KR102140492B1 - 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 - Google Patents

퐁암(Pongam) 나무 추출물을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 퐁암(Pongam) 나무에서 유래한 유효성분을 이용한 줄기세포 분화 촉진용 조성물, 및 상기 조성물을 이용하여 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물은 골분화를 유도하는 효과가 있으므로, 세포 치료를 목적으로 줄기세포를 골분화시킬 때에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

퐁암(Pongam) 나무 추출물을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물{Composition for Promoting the Differentiation of Stem Cells Comprising the Extract of Pongam tree}
본 발명은 줄기세포의 분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 분화 촉진 방법에 관한 것이다.
최근 조직공학을 이용한 재생의학 분야에서 줄기세포의 이용 기술이 난치병 치료를 위한 새로운 분야로 제시되고 있다. 이에 줄기세포의 연구에 대한 관심이 높아지고, 증식과 분화를 통하여 조직을 형성할 수 있는 줄기세포를 이용하면 다양한 종류의 질병 치료뿐만 아니라, 조직 훼손 등으로 인한 문제도 해결할 수 있는 것으로 인식되고 있다.
줄기세포(stem cell)는 미분화 상태에서 자가 복제 능력을 가지면서 적당한 조건하에서 특정 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다. 줄기세포는 그 기원에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분이 될 수 있다. 인간의 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 얻어지기 때문에 세포 증식 및 분화 능력이 우수하나 생명윤리적인 문제점을 가지고 있다. 그에 반해, 성체 줄기세포는 배아 줄기세포에 비해 분화 능력이 한정되어 있으나, 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 채취하여 줄기세포로 발전시킨 것으로 윤리적인 문제가 적다. 성체 줄기세포로는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경모세포, 상피모세포 등이 존재하며, 조혈모세포의 경우 혈구 및 임파구를 생산할 수 있는 모세포로서 혈액 암을 포함한 면역계 질환 치료에 도움이 되고, 중간엽 줄기세포의 경우 뼈, 연골, 지방 및 섬유조직으로 분화되며 각 조직이 손상되었을 때 이들의 회복에 관여한다. 그러나 이러한 성체 줄기세포는 각각의 조직에 소량 존재하며 수년간 분열 혹은 증식을 하지 않고 존재하기도 한다.
즉, 줄기세포라 함은 이러한 분화능력은 가지고 있으나, 아직 분화는 일어나지 않은 '미분화' 세포를 의미하는 것이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 줄기세포는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있어, 이를 이용한 질병의 치료 등의 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 배아 줄기세포의 윤리적인 문제가 대두되면서, 상대적으로 윤리적인 문제가 적은 성체 줄기세포를 이용하려는 연구가 주목받고 있다.
따라서, 골수, 골막, 지방 조직 및 근육을 포함하는 다양한 조직으로부터 인간 줄기세포를 분리하여 사용하고 있는 실정이다. 종래의 연구에 따르면 치은 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포는 임상적으로 뼈 재건과 같은 골 재생에 있어 줄기세포 기반 치료에 새로운 공급원이 될 수 있다. 또한, 인간 치은 조직 유래 중간엽 줄기세포는 재생 의학에서 세포 치료를 위한 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 우수함이 밝혀졌다(Tomar GB, Srivastava RK, Gupta N, Barhanpurkar AP, Pote ST, Jhaveri HM, et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells are superior to bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cell therapy in regenerative medicine. Biochem Biophys Res Commun 2010;393:377-383.). 줄기세포의 다른 공급원과 마찬가지로 치은 조직 유래 중간엽 줄기세포에서 면역 조절 성질이 발견되었다. 치은 조직으로부터 유래된 줄기세포는 격리의 용이성, 접근 가능한 조직 공급원 및 빠른 생체 외 팽창을 포함한 몇 가지 장점을 가지고 있다.
