usando el equipo superCos de Stratagene. Entonces se selecciona un cósmido que contiene las secuencias desde 110,095 a 146,694 del genoma de HSV-1. Entonces se pueden realizar varias decisiones y re-ligaciones para producir un vector compacto final que exprese los cuatro genes inmediatos tempranos del HSV-1, pero que carezcan de la mayoría de las secuencias innecesarias de intervención. Los siguientes pasos se llevan a cabo para generar la construcción deseada: 1. El cósmido HSV1 (43392 pb) se digiere con Seal y Ndel y se re-liga para dar OPhsvl-1. 2. OPhsvl-1 (39694 pb) se digiere con AflII y Clal y se re-liga para dar OPhsvl-2. 3. OPhsvl-2 (31365 pb) se digiere con EcoRV y SwaI y se re-liga para dar OPhsvl-3. 4. OPhsvl-3 (30727 pb) se digiere con BbvCI y se re -liga para dar OPhsvl-4. 5. OPhsvl-4 (27688 pb) se digiere con Bpull021 y BbvCI y se re-liga para dar OPhsvl-5. 6. OPhsvl-5 (26121 pb) se digiere con kpn y se digiere parcialmente con Psp 14061 y se re-liga para dar OPhsvl-6, en la construcción final que tiene todos los cuatro genes inmediatos tempranos presentes, pero de los cuales se han removido la mayoría de las otras secuencias extrañas .

Ejemplo 3: Inserción de codificación heteróloga (i) Estrategia general La construcción OP23-6 generada en el Ejemplo 1 se usó para generar una construcción donde se reemplazan las secuencias de codificación ICP 0, 4, 22 y 27 por secuencias heterologas de codificación. La estrategia básica empleada es remover primero las secuencias originales de codificación y luego insertar las secuencias heterologas de codificación en su lugar. Para cada secuencia de codificación que se va a reemplazar, el concepto es encontrar tres sitios únicos de enzimas de restricción; uno dentro del gen; uno fuera del gen y la región 5', en la dirección 5'; y uno en la región 3', en la dirección 3'. La secuencia de codificación y entonces se reemplaza en dos pasos . Los cebadores de PCR se eligen para amplificar e incluyen, el sitio único de restricción en la dirección 5' justo en la dirección 5' del inicio de las secuencias de codificación. El cebador 3' incluye la secuencia del sitio único de restricción en las secuencias de codificación. La PCR produce un fragmento de ADN que tiene la región 5' del gen, no secuencias de codificación, y se enlista con el sitio único de restricción encontrado en las secuencias de codificación. El vector original entonces se digiere con la enzima única específica para el sitio de restricción 5' y el sitio de restricción interno a la secuencia de codificación para escindir la mitad 5' del gen. Esto entonces se reemplaza con el producto de PCR digerido con las mismas enzimas. La repetición del mismo conjunto de pasos para el extremo 3' de las secuencias de codificación da una construcción resultante que tiene los extremos 5' y 3' originales del gen, pero en el cual se han removido las regiones de codificación. Todo lo que permanece de la construcción es el sitio único de enzima dentro de la misma. El nuevo gen entonces se insertará en el sitio. El proceso entonces se puede repetir para muchos de los genes de ICP presentes en OP23-6 conforme se desee.

