CN117752778A - 抗SARS-CoV-2或突变体mRNA疫苗和重组蛋白亚单位疫苗制备及应用 - Google Patents
抗SARS-CoV-2或突变体mRNA疫苗和重组蛋白亚单位疫苗制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗SARS‑CoV‑2或突变体感染的mRNA疫苗、重组蛋白疫苗及应用,属于医药领域。为解决SARS‑CoV‑2或其突变病毒感染预防和治疗药物的问题,本发明提供了预防和/或治疗SARS‑CoV‑2或其突变体感染的重组蛋白疫苗和/或mRNA疫苗,特别是提供了mRNA疫苗和重组蛋白疫苗的应用方法,其能诱导体内产生强烈的抗体和细胞免疫反应,阻断SARS‑CoV‑2的S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合,使宿主抵抗冠状病毒感染。
Description
技术领域
本发明涉及抗SARS-CoV-2或其突变体感染的药物以及联合用药给药方式,特别包含一种抗SARS-CoV-2或其突变体感染mRNA疫苗和/或重组蛋白疫苗及其给药方式,属于医药领域。
背景技术
SARS-CoV-2是由世界卫生组织命名的一种新型的β属的冠状病毒。该病毒有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别,是一种以前尚未在人类中发现的新冠状病毒分支。目前,变异新冠病毒主要有五大种类:Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron,Omicron变异株又分为BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA4和BA5等多种亚系。
SARS-CoV-2的主要结构蛋白包括刺突蛋白(Spike,S)、信使蛋白(Envelop,E)、膜蛋白(Membrane,M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N),其中,S蛋白在病毒的感染和毒力中起着关键作用,常被用来作为疫苗的抗原。由于SARS-CoV-2变异株含有多个突变位点,病毒的S蛋白也含有多个突变位点,导致变异株一定程度上能够逃逸新冠原型株(即“新冠病毒野生株”)疫苗激发的抗体,导致新冠疫苗失效或保护力降低。因此,开发针对各种变异的SARS-CoV-2病毒的疫苗,特别对各种变异的SARS-CoV-2病毒的广谱疫苗,对于新型冠状病毒的防治非常重要。
目前,基于腺病毒载体、mRNA、重组蛋白亚单位等10余种疫苗已在全球获得批准。其中,辉瑞-生物科技公司的BNT162B2(mRNA)、阿斯利康公司的ChAdOx1 nCoV-19(腺病毒载体)、Moderna公司的mRNA-1273(mRNA)、Novavax公司的NVX-CoV2373(蛋白亚单位)和阿斯利康公司的AZD1222(病毒载体)是一些具有代表性的疫苗。这些COVID-19疫苗有效地预防了由SARS-CoV-2及其突变体引起的疾病和致命后果。
然而,随着SARS-CoV-2的持续进化,新的变种的不断出现给疫苗的开发带来了新的挑战。值得注意的是,显性变异Omicron(如B.1.1.529)具有大量刺突蛋白突变,具有高度的传染性,并削弱了目前上市的疫苗所赋予的人群保护作用。例如,接种BNT162B2疫苗2-4周后,与WA1/2020菌株相比,对Omicron变种的中和能力降低了30倍。此外,另一项研究显示,WA1/2020菌株和Omicron变种之间50%中和抗体的几何平均滴度(GMT)相差22倍(1953VS 89)。最近,又出现了一系列的Omicron新变种,如BA.2,BA.3,BA.2.12.1,BA.4和BA.5(BA.4/5)。其中,Omicron BA.4/5在南非和美国占据主导地位。虽然BA.4/5的刺突蛋白突变与BA.2的刺突蛋白突变相当,但BA.4/5的中和逃逸能力明显增强,这对疫苗的开发是一个更重要的障碍。
鉴于SARS-CoV-2的持续流行和不断突变,接种第三剂加强剂或研发新一代疫苗是抗击新冠病毒的重要策略。现有研究者发现,三剂BNT162B2可以显著增加对Omicron的中和能力。同样,同源的mRNA-1273增强剂也可以提高两剂针对Omicron变种的mRNA-1273疫苗的效果。尽管第三剂加强剂可以增强它的中和能力,但它对抗BA.4/5型Omicron变种的效能仍然大大降低。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的目的在于提供抗SARS-CoV-2或其突变体感染的重组蛋白疫苗和mRNA疫苗及其联合给药方式。
本发明首先提供了预防和/或治疗SARS-CoV-2或其突变体感染的mRNA疫苗和重组蛋白疫苗,两种疫苗是分别含有以抗SARS-CoV-2或其突变体感染的mRNA或重组蛋白疫苗为活性成分的制剂。
本发明还提供抗SARS-CoV-2或其突变体感染的组合物,其含有以mRNA疫苗和重组蛋白疫苗为活性成分的制剂;其中,所述的mRNA疫苗含有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列构成的mRNA;所述的重组蛋白疫苗含有基于SEQ ID No.4所示氨基酸序列构建的蛋白。
本发明还提供了预防和/或治疗SARS-CoV-2或其突变体感染的联合用药物,其含有分别、同时或序贯给药的抗SARS-CoV-2或其突变体感染的mRNA疫苗和重组蛋白疫苗;其中,所述的mRNA疫苗含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列构成的mRNA;所述的重组蛋白疫苗含有基于SEQ ID No.4所示氨基酸序列构建的蛋白。
mRNA疫苗含有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;或所述核苷酸序列是与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有同源性且相同或相似的生物学活性,且在SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2序列经取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸获得的变体;优选地,所述突变体序列是在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列经取代和/或缺失和/或插入1~400个氨基酸获得的变体;优选地,所述突变体序列是在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列经取代和/或缺失和/或插入5~30个氨基酸获得的变体。
重组蛋白疫苗的蛋白前体氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;或是与SEQ ID No.4具有同源性且相同或相似的生物学活性,且在SEQ ID No.4序列经取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸获得的变体;优选地,所述RBD序列是在SEQ ID No.4序列经取代和/或缺失和/或插入1~400个氨基酸获得的变体;优选地,所述RBD序列是在SEQ ID No.4序列经取代和/或缺失和/或插入5~30个氨基酸获得的变体。
进一步地,所述mRNA疫苗、重组蛋白疫苗或联合用药物为肌肉注射剂、滴鼻剂、喷雾剂、鼻喷给药剂或吸入剂。优选地,所述的mRNA疫苗为肌肉注射剂,所述的重组蛋白疫苗为肌肉注射剂鼻喷给药剂。
进一步地,所述重组蛋白疫苗中,含有抗SARS-CoV-2或其突变体感染的蛋白和/或蛋白前体。
进一步地,所述蛋白和/或蛋白前体含有SARS-CoV-2的S蛋白中至少一种RBD序列与至少一种HR序列;其蛋白和/或蛋白前体序列如SEQ ID No.4所示;