한편, 전통적인 아시아 의학에서 오랫동안 사용되어온 특정 허브 추출물은 새로운 치료제의 원천으로 사용될 수 있는 것으로 나타났다(Jeong SH, Lee JE, Jin SH, Ko Y and Park JB: Effects of Asiasari radix on the morphology and viability of mesenchymal stem cells derived from the gingiva. Mol Med Rep 10: 3315-3319, 2014.). 이러한 추출물은 유효성을 검증하기 위해 사전 검증된 것으로 간주될 수 있으며 화학 합성 약물보다 안전 문제가 적을 것으로 예상된다. 그러므로, 본원의 연구자들은 화학 합성 약물보다 안전하고 효과적인 줄기세포의 생존력 및 분화력의 증가를 위해 본 발명을 고안하였다.
중국 공개특허 CN103330733A
본 발명의 목적은 퐁암(Pongam) 나무에서 유래한 유효성분을 이용한 줄기세포 분화 촉진용 조성물, 및 상기 조성물을 이용하여 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 및 줄기세포 배양용 배지를 제공한다.
또한 본 발명은 분리된 줄기세포에 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물은 천연물 유래의 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 유효 성분으로 하기 때문에, 화학물질로 인한 세포 독성이나 부작용은 감소시키며, 줄기세포의 특정 세포로의 분화를 효과적으로 증진시킬 수 있기 때문에, 다양한 줄기세포의 특정 세포로의 분화용 조성물로 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 치은 유래의 성체 줄기세포에 처리한 후 배양 후 1일자에 세포의 형태 변화를 관찰한 사진(최초 배율: 200배, 스케일 바: 200㎛)이다;
A: 대조군, B: 0.001중량%, C: 0.01중량%, D: 0.1중량%, E: 1중량%.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후 배양 1일자의 세포 생존도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후 배양 3일자 및 7일자의 ALP 활성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후 배양 3일자의 무기질화 정도를 관찰한 사진(최초 배율: 100배, 스케일 바: 400㎛)이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후 배양 7일자의 무기질화 정도를 관찰한 사진(최초 배율: 100배, 스케일 바: 400㎛)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후 배양 3일자 및 7일자의 무기질화 정도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 "줄기세포(stem cell)"란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 분화능력에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell) 및 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.
본 발명에 따른 "치은(Gingiva)"은 줄기세포의 보다 유리한 공급원이 될 수 있다. 줄기세포는 뼈, 지방 조직 및 연골을 비롯한 다양한 세포 유형으로 분화 할 수 있는 능력을 가진 자가 재생 능력과 다원능을 가지고 있다. 줄기세포는 구강 내 영역을 포함한 다양한 출처에서 얻을 수 있다(Ballini A, De Frenza G, Cantore S, et al: In vitro stem cell cultures from human dental pulp and periodontal ligament: new prospects in dentistry. Int J Immunopathol Pharmacol 20: 9-16, 2007). 치수(Dental pulp) 및 치주인대(periodontal ligament)는 바람직한 공급원으로 간주되고 있다. 그러나 조직의 양이 제한되어 있기 때문에 추가적인 치아 추출 절차가 필요한 실정이다. 따라서, 본원의 연구자들은 치은 유래 줄기세포가 골 형성 형성 능력, 플라스틱 부착력 및 골 형성, 지방 형성 및 연골 형성을 할 수 있는 다중 선로 분화능을 보유하고 있으며 CD44, CD73, CD90 및 CD105를 포함한 줄기 세포 마커를 발현하는 것을 발견하였다. 또한, 치은에서 줄기세포를 수확하는 것은 침윤성, 통증 및 감각 상실로 인해 상악골과 하악골의 골수보다 쉽다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에서 "추출물"은 원료로부터 임의의 방법으로 추출 또는 분리해 낸 물질을 말하며, 원료로부터 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한없이 모두 포함하는 의미이다. 여러 가지 방법이 허브 추출에 적용될 수 있다. 예를 들어, 냉간 압출, 압착 추출(expeller pressing), 및 용제 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 용제 추출에는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 헥세인, 염화 메틸렌, 에틸 아세테이트 및 멸균수과 같은 다양한 용제가 사용될 수 있다(Wang MH, Jeong SH, Guo H and Park JB: Anti-inflammatory and cytotoxic effects of methanol, ethanol, and water extracts of Angelicae Dahuricae Radix. J Oral Sci 58: 125-131, 2016). Pongamia pinnata 추출을 위한 새로운 마이크로웨이브 보조 추출 방법도 개발되었다(Soumya V, Muzib YI and Venkatesh P: A novel method of extraction of bamboo seed oil (Bambusa bambos Druce) and its promising effect on metabolic symptoms of experimentally induced polycystic ovarian disease. Indian J Pharmacol 48: 162-167, 2016). 서로 다른 유형의 용제 간에는 서로 다른 용해도와 끓는점이 나타난다. 용매의 유형 및 농도에 따라 다른 효과가 달성될 수 있음을 주목해야 한다.
