MXPA03002415A - Metodo para tratar a un paciente que utiliza una construccion de tejido conectivo cultivado. - Google Patents

Abstract

La invencion se dirige a un metodo para reemplazo y reparacion de tejidos que utiliza una construccion de tejido conectivo bioremodelable, cultivado. La invencion se dirige especificamente a un metodo para reparar la fibrosis anular del disco intervertebral, despues de la cirugia por discoectomia en donde la fibrosis anular se ha abierto, con una construccion de tejido conectivo bioremodelable, cultivado.

Description

MÉTODO PARA TRATAR A UN PACIENTE UTILIZANDO UNA CONSTRUCCIÓN DE TEJIDO CONECTIVO CULTIVADO CAMPO DE LA INVENCION La invención está en el campo de la ingeniería de tejidos, en particular con el uso de una construcción de tejido conectivo vivo, cultivado, en indicaciones para reparación quirúrgica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las lesiones de disco intervertebral son dolorosas, debilitantes y costosas " para el paciente. El disco intervertebral está situado entre las superficies articulares de cuerpos vertebrales adyacentes. El disco consta de capas concéntricas de fibras de colágeno, la fibrosis anular, y el núcleo pulposo central, que le rodea. El núcleo pulposo consta de una matriz de tejido conectivo de fluido viscoso y células. Las células de núcleo pulposo, las células physaliphorous , se dispersas en agregados irregulares en toda la matriz extracelular que consiste de sustancias fundamentales. Sobre el exterior de las vértebras, la fibrosis anular y las vértebras están apoyadas periféricamente mediante ligamentos longitudinales que corren paralelos a la espina . El disco intervertebral funciona en la forma de un atenuador de choque hidráulico con el núcleo pulposo que actúa como el fluido hidráulico. Con el avance de la edad, las fibras de colágeno de la fibrosis anular se adelgaza y se debilita. El núcleo pulposo puede romperse a través del anillo posteriormente y comprimir las raices nerviosas, una condición comúnmente conocida como "disco desviado". Los discos implicados en las lesiones cervicales están entre la quinta y la sexta (C5-C6) vértebras y la sexta y la séptima (C6-C7) vértebras; y en las lesiones de la espalda baja, con mayor frecuencia se afectan la cuarta y quinta vértebras lumbares (L4-5) o la primera vértebra lumbar y la primera vértebra sacral (L5-S1) . En los casos en donde no hay ruptura de disco, la compresión del nervio puede estar provocada por formación osteocitica a partir de la enfermedad degenerativa de discos. El osteocito sobresale en el foramen intervertebral y comprime la raíz nerviosa dando por resultado en dolor crónico continuo o intermitente. Cuando un cirujano elimina la totalidad o parte del disco roto de la espalda, agranda la perforación en la fibrosis anular a través de la cual retira el disco roto y suelta el tejido del disco en el espacio intermedio. El orificio formado nunca sana lo cual permite que haya susceptibilidad de una ruptura adicional del disco a través del orificio persistente, asi como también, una cascada inflamatoria que resulta de la exposición del interior del disco al espacio epidural . La inflamación y la fibrosis se presenta en el espacio intervertebral, dando por resultado con frecuencia en un cambio en los tejidos circundantes que incluyen las vértebras, placas hialinas, duramadre y la médula espinal . Cada año se realizan aproximadamente 200,000 disco-ectomias . La reparación biológica del orificio anular o defecto es esencial para mejorar la norma de cuidado del paciente con lesión de disco intervertebral. La presente invención se dirige a la reparación de la fibrosis anular mediante el uso de una construcción de tejido conectivo cultivado que, cuando se aplica quirúrgicamente al defecto en el anillo, cierra el orificio para formar una barrera y evitar la inflamación y una ruptura adicional del disco .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención es un método para reparar un disco intervertebral lesionado de un paciente utilizando una construcción de tejido conectivo y cultivado. El método incluye modificar la abertura en la fibrosas anular del disco intervertebral creada por la erniación del disco y retirar selectivamente el núcleo pulposo, luego injertar una construcción de tejido conectivo cultivado en la abertura. El cierre de la fibrosis anular es importante para evitar una nueva herniación del disco y mitigar la respuesta inflamatoria y la fibrosis epidural en la cavidad que da por resultado en daño al nervio. La construcción de tejido conectivo cultivado es un tejido cultivado viviente que contiene células de tejido conectivo y matriz extracelular , tal como por ejemplo, colágeno. Debido a las propiedades similares a tejido de la construcción de tejido cultivado, éste es bio-remodelable, lo que significa que es capaz de experimentar repoblación celular mediante el crecimiento hacia adentro de células hospederas, vascularización, y reorganización y reemplazo de los componentes de la matriz de la construcción implantada mediante las células hospederas y las enzimas.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa un aparato para formar un tejido conectivo equivalente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se dirige a un método para reemplazo y reparación de tejidos utilizando una construcción de tejido conectivo cultivado. La construcción de tejido conectivo comprende colágeno y células vivientes y por lo tanto es bio-remodelable , lo que significa que cuando se injerta a un paciente en necesidad de reemplazo y reparación de tejido inmediatamente funciona como un tejido de reemplazo mientras que al mismo tiempo comienza a integrarse con el tejido del paciente en el sitio de implante para formar un nuevo tejido. En la modalidad más preferida, la invención se dirige a un método para reparar la fibrosis anular del disco intervertebral, después de la cirugía por disco-ectomía en donde se ha abierto la fibrosis anular, con una construcción de tejido conectivo cultivado. La construcción de tejido conectivo cultivado se utiliza para cerrar la