或所述序列是与SEQ ID No.4具有同源性且相同或相似的生物学活性,且在SEQID No.4序列经取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸获得的变体;优选地,所述RBD序列是在SEQ ID No.4序列经取代和/或缺失和/或插入1~400个氨基酸获得的变体;优选地,所述RBD序列是在SEQ ID No.1序列经取代和/或缺失和/或插入5~30个氨基酸获得的变体。
进一步地,所述S蛋白中RBD序列与HR序列形成的蛋白能够自发形成三聚体。
进一步地,所述同源性氨基酸序列选取Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron,Omicron的RBD序列中的至少一种。
进一步地,所述蛋白前体,是在所述抗SARS-CoV-2或其突变体感染的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签;优选地,所述信号肽包括S蛋白或其突变体自身的信号肽和/或在自身信号肽前额外添加的人tPA信号肽;优选地,所述的蛋白标签选自如下至少一种:组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签;更优选地,所述蛋白标签为Trx标签和/或6His标签。
进一步地,在所述抗SARS-CoV-2或其突变体感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区;优选地,所述的蛋白酶选自如下至少一种:肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。
进一步地,所述蛋白和/或蛋白前体的氨基酸序列选自SEQ ID No.4。
进一步地,编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
进一步地,所述重组蛋白疫苗和/或mRNA疫苗中,含有抗SARS-CoV-2或其突变体感染的核酸。
进一步地,所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了重组载体,含有多核苷酸序列,所述多核苷酸序列选自SEQ IDNo.1、SEQ ID No.5中至少一种。
进一步地,重组载体,所述重组载体采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种;优选地,所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1;优选地,所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体;进一步优选地,所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002;优选地,所述的大肠杆菌表达载体为pET32a;优选地,所述的酵母表达载体为pPICZaA。
本发明还提供了宿主细胞,其含有上述的重组载体。
进一步地,所述宿主细胞采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种;优选地,所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种;优选地,所述的哺乳动物细胞为CHO细胞或HEK293细胞。
进一步地,所述重组蛋白疫苗和/或mRNA疫苗,还包括药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
进一步地,所述的辅助性成分为免疫佐剂;优选地,所述的免疫佐剂选自如下至少一种:鲨烯水包油乳剂、铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、细菌毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料;
进一步地,所述免疫佐剂满足以下至少一项:所述的鲨烯水包油乳剂为MF59;所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种;所述的钙盐为磷酸三钙;所述的植物皂苷为QS–21或ISCOM;所述的植物多糖为黄芪多糖;所述的细菌毒素选自重组霍乱毒素、白喉毒素中至少一种;所述的脂质选自如下至少一种:磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺;所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种:(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、CpG ODN。
本发明还提供了上述药物单独或联合用药物制备预防和/或治疗SARS-CoV-2或其突变体感染的药物中的用途。
进一步地。所述新冠病毒变异株包括:Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron,Omicron中的至少一种。
本发明还提供了上述蛋白的制备方法,包括如下步骤:培养上述的宿主细胞,使其表达所需的蛋白或前体,然后回收所需的蛋白,即得。
本发明还提供了所述重组蛋白的制备方法,包括如下步骤:构建含有所述多核苷酸的重组载体,对人体进行免疫,产生所述的蛋白。
进一步地,所述的载体选自如下至少一种:mRNA、DNA疫苗、腺病毒、安卡拉痘苗病毒vaccinia Ankara virus、腺相关病毒。
有益效果:本发明提供了抗SARS-CoV-2或突变体感染的蛋白及其疫苗,具体提供了抗SARS-CoV-2或其突变体感染的mRNA疫苗和重组蛋白疫苗,编码两种疫苗的核苷酸序列均选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5中的至少一种。本发明通过实验发现,将两者疫苗结合,即将重组蛋白疫苗作为第三异源增强剂与两种mRNA疫苗结合可以增强体液和细胞免疫反应,表现为更高的抗RBD IgG水平,更强的中和抗体和IFN-γ-分泌T细胞。为异源增强策略对抗COVID-19提供了坚实的指示,第三种异源蛋白亚基增强剂(RBD-HR/三聚体疫苗)在两剂mRNA疫苗后成为合适的加强剂候选疫苗。
SEQ ID No.1SARS-CoV-2Delta mRNA疫苗S抗原的核苷酸序列:
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAATGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTGCCCCCCGCCTACACCAACAGCTTCACAAGAGGGGTCTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGAAGCAGCGTGCTGCACAGCACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCTCCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCTAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGACACAGAGCCTGCTGATTGTGAACAACGCTACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGGGTGTACTACCACAAAAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGGCGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAACCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAAGGCAACTTCAAGAACCTCAGAGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGAGAGACCTGCCCCAAGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACAAGATTTCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCCGGCGACAGCAGCAGCGGGTGGACAGCCGGCGCTGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATTACCGACGCCGTCGACTGCGCCCTGGACCCCCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAGACAAGCAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTCGCTAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCTAGCTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGGGTCAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGACAGATCGCCCCCGGGCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGATAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTATAGATACAGACTGTTCAGAAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCAGCACCGAGATCTACCAAGCCGGCAGCAAGCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCTGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTCCCTTTTCAGCAGTTCGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGATGCCGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCCCTGCAGCTTTGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGCAACCAAGTGGCCGTGCTGTACCAAGGCGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCCGATCAGCTGACCCCCACCTGGAGAGTGTACAGCACCGGCAGCAACGTGTTTCAGACAAGAGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAACAGCAGACGGAGAGCTAGAAGCGTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACCGAGATCCTGCCCGTCTCCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACACAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAACTTCAGCCAAATCCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGAGAAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCTGGGCGACATCGCCGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAATGGCCTGACCGTCCTGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACAAGCGCCCTGCTGGCCGGCACAATTACAAGCGGCTGGACATTCGGCGCTGGCGCCGCCCTGCAAATCCCCTTCGCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACGAGAATCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAGCCTGAGCAGCACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGAACGTGGTGAATCAGAACGCCCAAGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCAGCTCCGTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATCACCGGCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATCAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGGCAGAGCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAGAAGAACTTCACCACCGCCCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAGCCTCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATTGTGAACAATACAGTCTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAGCTGGACAAGTACTTCAAGAATCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGGGACATCAGCGGCATCAACGCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATCGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGCAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCTCCTGCGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID No.2SARS-CoV-2Delta mRNA疫苗S抗原的的mRNA序列:
AUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCCCUGGUGAGCAGCCAAUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUGCCCCCCGCCUACACCAACAGCUUCACAAGAGGGGUCUACUACCCCGACAAGGUGUUCAGAAGCAGCGUGCUGCACAGCACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCUCCAACGUGACCUGGUUCCACGCCAUCCACGUGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGAUUCGACAACCCCGUGCUGCCCUUCAACGACGGCGUGUACUUCGCUAGCACCGAGAAGAGCAACAUCAUCAGAGGCUGGAUCUUCGGCACCACCCUGGACAGCAAGACACAGAGCCUGCUGAUUGUGAACAACGCUACCAACGUGGUGAUCAAGGUGUGCGAGUUUCAGUUCUGCAACGACCCCUUCCUGGGGGUGUACUACCACAAAAACAACAAGAGCUGGAUGGAGAGCGGCGUGUACAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAGUACGUGAGCCAACCCUUCCUGAUGGACCUGGAGGGCAAGCAAGGCAACUUCAAGAACCUCAGAGAGUUCGUGUUCAAGAACAUCGACGGCUACUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCCAUCAACCUGGUGAGAGACCUGCCCCAAGGCUUCAGCGCCCUGGAGCCCCUGGUGGACCUGCCCAUCGGCAUCAACAUCACAAGAUUUCAGACCCUGCUGGCCCUGCACAGAAGCUACCUGACACCCGGCGACAGCAGCAGCGGGUGGACAGCCGGCGCUGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUCCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUUACCGACGCCGUCGACUGCGCCCUGGACCCCCUGAGCGAGACCAAGUGCACCCUGAAGAGCUUCACCGUGGAGAAGGGCAUCUAUCAGACAAGCAACUUCAGAGUGCAGCCCACCGAGAGCAUCGUGAGAUUCCCCAACAUCACCAACCUGUGCCCCUUCGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUCGCUAGCGUGUACGCCUGGAACAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGACUACAGCGUGCUGUACAACAGCGCUAGCUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGGGUCAGCCCCACCAAGCUGAACGACCUGUGCUUCACCAACGUGUACGCCGACAGCUUCGUGAUCAGAGGCGACGAGGUGAGACAGAUCGCCCCCGGGCAGACCGGCAAGAUCGCCGACUACAACUACAAGCUGCCCGACGACUUCACCGGCUGCGUGAUCGCCUGGAACUCCAACAACCUGGAUAGCAAGGUGGGCGGCAACUACAACUAUAGAUACAGACUGUUCAGAAAGAGCAACCUGAAGCCCUUCGAGAGAGACAUCAGCACCGAGAUCUACCAAGCCGGCAGCAAGCCCUGCAACGGCGUGGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUUCAGCCCACCAACGGCGUGGGCUAUCAGCCCUACAGAGUGGUCGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCACGCCCCUGCCACCGUGUGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCUGGUGAAGAACAAGUGCGUGAACUUCAACUUCAACGGCCUGACCGGCACCGGCGUGCUGACCGAGAGCAACAAGAAGUUCCUCCCUUUUCAGCAGUUCGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGAUGCCGUGAGAGACCCUCAGACCCUGGAGAUCCUGGACAUCACCCCCUGCAGCUUUGGCGGCGUGAGCGUGAUCACCCCCGGCACCAACACAAGCAACCAAGUGGCCGUGCUGUACCAAGGCGUGAACUGCACCGAGGUGCCCGUGGCCAUCCACGCCGAUCAGCUGACCCCCACCUGGAGAGUGUACAGCACCGGCAGCAACGUGUUUCAGACAAGAGCCGGCUGCCUGAUCGGCGCCGAGCACGUGAACAACAGCUACGAGUGCGACAUCCCCAUCGGCGCCGGCAUCUGCGCUAGCUAUCAGACACAGACCAACAGCAGACGGAGAGCUAGAAGCGUGGCUAGCCAAAGCAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAGAACAGCGUGGCCUACAGCAACAACAGCAUCGCCAUCCCCACCAACUUCACCAUCAGCGUGACCACCGAGAUCCUGCCCGUCUCCAUGACCAAGACAAGCGUGGACUGCACCAUGUACAUCUGCGGCGACAGCACCGAGUGCAGCAACCUGCUCCUGCAGUACGGCAGCUUCUGCACACAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAGGUGUUCGCCCAAGUGAAGCAGAUCUACAAGACCCCCCCCAUCAAGGACUUCGGCGGCUUCAACUUCAGCCAAAUCCUGCCCGACCCUAGCAAGCCUAGCAAGAGAAGCUUCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAGCAGUACGGCGACUGCCUGGGCGACAUCGCCGCUAGAGACCUGAUCUGCGCUCAGAAGUUCAAUGGCCUGACCGUCCUGCCCCCCCUGCUGACCGACGAGAUGAUCGCUCAGUACACAAGCGCCCUGCUGGCCGGCACAAUUACAAGCGGCUGGACAUUCGGCGCUGGCGCCGCCCUGCAAAUCCCCUUCGCCAUGCAGAUGGCCUACAGAUUCAACGGCAUCGGCGUGACACAGAACGUGCUGUACGAGAAUCAGAAGCUGAUCGCCAAUCAGUUCAACAGCGCCAUCGGCAAGAUCCAAGACAGCCUGAGCAGCACCGCUAGCGCCCUGGGCAAGCUGCAGAACGUGGUGAAUCAGAACGCCCAAGCCCUGAACACCCUGGUGAAGCAGCUGAGCAGCAACUUCGGCGCCAUCAGCUCCGUGCUGAACGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCCGAGGCCGAGGUGCAGAUCGACCGGCUGAUCACCGGCAGACUGCAGAGCCUGCAGACCUACGUGACACAGCAGCUGAUCAGAGCCGCCGAGAUCAGAGCUAGCGCCAACCUGGCCGCCACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGGCAGAGCAAGAGAGUGGACUUCUGCGGCAAGGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCCCCCCACGGCGUGGUGUUCCUGCACGUGACCUACGUGCCCGCCCAAGAGAAGAACUUCACCACCGCCCCCGCCAUCUGCCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCUAGAGAGGGCGUGUUCGUGAGCAACGGCACCCACUGGUUCGUGACACAGAGAAACUUCUACGAGCCUCAGAUCAUCACCACCGACAACACCUUCGUGAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUUGUGAACAAUACAGUCUACGACCCUCUGCAGCCCGAGCUGGACAGCUUCAAGGAGGAGCUGGACAAGUACUUCAAGAAUCACACAAGCCCCGACGUGGACCUGGGGGACAUCAGCGGCAUCAACGCUAGCGUGGUGAACAUUCAGAAGGAGAUCGACAGACUGAACGAGGUGGCCAAGAACCUGAACGAGAGCCUGAUCGACCUGCAAGAGCUGGGCAAGUACGAGCAGUACAUCAAGUGGCCCUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCCGGCCUGAUCGCCAUCGUGAUGGUGACCAUCAUGCUGUGCUGCAUGACAAGCUGCUGCAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCUCCUGCGGCAGCUGCUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGUGCUGAAGGGCGUGAAGCUGCACUACACCUGA