본 발명에서 용어 "분화"란 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전능성 줄기세포가 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포로 변하는 과정도 분화이며, 상세하게는 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정도 분화에 해당된다. 본 발명은 인간 치은 조직으로부터 유래된 줄기세포를 사용하여, 분화를 촉진시키는 신규한 유효 성분을 포함하는 조성물을 고안하고, 또한 효과가 탁월한 농도를 발견하였다.
또한, 본 발명에서 "배지"는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미하며, 일반적으로 알려져 있는 RPMI-1640, DMEM, MEM 등의 배지, 또는 이의 일부 성분을 포함할 수 있으며, 또한, 글루타민, 우태아혈청 등을 포함할 수 있으나, 세포가 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 성분을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "계대 배양"이란, 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 사멸하게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage)라고 한다.
본 발명의 일 측면은 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
상기 "퐁암(Pongam) 나무"는 본 발명에서는 줄기세포 생존력 증가, 및 분화 촉진용 조성물의 유효성분의 원료로서 인도에서 발생한 것이다. 퐁암(Pongam) 나무는 인도 너도밤나무 나무 또는 퐁암(Pongam) 오일 트리라고도 한다. 일반적으로, 퐁암(Pongam) 나무는 류머티즘 치료에 많이 사용되고 있으며, 갈색 오일 씨앗에서 추출하여 사용되고 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 퐁암(Pongam) 나무는 Pongamia pinnata일 수 있다.
상기 Pongamia pinnata는 본 발명에서 줄기세포 생존력 증가 및 분화 촉진용 조성물의 유효성분의 원료로서 인디아 대륙, 중국, 일본, 말레시아, 호주 및 태평양섬의 일부를 포함하여 열대 및 온화한 아시아가 원산지인 콩(Fabaceae)과에 속하는 나무이다. 또한, 이는 최근에 밀레티아(Millettia)속으로 옮겨졌으며, Millettia pinnata와 동의어로 사용되기도 한다. M. pinnata는 주로 천연 살충제로 사용되고 있다.
본 발명에서는 줄기세포 분화 촉진용 조성물의 유효성분의 원료로서 상기 Pongamia pinnata를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 상기 Pongamia pinnata와 유전적 유연관계가 높은 다른 종의 식물들 역시 본 발명의 줄기세포 분화 촉진용 조성물의 유효성분의 원료로 이용할 수 있다.
본 발명의 줄기세포 분화 촉진용 조성물은 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 추출물의 생성을 위하여 본 발명에서 사용되는 퐁암(Pongam) 나무는 그의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎 등 식물의 전 범위에 걸쳐서 제한이 없으며 아울러, 본 명세서에서 상기 퐁암(Pongam) 나무는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 추출물은 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 모든 추출 방법을 통해 수득될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용하여 수득될 수 있다.