Biología molecular Se utiliza metodología normal de biología molecular usada para manipular secuencias de ADN para la conversión de OP23-6 en la construcción multigénica deseada, que expresa los antígenos heterólogos. Para generar los fragmentos de ADN apropiados para reemplazar los segmentos de la OP23-6 original, se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los fragmentos se clonan en el vector pTARGET (Promega) . Entonces se identifican los clones positivos por restricción y el ADN purificado del cultivo bacteriano de los clones positivo se usa para aislar preparaciones puras de los fragmentos deseados. Los fragmentos purificados de los geles de azarosa se ligan en el vector OP23-6 que se ha cortado de forma previas con las enzimas apropiadas de restricción y se ha purificado de geles de azarosa. Entonces se detectan positivos para las digestiones por restricción. Los genes heterólogos que se van a insertar en el vector se obtienen por reacciones de PCR en las cuales se manejaron los sitios apropiados de restricción en los extremos 5' y 3' de los fragmentos de PCR. Se detectan positivos que contienen la inserción deseada para la digestión por restricción y la orientación apropiada se confirma también. Se lleva a cabo la secuenciación de ADN para confirmar que los clones resultantes contienen las secuencias deseadas. (iii) Preparación de acunas de ADN. La precipitación de ADN en partículas de oro se logra usando procedimientos normales para la formulación de calcio/espermidina de vacunas de ADN. El ADN se mezcla con partículas de oro de 2 mieras en un pequeño tubo de centrífuga que contiene 300 mi de espermidina 50 m . La cantidad de ADN adicionado es de 2 ¿zg por mg de partículas de oro y típicamente se hacen lotes de 26 mg de oro {5t2 µg de ADN) . El ADN se precipita en el oro por la adición de un volumen 1/10 de CaCl2 al 10% durante la agitación continua del tubo en un mezclador giratorio. Los complejos ADN-oro se lavan tres veces con etanol puro y luego se cargan en la tubería Tefzel, se secan y cortan en segmentos de 1.7 cm (0.5 pulgadas) para el uso en el dispositivo de XR-1. Para la inmunización, las vacunas de ADN se distribuyen por el dispositivo de XR-1 en el abdomen de ratones Balb/C. Se da un disparo único para cada inmunización y a los animales se les da una cebadura y un refuerzo en 4 semanas. Se recolectan muestras de los animales dos semanas después de la inmunización final. (iv) ELISA de anticuerpos Se valoran muestras séricas para anticuerpos contra los antígenos heterólogos expresados por el vector usando un ensayo de ELIA. Se revisten placas de microtítulo Falcon Pro Bind) durante la noche a 4°C con antígeno en PBS (solución salina amortiguada con fosfatti, Bio Whittaker) . Las placas se bloquean durante 1 hora a temperatura ambiente con leche seca al 5%/PBS, luego se lavan tres veces con amortiguador de lavado (solución salina amortiguada con Tris 10 mM, 0. l%Brij -35) . Las muestras séricas diluidas en amortiguador de dilución (leche seca al 2% PBS/Tween 20 0.05% se adicionan a la placa y luego se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan tres veces y un anticuerpo anti -ratón de cabra biotinilado (Southern Biotechnology) diluido 1:8000 en amortiguador de ilusión se adiciona a la placa y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavan tres veces, luego se adiciona un conjugado de peroxidasa de rábano/estreptavidina (Southern Biotechnology) diluido 1:8000 en PBS y la placa se incuba durante 1 hora adicional a temperatura ambiente. Las placas se lavan tres veces, luego se adiciona solución de sustrato (Biorad) y la reacción se detiene con H2S0 1N. La densidad óptica se lee a 450 nm. (v) Cultivo Celular Se obtienen suspensiones celulares individuales de bazos de ratón. Los bazos se exprimen a través de una malla para producir una suspensión celular individual y las células entonces se sedimentan, y se tratan con amortiguador ACK (Bio Whittaker, Walkersville MD) para lisar las células sanguíneas rojas. Las células entonces se lavan dos veces con medio RPMI 1649 complementado con HEPES, glutamina al 1% (Bio Whittaker) , y suero de becerro vegetal inactivado térmicamente al 5% (FCS, Harían, indianápol is , IN) . Las células se cuentan y se vuelven a suspender a una concentración apropiada en el medio "total" que consiste de RPMI 1640 con HEPES y glutamina al 1%, complementado con FCS inactivado térmicamente al 5%, mercaptoetanol 50 mM (Gibco-BRL, Long Island NY) , gentamicina (Gibco-BRL) , piruvato de sodio MEM 1 mM (Gibco-BRL) y aminoácidos no esenciales MEM (Sigma, St. Louis MO) . Las suspensiones celulares entonces se utilizan en varios inmunoensayos . Para ensayos específicos de CD8, se cultivan las células in vi tro en la presencia de un péptido que corresponde a epitopes CD8 conocidos. Los péptidos se constituyen en DMSO (10 mg/ml) y se diluyen a 10 g ml en medio de cultivo. (v) ELISPOT Para ensayos de ELISPOT de IFN-g, se revisten placas de filtración de membrana Millipore Multiscreen con 50 µ? de 15 ^g/ml de anti-suero anti-IFN-g (Pharmingen) en amortiguador estéril de carbonato 0.1M, pH 9.6, durante la noche a 4°C. Las placas se lavan seis veces con