pared anular después del retiro del tejido del disco intervertebral dañado, tal como por ejemplo, el núcleo pulposo y la fibrosis anular, después de una disco-ectomía de múltiples niveles, para la corrección de deformidades espinales, cirugía reconstructiva espinal o retiro completo o parcial de un disco dañado debido a una lesión tal como por ejemplo, desgarre anular, lesión, ruptura, colapso, hernia o perforación. El cierre del anillo mediante este método sella la cavidad para reducir la respuesta inflamatoria y mitigar la fibrosis epidural post-operatoria que sigue naturalmente después del retiro del tejido de la cavidad. Este cierre de la fibrosis anular también evita el prolapso posterior del disco por el resto del tejido del disco intervertebral que permanece en el espacio intervertebral y retarda la degeneración adicional del disco. El método también incluye el cierre de la fibrosis anular utilizando una construcción de tejido conectivo cultivado después de la implantación de un reemplazo de disco. El apoyo de las vértebras con un reemplazo de disco o un separador después del retiro del disco algunas veces se realiza para que el disco intervertebral mantenga la función y evitar el daño al nervio. El reemplazo se proporciona al espacio intervertebral a través de una abertura hecha en la fibrosis anular, ya sea la misma utilizada para tener acceso al disco dañado o una abertura adicional. Los reemplazos de disco se utilizan para mantener la altura espacial normal del disco y evitar el impacto de las articulaciones de las facetas posteriores. La presión sobre los nervios espinales puede provocar dolor o parálisis en el área de su distribución. Los implantes separadores funcionales transmiten y atenúan las fuerzas de compresión y torsionales y estabilizan la articulación. Los materiales para el reemplazo de discos pueden incluir metales, aleaciones metálicas, sólidos sintéticos y tramas, e hidrogeles, siempre y cuando sean biocompatibles con los tejidos del paciente. Para retirar el disco dañado, se puede utilizar cualquier técnica conocida en este campo de retiro de discos intervertebrales, incluyendo de manera enunciativa: procedimientos de disco-ectomia, discotomia, laminectomia o laminotomia. Dependiendo del tipo y grado de lesión del disco, se puede tener acceso al disco intervertebral mediante cualquiera de varias formas que incluyen la anterior, posterior, posterior lateralmente. El método para tener acceso al disco intervertebral incluye técnicas de disco-ectomía mediante laparotomía. El acceso a través de la fibrosis anular incluye procedimientos uniportales y multiportales , en donde se producen una o más aberturas en la fibrosis anular para retirar el material del disco e implantar y poner en posición una prótesis separadora intervertebral. Después de que se realiza la disco-ectomía en el paciente, la construcción de tejido conectivo cultivado se inserta en el orificio creado en la fibrosis anular creada por el procedimiento quirúrgico para sellar la región interior del disco intervertebral. Dependiendo de la talla del paciente y el tamaño del orificio en el anillo, se pueden utilizar una o más piezas para obturar el orificio con las piezas mantenidas en el lugar mediante presión impuesta por los tejidos ci cundantes. Opcional y adicionalmente , se aplica una construcción de tejido conectivo cultivado sobre la abertura y se asegura en su lugar a lo largo del límite del tejido de la abertura y la construcción. Cuando se aplica la construcción sobre la abertura en el anillo, la construcción se puede asegurar en su lugar mediante sutura o adhesivo quirúrgico, tal como por ejemplo, cola vegetal u otros adhesivos biológicamente compatibles utilizados en los procedimientos quirúrgicos . Una vez que se completa el procedimiento para injertar la cons rucción, la misma asume inmediatamente la función como una barrera entre la cavidad interior del núcleo pulposo y la exterior de la fibrosis anular. En otro método preferido de la invención, se utiliza una construcción de tejido conectivo cultivado en la reparación quirúrgica del sistema nervioso central. La construcción del tejido conectivo cultivado se utiliza para sellar la duramadre que cubre el cerebro y la médula espinal. La construcción de hoja es una forma adecuada para cerrar los defectos durales después de una lesión o cirugia espinal o craneal para mantener la separación del interior del sistema nervioso central de otras células y tejidos corporales. La construcción de tejido conectivo cultivado es bioremodelable , lo que significa que capaz de experimentar una repoblación celular mediante el crecimiento hacia adentro de células hospederas, vascularización, y reorganización y reemplazo de los componentes matriz de la construcción implantada por las célula y enzimas hospederas. La prótesis de injerto retiene sus características funcionales mientras que las células del paciente remodelan todo, o prácticamente toda la construcción para integrarla con el tejido hospedero,, y como tal, es funcional como un análogo del tejido que repara o reemplaza. La construcción de tejido conectivo cultivado comprende células de tejido conectivo unidas mediante una matriz extracelula , principalmente de colágeno. El aspecto de la matriz extracelular de la construcción puede variar en la organización y composición, y todavía calificar como una construcción de tejido conectivo para utilizarse en el método de la invención. La construcción de tejido conectivo puede ser una retícula de colágeno contraído que contiene fibroblastos como se describe por Bell en la patente de los Estados Unidos No. 4, 485, 096 o por Kemp, et al. en la patente de los Estados Unidos No. 5,536,656 en donde la retícula de colágeno contraído se coloca sobre un gel de colágeno acelular, la descripción de las mismas se incorpora en la presente como referencia. Otra construcción para utilizarse en el método es una construcción de tejido tratado por bioingeniería de células cultivadas y componentes matriz extracelulares producidos endógenamente sin la necesidad de componentes matriz exógenos o un apoyo de