상기 추출에는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물이 추출용매로 이용될 수 있고, 바람직하게는 알코올, 더욱 바람직하게는 메탄올이 이용될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 유기용매는 C1-C4의 저급 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정하지 아니하고, 상기 C1-C4의 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
상기 추출은 상기 추출용매를 상기 퐁암(Pongam) 나무 총 중량에 대해 1배 내지 30배 첨가하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 3배 내지 20배, 더욱 바람직하게는 5배 내지 10배 첨가하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 추출용매의 첨가량이 상기 범위를 벗어나는 경우, 추출 자체가 제대로 이루어지지 않거나 또는 추출되더라도 활성성분이 충분히 확보되지 못하는 문제점이 있다.
상기 추출은 실온 또는 가온 조건 하에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 약 20 내지 200℃, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 150℃의 온도에서 추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추출시간은 바람직하게는 약 1 내지 15시간, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 10시간 동안 수행할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 추출 용매 및 추출 온도 등의 조건에 따라 달라질 수 있다. 상기 추출은 활성성분을 보다 다량 수득하기 위해 1 회 이상 여러 번 추출할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 5회, 더욱 바람직하게는 3회 연속추출하여 합한 추출액을 이용할 수 있다.
상기와 같은 추출 과정 이후에, 상기 추출물은 농축 또는 동결건조 등의 단계를 추가적으로 거칠 수 있다. 구체적으로, 상기 농축은 감압농축될 수 있고, 진공회전농축기를 이용하여 농축되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 농축은 20~100℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 50~70℃에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 건조는 동결건조될 수 있고, 진공동결건조기를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 동결건조는 -50~-100℃의 온도 범위에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 -60~-80℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 추출용매는 메탄올을 사용하였다. 추출 방법으로는, 냉간 압출, 압착 추출, 용제 추출 등 다양한 방법으로 추출할 수 있다. 추출시 용제는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 멸균수와 같은 다양한 종류의 용매를 사용할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 압착 추출 방법을 적용할 경우에는 냉간 압출에 비하여 상대적으로 높은 온도를 적용하는 것이 바람직하다.
상기와 같은 과정을 거쳐 수득된 퐁암(Pongam) 나무 추출물은 줄기세포의 조골세포로의 분화를 촉진하는 효과를 나타낸다. 다시 말해서, 상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물은 줄기세포가 조골세포로 분화되도록 유도하고, 분화된 조골세포는 높은 알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP) 활성을 나타내고, 무기질 결정을 형성한다.
상기 줄기세포는 인간을 포함하는 포유동물에서 유래한 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 치은에서 유래한 성체 줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명의 줄기세포 분화 촉진용 조성물에는 상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물이 0.0005 내지 0.9 중량%의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.001 내지 0.5 중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량%의 함량으로 포함될 수 있으나, 줄기세포를 분화할 수 있는 효과를 가지고 있는 농도라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지에 관한 것이다.
상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물은 줄기세포 배양용 배지에 일 성분으로 포함될 수 있다.
상기 줄기세포 배양용 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 모든 배지를 포함하고, 예를 들어 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등과 같은 기본 배지, 또는 골분화를 유도할 수 있는 성분이 함유된 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 측면은 줄기세포에 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화를 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 줄기세포 분화를 촉진시키는 방법은 줄기세포에 상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 처리하는 단계 및 상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물이 처리된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
상기 골분화 촉진의 대상이 되는 줄기세포는 인 비트로(in vitro) 상태일 수 있고, 상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물은 상기 줄기세포 배양용 배지의 형태로 줄기세포에 처리될 수 있다. 또한, 골분화를 촉진하기 위하여 줄기세포는 3차원 지지체에서 배양될 수 있다. 상기 지지체를 구성하는 성분은 생체적합한 물질을 사용할 수 있고, 지지체에서 배양되어 분화된 조골세포는 지지체로부터 별도로 분리하지 않고 골질환 치료를 위하여 지지체에 부착된 상태로 생체에 이식될 수 있다.
상기 배양은 인 비트로 상태 또는 인 비보 상태에서 수행될 수 있고, 특히 인 비트로 상태에서 수행되는 경우에는 CO2 배양기 내에서 수행될 수 있다.
