PT87084B

PT87084B - Processo para a producao de um equivalente de pele e equivalente de pele obtido por esse processo

Info

Publication number: PT87084B
Application number: PT87084A
Authority: PT
Inventors: Braham Shroot; Bruno Bernard; Marie-Cecile Lenoir; Yves-Michel Darmon; Daniel Asselineau
Original assignee: Cird
Priority date: 1987-03-26
Filing date: 1988-03-25
Publication date: 1992-07-31
Also published as: NZ223828A; DK164488D0; FI881362A; ES2004843A4; JPS648974A; ZA882033B; DE285471T1; ATE59971T1; NO881349L; ES2004843T3; US5639654A; AU602394B2; FR2612938B1; DK164488A; FI881362A0; EP0285471B1; FR2612938A1; GR880300158T1; NO171222C; FI881363A

Description

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de um equivalente de pele e ao equivalente de pele assim obtido.

E conhecido que se proour obter in vitro estruturas celulares comparáveis à pele animal ou humana, prinoipaloiente para as poder utilizar para enxertos a realizar em feridos, tais como as vítimas de queimaduras. E claro que se procuram estruturas tendo semelhanças tão grandes quanto possível com a estrutura da pela humana para eliminar os riscos de rejeição do enxerto. Além disso, é possível utilizar um tal material para estudar os efeitos farmacológi- 1 -

oos ou cosméticos de diversos produtos e um tal estudo dá resultados tanto mais fiáveis quanto maiores forem as semelhanças do material com a pele.

A presente invenção propõe-se pois proporcionar um processo que permite obter um equivalente de pele tendo com a pele semelhanças estruturais maiores que as apresentadas pelos materiais deste tipo actualmente conhecidos.

A capacidade de cultura dos queratin©citos num meio nutritivo apropriado é conhecida. Mais precisamente, o artigo de F. K. Noser (publicado em lhe Journal of Investigative Dermatology, 87, 485-488, 1986) mostra a capacidade de cultura dos queratinócitos da cutíQula de um folículo de cabelo humano. Além disso, o artigo de A. J. M. Vermorken (publicado em Molec. Biol. Re., 10, 205-213, 1985^ indica que a cultura de queratinócitos da cutícula de um folículo piloso pode conduzir à formação de um lençol oelular que compreende um certo número de camadas que apresentam uma certa diferenciação, de uma maneira um tanto análoga à que se constata numa epiderme animal ou humana. Sugere-se que esta fabricação de lençol celular poderia ser efectuada utilizando como suporte um equivalente de derme de tipo conhecido, mas não é dada qualquer precisão a este respeito. De resto, a cultura em imersão, que é descrita, conduz a uma estrutura de lençol celular apresentando ainda diferenças sensíveis com a de uma epiderme animal ou humana.

pedido de patente internacional PCT publicado cora o número WO 86/02273 descreve um processo de obtenção de um equivalente de pele que utiliza a capacidade cultura dos queratinócitos e emprega, como fonte de queratinócitos, biopsias de pele. Segundo este processo, obtem-se, por extracção ácida suave, por exemplo a partir de tendões de cauda de rato, colagéneo de tipo I, que se mantém era solução num ambiente ligeiramente ácido. Por outro lado, cul2

tivam-se num meio de cultura, fibroplastos obtidos, por exemplo, a partir de tecidos humanos.

Asolução de colagéneo é neutralizada po:? uma base e adicionada de elementos nutritivos. Juntam-se-lhe os fibroblastos. Tem-se então a formação de um gel que se contrai em consequência das interacções entre os fibroplastos e as moléculas de colagéneo, expulsando o meio nutritivo para formar um equivalente de derme. Antes deste gel se contrair, insere-se no mesmo uma biopsia de pele de 2 mm de diâmetro aproximadamente, que se posiciona de maneira que a epiderme da biopsia aflore a superfície do gel. Observa-se então uma migração e uma multiplicação dos queratinócitos provenientes da biopsia na superfície do equivalente de derme; as fases de diferenciação dos queratinócitos conduzem finalmente à formação das diferentes camadas de um equivalente de epiderme.

Um tal processo apresentado, no entanto, inconvenientes. Pode citar-se, por exemplo, o facto de )aão se obter um equivalente de pele globalmente homogéneo, visto que a biopsia, incluindo a sua parte defmica, fica inserida no equivalente de derme, Um outro inconveniente reside no próprio modo de extracção da biopsia, pois ela tem de ser feita por um médico, pode ser dolorosa e podem resultar cicatrizes visiteis. Além disso, o risco de contaminação do manipulador por agentes infecciosos tais como os virus não é de desprezar.

