NO171222B

NO171222B - Fremgangsmaate ved fremstilling av huderstatning

Info

Publication number: NO171222B
Application number: NO881349A
Authority: NO
Inventors: Bruno Bernard; Marie-Cecile Lenoir; Braham Shroot; Yves-Michel Darmon; Daniel Asselineau
Original assignee: Cird
Priority date: 1987-03-26
Filing date: 1988-03-25
Publication date: 1992-11-02
Also published as: ES2004843A4; GR880300158T1; EP0285471A1; ATE59971T1; FI881362A; JPS648974A; JP2733838B2; US5639654A; AU602394B2; NO171222C; ZA882032B; PT87084A; DK164488A; DE3861532D1; NO881349D0; FI881363A0; ZA882033B; PT87084B; FI881362A0; AU1374388A

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte for å erholde en erstatning for hud.

Man kjenner ved forskning å erholde cellulære strukturer in vitro som kan sammenlignes med animalsk eller human hud, spesielt for å kunne anvende slike ved podning i praksis på sår, så som ved store brannsår. Man har lenge søkt strukturer som har så store likheter som mulig med strukturen til human hud for å unngå risikoene for avstøtning av podningen. I tillegg er det mulig å anvende et slikt materiale for å studere de farmakologiske eller kosmetiske effekter på diverse produkter og en slik undersøkelse gir resultater som er mer pålitelige jo større likheter materialet har med huden.

Foreliggende oppfinnelse beskriver også en fremgangsmåte som tillater å erholde en huderstatning som har strukturelle likheter med hud, som er viktigere enn de som oppvises av materialer av den type som faktisk er kjent.

Kapasiteten til en kultur av keratinositter i et næringsmiljø er godt kjent. Mer nøyaktig gir artikkelen til F.K. Noser (publisert i "The Journal of Investigative Derma-tology", 87. 485-488, 1986) kapasiteten til keratinositt-kulturer med utbytte fra en follikkel med humant hår. I tillegg angir artikkelen til A.J.M. Vermorken (publisert i "Molec, biol. Rep." 10, 205-213, 1985), at kulturen av keratinositter erholdt fra en hårfollikkel kan lede til dannelsen av et cellulært sjikt bestående av et antall lag som oppviser en viss differensiering på en slik måte at den analoge hud er slik man finner den i en epiderm hos dyr eller mennesker. Det er foreslått at denne fremstillingen av cellulært sjikt kan foretas ved å bruke som støtte-materiale en hudekvivalent av kjent type, men ingen presisering er angitt i denne anledning. I tillegg hører immersjonskulturen som er beskrevet leder til en struktur av cellulærsjiktetsom oppviser flere vesentlige forskjeller i forhold til epiderm fra dyr eller mennesker.

Den internasjonale PCT-søknad publisert under nr. WO 86/02273 beskriver en fremgangsmåte for å erholde en huderstatning som bruker egenskapene til kulturen av keratinocytter og anvender, som kilde for keratinocytter, hudbiopsier. I følge denne fremgangsmåte erholdes, ved ekstraksjon under mildt sure betingelser for eksempel ved å skille sener i rottehale, kollagen av type I som holdes i oppløsning i svakt surt miljø. Man bruker dessuten i et kulturmiljø erholdte fibroblaster for eksempel fra humant vev. Kollagenoppløsningen nøytraliseres med en base og tilsettes næringselementer. Fibroblasti blir tilsatt.

Man har således dannelse av en gel som trekker seg sammen ved intraksjon mellom fibroblastene og kollagenmolekylene ved dyrkning i næringsmiljø, for å danne en erstatning for hud. Før gelen har trukket seg sammen setter man inn en biopsi av hud på ca 2 mm. i diameter som man plasserer på en slik måte at epidemien fra biopsien ligger an mot overflaten av gelen. Man observerer emigrering og en celledeling av keratinocytter som stammer fra biopsien fra overflaten av huderstatningen, og differensieringsfasen til keratinocyttene fører til slutt til dannelsen av diff-erensierte lag i en ekvivalent til epidermen.