red de miembros de andamio tales como aquellos descritos en la publicación del PCT No. WO 00/29553 de Murphy, et al., la exposición de la misma se incorpora en la presente como referencia. También se pueden utilizar las construcciones de tejido conectivo, tales como por ejemplo, aquellos que incorporan un miembro de trama sintética o bio-reabsorbible que tiene un extremo unido de fibroblastos cultivados que lo cubre con la matriz producida endógenamente tal como por ejemplo, aquellos descritos por las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,580,781, 5,443,950, 5,266,480, 5,032,508, 4,963,489 de Naughton, et al., una matriz de colágeno fibroso que contiene células cultivadas en la misma, como se describe por las patentes de los Estados ünidos Nos. 4,505,266 y 4,280,954 de Yannas, et al. se pueden utilizar como un componente de matriz que se cultiva con células no halogenéicas para repoblar la construcción, materiales xenogenéicos , tales como por ejemplo, dermis des-epidermalizada y des-celularizada, y otros tejidos de hoja plana que se hayan limpiado o determinantes antigénicos y desechos celulares. Los tipos celulares preferidos para utilizarse en esta invención se derivan de mesénquima. Los tipos celulares más preferidos son fibroblastos, células del estromales, y otras células de tejido conectivo de apoyo, o, como en la modalidad más preferida, fibroblastos humanos. Las cepas celulares de fibroblasto humano se pueden derivar de varias fuentes entre las que se incluyen de manera enunciativa prepucio de niño recién nacido, dermis, tendón, pulmón, cordones umbilicales, cartílago, uretra, estroma corneal, mucosa oral e intestino. ün tipo del fibroblasto preferido se deriva de la dermis. Las células humanas pueden incluir aunque no necesitan estar limitadas a: fibroblastos, células de músculo liso, condrocitos y otras células de tejido conectivo de origen del mesenquimatoso. Las células progenitoras embrionarias, tales como por ejemplo, las células de tallo mesenquimatoso, se pueden utilizar en la invención para preparar la construcción cultivada y se pueden inducirse ya sea in vitro o in vivo para diferenciar el desarrollo en el tejido deseado. Se apreciará por el técnico experto que la construcción de tejido conectivo cultivado puede contener, ya sea por adición intencional o por resultado de cultivo de fibroblastos provenientes de fuentes primarias, otras células encontradas en el tejido conectivo y otros componentes de matriz de extracelular . Se prefiere, aunque no se requiere, que el origen de la célula productora de matriz en la producción de la construcción de tejidos se derive de un tipo de tejido que se parezca o se imite después del empleo del método de cultivo de la invención. Por ejemplo, una construcción se cultiva con fibroblastos para formar una construcción de tejido conectivo viviente; o mioblastos, para una construcción de músculo esquelético. Para fabricar una construcción de tejido se puede utilizar más de un tipo celular. Aunque se prefieren células humanas para utilizarse en la invención, las células que se utilizaran en el método de la invención no se limitan a células provenientes de fuentes humanas. Se pueden utilizar células provenientes de otras especies mamífero entre las que se incluyen de manera enunciativa: fuentes equina, canina, porcina, bovino, felina, caprina, y ovina. También se pueden utilizar células de múrido y las células provenientes de fuentes de roedores. Las células donadoras pueden variar en desarrollo y edad. Las células se pueden derivar de tejidos donadores de embriones, recién nacidos, o individuos mayores entre los que se incluyen adultos.

Además, también se pueden utilizar en esta invención, células manipuladas por ingeniería genéticamente que se transfecten espontánea, química o viralmente. Para aquellas modalidades que incorporan más de un tipo celular, se pueden utilizar mezclas de células normales y modificadas o transíectadas genéticamente, y se pueden utilizar mezclas de células de dos o más especies o fuentes de tejido, o ambos. Se pueden utilizar células recombinantes o producidas por ingeniería genética en la producción de la construcción de tejidos para crear una construcción de tejido que actúe como un injerto para suministro de fármacos para un paciente que necesita niveles aumentados de productos celulares naturales o tratamiento con un terapéutico. Las células pueden originar productos de células recombinantes, factores de crecimiento, hormonas, péptidos o proteínas para una cantidad continua de tiempo o según se necesite cuando se señalan biológica, química, o térmicamente debido a las condiciones presente en el cultivo. Las células también se pueden manipular por ingeniería genética para que expresen proteínas o diferentes tipos de componentes de matriz extracelular que sean ya sea "normales" aunque se expresen a altos niveles o modificadas en alguna forma para producir un dispositivo de injerto que comprende una matriz extracelular y células vivientes que son terapéuticamente ventajosas para una curación mejorada de las heridas, neovascularización facilitada o dirigida. Estos procedimientos en general se conocen en la técnica, y se describen en Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springe Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), incorporada en la presente como referencia. Todos los tipos de células mencionados anteriormente se pueden utilizar en esta invención para la producción de una construcción de piel cultivada que sintetizará las citosinas que contienen el medio condicionado. Mientras que el colágeno es la composición de matriz extracelular más preferida para utilizarse en la producción de equivalentes de piel que produzcan y secreten citosinas a la condición del medio de cultivo, se pueden utilizar otros componentes de matriz de extracelular. Estos componentes de matriz extracelular se pueden utilizar solos o, de preferencia, se pueden incluir dentro del colágeno para que imiten la matriz dérmica natural. Estos componentes de matriz extracelular pueden incluir: otros colágenos, colágeno tanto fibrilar