Finalmente, a superfície de ^equivalente de epiderme que pode esperar-se obter é limitada pelo número de biopsias que pode obter-se a partir de um mesmo ser humano, por exemplo.

processo segundo a presente invenção dá remédio a estes inconvenientes, utilizando de maneira par• ticular e original a capacidade de cultura dos queratinócitos

contidos na cutícula de uai folículo piloso. Segundo a presente invenção, substitui-se a biopsia utilizada no documento WO 86/02273 por um folículo piloso envolvido pela sua cutícula e implantando-o sensivelmente perpendicularmente à superfície livre do equivalente de derme em curso de elaboração. Obtem-se então resultados completamente surpreendentes para 0 homem do ofício no que respeita à diferenciação dos queratinócitos; obtem-se com efeito um equivalente de epiderme cujas semelhanças com uma epiderme humana são absolutamente inesperadas. Assim, embora os queratinócitos sejam, no documento WO 86/02273 como no processo segundo a presente invenção, a fonte de formação de um equivalente d e epiderme, a inserção de um folículo piloso perpendicularmente à superfície livre do equivalente de derme em curso de elaboração, não é equivalente à de uma biopsia da pele quanto aos resultados obtidos e melhora estes resultados de maneira notável. Além disso, a estrutura do lençol celular, que constitui 0 equivalente de epiderme obtido, apresenta, em face da estrutura da pele, semelhanças muito mais importantes que as do lençol celular que se obtinha cultivando de maneira diferente as mesmas células da cutícula de um folículo piloso (artigo de A.J.M. Vermorken atrás citado). Finalmente, a ligação entre os lençóis constituidos pelo equivalente de derme e 0 equivalente de epiderme é satisfatório e permite uma manutenção fácil do equivalente de pele.

e quivalente de pele segundo a presente invenção assim constituído é bem diferenciado e bem organizado: com efeito, pode-se, no decurso do processo, retirar do equivalente de derme 0 ou os folículos pilosos e 0 ou os buracos assim formados no equivalente de pele voltam a fechar-se.

A diferenciação atingida in vitro pelo processo segundo a presente invenção é muito próxima da que se observa in vivo. Em especial, detecta-se a filagrina na camada granulosa da epiderme, como no caso da

pele normal e pode observar-se, por electroforese, que a filagrina foi bem obtida por corte da profilagrina ao nível das pontes oligopeptídicas. Por outro lado, encontra-se uma disposição em forma de paliçada das células basais que é normalmente a consequência da implantação dos folículos pilosos perpendicularmente à superfície do equivalente de derme em curso de elaboração.

Obtem-se implantaôdo um folículo piloso uma superfície de equivalentes de pele sensivelmente da mesma importância que a obtida com uma biopsia; mas podem ser retirados folículos em grande número e obter-se assim com um mesmo dador uma superfície muito grande, o que não sucede com as biopsias.

e quivalente de pele assim obtido pode ser utilizado em especial para o tratamento das feridas por enxerto deste equivalente de pele. Neste caso, o aceitador e o dador podem ser seres humanos e o dador do folículo piloso pode ser o mesmo que o aceitador do equivalente de pele,

A presente invenção refere-se portanto em primeiro lugar a um processo de obtenção de um equivalente de pele, no qual;

se prepara um equivalente de derme misturando:

a) células contrácteis recolhidas, por exemplo, a partir de culturas monocamadas realizadas num meio nutritivo semeado por fragmentos de tecido animal ou humano, com

b) um meio nutritivo (l-iNl) adicionado de componentes da matriz extracelular da derme, formando a referida mistura em gel que se con- 5 -

trai expulsando o meio nutritivo para formar o equivalente de derme.

22) se utiliza o equivalente de derme obtido segundo 12) como substrato para um equivalente de epiderme obtido por sementeira do referido substrato com os queratinócitos de um explantado animal ou humano e por manutenção de condiçbes que permitem a multiplicação dos queratinócitos na superfície do referido substrato, sendo o desenvolvimento desta cultura de queratinócitos favorecido pela utilização de pele menos um meio (MHl), MK2) em contacto com os referidos queratinócitos, caracterizado pelo facto de se semear o substrato por meio de pelo menos um folículo piloso ou um troço de folículo piloso extraído de uma pele animal ou humana por arranque, compreendendo o referido folículo um troço pelo menos parcialmente a sua cutícula celular e sendo implantado no substrato de modo que a sua linha longitudinal média seja sensivelmente perpendicular à superfície livre do substrato.