En slik fremgangsmåte oppviser flere ulemper. Man kan for eksempel angi at man ikke erholder en huderstatning som er fullstendig homogen idet biopsien som består av hudpartier, ikke ligger innsatt på hudekvivalenten. En annen ulempe ligger i måten biopsien fremskaffes på, som har blitt utført av en lege og kan ha vært smertefull, kan resultere i synlige arr. I tillegg kan det ikke sees bort fra risikoen for forurensing ved innvirkning av infeksjonsemner så som virus. Til slutt er overflaten til hudekvivalenten som man forsøker å erholde, begrenset til det antall biopsier som man kan fjerne fra for eksempel et menneske.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen overvinner disse ulemper ved å bruke på spesiell og særpreget måte kapasiteten til keratinocyttkulturen til å utnytte en hårfollikkel. Ifølge oppfinnelsen erstattes biopsen anvendt i dokumentet WO 86/02273 med en hårfollikkel omgitt av sin skjede og innplanteres i hovedsak vinkelrett på den fri overflate av hudekvivalenten i løpet av utarbeidelsen. Man erholder således resultater som er meget overraskende for fagmannen og som består av differensiering av keratinocytter og man erholder faktisk en epidermekvivalent hvis likhet med en human epiderm er absolutt uventet. I tillegg, i likhet med keratinocyttene i dokument WO 86/02273 og som i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er kilden for dannelse av en epidermekvivalent, og innsettelsen av en hårfollikkel vinkelrett til en fri overflate av hudekvivalenten under opparbeidelsen, ikke ekvivalent til en biopsi av hud anngående resultater som er erholdt og forbedret på bemerkelsesverdig måte. I tillegg oppviser strukturen til cellesjiktet, som består av den erholdte epidermekvivalent i forhold til hudstrukturen, meget viktige likheter med de til cellesjiktet som man erholder ved å dyrke forskjellig tilsvarende celler fra en hårfollikkel (artikkelen til A.J.M. Vermorken angitt ovenfor). Til slutt er forbindelsen mellom sjiktene bestående av dermekvivalent og epidermekvivalent tilfredstillende og tillater lett behandling av hudekvivalenten.

Hudekvivalenten fremstilt ifølge oppfinnelsen er således sammensatt, at den er godt differensiert og godt organisert. Den er også motstandsdyktig mot vann og i hovedsak homogen: faktisk kan man under fremgangsmåten fjerne fra hudekvivalenten, hårfollikkel (ene) og fordypningen (ene) som også er dannet i hudekvivalenten, kan fylles opp.

Differensieringen erholdt in vitro ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er meget nærliggende den som observeres in vivo. Man finner spesielt filamenter i hudens granulærlag som likner normal hud og man kan observere ved elektroforese at filamentet har blitt dannet ved innsetting av profilamenter på oligopeptidnivå. I tillegg finner man en foran-kringsegenskap til basalcellene som spesielt er en følge av implantasjonen av hårfollikkel vinkelrett på overflaten av hudekvivalenten under opparbeidelsen.

Man erholder ved implantasjon av en hårfollikkel en overflate av huderstatningen som i hovedsak er lik den som erholdes ved en biopsi, men man kan fjerne et stort antall follikkler og allikevel erholde fra en og samme donnor en meget stor overflate, noe som ikke er tilfelle når det gjelder biopsier.

Huderstatningen således erholdt kan spesielt anvendes for behandling av sår ved implantasjon med denne huderstatning. I dette tilfelle kan giver og mottaker være mennesker og giver av hårfollikkler kan være den samme som mottaker av huderstatningen.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte ved fremstilling av en huderstatning hvori:

1. Man fremstiller en hudekvivalent ved å blande:

A) kontraktile celler oppsamlet fra monolagskulturer dyrket i et næringsmedium med fragmenter av animalsk

eller humant vev.

med

B) et næringsmedium (MN1) tilsatt bestanddeler av

ekstraceullulær hudmatrise

hvor nevnte blanding danner en gel som trekker seg sammen under utskillelse av næringsmediet for å danne en dermekvivalent, og