SEQ ID No.3SARS-CoV-2Delta mRNA疫苗S抗原的氨基酸序列:
MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID No.4SARS-CoV-2Delta RBD-HR/三聚体蛋白前体序列(信号肽-Trx标签-6His标签-EK酶切位点-RBD序列-HR1序列-HR2序列):
MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDSIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL
SEQ ID No.5编码SEQ ID No.4的核苷酸序列:
ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACACACAAGCAAGATGGTGAGCGCTATCGTGCTGTACGTCCTGCTGGCCGCTGCTGCTCACAGCGCTTTCGCTGCTGACTCCATCCACATCAAGGACAGCGACGACCTGAAGAACCGTCTGGCCGAGGCCGGTGACAAGCTGGTCGTCATCGACTTCATGGCCACTTGGTGCGGTCCTTGCAAGATGATCGGCCCTAAGCTGGACGAGATGGCTAACGAGATGTCCGACAGCATCGTGGTCCTGAAGGTGGACGTCGACGAGTGCGAGGACATCGCCACCGAATACAACATCAACAGCATGCCCACCTTCGTGTTCGTGAAGAACAGCAAGAAGATCGAGGAATTTTCCGGCGCTAACGTCGACAAGCTGCGTAACACCATCATCAAGCTGAAGCTGGCCGGCTCCGGCTCCGGCCACATGCATCACCACCACCACCATTCCTCCGGTGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCGGAGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGCTGTACAACTCCGCTAGCTTCTCTACTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAGACGAAGTCCGTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAAGATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAACCTGGACTCCAAGGTCGGTGGCAACTACAACTACCGGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTTCCAAGCCCTGCAACGGTGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCCAGCCAACCAACGGAGTCGGTTACCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAAAGCGTCAACTTCAACTTCAACGGTCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCTAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCACTGTCATCCACTGCCTCCGCTCTGGGAAAGCTGCAGGACGTCGTGAACCAGAACGCCCAGGCTCTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGAAGAACCACACCTCTCCTGACGTCGACCTGGGCGACATCAGCGGAATCAACGCTTCTGTCGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACCGCCTGAACGAAGTGGCCAAGAACCTGAACGAATCCCTGATTGACCTCCAAGAACTCTAA
术语缩写:
单磷酸脂质A(MPL);鲨烯水包油乳剂(MF59)、重组霍乱毒素(rCTB)、黄芪多糖(APS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、阳离子胆固醇(DC-Chol)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、CpG ODN(含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列,人工合成的CpG)。
附图说明
图1为实施例1mRNA序列结构图;
图2为实施例1mRNA疫苗制备示意图;
图3为实施例1重组蛋白结构示意图;
图4为试验例1的免疫程序及分组示意图;
图5为试验例2小鼠接种第0,21,42天抗RBD特异性抗体检测结果;
图6为试验例2小鼠接种第0,21,111天抗RBD特异性抗体检测结果;
图7为试验例3小鼠接种第0,21,42天免疫的假病毒中和抗体水平;
图8为试验例3小鼠接种第0,21,111天免疫的假病毒中和抗体水平;
图9为试验例3小鼠接种第0,21,111天免疫针对Omicron及其变异株的假病毒中和抗体水平;
图10为试验例4小鼠接种第0,21,42天免疫的血清阻断实验流式图;
图11为试验例4小鼠接种第0,21,42天免疫的血清阻断实验统计图;
图12为试验例4小鼠接种第0,21,111天免疫的血清阻断实验流式图;
图13为试验例4小鼠接种第0,21,111天免疫的血清阻断实验统计图;
图14为试验例5RBD特异性lL-4生成CD4+(上图)和CD8+(下图)记忆T细胞的代表性流式细胞术点阵图;
图15为试验例5通过ELISA分析细胞上清液中IL-4的水平结果图;
图16为试验例5RBD特异性IFN-γ生成CD4+(上图)和CD8+(下图)记忆T细胞的代表性流式细胞术点阵图;
图17为试验例5通过ELISA分析细胞上清液中IFN-γ的水平图;
图18为试验例5RBD特异性IL-2生成CD4+(上图)和CD8+(下图)记忆T细胞的代表性流式细胞术点阵图;
图19为试验例5CD8+CD44+IL-2细胞流式统计图;
图20为试验例5CD4+CD44+IL-2细胞流式统计图;
图21为试验例5CD4+CD44+CD62L-细胞流式统计图;
图22为试验例5CD8+CD44+CD62L-细胞流式统计图;
图23为试验例6T卵泡辅助细胞的代表性流式细胞术点阵图;
图24为试验例6T卵泡辅助细胞流式统计图;
图25为试验例6浆母细胞细胞的代表性流式细胞术点阵图;
图26为试验例6浆母细胞流式统计图;
图27为试验例6生发中心B细胞流式统计图。
图28为试验例7实验小鼠的鼻甲组织病毒载量;
图29为试验例7实验小鼠的气管组织病毒载量;
图30为试验例7实验小鼠的肺组织病毒载量。
具体实施方式
目前,mRNA和蛋白疫苗联合的序贯免疫的研究仍是空白。
本发明提供了抗SARS-CoV-2或其突变体感染的重组蛋白疫苗、mRNA疫苗,并将两种疫苗组合或联合使用,在本发明具体实施方式中,蛋白疫苗RBD-HR/三聚体在两剂mRNA疫苗接种后作为第三剂异源增强剂。