Pode utilizar-se como célula contrátil fibroblastos: utilizam-se, vantajosamente, como células contrácteis, fibroblastos dérmioos obtidos a partir de dadores humanos sãos, e recolhidos a partir das culturas monocamadas, por tripsinização controlada.

Utiliza-se, de preferência, como meio nutritivo para as culturas de células contrácteis meio essencial mínimo (HEM); utiliza-se vantajosamente, como meio de cultura contendo componentes da matriz extracelular da derme, um meio contendo pelo menos colagéneo, em especial do tipo I.

Segundo uma forma de realização preferida, prepara-se o equivalente de derme pelas fases seguintes:

a) obtem-se uma solução fracamente ácida de colagéneo por extracção ácida suave a partir de uma

fonte animal ou humana; este colagéneo pode também ser de origem comercial, vendido, por exemplo, pela firma BIOETIOA”

b) aiist. ra-se a solução da fase a) com as células contracteis e um meio nutritivo (MN1), neutraliza-se por adição de uma base e vaza-se a mistura num receptáculo achatado;

c) deixa-se contrair o gel assim obtido durante vários dias.

Utiliza-se de preferência para o meio nutritivo (MN1) a formulação seguinte:

- de 80% a 20%, em volume, de meio essencial mínimo (ιΊΕΜ);

- de 0% a 20%, em volume, de soro de vitela fetal;

- de 0% a 20%, em volume, de soro humano do grupo AB;

- de 0% a 1%, em peso, de um ou mais produtos antifúngicos;

- de 0% a 2%, em peso, de um ou mais antibióticos;

- de 0% a 2%, em peso, de um ou mais compostos energéticos;

- de 0% a 2%, em peso de ácidos aminados não essenciais.

Pode enterrar-se o implante no substracto a partir da superfície livre do substracto numa distância compreendida entre 0,1 e 2 mm. De preferência, obtem-se um implante cortando o folículo piloso arrancado, sensivelmente perpendicularmente à sua linha longitudinal média, na zona onde ele está envolvido pela sua cutícula celular, para conservar um comprimento compreendido entre 0,5

e 5 mm, aproximadamente. Vantajosamente, corta-se o folículo piloso junto da sua base para eliraiaar o bolbo. De preferência, insere-se o implante no substrato quando do início da concentração do gel que constitui o substrato.

Vantajosamente, depois da sementeira do substrato, mantem-se durante um tempo TI o substrato implantado em imersão no meio nutritivo (MUI), que cobre o ou os implantes, e pode escolher-se um tempo TI de cerca de cinco a seis dias.

Quando tiver expirado o tempo Tl, substituiu-se vantajosamente o meio (MN1) por um meio (HN2) que se faz aflorar a um nível situado na espessura do equivalente de derme. De preferência, para assegurar e afloramento do meio (MN2) ao nível desejado, coloca-se o equivalente de derme numa grelha-suporte sobrelevada em relação ao fundo do receptáculo e ajusta-se o nível do meio (1W2), para que a grelha-suporte fique precisamente coberta mas que o meio (MN2) não cubra a face superior do equivalente de pele em curso de elaboração.

Pode utilizar-se, como meio (iíN2), a formulação seguinte:

- de 80% a 100%, em volume, de meio mínimo (MEM);

- de 0% a 10%, em peso, de um ou mais antibióticos e/ou antifúngicos;

- de 0% a 20%, em volume, de soro animal ou humano;

- de 0% a 0,05%, em peso de um ou mais factores de crescimento.

De preferência, extrai-se o implante do substracto por arranque num tempo T2 após a implantação. Pode escolher-se um tempo T2 de c erca de 8 a 15 dias e pode manter-se o equivalente de pele em contacto com o meio de cultura

até um tempo T3 depois da implantação superior a T2 e permitindo um recobrimento total do substrato pelos queratinócitos desenvolvidos no referido substrato e uma diferenciação apreciável dos referidos queratinócitos.

Pode semear-se o substrato por implantes regularmente repartidos e espaçados uns em relação aos outros de cerca de 0,5 a 2,5 cm e escolhe-se de preferência um tempo T3 de cerca de 15 dias a vários meses.