2. anvender dermekvivalenten erholdt ifølge punkt 1, som substrat for en epidermekvivalent erholdt ved tilsetning til nevnte substrat sammen med keratinocyttcelller fra animalsk eller humant vev, og ved å opprettholde betingelser som tillater vekst av keratinocyttcellene på overflaten av nevnte substrat, hvor utviklingen av denne kultur av keratinocyttceller er begunstiget ved anvendelsen av minst ett medium (MN1, MN2) til kontakt med nevnte keratinocyttceller, hvilken fremgangsmåte er særpreget ved at et substrat tilsettes minst en hårfollikkel eller en skjede av en hårfollikkel fjernet fra animalsk eller humant vev ved uttrykking, hvor nevnte follikkel eller skjede omfatter minst delvis sin cellulære vegg og blir implantert i substratet på en slik måte at deres gjennomsnittlige langsgående akse i hovedsak er vinkelrett på den frie overflate av substratet.

Man kan anvende som kontraktile celler fibroblaster, og man anvender fordelaktig som kontraktile celler dermfibroblaster erholdt i utgangspunkt fra friske humane givere som høstes ved slutten fra monolagskulturer ved trypsinering.

Man anvender fortrinnsvis som næringsmiljø for de kontraktile cellekulturer minimalt essensielt medium (MEM) ; man anvender fortrinnsvis som miljø for kulturen inneholdende bestandelene til den ekstra-cellulære dermmatrise, et miljø inneholdende minst kollagen, spesielt av type I.

Ifølge en foretrukket utførelsesform fremstilles dermekvivalenten ved hjelp av de følgende trinn: a) man erholder en svak sur oppløsning av kollagen med svakt sur ekstraksjon fra en animalsk eller human kilde, hvor dette kollagen også kan være av kommersiell opprinnelse erholdt fra bedriften "BIOETICA", b) man blander oppløsningen fra trinn A med kontraktile celler og et nærende medium (MN1), man nøytraliserer oppløsningen ved tilsettingen av en base og man sår ut blandingen på en mottakende plate; c) man lar gelen således erholdt trekke seg sammen i løpet av flere dager.

Man anvender fortrinnsvis for det nærende miljø (MN1)

følgende blanding:

8 0 - 100 volum % av minimalt essensielt medium (MEM);

0-20 volum % av føtalt kalveserum;

0-20 volum % av humant serum av gruppe AB;

0-1 vekt % av en eller fler antifungicider;

0-10 vekt % av et eller fler antibiotika;

0-2 vekt % av en eller fler energigivende for-bindelser;

0-2 vekt % av ikke-essensielle aminosyrer.

Man kan føre implantatet i substratet fra den fri overflate av substratet med en avstand som ligger mellom 0,1 og 2 mm. Fortrinnsvis erholdes innplantatet ved å skjære ut den avrevne hårfollikkel i hovedsak vinkelrett på sin gjennomsnittlige langsgående akse, i sonen eller den som den omgis av sitt cellulære materiale for å bibeholde en lengde som er mellom ca. 0,5 og 5 mm. Fordelaktig skjærer man hårfollikkelen i nærheten av dennes base for å fjerne roten. Fortrinnsvis innsettes implantatet i substratet ved begynnelsen av sammentrekning av gelen som utgjør substratet .

Fordelaktig etter tilførselen til substratet opprettholdes under en tid Tl substratet implantert ved immersjon i det nærende medium (MN1) som dekker implantatet (ene), og man kan velge en tid Tl i området 5 til 6 dager.

Når tiden Tl har utgått, erstattes fordelaktige miljøet (MN1) med et medium (MN2) som man kan plassere ved et nivå beliggende i mellomrommet av dermekvivalenten. Foretrukket for å sikre fremskaffelsen av mediet (MN2) til ønsket nivå, plasserer man dermekvivalenten på en nettingstøtte hevet i forhold til bunnen av brønnen og man justerer nivået til mediet (MN2) slik at nettstøtten er akkurat dekket, men at mediet (MN2) ikke dekker den øvre overflate av huderstatningen under opparbeidelsen.

Man kan anvende som medium (MN2) følgende sammensetning:

80 - 100 volum % av minimalt essensielt medium (MN1);

0-10 vekt % av ett eller fler antibiotika og /eller antifungicide midler;

0-20 volum % av humant eller animalt serum;

0-0,5 vekt % av en eller fler vekstfaktorer.