与用MF59样佐剂配制的重组蛋白相比,单次注射抗SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗后可产生更好的GC反应。然而,在本发明的研究中,发现三剂同源RBD-HR/三聚体疫苗和同源mRNA疫苗在GC应答中没有显著性。也有研究者发现,与接种了mRNA-1273的人相比,mRNA-Omicron加强剂不能引发更强的体液免疫和细胞免疫。此外,也通过研究显示出重组Omicron RBD的热稳定性和抗原性受损。因此,在本发明研究中,设计了基于Delta而不是Omicron的重组RBD蛋白,用于有效的对Delta变种的宽变种中和。通过实验验证,发现异源重组蛋白疫苗增强剂比同源mRNA疫苗提供了更强的免疫力和保护作用。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 mRNA疫苗和重组蛋白疫苗的制备
如图1所示,本发明以SARS-CoV-2突变株Delta毒株的全长S蛋白为基础,制备能够表达全长刺突蛋白的mRNA疫苗,其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示,mRNA序列如SEQ IDNo.2所示(图1),由油相(E1-1脂质、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2000和乙醇)和水相(mRNA柠檬酸钠溶液)按适当比例混合制备而成(图2),mRNA疫苗的内毒素小于15EU/剂或小于30EU/mL。
开发了一种重组三聚体并具有Delta衍生的受体结合域(RBD)蛋白疫苗(含L452R和T478K),制备RBD/HR三聚体蛋白,并将MF59样佐剂和RBD/HR三聚体蛋白等体积混合,制备RBD-HR/三聚体重组蛋白疫苗(图3)。鉴于MF59样佐剂在抗体和T细胞反应中的广泛潜力,选择MF59样佐剂作为佐剂来提高RBD-HR/三聚体蛋白的免疫原性。
具体制备过程如下:
(1)RBD/HR三聚体重组蛋白疫苗的制备:
1.RBD/HR三聚体蛋白的构建设计
因新冠病毒SARS-CoV-2的S蛋白为定位于膜上的蛋白,因此,为了保证模拟其分泌过程,在构建新冠病毒S-RBD-HR蛋白表达构建时,在蛋白的N-端加入了GP67的信号肽序列,以辅助蛋白的分泌表达,这一信号肽将在蛋白分泌的过程中自发被昆虫细胞所切除;同时,在GP67信号肽后加入了草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,S.frugiperda)的硫氧还蛋白(Trx)标签用以辅助S-RBD-HR折叠,加入了6xhis标签用以帮助后续纯化,加入了EK酶酶切位点,用以切除Trx和6xhis标签。此蛋白表达构建设计,通过EK酶切,将能够移除所有非S-RBD-HR的冗余氨基酸。其蛋白氨基酸设计序列如SEQ ID No.4所示。
基于pFastBac1载体(氨苄抗性)构建S蛋白的表达载体,使用BamHI,HindIII酶切位点插入到pFast-bacI载体中,按昆虫细胞偏爱密码子优化。
2.重组杆状病毒的扩增
采用Bac-to-Bac表达系统,利用细菌转座子原理,通过Tn7转座元件产生位点特异性转座,在大肠杆菌(DH10Bac,含bacmid(卡那霉素抗性)和helper plasmid(四环霉素抗性))内完成重组bacmid的构建。提取重组成功的bacmid,用碧云天的转染试剂Lipoinsect将其转染至sf9昆虫细胞以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。转染72h后收取第一代病毒,然后进行P2到P4代病毒的扩增,利用P3或P4代病毒表达蛋白。
3.蛋白表达
利用P3或P4代病毒感染Hi5昆虫细胞(sf9细胞),感染复数(MOI为0.5-10),培养48-72h后收集上清。最佳收获时间根据毒种病毒量和细胞状态可能每次都有差异,一般以镜检50%左右细胞病变为宜。
4.蛋白纯化
收获的培养上清4℃高速离心,0.22um滤膜过滤,采用亲合纯化方法(Histrap镍柱)初步纯化重组蛋白,然后利用MonoQ离子柱和Superdex 200 10/300GL分子筛精纯重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,纯度要求达到95%以上。经分子排阻层析等手段纯化后,得到了纯度较好、可用于后续免疫保护研究的RBD/HR三聚体蛋白抗原。
将MF59样佐剂和RBD/HR三聚体蛋白等体积混合,制备RBD-HR/三聚体重组蛋白疫苗。
(2)mRNA疫苗制备:
采用微流控技术制备能够表达全长刺突蛋白的mRNA疫苗。将E1-1脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000溶于无水乙醇中并以摩尔比50:10:38.5:1.5的比例配成一定体积的E1-1浓度为18mg/mL的有机相溶液,同时用枸橼酸缓冲液将表达全长刺突蛋白的mRNA(SEQIDNo.2)配制成一定体积的mRNA含量为0.6mg/mL的水相,通过微流控设备以水相和有机相流速比为3:1,总流速为9mL/min制备mRNA-LNP复合物,经磷酸盐缓冲液(PBS)超滤除去乙醇后,即得能够表达全长刺突蛋白的mRNA疫苗。
以下通过试验例证明本发明的有益效果。
试验例1小鼠免疫实验
6-8周龄的雌性NIH小鼠购买自维通利华公司,小鼠饲养在无特殊病原体的环境中。如图4所示,NIH雌性小鼠随机分为PBS组、同源mRNA组(mRNA)、同源RBD-HR/三聚体组(RBD-HR)和异源组(mRNA+RBD-HR)4组。
小鼠按同种或异源给药顺序给药。NIH小鼠在第0、21天分别以1、5、10μg mRNA疫苗免疫,第42天分别以对应剂量mRNA或10μg RBD-HR疫苗免疫;作为对照组,小鼠分别接种同类型、同剂量的3剂PBS、mRNA和RBD-HR/三聚体疫苗免疫。即同源mRNA组每只小鼠三次分别接种1μg或5μg或10μg mRNA疫苗,同源RBD-HR组每只小鼠三次均接种10μg RBD-HR疫苗,异源组前两次均接种同剂量的mRNA疫苗,第三次接种10μg RBD-HR疫苗。
为了测试RBD-HR疫苗在两剂mRNA疫苗后较长时间内对免疫应答的影响,我们在第111天用第三剂增强剂对小鼠进行免疫。在第56、84天、第125、153天通过眼眶静脉采集血液样本,在4℃下以6000转/分离心10分钟。血清样品在使用前保存于-20℃。第三次免疫7天后处死小鼠并取脾脏和淋巴结。将脾脏组织和淋巴结均质,用淋巴细胞分离液制备单细胞悬液。
试验例2抗RBD特异性抗体的检测
用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中RBD特异性抗体。首先,用重组RBD蛋白(0.1μg/孔)包被96孔NUNC-MaxiSorp平板(Thermo Fisher Scientific,USA),4℃,12小时。用1×PBST(1×PBS+0.1%Tween-20)洗三次,用1%牛血清白蛋白(BSA)在37℃阻隔1小时。培养皿与2倍稀释梯度的血清样品在室温下孵育1小时,然后通过1×PBST洗涤三次。在培养皿中加入1:10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗小鼠IgG抗体,室温下孵育1小时,洗5次。在培养皿中加入3,3',5,5'-四甲基联苯二胺(TMB),暗处孵育10分钟。用1 M H2SO4(100μl/孔)停止反应,在450nm处测定吸光度。
如图5和图6所示,在接种短时间间隔(第0,21,42天免疫)(图5)和长时间间隔(第0,21,111天免疫)(图6)的免疫程序中,异源性免疫接种方案相对于同源性接种三剂mRNA疫苗,可以产生更高水平的抗RBD结合抗体水平。
试验例3假病毒中和试验
为评估异源疫苗加强剂是否比同源疫苗加强剂具有更好的保护效果,在同源mRNA组小鼠每次肌肉注射1μg mRNA疫苗,并于第一次免疫后第84天和第153天(长期接种)收集血清,进行假病毒中和试验。
SARS-CoV-2假病毒(GFP-Luciferase)、BA.3和BA.4/5假病毒及其他新冠病毒变异株假病毒购自诺唯赞生物科技有限公司(中国)和吉满生物科技上海有限公司(中国)。NIH小鼠肌肉注射mRNA疫苗。在60℃灭活30分钟后,用完全二甲醚培养基的三倍梯度稀释血清。稀释后的血清与荧光素酶假病毒(野生型,B.1.1.7,B.1.351,P.1,B.1.617,C.37,BA.1,BA.2,BA.2.12.1,BA.3,BA.4/5)在37℃孵育1小时。将1.2×104 293T/ACE2细胞添加到每个孔中表达报告基因。48小时后,去除感染细胞上清后,每孔加入100ul与PBS1:1预混的平衡至室温的荧光素底物(50ul PBS+50ul荧光素底物),反应2min左右。最后,用荧光测定仪检测化学发光。