A presente invenção refere-se igualmente a um equivalente de pele constituído por um equivalente de derme coberto por um equivalente de epiderme, sendo o equivalente de derme uma película formada por um gel de colagéneo de tipo I que encerra fibroblastos distribuídos tridimensionalmente na referida película, caracterizado pelo facto de o equivalente de epiderme compreender:

a) um equivalente de membrana basal constituído por um depósito em camada laminar, de fibronectina, de colagéneo de tipo IV e de antigénio da penfigoide bolhosa;

b) células de camada basal em disposição em paliçada ligadas ao equivalente de membrana segundo

a) por hemidesmosomas;

c) células de camadas suprabasais que, a partir da primeira camada suprabasal, contém queratina básica de 67 IbDa e queratina ácida de 56,5 kDa;

d) células granulosas que contém grãos de querato-hialina, de involucrina e filagrina;

e) células achatadas e queratinizadas dispostas na vizinhança da superfície livre, dando, depois de extracção com sulfato de dodecilo sódico e com 2-mercapto

etanol, invólucros córneos, característicos dos corneótitos, estando as células das diferentes camadas ligadas entre si por desmosomas.

Finalmente, a presente invenção refe-se a um equivalente de pele, caracterizado pelo facto de ser obtido pelo processo atrás descrito.

Para melhor se compreender o objecto da presente invenção, vai a seguir descrever-se, a título de exemplo puramente ilustrativo e não limitativo, uma forma de realização representada no desenho anexo, cujas figuras representam:

A figura 1, um corte parcial de uma amostra de pele (em especial do couro cabeludo) na qual se plantou um folículo piloso (em especial um cabelo);

A figura 2, o cabelo da figura 1 arrancado para fora da amostra de couro cabeludo;

A figura 5, um equivalente de pele em curso de elaboração, imerso num meio nutritivo;

A figura 4, o equivalente de pele da figura 3 posto em contacto com o ar numa fase ulterior; e

A figura 5, um corte parcial do equivalente de epiderme de um equivalente de pele segundo a presente invenção.

Na figura 1, vê-se uma amostra de pele, em especial do couro cabeludo, com a referência (1) no seu conjunto, na qual está plantado um folículo piloso (2). 0 folículo desenvolve-se a partir da epiderme designada por (3) no seu conjunto. A epiderme está separada da derme designada no seu conjunto por (4) por uma membrana

basal (5). Distinguem-se na epiderme quatro níveis, que são, a partir da membrana basal para o exterior da pele, a camada basal (6), a camada de Malpighi (7), a camada granulosa (8) e a camada córnea (9).

A epiderme é constituída por 95$ de células designadas por queratinócitos. Estes queratinócitos sofrem uma diferenciação desde a camada basal até à camada córnea. A camada basal (6) é constituída por um só nível de queratinócitos (10), de forma sensivelmente paralelipipédica; estas células tem um eixo maior sensivelmente perpendicular à membrana basal (5) e estão ligadas a esta pela sua base, graças a hemidesmosomas (39). A camada de Malpighi (7) é constituída essencialmente por uma pilha de camada de queratinócitos poliédricos (11). Entre a camada de Malpighi (7) e a camada córnea (9) situam-se duas ou três camadas dé queratinócitos achatados (12) que constituem a camada granulosa (8), Finalmente, a camada córnea (9) é constituída por uma pilha de células sensivelmente hexagonais (13) , mortas, achatadas e bem ordenadas.

A derme (4) compreende fibroblastos (14) mergulhados numa matriz extracelular (15) composta por macromoléculas tais como colagéneos, mucopolissacaridos, glicoaminogluoanos ou fibronectina.

óabelo (2) é constituído por um corpo (16) cuja parte plantada na epiderme termina por um bolbo (17). 0 bolbo (17) apresenta, na sua base, uma cavidade (18) que contém papilas dérmicas (19), e que se abre sobre a derme por um orifício (20). Uma parte da membrana basal (5) da epiderme envolve parcialraente o corpo (16) do cabelo (2), bem como o bolbo (17) e liga-se a este deixando aberto o orifício (20). Esta parte da membrana basal constitui assim uma cutícula (21) delimitada exteriormente por queratinócitos (10) da camada basal e encerrando entre esta camada e o cabelo queratinócitos poliédricos (11) da camada de Malpighi.

Uma das fases do processo consiste em preparar um implante constituido por uma parte do cabelo (2)_oEsta preparação efectua-se da seguinte maneira: o cabelo é retirado facilmente sem dor e sem risco de infecção com o auxílio de uma pinça, por exemplo. Esta operação não necessita de qualquer qualificação médica: um tal cabelo arrancado está representado na figura 2.

