JP2018513724A - 皮膚再建の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
− 最も薄く、表皮と称される表層部分、
− より厚い中間部分で、表皮が付着されている真皮、及び
− より深い層の皮下組織
を含む。
a.線維芽細胞培地M1中で線維芽細胞を培養する工程;
b.コラーゲンを含むマトリクスに、工程aで得られた線維芽細胞を播種する工程;
c.コラーゲンを含むマトリクスに播種された線維芽細胞を、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地M2中で培養し、マトリクス及び培養された線維芽細胞に代用真皮を形成させる工程;
d.メラニン形成細胞を、メラニン形成細胞培地M3中で培養する工程;
e.角化細胞を、角化細胞培地M4中で培養する工程;
f.工程dで得られたメラニン形成細胞と工程eで得られた角化細胞とを混合する工程;
g.工程cで得られた代用真皮を、工程fで得られた混合物とともに播種する工程;
h.工程gで播種された代用真皮を、皮膚培地M5中で培養して、代用皮膚を形成する工程
を含む、代用皮膚を作製するための方法を提供することによって、この必要性を満たすことである。
Docteur Roux、F−75724 Paris Cedex 15のCollection Nationale de Culture de Microorg
anisme[フランス国立微生物カルチャーコレクション](CNCM)由来のものを例とする細胞バンクから入手した線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び/又は角化細胞であってよい。それらはまた、市販の線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び/又は角化細胞であってもよく、例えば、Thermofischer scientific社、CellnTec社、又はPromocell社から販売されている細胞である。それらはまた、動物、好ましくは、哺乳類から、及び/又はヒトから予め単離された生物サンプルから単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び/又は角化細胞であってもよい。線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び/又は角化細胞は、1つの生検組織又は複数の生検組織から独立して単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び/又は角化細胞であってよい。線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び/又は角化細胞は、前記患者への前記代用皮膚の移植片の目的で、個体、好ましくは、哺乳類及び/又はヒトからの1つの生検組織又は複数の生検組織から独立して単離されてよい。それらは、独立して、個体に対して自家性又は異種性である線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び/又は角化細胞であってよい。
Biol, 2013[4]、及び/又はRevilla et al., J Tissue Eng Regen Med, 2015[5]に記載される方法によって得られた線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び/又は角化細胞であってよい。
− 培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程a’、
− トリプシン処理によって細胞を剥離する工程a’’、及び
− 沈澱又は遠心分離を行う工程a’’’、
も含んでよい。
よい。それは、例えば、沈降、又は800から1400回転毎分、例えば1200回転毎分に等しい速度での遠心分離であってよい。
る、又は例えばWonhye Lee et al. “Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication.” Biomaterials, 2009, March; 30(8):1587-95[7]に記載のような3Dプリンティングによる適用であってもよい。
。
− アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない線維芽細胞培地M21の存在下、18から28日間にわたる第一の培養工程c’、及び
− アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地M22の存在下、少なくとも2日間にわたる第二の培養工程c’’
を含んでよい。
成が可能となり、同時に、有利には、線維芽細胞自体によるコラーゲン産生も可能となり、したがって、真皮のリモデリングが可能となる。
g・mL−1、又は140μg・mL−1に等しいウシ脳下垂体抽出物(BPE)濃度を含んでよい。
− 培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程d’、
− トリプシン処理によって細胞を剥離する工程d’’、及び
− 沈澱工程d’’’、
も含んでよい。
なるメラニン形成細胞リンス溶液をも意味することを意図している。それは、例えば、上記の表2に記載の溶液を例とするHBSS緩衝溶液、又は7.2から7.4を含むpHのリン酸緩衝食塩水(PBS)であってもよい。それはまた、市販の緩衝溶液であってもよく、例えば、それぞれ、Gibco社、Sigma Aldrich社、又はLonza社から販売されているリン酸緩衝食塩水(PBS)又はハンクス平衡溶液であってもよい。
B153培地であってよい。それはまた、改変された市販の培地であってもよく、例えば、0.100から0.110M/l、例えば0.104M/lの塩化ナトリウム濃度、2から3×10−2M/l、例えば2.29×10−2M/lのHepes濃度、1.10×10−2M/lから1.25×10−2M/l、例えば1.19×10−2M/lの炭酸水素ナトリウム濃度を含み、並びに未改変MCDB153培地の濃度の2倍であるアルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、及びコリンの濃度を含むMCDB153培地であってもよい。
− 培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程e’、
− トリプシン処理によって細胞を剥離する工程e’’、及び
− 遠心分離工程e’’’、
