KR20220102007A

KR20220102007A - 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20220102007A
Application number: KR1020210004177A
Authority: KR
Inventors: 김현정; 이권영; 배효경; 강민혁; 전경휘
Original assignee: 주식회사 클리셀
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2022-07-19
Also published as: KR102466098B1

Abstract

본 발명은 인공피부모델의 제조방법에 있어서, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 출력방식으로 교대로 출력하여 형성되는 층을 상하로 적층시킴으로써, 상기 당화 I형 콜라겐의 수축성에 의한 피부 진피능선을 재현하도록 하는, 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 구조적으로는 인간 피부의 진피능선, 기능적으로는 체내 피부 노화 메커니즘을 모방한 3차원 인공피부모델의 구현에 의해, 인간의 노화된 피부와 유사한 환경을 제공함으로써, 항노화 물질 등 피부에 작용하는 다양한 물질들의 실제 효능과 독성 등을 테스트할 수 있고, 예측하기에 유효한 모델이 가능하며, 동물실험대체 모델로서 사용될 수 있는 효과를 가진다.

Description

인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델 및 이의 제조방법{Artificial skin model that induced rete ridge and dermal saccharification of human skin and its manufacturing method}

본 발명은 당화 I형 콜라겐을 재료로 이용한 인공피부모델에 관한 것으로서, 좀더 자세하게는 기계적 성질이 다른 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 출력 방식으로 교대로 출력하여 인간의 피부진피능선(rete ridge)을 구현하는 인공피부모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 피부는 인체에서 가장 큰 기관으로, 주변 독성물질과 미생물로부터 인체를 보호하고, 수분의 증발을 방지한다(Kanitakis, J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin. European Journal of Dermatology 2002, 12, 390). 이러한 인간의 피부는 두 개의 조직층으로 구성되어 있는데, 그 하나는 각화되어 층을 이룬 표피이고, 또 하나는 지지와 영양을 제공하는 콜라겐이 풍부한 진피층이다(Freyman, T.M, Yannas, I.V., Gibson, L.J. Cellular matrerials as porous scaffolds for tissuengineering. Progress in Materials Science 2001. 46, 273).

진피는 기저막을 사이에 두고 표피와 접해있다. 이 기저막은 0.1 mm 정도의 매우 얇은 막으로 진피와 표피를 단단히 결합시키며, 표피세포의 정상적인 증식과 각화를 유지하는데, 중요한 역할을 하며, 물결 모양의 진피능선(rete ridge)의 형태를 이루고 있다. 이 특이적인 형태의 진피능선에 의해 표피와 진피의 경계 면적이 증가하는데, 표피층의 세포조직을 기저층 조직에 부착시키는 연접인 헤미데스모솜(Hemidesmosomes)의 수가 증가됨에 따라, 기저층으로의 부착력과 조직 내 기계적 힘의 분포가 강화된다. 또한 진피능선은 상피줄기세포의 적소(niche)이기도 한데, 상피줄기세포는 상피세포의 증식과 분화, 손상 후 복구 등을 포함하여, 상피 조직의 항상성 유지에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 일반적으로 진피능선의 깊은 부분에서 관찰된다(Britani, N.B., Megan, M. M., Molly, E.B., Kevin, L.M., Dorothy, M.S., Heather. M.P. Fractional CO2 laser micropatterning of cell seeded electrospun collagen scaffolds enables rete ridge formation in 3D engineered skin. Acta Biomater 2020. 15, 287).