상기 CO2 배양기 내에서의 배양은 CO2 농도가 5 내지 15%인 환경에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 10%, 더욱 바람직하게는 5 내지 8%인 환경에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한 상기 CO2 배양기 내부는 상기 CO2 외에 O2로 채워질 수 있다.
또한, 상기 배양은 25 내지 45℃의 온도 범위에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 30 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 34 내지 37℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 배양 온도가 상기 온도 범위를 벗어나는 경우에는 줄기세포의 분화가 효율적으로 촉진되지 않고, 사멸되는 줄기세포가 많아지는 문제점이 있다.
또한, 상기 배양은 1 내지 25일 동안 지속하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 1 내지 15일, 더욱 바람직하게는 1 내지 10일 동안 지속하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 배양 기간이 25일을 초과할 경우 배양 용기 내에 세포의 밀도가 높아짐에 따라 영양 성분이 빠르게 고갈되고, 세포의 특성이 변하게 되며, 조골세포로의 분화가 유도되지 않는다. 또한, 상기 배양 기간 동안 계대 배양을 실시하여 세포군을 나누어 배양할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 퐁암(Pongam) 나무 추출물의 제조
Pongamia pinnata (L.) Pierre는 방글라데시에서 채취한 것을 사용하였으며, 표본은 한국생명공학연구원 식물표본 보관소에 기탁하였다(기탁번호 PB022015). 건조 및 분쇄한 Pongamia pinnata(PPT)의 잎 58g의 분말을 500㎖의 메탄올에 첨가한 후 실온에서 재여과(repercolation)하여 추출 하였다.
이 메탄올 추출물을 실온에서 여과시킨 후, 감압 하에서 회전식 증류기(Eyela NE-1001, Tokya Rikakikai Co Ltd, 일본)를 이용하여 60㎖로 농축하였다. 그리고 상기 농축물을 동결건조기(Labconco, 미국)를 이용하여 동결건조하여 15.04g의 고체 잔사를 수득하였다(수율: 26%(w/w))
실시예 2 : 치은 유래 줄기세포의 분리 및 배양
가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원의 의학연구윤리심의위원회에서 승인을 받은 후(no. KC11SISI0348), 치관 확장술 진행 중인 4명의 건강한 환자로부터 정상적인 치은(gingiva) 조직을 얻었다.
상기 치은 조직은 즉시 100U/㎖ 페니실린(시그마 알드리치, 미국) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(시그마 알드리치, 미국)이 포함된 살균된 인산완충식염수(PBS, Welgene)에 넣어 4℃에 두었다. 상기 치은 조직은 탈-상피화(de-epithelialize)하여 1-2mm로 절단하고, 1mg/ml의 디스파제(dispase)(시그마 알드리치, 미국) 및 2mg/ml의 콜라게나아제 Ⅳ(시그마 알드리치, 미국)로 소화시킨 후, 5% CO2 및 95% O2의 습윤 배양기에서 37℃로 배양하였다. 배양 24시간 후, 부착되지 않은 세포는 씻어내고, α-MEM 배지를 기본으로 하는 배지로 교체하였다. 상기 배지는 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco), 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200mM L-글루타민(시그마 알드리치, 미국) 및 10mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치, 미국)를 포함한다. 그 이후, 2-3일 마다 배지를 갈아줌으로써, 인간 치은 유래의 성체 줄기세포를 확립하였다.
실시예 3 : 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후, 줄기세포의 형태 확인
실시예 2에서 확립된 줄기세포를 96웰 플레이트에 2.0x103 세포/웰의 밀도로 배치하고, 상기 줄기세포를 상기 실시예 1에서 수득한 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 첨가한 α-MEM 배지(Gibco, 미국)로 5% CO2 및 95% O2의 습윤 배양기에서 37℃의 온도로 배양하였다. 상기 α-MEM 배지는 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco), 38ug/ml 덱사메타손, 2mg/ml 글리세로인산 디소듐 염수화물, 100U/㎖ 페니실린과 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(시그마 알드리치, 미국), 200mM L-글루타민(시그마 알드리치, 미국) 및 10mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치, 미국)로 구성되며, 상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물은 0.1% 다이메틸설폭시화물(DMSO)에 용해한 후 상기 α-MEM 배지 내에 최종 농도 0(대조군), 0.001중량%, 0.01중량%, 0.1중량% 및 1중량%로 첨가하였다. 상기 세포의 형태는 1일자에 도립 현미경(CKX41SF; 올림푸스 (주), 일본)으로 확인하여 이미지를 얻었다.