como no fibrilar proveniente de la familia de colágenos, tal como por ejemplo, tipos de colágeno II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, otras proteínas matriz que puedan incluir, de manera enunciativa: elastina, proteoglicanos , tales como por ejemplo, decorina o biglicano, o glucoproteinas tales como por ejemplo, tenascina, vitronectina, fibronectina, laminina, trombospondina I y glucosaminoglicanos (GAG) tales como por ejemplo, ácido hialurónico (HA) . La matriz dérmica puede variar en composición y estructura. Esponjas de colágeno, dermis biocompatible , bio-remodelable , descelularizada, o geles de colágeno. En lugar de proporcionar componentes de matriz extracelular a las células dérmicas, se pueden cultivar en miembros de trama biodegradable (tales como por ejemplo, nylon o poligalactina (PGA)) para proporcionar un soporte de cultivo se cultivan para producir matriz extracelular hasta que las células y su matriz desarrollen el soporte. En la modalidad preferida, la construcción de tejido conectivo cultivado es un gel de colágeno contraído, contraído por fibroblastos tales como por ejemplo, aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 4,485,096 de Bell, incorporada en la presente como referencia. En otra modalidad preferida, el gel de colágeno contraído se coloca sobre capa gruesa de colágeno de acelular sobre una membrana porosa para fijar el gel a la membrana y evitar una contracción radial excesiva del gel. Los métodos para incorporar una capa gruesa de colágeno acelular se describen en la patente de los Estados Unidos No. 5,536,656 de Kemp, et al., y se incorporan en la presente como referencia. 1 De acuerdo con la invención se puede preparar un gel de colágeno hidratado, tanto de tejido equivalente como de celular utilizando colágeno derivado de piel y tendón, que incluye tendón de cola de rata, colágeno de piel de becerro y tendón extensor de becerro. Podrían ser adecuadas otras fuentes de colágeno. Una composición de colágeno particularmente preferida derivada de tendón del extensor digital común de becerro y los métodos para derivar estas composiciones de colágeno se exponen en la patente de los Estados Unidos No. 5,106,949 de Kemp, la exposición de la misma se incorpora en la presente como referencia. Un equivalente dérmico se moldea directamente sobre la superficie inferior de un plato de para cultivo de tejidos; directamente sobre un miembro poroso, tal como por ejemplo, una membrana permeable a los líquidos; o un gel de colágeno hidratado, acelular, utilizando los procedimientos de acuerdo con las enseñanzas mencionadas anteriormente de Kemp, et al., y como describirá de aqui en adelante. Se agrega una mezcla de moldeo que contiene colágeno y fibroblastos al recipiente interno 20 sobre un gel de colágeno hidratado, acelular 25 y se mantiene bajo condiciones que permitan que se forme el tejido equivalente. A medida que se forme el tejido equivalentes sobre un gel de colágeno hidratado, acelular 25, se contrae radialmente. Típicamente, los lados de la capa dérmica 26 se inclinan hacia la periferia externa del gel de colágeno hidratado 25 para formar una mesa como se muestra en Figura 1 en 52. La concentración de colágeno, el número de células y el volumen de la mezcla de moldo se pueden controlar para optimizar el diámetro y espesor del tejido viviente equivalente. La mezcla de moldeo comprende células a una concentración de entre aproximadamente 1.25 x 104 a 5 x 104 células/ml y colágeno en aproximadamente 0.5 a 2.0 mg/ml en un medio nutritivo. Una concentración celular preferida es de aproximadamente 2.5 x 104 células/ml. Los cultivos se mantienen en una incubadora para asegurar condiciones ambientales suficientes de temperatura controlada, humedad y mezcla de gas para el cultivo de las células. Las condiciones preferidas están entre aproximadamente 34°C a 38°C, de mayor preferencia 37 ± 1°C con una atmósfera entre aproximadamente 5-10 ± 1% de C02 y una humedad relativa (Rh) entre aproximadamente 80-90%. Una vez que las retículas de colágeno se han contraído, las mismas se pueden utilizar para aplicaciones quirúrgicas para tratar a un paciente que necesite de una reparación o reemplazo de tejidos. En una modalidad alternativa de la presente invención, se forma un gel de colágeno acelular sobre el sustrato de cultivo antes de la formación de la construcción de tejido conectivo para proporcionar un medio fijador para el sustrato. En algunos casos, el sustrato requiere de este medio fijador en otros casos, no es necesario. Cuando se utiliza el componente de gel de colágeno acelular en la fabricación de la construcción de tejido conectivo cultivado, se ha encontrado que la proporción del volumen de la mezcla de moldeo para el tejido equivalente al volumen de la mezcla moldeo para el gel de colágeno hidratado, acelular, tiene efecto sobre la viabilidad y diferenciación celular. Proporciones útiles, volumen a volumen (v/v) , de mezcla de moldeo para tejido equivalente a mezcla de moldeo de gel de colágeno son aproximadamente 3:1 a 1:3. Una proporción preferida, en donde la concentración celular en la retícula de colágeno es de aproximadamente 2.5 x 104 células/ml es 3:1. El gel de colágeno hidratado, acelular 25 se prepara a partir de una composición de colágeno que comprende colágeno en aproximadamente 0.5 a 2.0 mg/ml, de preferencia aproximadamente 0.9 a 1.1 mg/ml y medio nutritivo. Esta composición de colágeno se agrega al recipiente interno 20 y se mantiene bajo condiciones que permitan que la composición de colágeno se solidifique y forme un gel de colágeno hidratado, acelular, de dimensiones adecuadas, típicamente entre aproximadamente 1 a 5 mía de espesor, un espesor preferido varía entre aproximadamente 2 mm a 3 mm. Un gel de colágeno hidratado, acelular 25, de preferencia es bastante grueso, de tal forma que una porción acelular restante como células migre del tejido equivalente en un gel de colágeno hidratado, acelular, y tan delgado de tal forma que el tejido equivalente no se retire indeseablemente de la fuente nutritiva proporcionada en el recipiente externo 10.