한편, 인체의 노화는 여러 기전의 복합적인 작용에 의해 진행되는 현상이다. 원인으로는 유전 물질 변이의 축적, 독성대사산물의 축적, 유리기(free radical)의 생성, 화학적 변형, 당화에 의한 거대 분자의 가교 형성 등이 알려져 있다(Zouboulis, C.C., Makrantonaki E. Clinical aspects and molecular diagnostics of skin aging. Clin Dermatol 2011. 29, 3). 이 중 당화(glycation)는 노화의 중요한 메커니즘 중의 하나인데, 실제로 최종당화산물(Advanced glycosylation ends products; AGEs)은 나이가 들면서 피부에 증가하여, 진피 내 세포외기질에 축적됨에 따라, 세포노화 혹은 세포사멸을 유발시켜 조직 내 세포의 생존율을 낮춘다. 또한 유전자의 발현과 단백질의 합성 또한 변형되어 피부의 항상성을 손상시키고, 궁극적으로는 피부의 생체 역학적 특성 자체를 바꿔놓는다(Reihsner, R., Melling, M., Pfeiler, W., Menzel, E.J. Alterations of biochemical and two-dimensional biomechanical properties of human skin in diabetes mellitus as compared to effects of in vitro non-enzymatic glycation. Clin Biomech 2000. 15, 379).

최근 화장품의 동물실험 금지 조치에 따라 기존의 동물실험을 대체할 수 있는 여러 동물대체시험법이 개발되고 있으며, 특히 인간의 건강한 피부, 혹은 피부의 질환을 재현하는 인간인공피부(Human skin equivalent)는 학술 및 산업 연구에서 엄청난 관심을 얻어왔다. 지난 30년 동안 인공인간피부를 구성하는 다양한 방법이 개발되었으며, 시험관 내 및 생체 내 응용 분야에 상업적으로 이용되고 있는데, 이러한 인간인공피부는 소비자 제품의 안전성 및 효능 테스트에 광범위하게 사용되고 있으며, 상처 치유, 건선, 아토피 피부염, 노화, 광 생물학, 피부암 및 숙주-미생물 상호 작용을 포함한 건강 및 질병의 피부 형태 형성, 분화 및 장벽 특성 등에 대한 연구와 관련하여 이용되고 있다.

또한 인간인공피부는 인간 세포를 사용하기 때문에 더 나은 예측 가능성과 생리학적 관련성을 제공하며, 배양액, 진피의 세포외기질 및 세포 종류 등 다양한 미세 환경 조건을 달리하여 정상 피부 및 피부 질환을 재현할 수 있다(Gopu, S., Paul, L.B., Mei, B.Q. Full-thickness human skin equivalent models of atopic dermatitis. Methods Mol Biol. 2019. 1879, 367).

위와 같은 노력의 하나로, 인간 피부의 진피능선의 생리학적 기능을 확인하기 위하여 형태학적으로 재현하는 연구가 시도되고 있으며(Britani, N.B., Megan, M.M., Molly, E.B., Kevin, L.M., Dorothy, M.S., Heather, M.P. Fractional CO2 laser micropatterning of cell-seeded electrospun collagen scaffolds enables rete ridge formation in 3D engineered skin. Acta Biomater 2020. 15, 287), 인위적으로 형성시킨 진피능선이 세포의 발달학적 세포신호전달체계 및 조직의 분화와 세포의 생존율에 직접적인 영향이 있음을 확인하는 연구결과가 발표되고 있다(Prasad, A., Abhishak, C.G., Prashanth, J., Subhadeep, R., Chittur, C.L., Gurpreet, K., Balaji, B. Direct 3D bioprinted full-thickness skin constructs recapitulate regulatory signaling pathways and physiology of human skin. Bioprinting 2019. 15, e00051).

그러나 현재까지 인간 피부의 진피능선을 모방하면서도 표피와 진피 두 층 모두 잘 형성시킨 모델은 발표된 바 없다. 또한, 피부노화모델에 관련해서는 체내의 노화 메커니즘을 모방하고자 인위적으로 오탄당과 반응시킨 I형 콜라겐을 진피층 구조체 재료로 사용한 인공피부를 최종당화산물에 의한 피부노화모델로 제시한 연구 보고들이 있으나(Paula, C.P. et al. Glycated reconstructed human skin as a platform to study pathogenesis of skin aging. Tissue Eng Part A. 2015. 21, 2417. Hiren, D., Khushi, M., Prakriti, T. Glycated collagen-a 3D matrix system to study pathological cell behavior. Biomater Sci. 2019. 8, 3480. Herve´, P., Marie, P.T., Daniel, A. Reconstructed skin modified by glycation of the dermal equivalent as a model for skin aging and its potential use to evaluate anti-glycation molecules. Exp Gerontol 2008. 6, 584), 이는 인공피부 제작 단계에서 당화 I형 콜라겐에 항노화 물질을 혼합하여 진피층을 구성한 것으로, 진정한 피부 노화 모델이라 하기에는 한계를 지니고 있다.