PBS estéril y luego se bloquean con medio de cultivo de tejido que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS) durante 1-2 horas a temperatura ambiente . El medio se remueve y las células del bazo se colocan en las cavidades con un total de lxlO6 por cavidad. Para las cavidades en las cuales se adicionan menos de lxlO6 células de animales inmunizados, las células de los animales sencillos se usan para llevar el total a 1X106. Las células se incuban durante la noche en un incubador de cultivo de tejido en la presencia del péptido como se describe anteriormente. Las placas se lavan dos veces con PBS y una vez con agua destilada. Esto se sigue con tres lavados con PBS. Se adiciona anticuerpo monoclonal anti-IFN-g biotinilado (Pharmingen) a la placa (50 µ? de una solución de 1 /¿g/ml en PBS) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan seis veces con PBS luego se adicionan 50 µ? de un conjugado de fosfatasa alcalina-estreptavidina (1:1000 en PBS, Pharmingen) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan seis veces con PBS y el sustrato de color (BioRad) se adiciona y la reacción se deja proseguir hasta que aparecen puntos oscuros. La reacción se detiene al lavar con agua tres veces. Las placas se secan con aire y los puntos se cuentan bajo un microscopio. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (44)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una costrucción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende ácido nucleico genómico viral, este ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, cada una comprende un promotor endógeno capaz de la expresión en una célula de mamífero, donde los promotores endógenos de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo de vida viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico, genómico, viral, donde: (a) al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores activos en la misma fase se enlazan cada una de forma operable a una secuencia heterologa separada de codificación insertada en el ácido nucleico genómico viral; y (b) el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo. 2. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los por lo menos dos promotores endógenos se intercalan en el mismo punto en el ' ciclo de vida viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico.
3. 3. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las por lo menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica son ya sea ambas/todas de genes virales inmediatos tempranos, o ambas/todas de genes virales tempranos .
4. 4. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las por lo menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica son diferentes.
5. 5. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral se selecciona del grupo que consiste de un virus de ADN y un virus de ARN.
6. 6. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el virus de ADN es un virus de ADN de doble hebra seleccionado de un herpesvirus y un virus adeno-asociado (AAV) .
7. 7. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el herpesvirus se selecciona del grupo que consiste de virus de herpes simplex (HSV) , un citomegalovirus (CMV) y un virus de Epstein-Barr (EBV) .
8. 8. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el HSV se selecciona del grupo que consiste de HSV-1 y HSV-2.
9. 9. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el ácido nucleico genómico viral se deriva de un virus de herpes simplex y las por lo menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica comprenden cada una un promotor endógeno seleccionado del grupo que consiste de los promotores génicos ICPO, ICP4, ICP22 e ICP27.
10. 10. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el ácido nucleico genómico viral se deriva de un virus de herpes simplex y los dos promotores endógenos de las por lo menos dos unidades reguladoras de expresión génica son promotores génicos de la proteína de tegumento de HSV.
11. 11. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el ácido nucleico genómico viral es de citomegalovirus humano y los promotores endógenos de las por lo menos dos unidades reguladoras de expresión génica son: al menos dos seleccionados del grupo que consiste de los promotores génicos UL36, UL37 y UL38; - los promotores génicos UL82 y UL83; o - los promotores génicos UL122 y U123.
12. 12. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque todas las secuencias heterólogas de codificación expresadas por las unidades endógenas reguladoras de expresión génica se derivan del mismo organismo.
13. 13. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dos o más de las secuencias heterólogas de codificación codifican para antígenos.
14. 14. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los antígenos son antígenos de un patógeno.
15. 15. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque algunas o todas las secuencias virales, aparte de las por lo menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, que están presentes en la región del genoma viral que corresponde a aquél entre los extremos 5' y 3' del ácido nucleico genómico viral, en la construcción están ausentes de la construcción.