も含んでよい。
− ヒアルロン酸及びヒアルロン酸塩を、又はアスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない培地M51の存在下、少なくとも6時間、好ましくは、6から24時間にわたる第一の培養工程h’、
− ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地M52の存在下、0から7日間、好ましくは、少なくとも2日間にわたる第二の培養工程h’’、並びに
− ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地M53中、少なくとも2日間にわたる第三の培養工程h’’’
を含んでよい。
スコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地M53中に、工程h’’で得られた播種された代用真皮を浸漬させることにより、真皮−表皮接合部の形成を促進することが可能となり、したがって、播種された代用真皮の細胞のより良好な極性化が得られることを実証した。
成細胞の存在によって、構成的な色素沈着を呈する。
− 線維芽細胞、角化細胞、及び採取したサンプルからの線維芽細胞を用いて、本発明に従って代用皮膚を作製する工程、及び
− 得られた代用物を個体に移植する工程
を含む皮膚移植法も本発明の主題である。
本例において、用いた細胞は、過去に患者に対して行った乳房形成術から採取した皮膚生検組織から得た。
a.生検組織を滅菌HBSS(ハンクス平衡塩溶液)でリンスする。
b.生物学技術者が外科用メスを用いて脂肪組織を除去する。
c.37℃まで予備加熱したトリプシン−EDTAと共に、3から24時間インキュベートする。
d.照射処理FCS(トリプシン阻害剤)で中和する。
e.表皮を除去し、高増殖(p63陽性)細胞が見られる基底層を外科用メスでこすり取る。
f.ろ過、1200回転毎分での遠心分離、並びに、以下の表4に示す化合物を含むが、L−アルギニン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、及び塩化コリンの濃度を2倍とし、NaCl濃度を0.104M/lに低下させ、Hepesを2.29×10−2M/lに低下させ、及びNaHCO3を1.19×10−2M/lに低下させ、培地のpHを7.4に調節し、及び角化細胞のための抗生物質(ペニシリン及びストレプトマイシン1%)を含む改変*MCDB153培地中への1cm2あたり100000細胞でのペレットの播種を行う。
h.およそ1週間後、差別的トリプシン処理(differential trypsinization)=0.025% トリプシン及び0.0.1M EDTAでのトリプシン処理(メラニン形成細胞を剥離するために1〜2分間、角化細胞を剥離するために10分間)を行う。メラニン形成細胞が先に剥離するために、培養物を精製することができる。
照射処理FCSでの中和、1200回転毎分での遠心分離、及び同じ媒体での増幅のためのペレットの播種を行う。
i.3日ごとに培地を交換しながら、37℃、5% CO2で1週間インキュベートする。
a.真皮部分をHBSSでリンスする。
b.1% コラゲナーゼと共に、37℃で、真皮の種類に応じて最大3時間にわたって真皮をインキュベートする。
c.照射処理FCSで中和する。
d.40μmの細胞ふるいでのろ過、GR 2022遠心分離機による1200回転毎
分での5分間の遠心分離、並びに10% 照射処理FCS、及び1%でペニシリン及びストレプトマイシンを含むDMEM中への24時間の1cm2あたり100000細胞でのペレットの播種を行う。
e.Jouan IG 150インキュベーター中、3日ごとに培地を交換しながら、37℃、5% CO2で1週間インキュベートする。
a.0.025% トリプシン及び0.0.1M EDTAで10分間線維芽細胞をトリプシン処理し、続いて照射処理FCSで中和し、GR 2022遠心分離機により1200回転毎分で5分間遠心分離し、予めハンクス平衡塩溶液(HBSS)で3回リンスした滅菌コラーゲン由来の真皮マトリクス、すなわち、Integra matrix(登録商標)上の10% FCSを含むDMEMに、注文生産のステンレス鋼インキュベーターチャンバー中、1cm2あたり30000線維芽細胞の割合で播種する。
b.37℃、5% CO2での24時間の培養後、インキュベーションチャンバーをマトリクスから取り除いた。
c.播種したマトリクスを、10%の照射処理FCS、並びに1%でペニシリン及びストレプトマイシン、並びに50mg/mL アスコルビン酸を含むDMEM中、3日ごとに培地を交換しながら、37℃、5% CO2で1週間インキュベートした。
d.角化細胞及びメラニン形成細胞のトリプシン処理を、0.025% トリプシン及び0.0.1M EDTAで、メラニン形成細胞培養皿からのメラニン形成細胞の剥離のために1から2分間、角化細胞培養皿からの角化細胞の剥離のために10分間行う。照射処理FCSでの中和、及び遠心分離、及びインキュベーションチャンバー中での、19角化細胞あたり1メラニン形成細胞を含有する混合物の1cm2あたり400000細胞での播種を行う。
e.24時間接着させる。
f.改変グリーン培地:50mg/mlでヒアルロン酸を含むDMEM/ハムF12/10% FCSで7日間液浸させる。
g.改変グリーン培地:10% FCS、50mg/mlでのヒアルロン酸及び50mg/ml アスコルビン酸、並びに抗生物質、すなわち1% ペニシリン−ストレプトマイシンを含むDMEM/ハムF12で7日間界面培養する。
に従って得られた代用物、及び生体内皮膚の免疫組織化学的標識を、代用物中でのメラニン形成細胞の存在、特にIV型コラーゲンを含む基底層の生成(図6D(2))、基底層中における細胞の増殖能(図6D(1))、及びメラニン形成細胞の存在(図6C)を識別する目的で、Salducci, M., Andre, N., Guere, C., Martin, M., Fitoussi, R., Vie,