그 결과, 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 0.001 내지 1%로 포함하는 배지로 배양된 줄기세포의 경우 세포 형태가 배양 후 1일자에 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 동일한 방추형(spindle-shaped)의 형상으로, 섬유아세포 유사 형태를 가지는 것이 확인되어, 본 발명의 퐁암(Pongam) 나무 추출물이 줄기세포에 영향을 미치는 독성이 없으며, 부착능이 저하되지 않음을 확인하였다.(도 1)
실시예 4 : 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후, 줄기세포의 생존도 확인
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 줄기세포를 배양하였고, 배양 1일자에 세포 계수 키트-8(CCK8, 도진도, 일본)를 이용하여 살아있는 세포를 확인하였다. 세포 계수 키트는 세포 생존도를 확인하기 위한 분석 방법으로, 수용성 테트라졸륨염이 배양 배지 내에 있는 세포의 디히드로게나제에 의해 환원되어 포르마잔이 되는 원리를 이용한 것이며, 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 비례하므로, 상기 포르마잔의 생성량을 비색 분석(colorimetric assays)으로 확인함으로써 세포의 생존도를 확인할 수 있다. 배양 1일자의 세포를 배양용기에서 분리하여 세포 현탁액을 만들고, 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 웰당 100㎕ 넣은 후, CCK-8 용액 10㎕를 각 웰에 더하였다. 5% CO2 및 95% O2의 습윤 배양기에서 37℃로 2시간 배양하였다. 배양이 완료된 96웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더(BioTek, 미국)를 이용하여 450nm에서 분광 광학적 흡광도를 측정함으로써, 줄기세포의 생존도 정도를 확인하였다.
그 결과, 배양 1일자에 대조군의 줄기세포 밀도를 100중량%(100.0±5.1%)(P> 0.05)로 하였을 때, 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 0.001중량%, 0.01중량%, 0.1중량% 및 1중량%로 처리한 군은 94.0±5.4, 94.3±7.2, 91.1±4.9, 및 86.5±5.2를 나타내어, 본 발명의 퐁암(Pongam) 나무 추출물이 줄기세포에 영향을 미치는 독성이 없음을 확인하였다.(도 2)
실시예 5 : 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후, 알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP) 활성 정도 확인
ALP는 조골세포(osteoblast) 활성의 표지인자로 알려져 있으며 석회화 과정 동안 무기인산의 운반, 세포 분열이나 분화의 조절자 역할을 한다. 따라서, 퐁암(Pongam) 나무 추출물이 치은 유래 성체 줄기세포의 조골세포로의 분화를 유도하는지 확인하기 위하여 ALP 활성을 측정하였다.
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 줄기세포를 배양하였고, 3-4일마다 새로운 배지로 교체해 주었다. ALP 활성은 배양 3일자 및 7일자에 시판 중인 키트(K412-500, BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조사의 권장 실험법 대로 측정하였으며, 마이크로플레이트 리더(BioTek, 미국)를 사용하여 흡광도 405nm에서 p-nitrophenyl phosphate에 의한 흡광도 변화를 지표로 사용하였다.
그 결과, 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 0중량%(대조군), 0.001중량%, 0.01중량%, 0.1중량% 및 1중량%로 처리한 군의 흡광도는 배양 3일자에 0.073±0.000, 0.075±0.001, 0.083±0.000, 0.078±0.002, 및 0.081±0.001를 나타내었으며, 배양 7일자에 0.104±0.001, 0.110±0.000, 0.122±0.001, 0.130±0.001 및 0.121± 0.000를 나타내어(표 1), 퐁암(Pongam) 나무 추출물의 처리는 대조군에 비해 ALP 활성을 통계적으로 유의하게 증가시킴을 확인하였고(도 3), 특히 퐁암(Pongam) 나무 추출물의 농도가 0.1중량%일 때, 가장 높은 활성을 나타내었다.