16. 16. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la región ausente comprende parte o todas las secuencias de intervención entre las dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, adyacentes, enlazadas a secuencias heterólogas de codificación.
17. 17. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la región ausente corresponde a uno o más de los genes presentes .. en la región del genoma viral diferentes de aquellos de las por lo menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica para expresar las secuencias heterólogas de codificación.
18. 18. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el ácido nucleico geonómico viral es de HSV-2 y las secuencias virales se han removido de la construcción por una o más de las siguientes técnicas: (a) una digestión parcial con una enzima BstXI y luego re-ligación para remover las secuencias entre ICP27 e ICPO; (b) una digestión completa con una enzima BspHI, seguido por digestión parcial con una enzima BsiWI y luego re-ligación para remover las secuencias adyacentes a ICP22; (c) una digestión con una enzima Srfl y luego religación para remover las secuencias entre ICP4 e ICPO; (d) digestión total con una enzima BstXI y luego re-ligación para remover las secuencias entre ICP27 e ICPO.
19. 19. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el ácido nucleico genómico viral es de HSV-1 y las secuencias virales se han removido de la construcción para remover sustancialmente todas las secuencias de HSV-1 extrañas a las secuencias de codificación de ICPO, ICP4, ICP22 e ICP27.
20. 20. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico genómico viral corresponde a una región contigua del genoma viral de donde se derivan, aparte del reemplazo de las secuencias de codificación, las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que están enlazadas operablemente de forma natural con las secuencias heterólogas de codificación.
21. 21. Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las unidades endógenas reguladoras de expresión génica enlazadas operablemente a las secuencias heterólogas de codificación son promotores endógenos.
22. 22. Un método para generar una construcción de ácido nucleico para la administración directa a un sujeto para producir una respuesta inmune en el sujeto, el método está caracterizado porque comprende: (a) insertar el ácido nucleico genómico viral en una estructura de vector, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, cada una comprende un promotor endógeno capaz de la expresión en una célula de mamífero, donde los promotores endógenos de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral; y (b) ya sea antes, al mismo tiempo o subsiguiente a la inserción del ácido nucleico genómico viral en la estructura de vector, enlazado operablemente, cada uno de los promotores endógenos de al menos dos de las unidades reguladoras de expresión génica en el ácido nucleico genómico viral a las secuencias heterologas de codificación; en donde el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterologas insertadas en el mismo.
23. 23. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método comprende además suprimir del ácido nucleico genómico viral algunas o todas las secuencias virales, a parte de las por lo menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, que están presentes en la región del genoma viral que corresponde a aquella entre los extremos 5' y 3' del ácido nucleico genómico viral de la construcción.
24. 24. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las secuencias suprimidas son algunas o todas lás secuencias de intervención de no codificación entre las unidades endógenas adyacentes, reguladoras de expresión génica a las cuales se van a enlazar de forma operable las secuencias heterólogas de codificación.
25. 25. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el ácido nucleico genómico se inserta en la estructura de vector como un fragmento individual .
26. 26. Partículas revestidas, adecuadas para la distribución desde un vehículo de distribución mediada por partículas, partículas caracterizadas porque comprenden partículas portadoras revestidas con una construcción de ácido nucleico en donde la construcción comprende ácido nucleico genómico viral, el ácido nucleico genómico viral comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, cada una comprende un promotor endógeno capaz de la expresión en una célula de mamífero, donde los promotores endógenos de las unidades están activos en el mismo punto en el ciclo viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral, donde al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores, se enlazan cada una de manera operable a una secuencia heteróloga de codificación insertada en el ácido nucleico genómico viral; y - el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterologas insertadas en el mismo.
27. 27. Partículas revestidas de conformidad con la reivindicación 26, caracterizadas porque las partículas portadoras son oro o tungsteno.
28. 28. Receptáculo de dosisificación para un dispositivo de distribución mediada por partículas, caracterizado porque comprende partículas revestidas de acuerdo a la reivindicación 26.
29. 29. Un dispositivo de distribución mediado por partículas, caracterizado porque está cargado con partículas revestidas de acuerdo a la reivindicación 26.