Quando desta extracção do implante, a cutícula (21) separa-se da camada basal envolvendo por rotura da referida camada. Dois casos podem então produzir-se: ou, quando da extracção, a camada basal rompe-se ao nível do bolbo e então extrai-se unicamente o corpo (16) do cabelo, ficando a cutícula (21) na epiderme (3); ou então a membrana basal rompe-se acima do bolbo, nomeadamente ao nível da junção derme/epiderme, e obtem-se então um cabelo ouja parte inferior é envolvida na cutícula (21). Apenas esta última eventualidade é retida na fase de preparação do implante; os cabelos ou os pelos arrancados sem cutícula não são utilizados. Se as papilas dérmicas ficaram na epiderme (3) quando da extracção, o cabelo (2), uma vez retirado, não contém nem fibroblasto nem qualquer contaminante dérmico, sendo estes últimos de facto elementos parturbantes numa cultura.

Por outro lado, as papilas dérmicas poderão eventualmente dar de novo origem a um cabelo e recriar uma outícula (21) contendo queratinócitos (10) e (11). 0 folículo piloso representa portanto uma fonte praticamente infinita de queratinócitos.

%rta-se em seguida o cabelo arrancado, sensivelmente perpendicularmente à sua linha longitudinal média, na zona onde ela é envolvida pela sua cutícula (21) nos pontos (A) e (B) referenciados na figura 2, tais que (B) se encontra por cima do bolbo e (A) por cima de (B), para conservar um comprimento (AB) compreendido entre 0,5 e

mm, aproximadamente

Elimina-se assim o bolbo (17) porque, por um lado, a extremidade mole poderia ser perturbadara na sequência do processo, como atrás se explicou, e, por outro lado, elimina-se assim todo risco de contaminação por papilas dérmicas que teriam ficado no aível do bolbo. Obtem-se então um implante (22) pronto para ser utilizado.

Paralelamente a esta preparação do implante (22), uma outra fase do processo consiste na preparação de uma estrutura equivalente à derme (4) e que no seguimento designaremos por um equivalente de derme. Esta preparação realiza-se, de maneira conhecida, como adiante se indica.

Extraiem-se em dadores humanos fragmentos de tecido cutâneo que compreendem derme e epiderme. Estes fragmentos são dispostos numa caixa num meio de cultura que é meio essencial mínimo (HEM), vendido, por exemplo, pela SEHOMED, de que se dá no Quadro I seguinte uma composiçã· clássica:

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QUADRO I FORMULAÇÃO D'O Μ Ε M

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Os fsbroblastos ãa derme deixam então o tecido cutâneo e multiplicam-se em monocamada no fundo da caixa.

Prepara-se, por outro lado, uma solução fracamente ácida de colagéneo de tipo I, obtida por extracção ácida suave a partir de tendões de cauda de rato.

Mistura-se em seguida esta solução fracamente ácida de colagéneo com fibroblastos, cultivados em monocamada como atrás se indicou e recolhidos por tripsinização controlada a partir de culturas subconfluentes ou confluentes, na presença de um meio nutritivo (MN1), com a composição seguinte:

- 85 a 90%, em volume, de MEM;

- 10%, em volume, de soro de vitela fetal ou

- 10% em volume, de soro humano AB;

- 1%, em peso, de ácidos aminados não essenciais (indicados no Quadro II seguinte)

QUADRO II

ÁCIDOS AMINADOS NÃO ESSENCIAIS

Componentes	Quantidades (mg/1)
D-Alanina	8,90
L-Asparagina.HgO	15,00
Acido L-Aspártico	13,50
Acido L-Glutâmioo	14,70
D-Glicina	7,50
L-Prolina	11,50
L-Serina	10,50

- 100 ϋ/ml de penicilina

- 100 ^tg/nil de estreptomicina

- 2,5_zug/ml de anfotericina B

- 1 mM de piruvato de sódio.

Neutraliza-se a mistura com soda 0,1 N e vaza-se numa recipiente achatado (23), como se representa na figura 3. A mistura forma um gel muito rapidamente»

Em consequência das interacções entre os fibroblastos, que são células contrácteis, e as fibras de colagéneo contidas no meio nutritivo gelieicado, o volume de gel diminui, o meio nutritivo é expulso e forma-se um equivalente de derme (24). Deixa-se efeotuar-se esta contração do gel durante alguns dias; o volume do gel reduz-se pelo menos de vinte vezes.

Os fibroblastos não constituem as únicas células contrácteis utilizáveis. Poderia também usar-se, por exemplo as células dos músculos lisos, bem como as do mús culo cardíaco; podem igualmente citar-se as plaquetas sanguíneas.

Do mesmo modo, se se tiver utilizado neste exemplo uma solução de colagéneo do tipo I como compo nente da matriz extracelular de derme, há todavia vários cola· géneos que convém para a reconstituição de um equivalente de derme; estes colagéneos devem, de preferência, ser feitos de moléculas completas que possuem ainda os seus telopeptidos. 0 colagéneo de tipo I faz parte deste grupo mas pode citar-se ainda o colagéneo humano extraído da placenta depois de digestão enzámática parcial.