최근 3차원 바이오 프린팅 기술의 발달로, 이를 이용한 인공피부 및 플랫폼 개발을 위한 연구가 활발하다. 3차원 바이오 프린팅은 컴퓨터의 지원 설계를 사용하여 원하는 패턴으로 살아있는 세포 및 생체 물질을 증착시킬 수 있으며, 높은 반복성과 유연성을 갖춘 레이어 별 인쇄방법으로 3D 구조의 구축을 용이하게 한다(Wei, C.Y. et al. 3D bioprinting of skin tissue: From pre-processing to final product evaluation. Adv Drug Deliv Rev 2018. Jul;132, 270). 이는 구조 내에서 세포와 특정 세포외기질을 배열하는데 한계가 있는 기존의 인공 피부 제작 접근 방식(e.g. 피펫팅)의 문제를 극복해줄 것으로 기대를 모으고 있다.

그러나 진피층 구조체 재료로 가장 많이 사용되고 있는 콜라겐은 실온에서 가공성(processability)이 낮고, 가교를 정밀하게 조절하기 힘든 특성 때문에 3D 바이오 프린팅(bioprinting) 기술을 이용한 공정이 기존의 제작 방식과 비교하여 큰 차이가 없다는 한계를 가진다(Priya, G. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin Tissue Engineering for Tissue Repair and Regeneration. Tissue Engineering 2008, 14, 205).

한국공개특허 제10-2017-0014678호의 "저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법", 2017.02.08 공개

상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 응축하는 당화 I형 콜라겐의 특성을 이용하여 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 프린팅 방식으로, 일반 I형 콜라겐과의 교대로 출력 후, 진피층의 부분적인 수축을 유도하여, 인간 피부의 진피능선의 구현 및 당화를 유발시킨 인공피부모델을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적들은 이하의 실시례에 대한 설명을 통해 쉽게 이해될 수 있을 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일측면에 따르면, 인공피부모델의 제조방법에 있어서, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 출력방식으로 교대로 출력하여 형성되는 층을 상하로 적층시킴으로써, 상기 당화 I형 콜라겐의 수축성에 의한 피부 진피능선을 재현하도록 하는, 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법이 제공된다.

상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층에 네블라이저(Nebulizer)를 사용하여 가교제를 미스트 형태로 분무할 수 있다.

상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력 이전에 I형 콜라겐으로만 적층되는 층을 형성함으로써, 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층의 하측에 상기 I형 콜라겐으로만 적층되는 층이 형성되도록 할 수 있다.

상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층에 섬유아 세포가 포함되도록 하고, 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층의 상단에 각질형성세포가 적층되도록 할 수 있다.

상기 3차원 바이오 프린터의 디스펜서 내에 바이오 잉크로서, 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 각각 주입하고, 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 분사하기 위하여 분사노즐에 공급되는 공압의 세기와 상기 분사노즐을 개폐시키는 밸브의 개방 시간의 조절에 의해 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐의 분사량을 조절하되, 상기 공압의 세기가 2~15 psi이고, 상기 개방 시간이 300~3,000 μsec이며, 교대로 출력되는 상기 당화 I형 콜라겐의 드롭렛(Droplet)과 상기 I형 콜라겐의 드롭렛(Droplet)의 출력 비율이 1 : 0.5~5일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 일측면에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법에 의하여 제조되는 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델이 제공된다.

본 발명에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델 및 이의 제조방법에 의하면, 구조적으로는 인간 피부의 진피능선, 기능적으로는 체내 피부 노화 메커니즘을 모방한 3차원 인공피부모델의 구현에 의해, 인간의 노화된 피부와 유사한 환경을 제공함으로써, 항노화 물질 등 피부에 작용하는 다양한 물질들의 실제 효능과 독성 등을 테스트할 수 있고, 예측하기에 유효한 모델이 가능하며, 동물실험대체 모델로서 사용될 수 있는 효과를 가진다.