30. 30. Un dispositivo de distribución mediado por partículas de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque es una jeringa sin aguja.
31. 31. Un método para obtener la expresión en una célula de mamífero de un polipéptido de interés, método está caracterizado porque comprende transferir a las células una construcción de ácido nucleico que comprende ácido nucleico genómico viral, este ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica cada una comprende un promotor endógeno capaz de la expresión en una célula de mamífero, donde los promotores endógenos" de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral, donde: al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores, se enlazan cada una de manera operable a una secuencia heteróloga de codificación insertada en el ácido nucleico genómico viral; y - el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo.
32. 32. Un método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la construcción se distribuye directamente a un sujeto.
33. 33. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la construcción se distribuye por inyección, distribución transdérmica de partículas, inhalación, de forma tópica, oral, intranasal o transmucosa.
34. 34. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la construcción se distribuye por inyección sin aguja.
35. 35. Un método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la construcción de ácido nucleico se reviste en partículas portadoras.
36. 36. Un método de inmunización por ácido nucleico, caracterizado porque' comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de partículas revestidas, partículas que son adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, las partículas que comprenden partículas portadoras revestidas con una construcción de ácido nucleico, en donde la construcción comprende ácido nucleico genómico viral, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden cada una un promotor endógeno capaz de la expresión en una célula de mamífero, donde los promotores endógenos de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo viral del virus, de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral, donde: al menos dos de las unidades endógenas reguladoras de expresión génica que comprenden promotores se enlazan cada una de forma operable a una secuencia heteróloga de codificación insertada en el ácido nucleico genómico viral; y - el ácido nucleico genómico viral es de 1 a 50 kb de longitud excluyendo las secuencias heterólogas insertadas en el mismo.
37. 37. Un método para generar una construcción de ácido nucleico para la administración directa a un sujeto para producir una respuesta inmune en el sujeto, el método caracterizado porque comprende: (a) insertar el ácido nucleico genómico viral en una estructura de vector, el ácido nucleico genómico viral que comprende al menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, cada una comprende un promotor endógeno capaz de la expresión en una célula de mamífero, donde los promotores endógenos de las unidades están activos en la misma fase en el ciclo viral del virus de donde se deriva el ácido nucleico genómico viral; y (b) ya sea antes, al mismo tiempo o subsiguiente a la inserción el ácido nucleico genómico viral en la estructura de vector, suprimir el ácido nucleico genómico viral, algunas o todas las secuencias virales, parte de las por lo menos dos unidades endógenas reguladoras de expresión génica, que están presentes en las regiones del genoma viral que corresponden a aquel entre los extremos 5' y 3' del ácido nucleico genómico viral de la construcción; donde la longitud del ácido nucleico genómico viral insertado en la estructura de vector que es de 1 a 50 kb.
38. 38. Un método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque las secuencias de ácido nucleico suprimidas son parte o todas las secuencias de intervención de no codificación entre los dos promotores endógenos.
39. 39. Partículas revestidas, adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, las partículas se caracterizan porque comprenden partículas portadoras revestidas con una construcción de ácido nucleico generada por un método como se define en la reivindicación 36.
40. 40. Un receptáculo de dosis para un dispositivo de distribución mediada por partículas, caracterizado porque comprende partículas revestidas de acuerdo a la reivindicación 39.
41. 41. Un dispositivo de distribución mediada por partículas, caracterizado porque está cargado con partículas revestidas de acuerdo a la reivindicación 40.
42. 42. Un método para obtener la expresión en una célula de mamífero de un polipéptido de interés, el método caracterizado porque comprende transferir a las células una construcción de ácido nucleico generada por un método de acuerdo a la reivindicación 37.
43. 43. Un método de inmunización por ácido nucleico, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de partículas revestidas, partículas que son adecuadas para la distribución desde un vehículo de distribución mediada por partículas, las partículas que comprenden partículas portadoras revestidas con una construcción de ácido nucleico generado por un método de acuerdo a la reivindicación 37.
44. 44. Uso de' una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, una construcción de ácido nucleico generada por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, 37 y 38 o partículas revestidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26, 27 y 39 en la fabricación de un medicamento para el uso en inmunización con ácido nucleico.