Foretrukket fjerner man implantatet fra substratet ved avlivning ved en tid T2 etter implantasjonen. Man kan velge tiden T2 i området 8 til 13 dager og man kan opprettholde huderstatningen i kontakt med dyrkningsmiljøet til en tid T3 etter implantasjonen i huderstatningen. Man velger fortrinnsvis en tid T3 som er større en T2 og tillater en fullstendig gjennvinning av substrat med keratinocyttene utviklet i nevnte substrat og en synlig differensiering av nevnte keratinocytter.

Man kan så ut på substratet implantater som er regulært formet og med en avstand fra hverandre på ca. 0,5-2,5 cm. og man velger fortrinnsvis en tid T3 omkring 15 dager til flere måneder.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det fremstilles en huderstatning bestående av en dermekvivalent fremskaffet fra en epidermekvivalent hvor dermekvivalenten er en film dannet av en kollagengel av type I inneholdende fibroblaster fordelt tredimensjonalt i nevnte film hvor huderstatningen omfatter: a) en ekvivalent av basalmebran bestående av en mengde på et laminatlag av fibronektin av kollagen av type IV og antigener mot blæreutslett; b) celler av basallaget anbrakt side om side fremskaffet fra membranekvivalenten fra punkt A. ved hemidesmosomer; c) celler fra suprabasallaget som i første suprabasallag inneholder basisk keratin på 67 kDa og sur keratin på 56,5 kDa; d) granulceller som inneholder korn av keratohyalin, involukrin, transglutaminase og filagrin; e) utflatede og keratiniserte celler anbrakt i nærheten av den fri overflate fremskaffet etter ekstraksjon med en .

natriumdodesylsulfat og 2-merkaptoetanol med ©n omsluttende omhylling som er særpreget for korneosytter, hvor cellene til de forskjellige lag ligger mellom disse ved desmosomer.

For bedre å forstå målet for oppfinnelsen, er det beskrevet nedenfor som kun et illustrerende og ikke begrensende eksempel, et utfyllingseksempel representert ved de medfølgende tegninger.

I disse tegningene er:

- figur 1 et delvis snitt av en huddel (spesielt av lærhudshår) hvori det er plassert en hårfollikkel (spesielt et hovedhår); - figur 2 representerer håret fra figur 1 fjernet fra hårsekken; - figur 3 viser en huderstatning under opparbeidelse neddynket i næringsveske; - figur 4 viser tilsvarende huderstatning som i figur 3, men i kontakt med luft under en senere fase; - figur 5 er et delsnitt av epidermekvivalenten til huderstatningen fremstilt ifølge oppfinnelsen.

I figur 1 vises en huddel, spesielt lærlaget kalt 1 i sammensetningen, hvori det er plassert en hårfollikkel 2. Follikkelen utvikles fra epidermen betegnet 3 i sammensetningen. Epidermen er adskilt fra dermen betegnet med 4 i sammensetningen via en basalmembran 5. Man skiller mellom fire nivåer i epidermen som er, ved å gå ut fra basalmembranen mot det utvendige av huden, basallaget 6, malpigilaget 7, granullaget 8 og hornlaget 9.

Epidermen består av 95 % av celler kalt keratinocytter. Keratinocyttene oppviser en differensiering fra basallaget til hornlaget. Basallaget 6 består av et enkelt lag keratinocytter 10 som i hovedsak har paralellepipedisk form hvor disse celler har hovedaksen i hovedsak vinkelrett på basalmembranen 5 og ligger i forhold til sistnevnte med base mot hemidesmosonene 39. Malpigilaget 7 består i hovedsak av en opphopning av det polyedriske keratinocyttlag 11. Mellom malpigilaget 7 og hornlaget 9 ligger 2 eller 3 lag av flate keratinocytter 12 som utgjør granurlaget 8. Endelig består hornlaget 9 av en opphopning av i hovedsak hexagonale celler 13 som er døde, avflatede og godt ordnede.