如图7所示,较短时间免疫程序中,异源性序贯免疫组相比同源性mRNA疫苗免疫组能够产生更高的广谱性中和抗体水平。
如图8所示,在长时间间隔的免疫程序中,异源性接种组相对于同源性mRNA疫苗组,也产生了更高的广谱性中和抗体滴度。
如图9所示,长时间间隔免疫程序中,异源性免疫组可以产生针对包括BA.4/5变异株在内的,对Omicron及其变异株更高的中和抗体水平。
试验例4RBD蛋白与ACE2受体结合的阻断实验
用RBD-Fc(Omicron)蛋白检测与ACE2受体的结合。将RBD-Fc蛋白(0.3μg/ml)连续稀释到免疫血清(mRNA疫苗免疫剂量为1μg/次/只,蛋白免疫剂量为10μg/次/只)中,37℃孵育30分钟。然后分别加入293T/ACE2细胞(5×104),室温孵育30分钟。细胞用BPBS(PBS中添加1% BSA)冲洗3次。将pe标记的抗人IgG-Fc抗体加入细胞,4℃暗处孵育30分钟。采用流式细胞仪测定结合浓度,并用NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)对结果进行分析。
如图10和图11所示,21天时间间隔的免疫程序中,第三剂异源性RBD/HR三聚体加强针可以有效加强小鼠血清的阻断hACE2的结合能力,提高阻断率。
如图12和图13所示,在第二剂接种后90天,接种第三剂加强针的免疫程序中,第三针异源性RBD/HR三聚体疫苗加强针相对于第三剂同源mRNA疫苗,同样可以有效加强小鼠血清的阻断hACE2的结合能力,提高阻断率。
综上,为了验证抗病毒中和效用的潜在机制,我们采用流式细胞术检测细胞表面ACE2受体与RBD-Fc(Omicron)结合的阻断。与两个不同时间间隔的免疫方案的假病毒试验结果一致,异源接种也显示出RBD-Fc(Omicron)与人ACE2受体之间的抑制率高于同源mRNA接种。值得注意的是,较短的方案的抑制率更好,这强调了在适当的时间接受强化免疫的重要性。这些结果表明,与mRNA疫苗的同源疫苗相比,含有蛋白质亚单位的异源性疫苗可能是诱导更强体液免疫的更好策略。
试验例5脾脏淋巴细胞流式检测
脾脏淋巴细胞在1640培养基中培养72h,进行细胞内细胞因子染色(ICS)。在1640培养基中加入10%胎牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、1mM丙酮酸(均来自美国Gibco公司)、50μMβ-巯基乙醇和20U/ml IL-2(均来自Sigma-Aldrich公司)。此外,在活性细胞中添加RBD(10μg/孔)。为了阻止细胞内细胞因子的分泌,brefeldin A(BFA,BDBiosciences)在染色前孵育6小时。细胞在1×PBS冷液中洗涤,在4℃下用CD4(BrilliantViolet 421)、CD8(FITC)、CD44(Brilliant Violet 510)、B220(PerCP/Cyanine5.5)和MHC-II(BV711)(均来自BioLegend)染色30分钟。然后将细胞固定并渗透,以促进细胞内用抗IFN-γ(PE)、抗IL-4(Brilliant Violet 421)和IL-2(APC)染色(所有流式抗体来自BioLegend)在室温下放置2小时。用冷的1×PBS洗细胞,再用流式细胞术检测。
T细胞反应是临床结果的主要决定因素,对预防SARS-CoV-2具有重要作用。同源mRNA组小鼠每次肌注5μg mRNA。检测了CD4+和CD8+T细胞对SARS-CoV-2RBD的反应。制备脾脏淋巴细胞的单细胞悬液,以评价RBD-HR/三聚体异源疫苗对细胞免疫反应的进一步影响。用RBD蛋白在37℃刺激72h后,用流式细胞仪和ELISA检测分泌的细胞因子(IL-4和IFN-γ)。实验发现,异源疫苗和同源蛋白疫苗组分泌的IL-4(图14,15)和IFN-γ(图16,17)水平较高,说明RBD-HR/三聚体疫苗可诱导强烈的T细胞应答。
据报道,mRNA疫苗可引起与IL-2相关的固态T细胞应答,而蛋白质疫苗则不能。值得注意的是,异体疫苗接种和同源mRNA疫苗接种诱导了类似的IL-2相关CD8+T细胞应答(图18-20)。记忆T细胞反应对于加速和增强免疫反应至关重要,特别是当再次感染相同的病原体时显得更为重要。此外,免疫T细胞记忆反应也可提供对多种变异的保护性免疫。我们在第49天评估了脾脏效应记忆(CD44+CD62L-)T细胞的亚群。CD4+和CD8+效应记忆T细胞数量均高于mRNA和RBD-HR/三聚体同源疫苗接种组(图21,22)。总之,RBD-HR/三聚体异体疫苗接种诱导的细胞免疫能力强于同源mRNA疫苗。
试验例6脾脏记忆性T细胞的检测
脾脏淋巴细胞单细胞悬液制备完成后,我们用CD3(PerCP/Cyanine5.5)、CD62L(Brilliant Violet 421)、CD4(APC)、CD8(FITC)、CD69(PE-cy7)、抗小鼠CD44(BrilliantViolet 510)、CD95(FITC)、B220(PE-cy7)、GL7(PE)、CD4(Brilliant Violet 510)、CD8(Brilliant Violet 510)、CD19(Brilliant Violet 421)、CD138(APC)、CXCR5(APC)、PD1(Brilliant Violet 421)和抗小鼠CD19(PE)染色,对Tfh细胞、GC B细胞、浆母细胞和效应记忆T细胞进行染色(流式抗体均来自BioLegend)。细胞在黑暗中4℃染色。30分钟后,用1×PBS冲洗细胞,用流式细胞仪检测。
持久的记忆反应在再次感染时提供快速有效的保护性免疫。同源mRNA组小鼠每次肌注5μg mRNA。为了检测外源疫苗是否会诱导RBD-HR/三聚体进一步的记忆反应,我们分析了T卵泡辅助细胞效应(Tfh)、浆母细胞反应和生发中心(GC)效应的形成,这些对持久记忆反应至关重要。此外,GC B和Tfh细胞与中和抗体反应密切相关。结果表明,RBD-HR/三聚体的异体接种可以增强Tfh(图23,24)、血浆母细胞(图25,26)和GC-B应答(图27)。值得注意的是,异源接种组中Tfh和GC B细胞的频率最高。因此,这些结果表明,RBD-HR/三聚体异体疫苗比mRNA疫苗的增强剂能诱导更大的持久记忆免疫应答。
试验例7活病毒攻毒试验
小鼠按同种或异源给药顺序给药。小鼠在第0、21天5μg mRNA疫苗免疫,第42天分别以对应剂量5μg mRNA或10μg RBD-HR疫苗免疫;PBS组作为对照组。
为了测试RBD-HR疫苗在两剂mRNA疫苗后对小鼠的保护性,在第56天进行活病毒攻毒。以滴鼻方式进行攻毒。所有实验动物使用Omicron(BA.1)通过鼻腔滴鼻的方式进行攻毒,每只小鼠攻毒量为1×106TCID50。小鼠在攻毒后第4天解剖取右肺叶、鼻甲、气管组织进行病毒载量检测,组织剪碎后混合,称重,称取接近100mg的组织,以800μL Trizol进行组织匀浆。组织匀浆取其中400μL提取RNA,最终溶解与50μL无核酸酶水中,保存于-80℃备用。RNA用于后续qRT-PCR(一步法)检测病毒载量。使用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测病毒基因组RNA(genomic RNA,gRNA)。采用的引物和探针靶标为SARS-CoV-2的N基因。正向:SEQID No.6 5'-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3';反向:SEQ ID No.75'-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3';探针:SEQ ID No.85'-FAM-ACNCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1-3'。