도 1은 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조공정과정을 설명하기 위한 도식이다.
도 2는 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법에서 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 프린팅에 의한 교대로 출력을 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법에서 당화 I형 콜라겐 형성을 보여주는 도식이다.
도 4는 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 전체 구조를 나타낸 측면도이다.
도 5는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 광학 이미지로서, (a)는 일반 I형 콜라겐을 사용한 인공피부조직이고, (b)는 본 발명에 따른 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 사용한 인공피부조직이다.
도 6은 일반 I형 콜라겐을 사용한 인공피부조직(a,c) 및 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 사용한 인공피부조직(b,d) 내의 케라틴-10(Keratin-10) 및 로리크린(Loricrin)의 발현을 나타낸다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고, 여러 가지 실시례를 가질 수 있는 바, 특정 실시례들을 도면에 예시하고, 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니고, 본 발명의 기술 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 식으로 이해되어야 하고, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시례에 한정되는 것은 아니다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시례를 상세히 설명하며, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응하는 구성요소에 대해서는 동일한 참조 번호를 부여하고, 이에 대해 중복되는 설명을 생략하기로 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조공정을 보여주는 도식이고, 도 2는 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법에서 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 프린팅에 의한 교대로 출력을 설명하기 위한 도면이다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법은 인공피부모델의 제조방법에 있어서, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 출력방식으로 교대로 출력하여 형성되는 층을 상하로 적층시킴으로써(b 참조), 당화 I형 콜라겐의 수축성에 의한 피부 진피능선을 재현하도록 한다(d 참조). 여기서 I형 콜라겐은 일반 I형 콜라겐을 의미할 수 있다. 여기서, 교대는 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐이 전후방향(X축), 좌우방향(Y축), 그리고, 상하방향(Z축) 중에서 일부 또는 전부가 서로 번갈아가면서 배열됨을 의미할 수 있는데, 도 2에서는 일례로서, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐이 전후방향(X축)과 좌우방향(Y축)으로 교대로 배열됨을 나타낸다.

교대로 출력되기 위해 사용되는 당화 I형 콜라겐은 도 3에서와 같은 I형 콜라겐에 대한 당화 과정을 거칠 수 있는데, 그 제조를 위하여, 예컨대, I형 콜라겐(FS22005, Collagen solution, UK)을 이용할 수 있고, 제품 농도(3~10 mg/ml)를 사용할 수 있다. 또한 콜라겐의 당화 과정에서는 D-ribose(R-9629, Sigma, USA)을 이용하였으며, D-ribose 용액은 0.1 M 아세트산(A2207, 삼전순약공업(주), 한국)을 용매로 사용하여 고정 농도 500 mM으로 제조할 수 있다. 당화 I형 콜라겐 합성 과정은 일반 I형 콜라겐(3~10 mg/ml) 10 mL을 유리 플라스크에 주입하고, 교반 막대(stir bar)와 함께 자기 교반기 위에서 교반하면서, D-ribose 용액(500 mM) 10 mL(콜라겐:D-ribose = 1:1)을 한방울씩 떨어뜨려 균등하게 섞일 수 있도록 한다. 이후 4~10 ℃의 냉장 온도 범위 내에서 5일간 자기 교반기 위에서 반응시킨다. 반응이 완료된 당화 I형 콜라겐 용액은 합성되지 않은 저분자 D-ribose를 제거하기 위해 12-14 kD 기공의 투과막(132680T, SPECTRUM, Greece)을 사용하여, 0.1 M 아세트산 용액을 용매로 2일간 자기 교반기 위에서 교반시킨다. 합성되지 않은 저분자 D-ribose가 제거된 당화 I형 콜라겐은 샘플 용기에 분주하여 4 ℃에서 보관하였다.