Dermen 4 omfatter fibroblaster 14 og er fyllt med en ekstra-cellulær matrise, bestående av makromolekyler så som kollagener, mukopolysakkarider, glykoaminoglykaner eller fibronektin.

Håret 2 består av et legeme 16, hvis del er plassert i epidermen og ender i en rot 17. Roten 17 oppviser ved sin base et hullrom 18 som inneholder dermiske papiller 19 og som åpner seg til dermen via en åpning 20. Et parti av basalmembranen 5 til epidermen omslutter delvis legemet 16 til hårstrå 2 sammen med roten 17 og den ligger under denne og omfatter en åpning 20. Denne del av basalmembranen omfatter også en utvidelse 21 begrenset utad med keratinocytter 10 til basallaget og inneholder mellom dette lag og håret polyedriske keratinocytter 11 til malpigilaget.

En av trinnene til fremgangsmåten består av å fremstille et implantat bestående av en del av håret 2. Denne fremstilling blir utført som følger: håret blir enkelt fjernet uten smerte og uten risiko for infeksjon, ved hjelp av for eksempel en pinnsett. Denne operasjonen krever ingen medisinsk utdannelse og et slikt utnappet hår er vist i figur 2.

Etter denne fraskillelsen fra implantatet skilles utvidelsen 21 fra det omliggende basallaget ved oppsprekning av nevnte lag. To tillfeller kan således dannes: enten vil, etter ekstraksjonen, basallaget avrives ved nivået til utvidelsen og man fjerner således alene hårlegemet 16 hvor utvidelsen 21 forblir i epidermen 3, eller så avrives basalmembranen under utvidelsen spesielt ved nivået til skillet mellom derm/epiderm, og man erholder således et hår hvis nedre parti er omgitt av utvidelsen 21. Kun denne andre even-tualitet er gjort gjeldende ved preparasjonstrinnet til implantatet; hårene eller den utnappede pels, uten utvidelse blir ikke brukt. Dersom de dermiske papiller er tilbake i epidermen 3 etter fraskillelsen, inneholder håret 2, som er fjernet en gang, ikkefibroblaster eller noen dermiske forurensinger hvor sistnevnte kan være generende elementer i en kultur. For eksempel kan de dermiske papiller eventuelt gi en gjenndannelse til et hår og gjenndanne en utvidelse 21 inneholdende keratinocyttene 10 og 11. Hårfollikkelen oppviser imidlertid en så godt som uendelig kilde til keratinocytter.

Et snitt over det fjernede hår i hovedsak vinkelrett på dettes langsgående akse i område hvor det treffer på utvidelsen 21 til punktene A og B, er vist i figur 2, hvor B befinner seg over utvidelsen og A over B for å bevare en lengde av B som ligger mellom ca. 0,5 og 5 mm.

Man fjerner også utvidelsen 17 idet for det første den bløte ende kan være generende under fremgangsmåten som forklart nedenfor, og for det andre fjerner man også enhver risiko for forurensing av de dermiske papiller som ligger på høyde med roten. Man erholder således et implantat 22 som er klart til å bli brukt.

Parallelt med denne fremstilling av implantatet 22 består et annet trinn av fremgangsmåten av fremstillingen av en tilsvarende struktur som derm 4, hvor dette i det følgende kalles er dermekvivalent. Denne fremstillingen utføres på

kjent måte som angitt nedenfor.

Man fjerner fra humane givere kutane vevsfragmenter inneholdende derm og epiderm. Disse fragmenter plasseres i en skål i et kulturmiljø som er av "Minimalt Essensielt Medium" (MEM) forhandlet for eksempel av la Societe Seromed og hvis vanlige sammensetning er angitt i tabell 1 nedenfor. Dermfibroblastene stammer således fra kutanvevet og formerer seg til et monolag i bunnen av skålen.

Man fremstiller for det andre en svakt sur opplesning av kollagen type 1 erholdt ved svakt sur ekstraksjon fra halesener hos rotter.

Man blander derpå denne svakt sure oppløsning av kollagen med fibroblastene dyrket i monolag som angitt ovenfor, og høster disse ved trypsinering utført ved subkonfluent eller konfluentkultur ved tilstedeværelse av et nærende miljø

(MN1) med følgende sammensetning:

85 - 90 volum % MEM;

10 volum % føtalt kalveserum eller

10 volum % humant serum AB;

1 vekt % ikke-essensielle aminosyrer

(angitt i tabell II nedenfor).