结果发现PBS组实验小鼠鼻夹、气管、肺组织(图28-30)中有高水平的病毒载量,mRNA疫苗组病毒载量下降显著,仅有低水平的病毒残留,RBD-HR序贯mRNA疫苗组各组织中均未检测到病毒载量,说明在小鼠中RBD-HR序贯mRNA疫苗能更好地抑制病毒的复制并清除残余病毒。
综上,在本发明中,自组装重组RBD-HR疫苗的第三剂异源增强剂与两种mRNA疫苗启动可以增强体液和细胞免疫反应,表现为更高的抗RBD IgG水平,更强的中和抗体和IFN-γ-分泌T细胞。此外,异源接种比同源RBD-HR和mRNA接种能诱导更强的效应记忆反应。此外,异体疫苗接种诱导的淋巴母细胞反应高于同源mRNA组,诱导的GC-B细胞和Tfh反应高于两组,表明异体疫苗接种可诱导更高的持久记忆反应,且与mRNA同源序贯相比,RBD-HR异源序贯提供了更好的保护作用。因此,本发明提供了一种异源增强免疫新策略,第三种异源蛋白亚基增强剂(RBD-HR/三聚体疫苗)在两剂mRNA疫苗后成为合适的加强剂候选疫苗。
Claims (18)
1.预防和/或治疗SARS-CoV-2或其突变体感染的mRNA疫苗,其特征在于:是含有以抗SARS-CoV-2突变体感染的mRNA疫苗为活性成份。
2.预防和/或治疗SARS-CoV-2或其突变体感染的重组蛋白疫苗,其特征在于:其含有抗SARS-CoV-2突变体感染的重组蛋白疫苗为活性成份。
3.如权利要求1所述的mRNA疫苗,其特征在于:mRNA序列含有编码SARS-CoV-2突变体的S蛋白的全长核酸序列。
4.如权利要求1所述的mRNA疫苗,其特征在于:编码SARS-CoV-2突变体的S蛋白的全长核酸序列如SEQ ID No.1或/和SEQ ID No.2所示;或是与SEQ ID No.1或/和SEQ IDNo.2具有同源性且相同或相似的生物学活性,且在SEQ ID No.1或/和SEQ ID No.2序列经取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸获得的变体;优选地,所述突变体序列是在SEQ ID No.1或/和SEQ ID No.2序列经取代和/或缺失和/或插入1~400个氨基酸获得的变体;优选地,所述突变体序列是在SEQ ID No.1序列经取代和/或缺失和/或插入5~30个氨基酸获得的变体。
5.如权利要求2所述的重组蛋白疫苗,其特征在于:蛋白和/或蛋白前体含有SARS-CoV-2或其突变体的S蛋白中至少一种RBD序列与至少一种HR序列的蛋白。
6.如权利要求2所述的重组蛋白疫苗,其特征在于:蛋白和/或蛋白前体含有如序列SEQID No.4所示的氨基酸序列;或含有与SEQ ID No.4具有同源性且相同或相似的生物学活性,且在SEQ ID No.4序列经取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸获得的变体;优选地,所述RBD序列是在SEQ ID No.4序列经取代和/或缺失和/或插入1~400个氨基酸获得的变体;优选地,所述RBD序列是在SEQ ID No.4序列经取代和/或缺失和/或插入5~30个氨基酸获得的变体。
7.抗SARS-CoV-2或其突变体感染的组合物,其特征在于:含有以mRNA疫苗和重组蛋白疫苗为活性成分的制剂;其中,所述的mRNA疫苗为权利要求1、3或4所述的mRNA疫苗;所述的重组蛋白疫苗为权利要求2、5或6所述的重组蛋白疫苗。
8.抗SARS-CoV-2或其突变体感染的联合用药物,其特征是:其含有分别、同时或序贯给药的抗SARS-CoV-2或其突变体感染的mRNA疫苗和重组蛋白疫苗;其中,所述的mRNA疫苗为权利要求1、3或4所述的mRNA疫苗;所述的重组蛋白疫苗为权利要求2、5或6所述的重组蛋白疫苗。
9.如权利要求1所述的mRNA疫苗或权利要求2所述的重组蛋白疫苗或权利要求8所述的联合用药物,其特征在于:所述给药方式为肌肉注射剂、滴鼻剂、喷雾剂、鼻喷给药剂或吸入剂。
10.如权利8所述的联合用药物,其特征在于:所述的重组S蛋白中RBD序列与HR序列形成的蛋白能够自发形成三聚体。
11.如权利要求8所述的联合用药物,其特征在于:所述同源性氨基酸序列选取Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron,Omicron的RBD序列中的至少一种。
12.如权利要求10所述的联合用药物,其特征在于:所述蛋白前体,是在所述抗SARS-CoV-2或其突变体感染的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签;优选地,所述信号肽包括S蛋白或其突变体自身的信号肽和/或在自身信号肽前额外添加的人tPA信号肽;优选地,所述的蛋白标签选自如下至少一种:组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签;更优选地,所述蛋白标签为Trx标签和/或6His标签。
13.如权利要求8所述的联合用药物,其特征在于:在所述抗SARS-CoV-2或其突变体感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区;优选地,所述的蛋白酶选自如下至少一种:肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。
14.权利要求2所述的重组蛋白疫苗采用的宿主细胞,其特征在于:所述宿主细胞采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种;优选地,所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种;优选地,所述的哺乳动物细胞为CHO细胞或HEK293细胞。
15.如权利要求1所述的mRNA疫苗或权利要求2所述的重组蛋白疫苗,其特征在于:所述mRNA疫苗和/或重组蛋白疫苗,还包括药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
16.如权利要求13所述的联合用药物,其特征在于:所述重组蛋白疫苗还包括药学上可接受的辅料或者辅助性成分,所述的辅助性成分为免疫佐剂;优选地,所述的免疫佐剂选自如下至少一种:鲨烯水包油乳剂、铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、细菌毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料;进一步地,所述免疫佐剂满足以下至少一项:所述的鲨烯水包油乳剂为MF59;所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种;所述的钙盐为磷酸三钙;所述的植物皂苷为QS-21或ISCOM;所述的植物多糖为黄芪多糖;所述的细菌毒素选自重组霍乱毒素、白喉毒素中至少一种;所述的脂质选自如下至少一种:磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺;所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种:(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、CpG ODN。
17.权利要求1、3、4、9任一项所述的mRNA疫苗、权利要求2、5、6、9任一项所述的重组蛋白疫苗、权利要求7所述的组合物或权利要求8、9-13任一项所述的联合用药物制备预防和/或治疗SARS-CoV-2或其突变体感染的药物中的用途。
18.权利要求1、3、4、9任一项所述的mRNA疫苗、权利要求2、5、6、9任一项所述的重组蛋白疫苗、权利要求7所述的组合物或权利要求8、9-13任一项所述的联合用药物在制备治疗和/或预防新冠病毒变异株的感染或致病药物中的用途;进一步地,所述新冠病毒变异株包括:Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron,Omicron中的至少一种。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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