당화 I형 콜라겐 제조에 사용되는 농도와 방법은 D-ribose를 이용하는 여러 가지 방법에서 선택된 것을 예로 들 수 있으나, 콜라겐을 당화 성질로 합성할 수 있는 것이면, 반드시 이에 한정되지 않는다. 또한, 교대로 출력되기 위해 사용되는 I형 콜라겐은 앞서 당화 I형 콜라겐 제조에 사용된 I형 콜라겐(FS22005, Collagen solution, UK)을 이용할 수 있는데, 이 역시 이에 반드시 한하는 것은 아니다.

인공피부조직을 제작하기 위해, 일례로, 3차원 바이오 프린터(U-FAB, (주)클리셀(CLECELL), 한국)에 내재되어 있는 U-Studio(소프트웨어, (주)클리셀(CLECELL))을 이용하여 출력 방법을 설정할 수 있다.

콜라겐의 적층을 위한 방법으로서, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층에 네블라이저(Nebulizer)를 사용하여 가교제를 미스트 형태로 분무할 수 있다. 네블라이저를 채용하여 가교제를 기판 상에 미스트 형태로 분무하면서 층상 가교 또는 혼합 가교 방식을 사용할 수 있다. 여기서, 가교제는 일례로 NaHCO₃(Sodium bicarbonate)일 수 있으며, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐의 교대로 출력 전에 또는 후에 미스트로 분무됨으로써, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층과 층간의 젤화로 인한 가교 역할을 할 수 있고, 나아가서, 층을 이루는 드롭렛(Droplet) 간의 가교 역할을 할 수도 있다.

도 1, 도 4 및 도 5에서와 같이, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐의 교대로 출력(b 참조) 이전에 I형 콜라겐으로만 적층되는 층을 형성함으로써, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층의 하측에 I형 콜라겐으로만 적층되는 층이 형성되도록 할 수 있다(a 참조). 예컨대, 인공 진피층 출력에서는 총 30층을 적층하였으며, 이 중 하층부(1~20층)에는 I형 콜라겐만 적층하였고, 상층부(21~30층)에 당화 I형 콜라겐을 I형 콜라겐과 교대로 출력 및 경화함으로써 인공 진피의 상층부에 진피능선을 유도하였다.

이때 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐이 교대로 출력될 수 있도록, 3차원 바이오 프린터의 디스펜서 내에 바이오 잉크로서, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 각각 주입하고, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 분사하기 위하여 분사노즐에 공급되는 공압의 세기와 분사노즐을 개폐시키는 밸브의 개방 시간의 조절에 의해 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐의 분사량을 조절하되, 공압의 세기가 2~15 psi일 수 있고, 개방 시간이 300~3,000 μsec일 수 있으며, 교대로 출력되는 당화 I형 콜라겐의 드롭렛(Droplet)과 I형 콜라겐의 드롭렛(Droplet)의 출력 비율이 1 : 0.5~5일 수 있다. 즉, 각 디스펜서 내에 바이오 잉크를 주입한 후 공압의 세기, 밸브의 개폐 시간으로 분사되는 각 콜라겐의 양을 조절할 수 있고, 분사되는 바이오 잉크의 간격을 조절함으로써 당화 I형 콜라겐의 드롭렛(Droplet)과 I형 콜라겐의 드롭렛(Droplet)의 출력 비율은 예컨대 1:0.5~5, 일례로 1 : 1.6이 되도록 할 수 있다. 이러한 출력 비율의 범위는 이론상 출력지점과 resolution의 조절로 두 물질을 균일한 간격으로 출력할 수 있는 범위이다. 이 때 앞서 설명한 바와 같이, 공압의 세기 범위는 2~15 psi, 밸브의 개폐시간 범위는 300~3,000 μsec일 수 있다. 바이오 잉크의 분사 방법은 한국등록특허 제0818494호의 "세포용액의 분사장치, 이를 이용한 3차원 인공 생체조직성형장치 및 그 성형방법"에 개시된 바와 같이, 디스펜서 내의 공압과 개폐밸브의 개폐를 이용한 방식을 사용할 수 있다. 이는 두 물질을 교대로 출력하는 비율에 대한 여러 조건 실험 결과를 통해서, 가장 효과적인 진피능선 유도 조건으로 설정하였다.