Blandingen nøytraliseres med 0,1 N lut og man plasserer dette i en skål 23 som angitt i figur 3. blandingen opptas i gelen meget raskt.

Etter interaksjoner mellom fibroblastene som er kontraktile celler, og kollagenfibrene inneholdt i gelformig næringsmedium minsker volumet til gelen, det nærende medium støtes ut og en dermekvivalent 24 danner seg. Man lar denne sammentrekning av gelen fortsette i løpet av et par dager og volumet til gelen reduseres minst 20 ganger.

Fibroblaster utgjør ikke de eneste anvendbare kontraktile celler. Man kan også for eksempel anvende glatte muskelceller, tverrstripete muskelceller så vel som hjertemuskel-celler og man kan også anvende blodplater.

Tilsvarende, dersom man har brukt i dette eksempel en kollagenoppløsning av type 1 som ekstra-cellulær dermatrise, består denne imidlertid av flere kollagener som er passende for gjendannelse av en dermekvivalent, og disse kollagener kan også fortrinnsvis være dannet av fullstendige molekyler som også omfatter deres telopeptider. Kollagene av type 1 stammer fra denne gruppe, men man kan likeledes angi humant kollagenekstrakt fra placenta etter delvis enzymfordøying.

Etter at fremstillingen av gel som danner dermekvivalenten 24 har blitt foretatt, utfører man derpå etterfølgende trinn av fremgangsmåten som er epidermisering av denne dermekvivalent.

Implantet 22 erholdt som angitt ovenfor, plasseres i gelen under de første minutter av kontraksjonen på en slik måte at dens midlere langsgående akse i hovedsak er vinkelrett på den fri overflate av gelen. Det er i denne innsetningsfase av implantet 22 at hårfollikkelroten kan være generende idet dennes bløte del ikke letter innsetningen. Det er derfor det er foretrukket å fjerne roten under fremstillingen av implantatet.

Under sammentrekningsfasen av gelen som vil gi opphav til dermekvivalenten 24, befinner implantet 22 seg fast forankret i gelen. Det er vist i figur 3 en dermekvivalent 24 i hvilken det er innsatt flere implantater 22. Faktisk er det mulig å utså dermekvivalenten under opparbeidelsen av implantatene regelmessig plassert og beliggende for eksempel i en avstand på omkring 0,5 - 2,5 cm. Etter denne utsåing opprettholdes dermekvivalenten under 5 til 6 dager i imersjon i et nærende miljø 25 (MN1). Dette dyrkningsmiljø 25 dekker implantene som angitt i figur 3. Under denne fase starter veksten av keratinocyttene i gelen 21 av implantatene og man hjelper således fra utgangen av implantatene en radiell og vertikal bevegelse av keratinocyttene på overflaten av dermekvivalenten 24.

Denne migrering av keratinocytter vil føre mot slutten av epidermiseringen til en dannelse på dermekvivalenten av en epidermekvivalent 26.

Sammensetningen (dermekvivalent 24/epidermekvivalent 26) vil således utgjøre en huderstatning 27.

Mot slutten av denne periode på 5 til 6 dager kan man erstatte mediet (MN1) med et medium 29 (MN2) med følgende sammensetning: 85-90 volum % av minimalt essensielt medium (MEM) 0-10 vekt % av antibiotika (penicilin, streptomysin,

amfoterisin B)

10 volum % animalt eller humant serum

0-0,05 vekt % av vekstfaktorer (epidermisk vekst faktor, hydrokortison, koleratoxin.)

På samme tid blir huderstatningen 27 anbrakt på en rist av ikkeoksydertbart metall 28, beliggende på bunnen av skålen 23. Nettet holder huderstatningen hevet i dyrkningsskålen

23 i nærheten av overgangen mellom luft og veske som angitt i figur 4. Nivået til mediet MN2 justeres på en slik måte at nettverksstøtten 28 såvidt er dekket, men hvor mediet MN2 ikke dekker øvre flate av huderstatningen 27 under opparbeidelsen. Det er også nødvendig å plassere huderstatningen under opparbeidelsen i kontakt med luft, og sikre næring til keratinocyttene i dermekvivalenten for å favorisere differensiering av keratinocyttene og således dannelsen av en godt strukturert epidermekvivalent.