En otra modalidad alternativa, la construcción de tejido conectivo cultivado se forma a partir de células que crecen bajo condiciones para producir una capa de matriz extracelular que se sintetiza y ensambla mediante células de fibroblasto cultivadas, con las células de fibroblasto cultivadas contenidas dentro de la capa de matriz extracelular sintetizada, en donde la matriz extracelular se produce por las células del fibroblasto cultivadas en ausencia de componentes de matriz exógena o miembros sintéticos durante las condiciones de cultivando. Los procedimientos por fabricar estas construcciones de tejido conectivo cultivado se describen en la Publicación del PCT No. WO 00/29553 de Murphy, et al., las enseñanzas de la misma se incorporan en la presente como referencia y se describen brevemente más adelante. Una vez que se han obtenido los números de células suficientes después del aislamiento y aumento a escala, las células se recolectan y se siembran en una superficie de cultivo adecuada y se cultivan bajo condiciones de crecimiento adecuadas para formar una hoja confluente de células. En la modalidad preferida, las células se siembran sobre una membrana porosa que se sumerge para permitir el contacto con el medio de la parte inferior del cultivo a través de los poros y directamente hacia arriba. De preferencia, las células se suspenden en cualquier base o medio de crecimiento y se siembran en la superficie de cultivo celular a una densidad entre aproximadamente 1 x 105 células/cm2 a 6.6 x 105 células/cm2, de mayor preferencia entre aproximadamente 3 x 105 células/cm2 a 6.6 x 105 células/cm2 y con la máxima preferencia en aproximadamente 6.6 x 105 células/cm2 (células por centímetro cuadrado del área de la superficie) . Los cultivos se desarrollan en medio de crecimiento para establecer el cultivo y se cultivan entre aproximadamente 80% a 100% de confluencia en cuyo tiempo se inducen químicamente mediante el cambio del medio al medio para la producción de matriz con el fin de sobre-regular la síntesis y secreción de la matriz extracelular . En un método alternativo, las células se siembran directamente en el medios de producción para eliminar la necesidad de cambiar del medio básicos al medio de producción, aunque este es un método que requiere mayores densidades de sembrado . Durante el cultivo, los fibroblastos organizan las moléculas de matriz secretada para formar una estructura similar a tejido tridimensional aunque no exhiben fuerzas contráctiles significativas para provocar que la construcción de célula-matriz en formación se contraiga y se desprenda por si mismo del sustrato de cultivo. Los intercambios de medio se hacen cada dos a tres dias con medio de producción de matriz recién preparada y con el tiempo, la matriz secretada aumenta de espesor y organización. El tiempo necesario por crear una construcción de célula-matriz depende de la capacidad de la densidad de sembrando inicial, el tipo celular, la edad de la linea celular, y la capacidad de la linea celular para sintetizar y secretar la matriz. Cuando se forma por completo, las construcciones de la invención tienen un espesor grueso debido a la matriz fibrosa producida y organizada por las células; las mismas no son cultivos celulares confluentes normales o demasiado confluentes, en donde las células pueden ser aproximadamente adherentes entre si. La calidad fibrosa proporciona a las construcciones propiedades similares a tejido cohesivo a diferencia de los cultivos normales, debido a que resisten el daño físico, tal como por ejemplo, el rasgado o rompimiento, con el manejo rutinario en un establecimiento clínico. En la fabricación de una construcción dérmica cultivada, las células formaran una matriz organizada alrededor de ellas mismas sobre la superficie de cultivo celular de preferencia la menos aproximadamente 30 mieras de espesor o más, de mayor preferencia entre aproximadamente 60 a 120 mieras de espesor a través de la superficie de la membrana; sin embargo, se han obtenido espesores en exceso de 120 mieras y son adecuados para utilizarse en aplicaciones de prueba o clínicas, en donde son necesarios estos espesores mayores. Todavía en otra modalidad alternativa, las construcciones de tejido conectivo cultivado se pueden tratar antes de la aplicación a un paciente para intensificar la asimilación del injerto o curación, o ambos, para el sitio de aplicación sobre el paciente. Las construcciones se pueden tratar con otros componentes al ponerlas en contacto con una solución que contiene los componentes, tal como por ejemplo, mediante inmersión. Los componentes para tratar una construcción antes de la aplicación comprenden componentes de matriz extracelular, tales como por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, proteoglicano o glucosaminoglicanos; o citosinas, entre las que se incluyen los factores del crecimiento tales como por ejemplo: factor de crecimiento con fibroblasto básico (bFGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento con queratinocitos (KGF) , factor alfa de crecimiento transformante (TGF ) , factor beta de crecimiento transformante (TGFP) , entre el que se incluye el factor beta-1 de crecimiento transformante (TGF i) y el factor beta-2 de crecimiento transformante (TGFP2), factor estimulador de colonias granulatorias (GCSF) , factor de crecimiento similar a insulina (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , y factor de necrosis de tumor (TNF) . Se debe observar que los términos mencionadas anteriormente entre paréntesis son abreviaturas conocidas comúnmente y utilizadas en la técnica para la nomenclatura formal que las precede. Los siguientes ejemplos se proporcionan para explicar mejor la práctica de la presente invención y no se deben interpretar de ninguna forma como limitantes del alcance de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que se pueden realizar diversas modificaciones a los métodos descritos en la presente mientras que no se aparten del espíritu y alcance de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación de una construcción de tejido conectivo que comprende una retícula de colágeno contraído Se sembraron fibroblastos humanos de prepucio de recién nacido (originado en Organogénesis, Inc. Cantón MA) a 5 x 105 células/162 cm2 de cultivo de tejido tratado en un matraz y desarrollado en medio de crecimiento. El medio de crecimiento consistió de: medio Dulbecco's Modified Eagle' s (D EM) (formulación con alto contenido de glucosa, sin L-glutamina, Bio hittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de bovino recién nacido (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, ütah) y L-glutamina 4 mm (BioWhittaker, Walkers ille, MD) . Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 ± 1°C dentro de una atmósfera de 10 + 1% C02- El medio se reemplazó con medio recién preparado cada dos a tres dias. Después de 8 días en el cultivo, las células se habían desarrollado hasta confluencia, es decir, las células habían formado una monocapa empaquetada a lo largo de la parte inferior del matraz para cultivo de tejidos, y el medio se aspiró desde el matraz de cultivo. Para enjuagar la monocapa, se agregó solución salina amortiguada con fosfato filtrado estéril a la parte inferior de cada matraz de cultivo y luego se aspiró desde los matraces. Las células se separaron del matraz al agregar 5 mi de tripsina-verseno glutamina (BioWhittaker , Walkersville , MD) a cada matraz y agitando suavemente para asegurar la cobertura completa de la monocapa. Los cultivos se regresaron a la incubadora. Tan pronto como las células se separaron, se agregaron 5 mi de SBTI (inhibidor de soya tripsina) a cada matraz y se mezclaron con la suspensión para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión celular se retiró de los matraces y por último se dividió entre tubos centrifugadores estériles, cónicos. Las células se recolectaron mediante centrifugación a aproximadamente 800-1000 x g durante 5 minutos. Se utilizó un aparato similar al mostrado en Figura 1 para conducir el trabajo descrito anteriormente. La tapa se retiró para conducir la operación aunque de otra manera se mantuvo en su lugar para mantener la esterilidad. Se lista la información pertinente con respecto al aparato: el recipiente externo 10 tuvo un diámetro de 100 mm o más. El recipiente interno 20 tuvo un diámetro de 75 mm. El miembro permeable 24 consta de una membrana del policarbonato con un tamaño del poro de aproximadamente 3 µ?? (mieras) y un espesor de 5 ]im (mieras ) . Se formó una solución "premezcla" de 16.2 mi de Medio Esencial Mínimo 10X (MEM) , 1.6 mi de L-glutamina 200 mm, 0.2 mi de 50 mg/ml de gentamicina, 18.0 mi de suero bovino fetal, 5.0 mi, 71.2 mg/ml de bicarbonato de sodio. Las soluciones madres se combinaron asépticamente en la secuencia anterior, y se almacenaron a 4°C durante aproximadamente 30 minutos en un tubo estéril de 50 mi. Aproximadamente 27.44 mi de 2.2 mg/ml de solución de colágeno (extraída por ácido de tendón extensor digital común bovino) en 0.05% v/v de ácido acético, se pesaron en un tubo de 50 mi y se almacenaron a 4°C durante 30 minutos. Se agregó medio de Esencial de Mínimo Dulbecco's (DMEM) completo (que contenía FBS al 10%, L-glutamina 4 mm, 50 g/ml de gentamicina) y se pipetearon alícuotas de 1 mi sobre la membrana del recipiente interno 20 interno y se dejó gelificar a temperatura ambiente. La capa de tejido conectivo, un gel de colágeno hidratada que contenía las células, se moldeó con fibroblastos dérmicos humanos. Una descripción general de los procedimientos y reactivos también se puede encontrar en la patente de los Estados Unidos No. 4,485,096 de Bell, la patente de los Estados Unidos No. 5,536,656 de Kemp, et al., y la patente de los Estados Unidos No. 5,712,163 de Parenteau, las exposiciones de las mismas se incorporan en la presente como referencia. La mezcla de moldeo para preparar cada construcción de tejido conectivo incluyó aproximadamente 12.5 mi de la premezcla descrita anteriormente a la cual se agregaron a 27.44 mi de una solución de colágeno de 2.2 mg/ml en 0.05% v/v de ácido acético, también se describió anteriormente, y 6.25 x 105 de fibroblastos dérmicos humanos. Después de que se mezclaron los componentes, a un volumen total de aproximadamente 40 mi, se vacio en el recipiente 20 y se dejó gelificar. El colágeno gelificado que contenia los fibroblastos suspendidos se sumergió en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) completo agregado al recipiente externo 20 y luego se incubó a 36°C/10% de C02 durante 4 a 8 días para permitir las células contrajeran el colágeno para formar una retícula de colágeno contraído que es una construcción de tejido conectivo cultivado 52.