도 2에서는 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법에서 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐의 교대로 출력하는 방법의 예시를 나타내는데, 이에 따르면, 각 바이오 잉크가 주입된 디스펜서가 출력이 시작되는 X, Y축 원점을 (0,0) μm으로 정한다. 그리고 I형 콜라겐은 (X, Y = 0,0) μm으로 설정하고, resolution은 설정한 파라미터의 드롭렛(Droplet) 크기에 맞추어 적절한 값으로 설정하여 기준을 잡는다. 당화 I형 콜라겐의 경우, I형 콜라겐의 출력 위치를 기준으로 하여 1:1 비율로 교대로 출력되도록 (X, Y = α, α) μm, resolution은 2α μm로 설정할 수 있다. 이는 틈새없이 한 면이 모두 바이오 잉크로 적층되는 조건이다.

도 1 (a) 내지 (c) 및 도 4를 참조하면, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층에 섬유아 세포가 포함되도록 하고, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층의 상단에 각질형성세포가 적층되도록 할 수 있다. 여기서 섬유아 세포는 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층에 포함되거나, 이들의 층 사이에 개재되도록 할 수 있고, I형 콜라겐으로만 형성되는 층에 포함되거나, I형 콜라겐으로만 형성되는 층 간에 포함될 수 있다. 이처럼 인공피부에 포함되는 세포는 예컨대, 일반 신생아의 포피세포에서 통상적인 포피 절제로 분리 후 배양하여 동결시킨 각질형성세포(Keratinocytes, PCS-200-010, ATCC)와 섬유아세포(Fibroblasts, PCS-201-010, ATCC)를 사용할 수 있고, 각질형성세포와 섬유아세포는 3D 바이오 프린터를 사용하여 주입되도록 할 수도 있다.

인공피부 배양용기는, 예컨대, 지름 12 mm, 바닥 면의 기공 크기 0.4 mm의 인서트(Nunc, USA)를 사용할 수 있는데, 당형 I형 콜라겐, I형 콜라겐, 섬유아세포를 출력하여 만든 진피층 위에 각질형성세포를 출력하여 3차원 배양을 시행하였다(도 1의 d 참조). 각질형성세포는 공기층과 물층의 중간에서 배양함으로써 중층편평상피로 분화하며, 각질화되어 실제 피부층을 형성할 수 있도록 하였다.

본 발명의 다른 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델은 앞서 설명한 본 발명의 일 실시례에 따른 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법에 의하여 제조된 것으로서, 중복되는 설명을 생략하기로 하며, 이하, 본 발명들을 하기의 실시례들 통하여 설명한다. 이하의 실시례들은 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시례들의 범위로 제한되는 것은 아니다. 또한 아래에 기술된 비교례는 실시례와 대비하기 위한 것으로 기재된 것일 뿐이며, 종래의 기술로서 기재한 것이 아니다.

[ 실시례 1]