Terminada a preparação do gel, que forma o equivalente de derme (24), inicia-se então a fase seguinte do processo, que é a epidermização deste equivalente de derme.

Insere-se o implante (22), obtido como atrás se indicou, no gel durante os primeiros minutos de contracção, de modo que a sua linha longitudinal média fique sensivelmente perpendicular à superfície livre do gel. E nesta fase de inserção do implante (22) que o bolbo do folículo piloso pode ser prejudicial porque a sua parte mole não facilita a inserção. E por isso que é preferível cortar o bolbo na preparação do implante.

Durante a fase de contracção do gel, que vai dar origem ao equivalente de derme (24), o implante encontra-se solidamente retido no seu lugar no gel. Representou-se na figura 3 um equivalente de derme (24) no qual se inserem várias implantes (22). Com efeito é possível semear o equivalente de derme em curso de elaboração por implantes regularmente distribuídos e espaçados por exemplo uns em relação aos outros de cerca de 0,5 a 2,5 cm. Depois desta sementeira, mantem-se durante 5 a 6 dias o equivalente de derme (24) em imersão no meio nutritivo (25) (MNl). Bste meio de cultura (25) recobre os implantes como se representa na figura 3. Durante esta fase, a multiplicação dos queratinócitos das cutículas (21) dos implantes i.nicia-se, e assiste-se então, a partir destes implantes, a um movimento radial e vertical dos queratinócitos à superfície do equivalente de derme (24).

Esta migração dos queratinócitos vai conduzir, no fim da epidermiLzação, à formação no equivalente de derme de um equivalente de epiderme (26).

conjunto (equivalente de derme (24)/ /equivalente de epiderme (26)) vai portanto constituir um equi valente de pele (27).

No fim deste período de 5 ou a 6 dias, substitui-se o meio (MN1) por um meio (29) (MN2) com a seguinte formulação:

- 85 a 90%, em volume, de meio essencial mínimo (MEM);

- 0 a 10%, em peso, de antibióticos (penicilina, estreptomicina, anfotericina B)

- 10 %, em volume, de soro animal ou humano

- 0 a 0,05 %, em peso, de factores de crescimento (factor de crescimento epidérmico, hidrocortisona, toxina colérica)

Ao mesmo tempo, dispóe-se o equivalente de pele (27) numa grelha de aço inoxidável (28) que assenta no fundo do receptáculo (23). A grelha mantém o equivalente de pele sobrelevado na caixa de cultura (23), na vizinhança da interface ar-líquido, tal como se representa na figura 4. Ajusta-se o nível do meio (02) de modo tal que a gre_ lha de suporte (28) fique justamente recoberta mas que o meio (02) não cubra a face superior do equivalente de pele (27) em curso de elaboração. 0 facto de colocar assim o equivalente de pele em curso de elaboração em contacto com o ar e assegurar a alimentação dos queretinócitos pelo equivalente de derme, favorece a diferenciação dos queratinócitos e portanto a formação de um equivalente de epiderme bem estruturado.

Após 8 a 13 dias, retiram-se os implantes enquanto o equivalente de epiderme em formação continua sobre o equivalente de derme. 0 diâmetro dos implantes é muito pequeno, da ordem de 0,5 mm aproximadamente, de modo que os buracos resultantes da extracção dos implantes para fora do equivalente de pele são novaraente tapados e obtem-se portanto um equivalente de pele globalmente homogéneo, sem buracos, estanque.

Uma vez retirados os implantes (22), deixa-se o equivalente de pele (27) em curso de elaboração em contacto com o meio (Iffi) durante um tempo que permite

um recobrimento total do equivalente de derme pelos queratinócitos desenvolvidos sobre o mesmo. 0 crescimento do equivalente de epiderme é medido colorindo a cobertura epitelial com o azul do Nilo em solução aquosa a 1/10 000 e medindo a superfície do equivalente de epiderme.

A superfície de um equivalente de pele (27) varia em função do número de implantes inseridos no equivalente de derme e em função da superfície deste. Assim, com um só implante, com um diâmetro de cerca de 0,5 rap, obtem-se um equivalente de pele com uma superfície de cerca de 1 cm ao fim de 10 a 12 dias, E claro que podemos obter uma superfície maior semeando o equivalente de derme por implantes regularmente distribuídos e espaçados uns dos outros de cerca de 0,5 a 2,5 cm, por exemplo.