Ejemplo 2: Preparación de una construcción de tejido conectivo de células cultivadas y componentes de matriz extracelular producidos endógenamente sin la necesidad de componentes de matriz exógena o soporte de red o miembros de andamio La construcción de tejido conectivo de células cultivados y los componentes de matriz extracelular producida endógenamente se prepararon de acuerdo con las enseñanzas de urphy, et al., expuestas en la Publicación del PCT WO 00/29553. Se cultivaron fibroblastos humanos de prepucio de recién nacido para expandir sus números utilizando el procedimiento descritos en Ejemplo 1 aunque en un medio definido químicamente, es decir, que no contenían suero o extractos de órganos derivados de animales. Las células luego se resuspendieron a una concentración de 3 x 106 células/ml, y se sembraron sobre insertos de membrana tratada con cultivo de tejido de 4 mm de diámetro, de tamaño de poro de 0.4 miera en una bandeja de seis cavidades a una densidad de 3.0 x 106 células/T (6.6 x 105 células/cm2] . Las células en este ejemplo se cultivaron en medio definido químicamente por completo. El medio contuvo: una mezcla de base 3:1 de DMEM, medio Hams F-12 (Quality Biologics, Gaithersburg, MD) , GlutaMAX 4 mm (Gibco BRL , Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) , etanolamina 1 x 1CT4 M (Fluka, Ronkonkoma, NY cat . #02400 ACS grade) o-fosforil-etanolamina 1 x 10-4 M (Sigma, St . Louis, O) , 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) , triiodotironina 20 pM (Sigma, St. Louis, MO) , 5 g/ml de insulina (Sigma, St . Louis, MO) , 0.4 µ?/p?? de hidrocortisona (Sigma, el St., Louis, MO) , 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 50 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0.2 g/ml de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO) , 0.1 g/ml de glicina (Sigma, St . Louis, MO) . Las muestras para análisis histológico se tomaron a los dias 7, 14 y 21 y se mezclaron en formalina, luego se incrustaron en parafina para la tinción con hemotoxilina y eosina para el análisis con microscopio de luz. El análisis bioquímico que mide el contenido de colágeno de la construcción mostró 170.88 + 9.07 pg/cm2. Junto con el colágeno fibrilar producido endógenamente, también estuvieron presentes decorina y glucosaminoglicano en las construcciones de matriz celular. Las construcciones dérmicas cultivadas formadas comprendieron fibroblastos dérmicos y matriz producida endógenamente. Todos tuvieron fibrillas de colágeno formadas completamente en organización empacada, dispuesta entre las células. Sus calidades fibrosas, espesor, e integridad cohesiva proporcionaron a la construcción una considerable resistencia para permitir que se desprendiera de la membrana de cultivo y se manipulara a medida que se transfirió a un paciente que será tratado con la construcción, como en un injerto o implante.

E emplo 3: Uso de una construcción de te ido conectivo para reparar la fibrosis anular después de una disco-ectomia parcial Para observar la persistencia de los fibroblastos de injerto en la construcción de tejido conectivo cultivado, las construcciones que contenian fibroblastos de porcino etiquetadas con Proteina Fluorescente Verde (GFP) se implantaron en un modelo de cerdo. Seis cerdos jóvenes de cualquier sexo de hasta 50 kg se encerraron individualmente durante un mínimo de dos días antes de la cirugía, mientras que se alimentaron con pig chow normal. Los animales experimentales se pre-anestesiaron con Telazol y atropina y se intubaron. Se colocaron en gas de inhalación de isoflurano y oxigeno y se mantuvieron en plano quirúrgico de anestesia. También se les administró un antibiótico. Los defectos en los discos se crearon al hacer una incisión de 5 x 10 mm en el anillo seguido por una disco-ectomía normal igual a la eliminación nuclear de cada espacio. ün total de tres discos se operaron por cerdo. Dos sitios se trataron con construcciones de tejido conectivo cultivado con fibroblastos etiquetados con GFP y el sitio restante sirvió como un control. Para aplicar la construcción de tejido conectivo, primero se cortó en tres o cuatro piezas más pequeñas y luego se insertaron en la abertura de orificio anular. Dos animales se sacrificaron en cada una de las semanas 2, 4 y 6 y se retiraron los sitios quirúrgicos. Los discos se colocaron en formalina y luego en etanol al 70% antes del procesamiento histológico. Los discos se seccionaron en serie y se examinaron bajo fluorescencia para la evidencia de fibroblastos marcados con GFP.

Ejemplo 4 : Uso de una construcción de tejido conectivo con un separador de disco intervertebral para mantener el espacio intervertebral Para observar la persistencia de fibroblastos de injerto en la construcción de tejido conectivo cultivado, en un modelo de cerdo se implantaron fibroblastos que contenían las construcciones . Seis cerdos de cualquier sexo de hasta 50 kg se encerraron individualmente durante un mínimo de dos días antes de la cirugía, mientras que se alimentaron con pig chow normal. Los animales experimentales se pre-anestesiaron con Telazol y atropina y se intubaron. Se colocaron en gas de inhalación de isoflurano y oxígeno y se mantuvieron en plano quirúrgico de anestesia. Se les administró un antibiótico. Los defectos en los discos se crearon al hacer una incisión de 5 x 10 mm en la fibrosis anular seguida por una disco-ectomía normal igual a la eliminación nuclear de cada espacio. Un total de tres discos se operaron por cerdo. A través del orificio hecho en la fibrosis anular, se abrió el espacio intervertebral y se retiró el disco, restringido a la tercera porción anterior y media. Se colocó el separador de disco intervertebral que comprende una trama de Dacron e hidrogel en el interior de la cavidad torácica al hacerlo pasar a través del orificio en la fibrosis anular. Se aseguró la buena posición del implante al utilizar procedimientos radiológicos y luego el separador se fijó en su lugar. La construcción del tejido conectivo cultivado luego se aplicó a la abertura anular al cortar primero la construcción al tamaño de la abertura del orificio anular y luego suturar al tejido circundante la abertura del espacio utilizando suturas reabsorbibles . Mientras que los tres sitios se proporcionaron con un separador de disco intervertebral, dos sitios se trataron con construcciones de tejido conectivo cultivado y el sitio restante sirvió como un control. Dos animales se sacrificaron en cada una de las semanas 2, 4 y 6 y se retiraron los sitios quirúrgicos. Los discos se colocaron en formalina y luego en etanol al 70% antes del procesamiento histológico. Los discos se seccionaron en serie y se examinaron bajo fluorescencia para la evidencia de fibroblastos marcados con GFP . En todos los especímenes, el separador de disco interver ebral mantuvo su colocación original. En especímenes control, el núcleo pulposo mostró una pérdida significativa de proteoglicanos y colágeno y un aumento en otras proteínas sin colágeno en la cavidad. En especímenes experimentales, la construcción de tejido conectivo formó una cicatriz completa sobre la abertura realizada en la fibrosis anular. La composición bioquímica de la cavidad cambió ligeramente aunque fue cercana a la composición de los especímenes de control negativo, lo que indica que la fibrosis de la cavidad se había evitado sustancialmente mediante el cierre del anillo después de la lesión al disco.