Etter 8 til 13 dager blir implantatene fjernet, hvorpå epidermekvivalenten under dannelse hviler på dermekvivalenten. Diameteren på implantatene er meget små, i størelsesorden ca. 0,5 mm. hvor hullene som stammer fra <;>fjerningen av implatningene fra huderstatningen omleires og man erholder således en huderstatning som i hovedsak er homogen, vanntett og uten hull.

Når implantatene 22 trekker seg sammen, holdes huderstatningen 20 under opparbeidelsen i kontakt med mediet MN2, i løpet av en tid som tillater en fullstendig dekning av dermekvivalenten med keratinocytter utviklet på sistnevnte. Veksten av epiderm-ekvivalenten måles ved å farge epitel-laget med nilblått i vanndig oppløsning på 1/10000 og ved å måle overflaten til epidermekvivalenten.

Overflaten til en huderstatning 27 varierer som funksjon av antall innsatte implantater i dermekvivalenten og som funksjon av overflaten til disse. I tillegg med et enkelt implantat med en diameter på ca. 0,5 mm. erholdes en huderstatning med en overflate på ca. 1 cm<2> i løpet av 10 til 12 dager. Man kan også erholde en overflate som er meget større ved utsåing på dermekvivalenten med implantater regelmessig beliggende i en avstand fra hverandre på for eksempel 0,5 - 2,5 cm.

Når denne epidermiseringsfase er avsluttet, erholdes en huderstatning 27 som er avbildet på figur 5 ved et delvis snitt gjennom epidermekvivalenten 26. Klassisk foretas dette snitt etter farging med hemalun floxin safran.

Huderstatningen 27 erholdt ifølge utførelsesformen beskrevet ovenfor, omfatter således en dermekvivalent dekket med en epidermekvivalent 26 hvor dermekvivalenten er en film dannet av en gel av kollagen type 1, inneholdende fibroblaster fordelt tredimensjonalt i filmen. Epidermekvivalenten 26 vist i figur 5, består av en basalmembranekvivalent 5a, bestående av en avleiring av laminerte lag av fibronektin kollagen type 4 og antigen til rotblæreutslett. Under denne basalmembranekvivalent finner man keratinocytter 10a anbrakt side om side forbundet med mebranekvivalenten via hemidesmosomer 39: man fremstiller således en basallagekvivalent 6a. Det observeres likeledes celler under progressiv differensiering under cellene 10a, til basallaget 6a til utflatede celler 13a, anbragt i nærheten av den fri overflate hvor cellene i de forskjellige lag er forbundet mellom seg via desmosomer 30. Ekvivalenten til hornlaget 9a samt ekvivalentene til malpigilaget 7a og granurulaget 8a, har meget store likheter med tilsvarende lag i human hud.

Man finner dessuten i keratinocyttene av epidermekvivalenten 26, keratinfibre 31, og det finnes at det basiske keratin på 67 kDa, som er en markør for terminal differensiering normalt fraværende i kulturer ifølge teknikkens stand og i hårfollikkler ferskt fremstilt, blir syntetisert på normal måte i de suprabasale lag 7a og 8a, sammen med sin partner surferatin på 56,5 kDa. I tillegg blir dette keratin på 67 kDa påvist i det første suprabasallag 7a, så som i normal hud.

Filamentdannelsen er også tilstede i epidermekvivalenten 26, den kan påvises i ekvivalenten til granurlaget 8a og den resulterer i matureringen av sin protyolytiske prekursor profilamentene. Ved for eksempel elektroforese kan man se at dette filament passende er spaltet til tunge oligo-peptider fra profilamentene. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater således matureringen av profilamenter i humane keratinocytter.

Epidermekvivalenten 26 således gjenndannet er altså godt differensiert og godt organisert. Den er likeledes uniform med hensyn til tykkelse og til differensiering.