Quando t errainar esta fase de epidermização, obtem-se o equivalente de pele (27), do qual se representa na figura 5 um corte parcial do equivalente de epiderme (26). Classicamente, este corte foi feito após coloração com 0 hemalumen-floxina-açafrão.

equivalente de pele (27) obtido segundo o modo de realização descrito atrás é pois constituído por um equivalente de derme recoberto por um equivalente de epiderme (26), sendo 0 equivalente de derme uma película formada por um gel de colagéneo de tipo I que encerra fibroblastos distribuídos tridimensionalmente na película. 0 equivalente de epiderme (26), representado na figura 5, compreende um equivalente de membrana basal (5a), constituído por um depósito em camada de laminina, de fibronectina, de colagéneo de tipo IV e de antigénio da penfigoide bolhosa. Por cima deste equivalente de membrana basal, encontrara-se queratinócitos (10a) dispostos em paliçada ligados ao equivalente de membrana por heraidesmosomas (39): encontramos portanto um equivalente de camada basal (6a). Observam-se igualmente cé• lulas progressivamente diferenciadas a partir das células

- (10a) da camada basal (6a) até células achatadas (13a) dispos- 19 -

tas na vizinhança da superfície livre/ estando as células das diferentes camadas ligadas entre si por desmosomas (30). 0 equivalente de camada córnea (9a), bem como os equivalentes de camadas de Malpighi (7a) e granulosa (8a) são muito semelhantes às camadas reais da pele humana.

E_ncontram-se, por outro lado, gueratinócitos do equivalente de epiderme (26), fibras de gueratina (31) e verifica-se que a queratina básica de 67 kDa, que é um marcador de diferenciação terminal normalmente ausente nas culturas de estado actual da técnica e nos folículos de cabelo retirados de fresco, é sintetizada de maneira normal nas camadas suprabasais (7a) e (8a) do mesmo modo que o seu par, a q ueratina ácida 56,5 kDa. Além disso, esta queratina de 67 kDa é detectada desde a primeira camada suprabasal (7a) como mma pele normal.

A filagrina está assim presente no equivalente de epiderme (26) y detecta-se no equivalente de camada granulosa (8a) y ela resulta da maturação proteolítica do seu precursor, a profilagrina. rpr electroforese, por exemplo, pode ver-se que esta filagrina é convenientemente cortada ao nível das pontas oligopeptídicas da profilagrina. 0 processo segundo a presente invenção permite pois a maturação da profilagrina em queratinócitos humanos.

equivalente de epiderme (26) assim reconstituído está pois bem diferenciado e bem organizado. É também uniforme do ponto de vista da espessura e do estado de diferenciação.

Finalmente, a afierencia equivalente de derme/equivalente de epiderme é excelente. Ela permite pois uma manipulação fácil do equivalente de pele (27) assim formado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lê Processo para a produção de um equivalente de pele no qual:

12 se prepara um equivalente de derme (24) misturando:

a) células contrácteis recolhidas a partir de culturas monocamadas realizadas num meio nutritivo semeado por segmentos de tecido animal ou humano com

b) um meio nutritivo (MN1) adicionado de componentes da matriz extracelular (15) da derme (4), formando a referida mistura um gel que se contrai, expulsando

0 meio nutritivo para formar 0 equivalente de derme (24);

22 se utiliza 0 equivalente de derme (24) obtido segundo 12) como substrato para um equivalente de epiderme (26) obtido por sementeira do referido substrato com os queratinócitos de um explantado animal ou humano e por manutenção de condições que permitem a multiplicação dos queratinócitos na superfície do referido substrato, seado a multiplicação dos queratinócitos à superfície do referido substrato favorecida pela utilização de pelo menos um meio (MNÍ;MN2)(25;29) em contacto oom os referidos queratinócitos, caracterizado pelo facto de se semear 0 substrato (24) por meio de pelo menos um folículo piloso (2) ou um troço (22) de folículo piloso (2) extraído de uma pele animal ou humana por arranque, compreendendo 0 referido folículo (2) ou troço (22) pelo menos parcialmente a sua cutítula celular (21) β sendo implantado no substrato (24) de maneira que a sua linha longitudinal média fique sensivelmente perpendicular à superfície livre do substrato.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizarem, como célula contráctil (14), fibroblastos.

- 3S _

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se utilizarem, como células contrácteis (14), fibroblastos dérmioos obtidos a partir de dadores humanos e recolhidos, a partir de culturas monocamadas, por tripsinização controlada.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de utilizar, como meio nutritivo para as culturas de células contrácteis (14), meio essencial mínimo (MEM).