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induce solar lentigo in pigmented reconstructed epidermis. Pigment Cell Melanoma Res. 27, 502-504[12]又はSimon, D., Daubos, A., Pain, C., Fitoussi, R., Vie, K., Taieb, A., de Benetti, L., and Cario-Andre, M. (2013). Exposure to acute electromagnetic radiation of mobile phone exposure range alters transiently skin homeostasis of a model of pigmented reconstructed epidermis. Int. J. Cosmet. Sci. 35, 27-34[13]に記載の方法に従って行った。図6E及び6Fは、基底位置のメラニン形成細胞の免疫組織化学的標識後(図6E、明色領域)、IV型コラーゲンの標識後(図6F(2))、及びp63増殖マーカーの標識後(図6F(1))の生体内皮膚の光学顕微鏡写真を示す。図6C及び6Dにおいて、生体内皮膚の場合のように(図6E及び6F)存在する細胞が高増殖性であるレベルにIV型コラーゲンが存在することによって実証されるように、本発明に従う代用皮膚がメラニン形成細胞及び基底層を含むことが明白に見られる。
本例において、用いた代用皮膚は、乳房形成術から得た細胞を13.3の(角化細胞+メラニン形成細胞)/線維芽細胞比で用いて例1に記載のようにして得た代用物であった。用いたマウスは、Jackson Labからのswiww nu/nuヌードマウスであった。
包埋し、次に4μmのセクションを切り出し、続いて皮膚の様々な層の標識のために、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。光学顕微鏡での観察を×40の倍率で行った。顕微鏡をCCDカメラ(ニコン、ソフトウェア NIS element Br)と連結させたため、観察結果の写真を撮影した。
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Claims (17)
- a.線維芽細胞培地M1中で線維芽細胞を培養する工程;
b.コラーゲンを含むマトリクスに、工程aで得られた線維芽細胞を播種する工程;
c.コラーゲンを含む前記マトリクスに播種された線維芽細胞を、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地M2中で培養し、前記マトリクス及び前記培養された線維芽細胞に代用真皮を形成させる工程;
d.メラニン形成細胞を、メラニン形成細胞培地M3中で培養する工程;
e.角化細胞を、角化細胞培地M4中で培養する工程;
f.工程dで得られたメラニン形成細胞と工程eで得られた角化細胞とを混合する工程;
g.工程cで得られた前記代用真皮を、工程fで得られた前記混合物とともに播種する工程;
h.工程gで播種された前記代用真皮を、皮膚培地M5中で培養し、それによって代用皮膚を形成する工程
を含む、代用皮膚を作製するための方法。 - 前記培地M5が、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培地M5が、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む、請求項2に記載の方法。
- 工程fのメラニン形成細胞と角化細胞との前記混合が、1/20から1/15のメラニン形成細胞/角化細胞比で行われる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程gの前記播種が、9から19の(角化細胞+メラニン形成細胞)/線維芽細胞比で行われる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程bの前記播種が、コラーゲンを含む前記マトリクスの表面積に対して20000から50000線維芽細胞/cm2の密度で行われる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程cが、アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない線維芽細胞培地M21の存在下、18から28時間にわたる第一の培養工程c’、及び
アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地M22の存在下、少なくとも2日間にわたる第二の培養工程c’’を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - 工程hが:
− ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない培地M51の存在下、6から24時間にわたる第一の培養工程h’、
− ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地M52の存在下、少なくとも2日間にわたる第二の培養工程h’’、並びに
− ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地M53中、少なくとも2日間にわたる第三の培養工程h’’’
を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1から8のいずれか一項に記載の方法を実行することによって得ることができる
代用皮膚。 - 前記線維芽細胞が、個体に関して、前記代用皮膚の前記個体への移植という観点から自家性である、請求項9に記載の代用皮膚。
- 前記線維芽細胞、前記メラニン形成細胞、及び前記角化細胞が、個体に関して自家性である、請求項10に記載の代用皮膚。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の方法の工程cで得ることができる代用真皮。
- 請求項10若しくは11に記載の代用皮膚、又は請求項12に記載の代用真皮から構成される移植片。
- 皮膚障害及び/又は皮膚物質の喪失を治療するための手段としての使用のための請求項13に記載の移植片。
- 前記皮膚障害及び/又は皮膚物質の喪失が、熱傷、治癒欠陥、慢性創傷、色素異常、血管腫、及び皮膚癌を含む群より選択される、請求項14に記載の使用のための移植片。
- 線維芽細胞培地M1、コラーゲンを含むマトリクス、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地M2、メラニン形成細胞培地M3、角化細胞培地M4、及び皮膚培地M5を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキット。
- 前記培地M1からM5が、独立して、臨床グレードの培地である、請求項16に記載のキット。
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