퐁암(Pongam) 나무 추출물 0중량%
(대조군)		 0.001중량% 0.01중량% 0.1중량% 1중량%
3일자 흡광도 0.073 0.075 0.083 0.078 0.081
7일자 흡광도 0.104 0.11 0.122 0.130 0.121
증가율 42.466% 46.667% 46.988% 66.667% 49.383%
상기한 표 1에 나타내는 바와 같이, 7일자 흡광도에 대한 3일자 흡광도의 비율에 대한 백분율을 사용하여, 퐁암(Pongam) 나무 추출물의 처리 농도에 따른 ALP 활성의 증가율을 확인하였으며, 대조군과 비교하여, 0.001중량%, 0.01중량%, 0.1중량% 및 1중량%에서 모두 증가함을 확인하였다.
실시예 6 : 퐁암(Pongam) 나무 추출물 처리 후, 무기질화 정도 확인
알리자린 레드는 칼슘과 같은 무기질 결정에 결합된다. 조골세포는 무기질 결정을 형성하므로 알리자린 레드 염색 정도에 비례하여 조골세포로의 분화 정도를 알 수 있다. 본 발명자들은 퐁암(Pongam) 나무 추출물에 의해 줄기세포가 조골세포로 분화하는지 확인하기 위하여 퐁암(Pongam) 나무 추출물이 포함된 배지로 줄기세포를 배양한 후 알리자린 레드 염색을 실시하였다.
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 줄기세포를 배양하였고, 3-4일마다 새로운 배지로 교체해 주었다. 배양 3일자 및 7일자에 칼슘 형성을 측정하기 위하여, 알리자린 레드 S 염색(ScienCell Research Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)을 수행하였다.
먼저, 알리자린 레드 S 염색 용액을 제조하였다. 알리자린 레드 S 2g을 증류수 100㎖에 용해시키고, pH를 4.1 내지 4.3으로 조정하여 알리자린 레드 S 염색 용액을 제조한 후, 여과하여 어두운 곳에 보관하였다.
배양된 세포를 고정하기 위해서, 배양용기에서 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. PBS를 제거한 후 중화 포르말린(10%)를 세포가 덮이도록 처리하였다. 30분 후 포르말린을 제거하고 세포를 증류수로 세척한 후, 증류수를 제거하였다. 고정된 세포에 상기에서 제조하여 보관한 알리자린 레드 S를 가하여 45분 동안 암실에서 염색하였다. 염색 완료 후에 알리자린 레드 S를 제거하고, 증류수로 4회 세척한 후 인산염완충액을 더하였다. 염색된 세포를 도립 현미경(Olympus Corporation, CKX41SF)으로 관찰하였다(도 4, 도 5). 또한, 칼슘 형성 정도를 정량적으로 평가하기 위해서 칼슘에 결합된 알리자린 레드 S를 10% 세틸피리디늄 클로라이드(시그마 알드리치, 미국)를 함유하는 10mM 인산 나트륨에 용해시킨 후, 560nm에서 분광 광도계(BioTek, 미국)로 측정하였다.
그 결과, 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 0중량%(대조군), 0.001중량%, 0.01중량%, 0.1중량% 및 1중량%로 처리한 군의 흡광도는 배양 3일자에 0.059±0.002, 0.044±0.002, 0.052±0.005, 0.049±0.004 및 0.063±0.002를 나타내었으며, 배양 7일자에 0.082±0.002, 0.102±0.001, 0.085±0.002, 0.084±0.007 및 0.080± 0.001를 나타내어(표 2, 도 6), 통계적으로 유의한 흡광도의 증가가 7일자 0.001중량% 군에서 가장 높은 것을 확인하였다(P<0.05).