본 발명의 실시례로서, I형 콜라겐은 진피의 하단층(1~20층)과 상단층(21~30층)의 출력 파라미터 값을 각각 상이하게 적용시켰다. 예컨대 하단층 I형 콜라겐 분사 파라미터 공압 7psi, 밸브 개폐시간 1400 μsec, 드롭렛(Droplet)당 부피 124.1±5.4 nL, 드롭렛(Droplet) 사이 간격 1,000 ㎛, 상단층 I형 콜라겐 분사 파라미터 공압 6psi, 밸브 개폐시간 600 μsec, 드롭렛(Droplet)당 부피 25.5±3.2 nL, Drop 사이 간격 1,000 ㎛이다. 이는 실제 인간 피부의 진피층 깊이에 따른 세포외 기질밀도차의 특성을 반영하기 위함이다. 출력 시작점은 X, Y (0,0) mm을 기준으로 출력하였다. 당화 I형 콜라겐 은 진피의 상단층(21~30층) 위치부터 적층하였으며, 출력 시작점은 X, Y (0.5, 0.5) mm을 기준으로 출력하였다. 당화 I형 콜라겐의 분사 파라미터는 공압 4 psi, 밸브 개폐시간 500 μsec, 드롭렛(Droplet)당 부피 25.5±3.2 nL, 드롭렛(Droplet) 사이 간격 1,000 ㎛이다. 이때, 출력 파라미터 값은 밸브의 종류 및 특성에 따라 다르게 적용할 수 있으므로 특정 값에 한정되지 아니한다. 출력 파라미터 값에 따른 드롭렛(Droplet)당 부피도 다르므로 교대로 출력을 위한 당화 I형 콜라겐의 출력 시작점 역시 특정 값에 한정되지 아니한다. 출력을 진행하는 동안 콜라겐의 변성을 방지하기 위하여 디스펜서의 온도는 15 ℃ 유지하였다. 이 때 사용되는 섬유아세포는 0.2 × 10² 내지 0.4 × 10⁶ (cells/ a culture insert) 범위로 섬유아세포 배양액(Fibroblast Basal Medium, PCS-201-030, ATCC)과 함께 디스펜서에 준비하여, 진피의 상.하단층(3, 8, 13, 15, 21, 27층)에 균일하게 출력하였다. 콜라겐의 중화반응 3차원 바이오 프린터 내에 장착된 네블라이저(Aerogen solo, Ireland)를 이용하여, 가교제, 예컨대 1N의 NaHCO₃ 용액을 콜라겐을 출력하는 각 층마다 분사하여 젤화시켰다. 출력 완료 후 배양액을 2일에 1회씩 교체해 주는 조건으로 7일간 배양하여 인공피부의 진피층을 제작하였다.

[ 비교례 1]

본 발명의 비교례로는 당화 I형 콜라겐을 제외한 일반 I형 콜라겐과 섬유아세포만을 사용하여, 실시례 1에서의 하단층 설정 값으로 전층(1~30층)을 출력하여 인공피부의 진피층을 제작하였다.

[ 시험례 1]

상기 제조한 실시례 1, 비교례 1에서 형성된 인공 진피층을 사용하여 인공피부를 하기의 방법에 따라 각각 배양하였다.

각질형성세포는 배양된 인공 진피층 위에 0.2 × 10⁶ 내지 0.6 × 10⁶ (cells/ a culture insert)의 범위로 균일한 간격으로 출력해준다. 이에 분사 파라미터는 공압 1.8 psi, 밸브 개폐시간 2,400 μsec, 드롭렛(Droplet) 사이 간격 280 μm으로 진행하였다. 출력 이후 각질형성세포 기본 배양액(Dermal cell basal medium, PCS-200-030, ATCC)를 넣어주고, 하루 배양 후 각질형성세포 분화 배양액(CnT-Prime 3D Barrier, CnT-PR-3D, CELLnTEC)으로 교체하여 각질형성세포의 분화를 유도하였다. 이후 인서트 내부의 배지를 모두 제거하고, 각질형성세포를 공기 중에 노출시키고, 각질형성세포 분화 배양액은 2일에 1회씩 교체해주며, 14일간 공기노출 배양하여 표피층을 형성시켜 인공피부를 완성하였다.

최종 배양된 각 인공피부 조직은 Cryosection을 통해 단면을 7mm 두께로 절편화하여 슬라이드에 붙인 다음, 헤마톡실린(Hematoxylin G3, Biognost) & 에오신(Eosin Y, Biognost)에서 조직의 세포형태를 확인하기 위한 염색을 수행하고, Keratin 10(Biolegend)과 Loricrin(Biolegend) 항체를 이용한 면역조직화학염색을 수행하여, 표피층의 각질형성세포의 분화 상태를 광학현미경을 비교 관찰 및 촬영하여, 도 5 및 도 6에 나타내었다. 이에 따르면, 본 발명의 실시례 1에 따라 인공피부를 제작하는 경우 3D 바이오 프린터를 사용하여 드롭렛(Droplet) 및 층(layer) 마다 각각 콜라겐을 경화시킬 수 있어, 당화 I형 콜라겐 외에도 수축성을 띄는 바이오 잉크를 교대로 출력함으로써 출력된 위치에서만 수축이 유도되어 진피능선 형태를 띄는 진피층을 구현해 낼 수 있으며, 이는 비교례 1로는 구현할 수 없는 특유의 효과이다.