Ejemplo 5: Un estudio de transcurso de tiempo que utiliza construcciones de tejido conectivo en la reparación de fibrosis anular de cerdos La disco-ectomía para retirar núcleo pulposo roto y expulsado es una práctica química común para aliviar el dolor y los trastornos neurológicos . El procedimiento crea un defecto en la fibrosis anular que con frecuencia se rellena con tejidos fibróticos, una situación que por último conduce al colapso del disco intervertebral y requiere la fusión de segmentos vertebrales adyacentes. Se prepararon construcciones de tejido conectivo porcino utilizando fibroblastos dérmicos porcinos transfectados para expresar la proteína fluorescente verde (GFP) de acuerdo con los métodos del Ejemplos 1. Cada construcción se constituyó de un colágeno de bovino Tipo I que contenía de 20 a 30 millones de fibroblásticos dérmicos de porcino transfectados por GFP viables y fueron de un espesor de aproximadamente 2 mi. El propósito de este estudio fue evaluar la viabilidad de las construcciones de tejido conectivo para reparar la fibrosis anular en un modelo porcino y para determinar la biocompatibilidad, persistencia y remodelación de las construcciones en este modelo. Para este estudio se utilizaron seis cerdos de 3 a 4 meses de edad. Se expusieron posteriormente tres discos vertebrales consecutivos a través de un procedimiento de laminotomía para cada animal. Se creo un defecto anular quirúrgico en cada disco expuesto. Varias piezas de construcción de tejido conectivo, cada una de aproximadamente 2 a 5 mm de diámetro, se implantaron en dos defectos de cada animal. El otro defecto de disco se dejó vació como un control. Los cerdos se sacrificaron, en grupos de dos a las dos, cuatro y seis semanas después del implante. Las columnas vertebrales que contenían los discos operados se retiraron y se fijaron en formalina amortiguada neutra al 10%. Se realizó una microscopía de campo brillante sobre secciones teñidas con hemotoxidina y eosina para una evaluación general, y se realizó una microscopía fluorescente sobre las seccione sin teñir para identificar las células marcadas con proteina fluorescente verde. La microscopía reveló una clara evidencia de residuos de construcción de tejido conectivo implantado, que incluyen fibroblastos fluorescentes viables, en varios de los anillos tratados provenientes de los dos grupos de animales sacrificados a las dos y cuatro semanas. Existió también una remodelación identificable de los residuos de construcción de tejido conectivo por el tejido hospedero. Los defectos implantados mostraron menos inflamación y una curación más avanzada que los controles en todos los puntos de tiempo. Los defectos implantados tuvieron tejido cartilaginoso formando puentes en la abertura, mientras que los defectos control todavía tuvieron una cantidad significativa de tejido fibrótico. Los resultados provenientes de este estudio de viabilidad indican que las construcciones de tejido conectivo implantadas en cerdo fueron biocompatibles con el tejido hospedero, pueden persistir hasta 4 semanas, e intensificar las actividades de reparación del anillo en 6 semanas . Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para fines de claridad y entendiendo, será obvio para alguien con experiencia en la técnica que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (6)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un método para reparar un disco intervertebral lesionado de un paciente utilizando una construcción de tejido conectivo cultivado, que comprende : (a) formar al menos una abertura en la fibrosis anular del disco intervertebral; (b) retirar al menos una porción del núcleo pulposo a través de la abertura en la fibrosis anular ; (c) injertar una construcción de tejido conectivo cultivado en la abertura en la fibrosis anula , caracterizado porque la construcción de tejido conectivo es bioremodelable y se integra con el tejido hospedero para cerrar la abertura con el nuevo tejido.
2. 2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la construcción de tejido conectivo cultivado comprende una proteína de matriz extracelular y fibroblastos.
3. 3. El método según la reivindicación 2, caracterizado porque la proteina de matriz extracelular es colágeno.
4. 4. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la construcción de tejido conectivo cultivado es una retícula de colágeno contraído que contiene fibroblastos.
5. 5. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la construcción del tejido conectivo cultivado es una capa de matriz extracelular que se sintetiza y se ensambla mediante células de fibroblasto cultivadas, con las células de fibroblasto cultivadas contenidas dentro de la capa de matriz extracelular sintetizada y la matriz se produce mediante las células de fibroblasto cultivadas en ausencia de los componentes de matriz exógena o los miembros sintéticos durante las condiciones de cultivo.
6. 6. ün tejido conectivo cultivado para utilizarse en la reparación quirúrgica, que comprende: fibroblastos cultivados en una matriz de colágeno .