Til slutt er ekvivalent adhering mellom derm/epidermekvivalent utmerket. Den tillater således en lett behandling av huderstatningen 27 som således er dannet.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av huderstatning hvor man: 1) fremstiller en dermekvivalent (24) ved å blande: a) kontraktile celler oppsamlet fra monolagskulturer dyrket i et næringsmedium, med fragmenter av animalsk eller humansk vev med b) et næringsmedium (MN1) tillsatt bestanddeler av ekstracellulær matrise (15) til dermen (4) hvor nevnte blanding danner en gel som trekker seg sammen ved utskillelse av næringsmediet for å danne en dermekvivalent (24) ; 2) anvender dermekvivalenten (24) erholdt fra punkt 1 som substrat for en epidermekvivalent (26) erholdt ved tilsetning av nevnte substrat med keratinocyttceller fra animalsk eller humant vev, og ved å opprettholde betingel-sene som tillater vekst av keratinocyttcellene på overflaten av nevnte substrat hvor utviklingen av denne kultur av keratinocyttceller er favorisert ved anvendelse av minst et medium (MN1, MN2), (25 ; 29) i kontakt med nevnte keratinocyttceller, karakterisert ved at substratet (24) tilsettes minst en hårfollikkel (2) eller en skjede (22) av hårfollikkelen (2) fjernet fra animalsk eller human hud ved uttrykking hvor nevnte follikkel (2) eller skjede (22) omfatter minst delvis sin cellulære vegg (21) og implanteres i substratet (24) på en slik måte at dennes gjennomsnittlige langsgående akse i hovedsak er vinkelrett på den fri overflate av substratet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at implantatet (22) plasseres på substratet (24) i en avstand fra den frie overflate av substratet på mellom 0,1 og 2 mm.

3. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 eller 2 karakterisert ved at implantet (22) som anvendes, erholdes ved å dele opp en uttrykket hårfollikkel (2) i hovedsak vinkelrett på dennes midlere langsgående akse i den sone hvor den omfatter den cellulære utvidelse (21), for å opprettholde en lengde på mellom 0,5 og 5 mm.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at hårfollikkelen (2) som tilsettes er beskåret i nærheten av dennes base for å fjerne roten (17) .

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 4, karakterisert ved at implantatet (22) omsettes i substratet (24) ved begynnelsen av gelens sammentrekning.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 5, karakterisert ved at man etter tilsetning av substratet (24) opprettholder implantasjonen av substratet nedsunket i et næringsmedium MN1 (25) mellom 5 og 6 dager.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at mediet MN1 (25) erstattes av et medium MN2 (29) som plasseres i et nivå liggende i mellomrommet til dermekvivalenten (24) , etter 5 til 6 dager.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at for å sikre beliggen-heten av mediet MN2 ved ønsket nivå, plasseres dermekvivalenten (24) på en nettstøtte (28) hevet i forhold til bunnen av skålen og hvor medienivået MN2 justeres slik at nettverkstøtten såvidt er dekket, men hvor nivået av mediet MN2 ikke dekker den øvre overflate av huderstatningen (27) under opparbeidelsen.

9. Fremgangsmåte ifølge etthvert av kravene 7 eller 8, karakterisert ved at det anvendes som medium MN2 følgende blanding : 80 - 100 volum% av minimalt essensielt medium (MEM); 0-10 vekt % av antibiotika og/eller antifongecide midler; 0-20 volum % av animalsk eller humansk serum; 0 - 0,05 vekt % vekstfaktorer.

10. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 9, karakterisert ved at implantatet (22) fjernes fra substratet (24) ved avrivning mellom 8 og 13 dager etter implantasjon.

11. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 10, karakterisert ved at huderstatningen (27) holdes i kontakt med dyrkningsmediet (29) til en tid som anvendt tillater en total gjennvinning av substratet (24) av utviklede keratinocyttceller på nevnte substrat og en vesentlig differensiering av nevnte keratinocyttceller etter implantasjonen i dermekvivalenten (24).

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at man tilsetter til substratet (24) implantater (22) , regelmessig beliggende fra hverandre i en avstand på 0,5 - 2,5 cm.