이와 같이, 기계적 성질이 다른 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 출력 방식으로 교대로 출력하여, 인간의 피부 진피능선(rete ridge)구현 및 당화를 유발시킨 인공피부모델을 제조하였다.

도 5의 b에서와 같이, 실시례 1은 응축력이 강한 당화 I형 콜라겐의 수축성에 의해 피부 진피 접합부에 인간 피부 구조와 유사한 진피능선이 모방됨을 확인할 수 있다. 반면 도 5의 a에서와 같이, 비교례 1은 피부 진피 접합부에 인간 피부 구조와 유사한 진피 능성을 제대로 모방하지 못함을 확인할 수 있다.

또한 도 6의 b와 d에서와 같이, 실시례 1에 해당하는 당화 I형 콜라겐을 사용하는 경우 Keratin 10과 Loricrin의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 반면 도 6의 a와 c에서와 같이, 비교례 1에 해당하는 일반 I형 콜라겐을 사용하는 경우 Keratin 10과 Loricrin 발현의 감소가 없음을 확인할 수 있었다. 이처럼 실시례 1의 경우, 진피능선의 구현 및 노화된 진피층을 모방하기 위해 사용된 당화 I형 콜라겐에 의한 영향으로, 표피층의 각질형성세포의 재생 능력 감소와 피부 장벽의 약화라는 인체의 노화된 피부의 특징을 그대로 보여주고 있는 것이라고 할 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따르면, 당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐의 교대로 출력을 이용하여 진피능선을 구현한 인공피부모델은 진피능선 형태에 의한 기능적인 부분과 함께 노화와 관련한 피부의 분화 및 장벽 특성을 포함하여 기존 인공피부모델보다 더 나은 예측 가능성과 생리학적 관련성을 제공함으로써, 항노화 물질의 실제 효능과 독성을 예측하기에 매우 유효한 모델이라고 할 수 있다.

이와 같이 본 발명에 대해서 첨부된 도면을 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시례에 한정되어서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이러한 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims

인공피부모델의 제조방법에 있어서,
당화 I형 콜라겐과 I형 콜라겐을 3차원 바이오 프린터의 드롭렛(Droplet) 출력방식으로 교대로 출력하여 형성되는 층을 상하로 적층시킴으로써, 상기 당화 I형 콜라겐의 수축성에 의한 피부 진피능선을 재현하도록 하는, 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층에 네블라이저(Nebulizer)를 사용하여 가교제를 미스트 형태로 분무하는, 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하기 이전에 I형 콜라겐으로만 적층되는 층을 형성함으로써, 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층의 하측에 상기 I형 콜라겐으로만 적층되는 층이 형성되도록 하는, 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층에 섬유아 세포가 포함되도록 하고, 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 교대로 출력하여 형성되는 층의 상단에 각질형성세포가 적층되도록 하는, 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 3차원 바이오 프린터의 디스펜서 내에 바이오 잉크로서, 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 각각 주입하고, 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐을 분사하기 위하여 분사노즐에 공급되는 공압의 세기와 상기 분사노즐을 개폐시키는 밸브의 개방 시간의 조절에 의해 상기 당화 I형 콜라겐과 상기 I형 콜라겐의 분사량을 조절하되, 상기 공압의 세기가 2~15 psi이고, 상기 개방 시간이 300~3,000 μsec이며, 교대로 출력되는 상기 당화 I형 콜라겐의 드롭렛(Droplet)과 상기 I형 콜라겐의 드롭렛(Droplet)의 출력 비율이 1 : 0.5~5인, 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델의 제조방법에 의하여, 제조되는 인간피부의 진피능선 구현과 진피층 당화를 유발시킨 인공피부모델.