- 5* _

Processo de acordo oom qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo faoto de se utilizar como meio de cultura contendo componentes da matriz extracelulares (15) da derme (4), um meio contendo pelo menos colagéneo.

- 6â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se utilizar como meio de oultura contendo componentes da matriz extracelular (15), um meio contendo colagéneo de tipo I_o

- 7a _

Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se preparar 0 equivalente de derme (24) por meio das fases seguintes:

a) obtem-se uma solução fracamente ácida de oolagáneo por extracção ácida suave a partir de uma fonte animal ou humana;

b) mistura-se a solução da fase a) com as células contrácteis (14) e 0 meio nutritivo (MN1), neutraliza-se por adição de uma base e vaza-se a mistura num recepçáoulo achatado (23);

c) deixa-se 0 gel (24) assim obtido contrair-se durante vários dias.

- 8ô -

Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se utilizar, para 0 meio nutritivo (MN1), a formulação seguinte:

- de 80% a 100%, em volume, de um meio essencial mínimo (MEM);

- de 0% a 20%, em volume, de soro de vitela fetal;

- de 0 % a 20%, em volume, de soro humano grupo AB;

- de 0 % a 10%, em peso, antibióticos;

- de 0 % a 2 %, em peso, de um ou mais compostos energétioos;

- 0 % a 2 %, em peso, de ácidos aminados não essenciais.

- 9^Ô Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de se enterrar o implante (22) no substrato (24) a partir da superfície livre do substrato numa distância compreendida entre 0,1 e 2 mm.

- 10 a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se obter o implante (22) cortando o folículo piloso arrancado (2) sensivelmente perpendicularmente à sua linha longitudinal média, na zona onde ele é envolvido pela sua cutícula celular (21), para conservar um comprimento compreendido entre 0,5 ® 5 mm, aproximadamente.

-lia -

Processo de acordo com a reivindicação

10, caracterizado pelo facto de se cortar o folículo piloso (2) na vizinhança da sua base para eliminar o bolbo (17).

-12S -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de se inserir

-24 o implante (22) no substrato (24) desde o início da contracção do gel, que constitui o substrato.

- 13 δ -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de, depois da sementeira do substrato (24), se manter durante um tempo TI o substrato implantado em imersão no meio nutritivo (MN1) (25), que cobre o ou os implantes (22).

- 146 -

Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de se escolher um tempo TI de •eroa de cinco a seis dias.

- 15^ê -

Processo de acordo com uma das reivindicações 13 e 14, caracterizado pelo facto de, quando terminado o tempo TI se substituir o meio (MN1) (25) por um meio (MN2) (29) que se faz aflorar a um nível na espessura do equivalente de derme (24).

- 16& -

Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de, para assegurar o afloramento do meio (MN2) ao nível desejado, se colocar o equivalente de derme (24) numa grelha-suporte (28) sobrelevado em relação ao fundo do receptáculo e se ajustar o nível do meio (MN2) para que a grelha-suporte justamente seja coberta, mas que o meio (MN2) não cubra a face superior do equivalente de pele (27) em curso de elaboração.

- 17& -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo facto de se utilizar, como meio (MN2), a formulação seguinte:

- de 80% a 100%, em volume, de meio essencial mínimo (MEM);

- de 0 % a 10 %, em peso, de um ou mais antibióticos;

- de 0 a 20 %, em volume, de soro animal ou humano;

- de 0 % a 0,05 %, em peso, de um ou mais factores de crescimento.

- 188 -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo facto de se extrair o implante (22) do substrato (24) por arranque num tempo T2 após a implantação.

- 19» Processo de acordo com a reivindicação 18, oaraoterizado pelo facto de se escolher um tempo T2 cLe cerca de 8 a 13 dias.

- 208 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo facto de se man

- 26 ter o equivalente de pele (27) em contacto com o meio de cultura (29) até um tempo T3 após a implantação no equivalente de derme (24).

- 21â -

Processo de acordo com as reivindicações 18 e 20, em combinação, caracterizado pelo facto de se escolher o tempo T3 superior a T2 e permitindo um revestimento total do substrato (24) pelos querathócitos desenvolvidos no referido substrato e uma diferenciação apreciável dos referidos queratinócitos.

- 22a -

Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se semear o substrato (24) por implantes (22) distribuídos regularmente e espaçados uns dos outros de cerca de 0,5 a 2,5 cm e por se escolher um tempo T3 de cerca de 15 dias a vários meses.

- 23® -

Equivalente de pele (27),caracterizado pelo facto de ser obtido pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 22.

0 Requerente declara que o primeiro pe dido desta patente foi apresentado na França em 26 de Março de 1987,sob o na.87 04205.