퐁암(Pongam) 나무 추출물 0중량%
(대조군)		 0.001중량% 0.01중량% 0.1중량% 1중량%
3일자 흡광도 0.059 0.044 0.052 0.049 0.063
7일자 흡광도 0.082 0.102 0.085 0.084 0.080
증가율 38.983% 131.818% 63.462% 71.429% 26.984
상기한 표 2에 나타내는 바와 같이, 7일자 흡광도에 대한 3일자 흡광도의 비율에 대한 백분율을 사용하여, 퐁암(Pongam) 나무 추출물의 처리 농도에 따른 무기질화 증가율을 확인하였으며, 대조군과 비교하여, 0.001중량%, 0.01중량% 및 0.1중량% 에서 증가함을 확인하였다.
본 발명은 인간 치은 조직으로부터 유래된 줄기세포의 골형성 분화에 대한 다양한 농도의 퐁암(Pongam) 나무 추출물의 효과에 대해 제공하였다. 본 발명은 퐁암(Pongam) 나무 추출물의 단기간 적용이 중간엽 줄기세포의 증식을 강화시켰음을 분명하게 입증하였다.
저용량의 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 적용하여, ALP 활성을 25%까지 향상 시켰고 미네랄화를 24%까지 향상시켰다. 다른 용량에서는 줄기세포에 대해 다른 영향을 줄 수도 있다. ALP 활성은 0.1중량%의 퐁암(Pongam) 나무 추출물에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, 0.001중량%의 퐁암(Pongam) 나무 추출물에서 미네랄화의 현저한 증가가 달성되는 것을 확인하였다. 종래의 연구에서, 전통 허브의 농도가 낮으면 총 대사 활성 및 ALP 활성 발현이 증가하지만 높은 농도에서는 세포 집단을 현저하게 감소시켰음을 보여주었다(Liu YR, Qu SX, Maitz MF, Tan R, Weng J. The effect of the major components of Salvia Miltiorrhiza Bunge on bone marrow cells. Journal of ethnopharmacology 2007;111:573-583). 하지만, 본원 발명자들은 본 연구를 통하여, 최대의 효과를 얻기 위해서는 배양된 세포의 단계, 시스템 및 배양 기간에 따라 퐁암(Pongam) 나무 추출물의 투여량이 상이할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 퐁암(Pongam) 나무 추출물은 중간엽 줄기세포의 골 형성 분화를 효과적으로 촉진시킬 수 있다는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, 본 발명의 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물을 제조할 수 있으며, 이를 이용하여 다양한 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법에 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (16)

  1. 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 분화 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 퐁암(Pongam) 나무는 Pongamia pinnata인, 줄기세포 분화 촉진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는, 줄기세포 분화 촉진용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기용매인, 줄기세포 분화 촉진용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 알코올은 메탄올인, 줄기세포 분화 촉진용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 성체 줄기세포인, 줄기세포 분화 촉진용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 성체 줄기세포는 치은(gingiva) 조직 유래인, 줄기세포 분화 촉진용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 0.0005 내지 0.9 중량%의 함량으로 포함하는, 줄기세포 분화 촉진용 조성물.
  9. 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 배양용 배지.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 퐁암(Pongam) 나무는 Pongamia pinnata인, 줄기세포 배양용 배지.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 줄기세포는 성체 줄기세포인, 줄기세포 배양용 배지.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 성체 줄기세포는 치은(gingiva) 조직 유래인, 줄기세포 배양용 배지.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 배지는 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 0.0005 내지 0.9 중량%의 함량으로 포함하는, 줄기세포 배양용 배지.
  14. 분리된 줄기세포에 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, 줄기세포 분화를 촉진시키는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 퐁암(Pongam) 나무는 Pongamia pinnata인, 줄기세포 분화를 촉진시키는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 처리하는 단계는 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 0.0005 내지 0.9 중량%의 농도로 처리하는 것인, 줄기세포 분화를 촉진시키는 방법.
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